一种吡咯喹啉酮生物碱及其制备和作为IDO1抑制剂的应用
阅读：750发布：2023-01-24
专利汇可以提供一种吡咯喹啉酮生物碱及其制备和作为IDO1抑制剂的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及医药技术领域，特别涉及一种吡咯喹啉 酮 生物 碱 及其制备和作为IDO1 抑制剂 的应用。所述吡咯喹啉酮生物碱的结构式如下式I所示：其中，羧基，酰胺基， 羧酸 酯类；R2＝H，或C1-C4烷基；R3＝羧基，酰胺基， 醛 基，羧酸酯类；R4＝C1-C4烷基类的 氧 化基团，巯基及其衍生物；R5＝羟基，C1-C4烷基类的氧化基团， 氨 基。本发明的吡咯喹啉酮生物碱可抑制 哺乳动物 IDO1活性，由于IDO1是 肿瘤 疾病 中关键的靶点，因此在肿瘤 治疗 和肿瘤免疫相关方面具有潜在的生物活性。，下面是一种吡咯喹啉酮生物碱及其制备和作为IDO1抑制剂的应用专利的具体信息内容。
1.一种吡咯喹啉酮生物碱，其特征在于，结构如下式I所示：
其中， 羧基，酰胺基，羧酸酯类；R2＝H，或C1-C4烷基；
羧基，酰胺基，醛基，羧酸酯类；R4＝C1-C4烷基类的氧化基团，巯基及其衍生物；R5＝羟基，C1-C4烷基类的氧化基团，氨基。
2.根据权利要求1所述的吡咯喹啉酮生物碱，其特征在于，结构如下式1或式1’所示：
3.一种根据权利要求1所述的吡咯喹啉酮生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将Streptomyces albogriseolus MGR072菌株进行燕麦培养基液体发酵培养，所得发酵液采用溶剂1浸泡、然后萃取，得菌株的总提取物；
B、将总提取物采用溶剂2溶解后加反相硅胶上样至反相硅胶玻璃减压柱上，以甲醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，然后分离纯化，得到所述吡咯喹啉酮生物碱。
4.根据权利要求3所述的吡咯喹啉酮生物碱的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述发酵培养的温度为30℃、培养时间为7天。
5.根据权利要求3所述的吡咯喹啉酮生物碱的制备方法，其特征在于，所述溶剂1为乙酸乙酯，溶剂2为氯仿-甲醇混合溶剂。
6.根据权利要求3所述的吡咯喹啉酮生物碱的制备方法，其特征在于，所述甲醇-水混合溶剂中，甲醇和水的提交比为40:60。
7.一种根据权利要求1所述的吡咯喹啉酮生物碱在制备IDO1抑制剂中的应用。
8.一种IDO1抑制剂，其特征在于，包括如下结构所示的吡咯喹啉酮生物碱：
其中， 羧基，酰胺基，羧酸酯类；R2＝H，或C1-C4烷基；
羧基，酰胺基，醛基，羧酸酯类；R4＝C1-C4烷基类的氧化基团，巯基及其衍生物；R5＝羟基，C1-C4烷基类的氧化基团，氨基。
9.根据权利要求8所述的IDO1抑制剂，其特征在于，所述吡咯喹啉酮生物碱的结构如式
1或式1’所示：
一种吡咯喹啉酮生物碱及其制备和作为IDO1抑制剂的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及一种吡咯喹啉酮生物碱及其制备和作为IDO1抑制剂的应用。
背景技术
[0002] 目前，关于吡咯[2,3-c]喹啉酮生物碱pyrrolo[2,3-c]quinoline类化合物已有一些文献报道，包括从自然界中分离得到的天然产物结构，如文献[A.Kanjana-opas,S.Panphon,H.-K.Fun and S.Chantrapromma.4-Methyl-3H-pyrrolo[2,3-c]quinoline.Acta Crystallogr.,Sect.E:Struct.Rep.Online.62(7):o2728-o2730,2006.]报道了一个吡咯喹啉酮化合物Marinoquinoline A的结构。文献[P.W.Okanya,K.I.Mohr,K.Gerth,R.Jansen and R.Muller,Marinoquinolines A-F,pyrroloquinolines from Ohtaekwangia kribbensis(Bacteroidetes),J.Nat.Prod.74(4):603-608,2011]报道了包括Marinoquinoline A在内的六个吡咯喹啉酮生物碱Marinoquinoline A-F的结构，以及它们的抗热带寄生虫活性。还有一些有机合成的文献报道该类化合物的化学合成，其中文献[M.Akula,J.P.Sridevi,P.Yogeeswari,D.Sriram and A.Bhattacharya,New class of antitubercular compounds:synthesis and anti-tubercular activity of 4-substituted pyrrolo[2,3-c]quinolones,Monatsh.Chem.145(5):811-819,2014]报道了4-取代的吡咯喹啉酮化合物具有抗结核杆菌的活性。尚未见该类化合物具有吲哚胺双加氧酶1(IDO1)抑制活性。
[0003] IDO1是一个含亚铁血红素的酶，是色氨酸到犬尿氨酸途径代谢的限速酶，是代谢途径第一步的关键酶。IDO1通过催化色氨酸的氧化裂解反应，调控体内色氨酸及代谢产物的水平，发挥着重要的生物学功能。近年来的研究显示，IDO1在多种肿瘤细胞中过度表达，消耗肿瘤微环境中的色氨酸，造成T细胞抑制，从而使肿瘤细胞逃避免疫系统的监控和清除。因此，IDO1目前是肿瘤免疫治疗的一个重要靶点。近年来，IDO1抑制剂的研究得到了广泛的关注，吸引了众多制药公司和科研高校的参与，采用高通量筛选方法以及基于药效基团结构的药物分子设计手段，发现了多种结构类型的IDO1抑制剂。目前已有超过10个小分子抑制剂进入临床研究阶段。由于肿瘤的种类众多，不同类型的肿瘤的疾病发展进程和机制也不同，寻找更多的不同结构类型，不同作用机制的IDO1抑制剂对于肿瘤免疫的治疗具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006] 本发明提供了一种吡咯喹啉酮生物碱，结构如下式I所示：
[0007]
[0008] 其中， 羧基，酰胺基，羧酸酯类；R2＝H，或C1-C4烷基；羧基，酰胺基，醛基，羧酸酯类；R4＝C1-C4烷基类的氧化基团，巯基及其衍生物；R5＝羟基，C1-C4烷基类的氧化基团，氨基。
[0009] 优选地，所述式I中， R2＝甲基； R4＝甲氧基；R5＝羟基。
[0010] 所述吡咯喹啉酮生物碱的具体结构如下：
[0011]
[0012] 优选地，结构如下式1或式1’所示：
[0013]
[0014] 本发明还提供了一种吡咯喹啉酮生物碱的制备方法，包括以下步骤：
[0017] 优选地，步骤A中，所述发酵培养的温度为30℃、培养时间为7天。
[0018] 优选地，所述溶剂1为乙酸乙酯，溶剂2为氯仿-甲醇混合溶剂。
[0019] 优选地，所述甲醇-水混合溶剂中，甲醇和水的提交比为40:60。
[0020] 本发明的吡咯喹啉酮生物碱的提取过程中，采用的是无酸条件