利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法
专利汇可以提供利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且利用固相载体从 生物 粒子中分离核酸的方法属于生物粒子快速分离技术领域,其特征在于:它用纳米 磁性 微球悬浮液或经特别处理的 纤维 膜作固相 吸附 介质来分离生物粒子中的细胞,再用细胞裂解液裂解细胞结构,通过固相吸附和 解吸 附以便直接从 全血 、 血浆 、唾液、尿液、细胞和组织培养液等生物样品中富集含有核酸的白细胞、病毒粒子、上皮细胞、培养细胞等的生物粒子,并获取核酸。这种方法简便快速,可用于各种不同规模和品种的样品制备,而且易于实现自动化、微型化装置的构建。，下面是利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，依次包含分离并裂解生物粒子的细 胞结构并从中分离出核酸的步骤，其特征在于，它依次含有以下步骤：
(1)在生物样品中加入可物理吸附含有核酸的细胞的固相吸附介质，它是一种悬浮状的 粒径范围为5～10000nm且经有机包覆的纳米磁性微球，使它们旋转混匀后静置；
(2)分离出上述固相吸附介质，弃去上清液，用缓冲液洗涤；
(3)加入细胞裂解液使其和固相吸附介质旋转混匀并静置后结合缓冲液使细胞裂解；
(4)用洗脱缓冲液洗涤上述固相吸附介质，获得上述固相吸附介质——核酸的复合物；
(5)回收含有核酸的洗脱缓冲液并分离出核酸。
2.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的 第(4)步获得的复合物是一种“微珠—聚合酶链式反应(PCR)”技术中的目标基因扩增用的 模板。
3.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：对于小 分子核酸(RNA或质粒子DNA)而言，在第(3)步中，可在弃去的上清液中再加入固相吸附 介质，根据需要用DNA裂解酶或RNA酶去消化不需要的小分子核酸后，再按步骤(4)、(5) 依次进行。
4.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的 固相吸附材料是在室温下用0.3mol/l NaOH液浸泡过夜，然后再用0.5mol/lBCl3·2H2O浸泡 8小时经去离子水洗至PH值为中性的玻璃纤维膜。
5.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的 分离固相吸附介质和液体的方法是磁场分离法。
6.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的 细胞裂解液含有：2.5～4mol/l NaI，3～5mol/l尿素，30～50g/l Triton-100(三硝基 甲苯)，8～12mmol/l EDTA(乙二胺四乙酸钠)(pH6.5)，15～30mmol/l Tris·HCl(三羟甲 基氨基甲烷)(pH6.5)。
7.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的 细胞裂解液组成为：15～20g GuSCN(异硫氰酸胍)，pH6.0的100ml TE(10mmol/lEDTA，25m mol/l Tris·HCl)，15～30gPEG8000(聚乙二醇)。
8.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的 洗脱缓冲液是TE溶液(10mmol/l Tris·HCl，1mmol/lEDTA)。
技术领域
一种利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法属于快速分离并裂解生物粒子的细胞以 获取核酸的技术领域。
背景技术
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用固相载体从生物样品中快速分离生物粒子，用细胞裂解 液裂解细胞结构，用洗脱缓冲液分离核酸或者利用微珠-聚合酶链式反应(PCR)技术进行目 标基因扩增，把扩增产物存于液相之中的提取分离核酸的方法。
本发明的特征在于，它依次含有以下步骤：
(1)在生物样品中加入可物理吸附含有核酸的细胞的固相吸附介质，它是一种悬浮状的 粒径范围为5～10000nm且经有机包覆的纳米磁性微球，使它们旋转混匀后静置；
(2)分离出上述固相吸附介质，弃去上清液，用缓冲液洗涤；
(3)加入细胞裂解液使其和固相吸附介质旋转混匀并静置后结合缓冲液使细胞裂解；
(4)用洗脱缓冲液洗涤上述固相吸附介质，获得上述固相吸附介质--核酸的复合物；
(5)回收含有核酸的洗脱缓冲液并分离出核酸。
所述的第(4)步获得的复合物是一种“微珠—聚合酶链式反应(PCR)”技术中的目标基 因扩增用的模板。
对于小分子核酸(RNA或质粒子DNA)而言，在第(3)步中，可在弃去的上清液中再加 入固相吸附介质，根据需要用DNA裂解酶或RNA酶去消化不需要的小分子核酸后，再按步骤 (4)、(5)依次进行。
所述的固相吸附材料是在室温下用0.3mol/l NaOH液浸泡过夜，然后再用0.5mol/l BCl3·2H2O浸泡8小时经去离子水洗至PH值为中性的玻璃纤维膜。
所述的分离固相吸附介质和液体的方法是磁场分离法。
所述的细胞裂解液含有：2.5～4mol/l NaI，3～5mol/l尿素，30～50g/l Triton-100 (三硝基甲苯)，8～12mmol/l EDTA(乙二胺四乙酸钠)(pH6.5)，15～30mmol/l Tris·HCl(三羟甲基氨基甲烷)(pH6.5)。
所述的细胞裂解液组成为：15～20g GuSCN(异硫氰酸胍)，pH6.0的100ml TE (10mmol/lEDTA，25mmol/l Tris·HCl)，15～30gPEG8000(聚乙二醇)。
所述的洗脱缓冲液是TE溶液(10mmol/l Tris·HCl，1mmol/lEDTA)。
使用证明：它达到了预期目的。
附图说明
图1：实施例3的人类基因组DNA电泳图谱。从300μl人全血中用15mg/ml磁球悬 浮液提取的基因组DNA的琼脂糖电泳检测图。磁球悬浮液的量：1(图2中的标号，下同)和 2，5μl；3和4，10μl；5和6，20μl；7和8，30μl；9和10，50μl；11和12， 70μl；13，100μl；14，120μl；15，150μl；M：1μlλphage DNA(HindIII酶切)marker.
图2：从人全血中用磁球提取的基因组DNA进行HLA-A等位基因PCR扩增后产物的琼脂 糖电泳检测图。O：阴性对照，P：阳性对照。
图3：用磁性微球从全血中分离DNA的流程示意图。
具体实施方法
实施例1：高分子DNA的分离。以用纳米磁性微球吸附DNA片断为例：在高温消毒的小 离心管(eppendorf)中加入15mg/ml的纳米磁性微球悬浮液40μl以及0.4μg/μl的双链 入-DNA分子量标记(marker)(Hind III酶切)15μl，在旋涡振荡器上轻微振荡15s，再加入 4mol·L-1的NaI溶液80μl，轻微振荡15s后，静置3分钟。再加入助吸剂异丙醇100μl， 轻微振荡5s，后静置2分钟。用磁性分离架把磁球固定，弃去上清液，用100μl、70％的乙 醇洗涤已吸附DNA的纳米磁球2次。加入50μl、pH＝8.0的TE溶液(10mol·L-1Tris.Cl， 1mmol·L-1EDTA)。在水浴中62℃恒温12分钟把DNA从磁球上洗脱下来。再把磁球与TE溶液 分离，把得到的TE溶液用琼脂糖水平凝胶电泳检测分离的DNA片断。全部操作只需15min， DNA片断回收率为95％以上。
实施例2：用纳米磁性微球分离大肠杆菌的基因组的(genomic)DNA。
样品为培养过夜的不含质粒的E.Coli大肠杆菌菌株。取收获的细胞培养液300μl，再 加入50μl纳米磁性微球悬浮液。振荡混合后采用磁性分离架分离磁球，弃去上清液。向磁 球加入300μl细胞裂解液(3mol/l NaI，4mol/l尿素，30g/l Triton-100(三硝基甲苯)， 10mmol/l EDTA(pH6.5)，25mmol/l Tris·HCl(pH6.5))(下同)，摇匀，室温静置5min。 加入300μl异丙醇。在旋涡振荡器上轻微振荡15s，室温静置5min。用磁性分离架把磁球固 定，弃上清后，再用70％乙醇洗磁性微球2次。然后加上述100μlTE溶液(pH＝6.0)，室温 静置10min。再用磁性分离架把磁球固定，收集洗脱液，进行紫外分析和琼脂糖凝胶电泳。 DNA产量约为30μg/ml，与传统的十二烷基硫酸钠(SDS)加蛋白酶K破胞，酚-氯仿抽提法 相比，产量及纯度相当。
实施例3：用纳米磁性微球吸附分离全血中白细胞并提取其中DNA。
本试验所用全血由健康供血者提供，用血液1/6体积的ACD(23mmol/l柠檬酸，80mmol/l 葡萄糖，45mmol/l柠檬酸钠)抗凝。取适量的血液300μl，加入50μl上述磁性微球溶液(用 上述pH＝6.0的TE溶液悬浮)，在旋涡振荡器上轻微振荡15s，室温静置3min后，用磁性分 离架把磁球固定。弃其他部分。加入300μl细胞裂解液，振荡混匀，室温静置2min。再加 入300μl异丙醇振荡混匀，室温静置5min。用磁性分离架把磁球固定，弃上清液。用70％ 乙醇洗涤2次磁球后，加入上述pH6.0的TE溶液，10min后用磁性分离架把磁球固定，收集 洗脱液，进行凝胶电泳分析，紫外分光分析。提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶(0.9％)电泳 检测，电泳图谱见附图1。该方法建立了一种快速高效的从全血中制备基因组DNA的方法， 它不用有毒试剂，操作安全。分别用在上述操作中所获的含人类基因组DNA的洗脱液或所获 的吸附有基因组DNA的磁珠直接作模板进行公知的HLA-A(人类白细胞抗原)等位基因的PCR 试验，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。电泳图谱见附图2。本试验建立了一种快速高效 的HLA等位基因扩增的磁珠-PCR法(microsphere based PCR)，与传统制样方法相比更为 简单，快速，模板制备仅需10min，并且排除了PCR抑制剂，且无非特异性扩增。图3是本 发明的磁性分离法的流程示意图。1是白细胞，2是红细胞，3是磁球，4是DNA，5是磁铁。 先使磁球3和生物样品人全血轻微振荡再静置，磁球3吸附白细胞1后被磁铁5吸附在管壁， 弃去其余溶液。加入细胞裂解液后进入裂解白细胞结构的过程，破胞后，DNA4被磁球3吸附 后，在磁铁5作用下吸附在管壁上，弃去其余溶液，用TE洗脱缓冲液把DNA从磁球上洗下后， 将磁球通过磁铁5固定，将含DNA的TE溶液移至新管中。对300μl人全血，采用100μl磁 球溶液(15μg/μl)可得到结果。
实施例4：用纳米磁性微球分离大肠杆菌的质粒DNA。
样品为培育过夜的含质粒的E.coli菌株，试验步骤为：取收获的细胞培育液300μl，然后 加入50μl纳米磁性微球悬浮液(15μg/μl)，振荡混合后采用磁性分离架分离磁球，弃溶液， 向磁球加入300μl细胞裂解液，摇匀，室温静置5min，再加入300μl异丙醇振荡混匀，室 温静置5min。用磁性分离架把磁球固定，转移上清液至另一新管中，重新加入50μl纳米磁 性微球悬浮液及300μl异丙醇，摇匀，室温静置5min，用磁性分离架把磁球固定，弃上清， 再用70％乙醇洗涤磁球2次。然后加入上述pH6.0的TE溶液100μl，和适量RNA酶溶液， 在适宜温度下降解RNA。再用磁性分离架将磁球固定，收集洗脱液，进行紫外分析和琼脂糖 电泳检测。质粒DNA产量约为5μg/ml，与传统的方法相比，产量及纯度相当。如果要用纳 米磁性微球分离大肠杆菌的RNA，则可用DNA酶来代替上述的RNA酶，其余步骤相同。
实施例5：用经过处理的纤维膜吸附DNA片断。
在高温消毒的eppendorf管中加入剪成直径0.5厘米圆形膜片的处理后的玻璃纤维膜， 再在纤维膜上加入0.4mg/μl的双链λ-DNAmarker(Hand III酶切)15μl，又加入5mol·L-1 NaI溶液80μl，轻微振荡15s，然后静置1min。再加入助吸剂异丙醇100μl，轻微振荡5s， 静置2min。用离心法除去上清液。用100μl、70％的乙醇洗涤吸附DNA的膜片2次。加入 50μlTE溶液(pH＝8.0，10mmol·L-1Tris.Cl，1mmol.L-1EDTA)。在水溶中用62℃恒温12min， 把DNA从膜片洗脱下来。然后用离心法把膜片与TE溶液分离，把得到的TE溶液用琼脂糖水 平凝胶电泳检测分离的DNA片断。整个操作只需15min。
实施例6：用经过处理的纤维膜分离大肠杆菌的基因组DNA。
样品为培养过夜的不含质粒的E.Coli菌株。取收获的细胞培养液300μl，然后加入剪 成宽0.3厘米的处理过的条状纤维膜膜片。振荡混匀后用吸管吸取再弃去上清液。加入300 μl细胞裂解液(20gGuSCN，100ml TE(pH6.0)(10mmol·L-1 Tris.Cl，25mmol.L-1 EDTA)，20gPEG8000)，摇匀，室温静置5min。加入300μl 70％乙醇，在旋涡振荡器上轻微振 荡15s，室温静置5min。用吸管吸取后再弃去上清液，再用70％乙醇洗膜片2次。然后加pH＝6.0 的上述100μl TE溶液，室温静置10min。收集洗脱液，进行紫外分析和琼脂糖凝胶电泳。 DNA产量约为40μg/ml，与传统的SDS加蛋白酶K破胞，酚—氯仿抽提法相比，产量及纯度 相当。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种树枝状生物玻璃的制备方法 | 2020-05-12 | 728 |
| 一种生物活性玻璃复合支架及应用 | 2020-05-12 | 398 |
| 一种生物玻璃颗粒材料及其制备工艺 | 2020-05-13 | 739 |
| 一种有效利用生物能发电的玻璃外墙 | 2020-05-13 | 696 |
| 缓冲型生物活性玻璃陶瓷种植牙 | 2020-05-13 | 782 |
| 玻璃生物反应容器 | 2020-05-11 | 122 |
| 抗微生物玻璃和类似玻璃的产品及其制备方法 | 2020-05-12 | 482 |
| 生物微晶玻璃及其用途 | 2020-05-11 | 699 |
| 一种氟磷灰石和锌尖晶石相生物玻璃、生物微晶玻璃及制备方法 | 2020-05-12 | 262 |
| 一种玻璃钢生物除臭塔 | 2020-05-12 | 833 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
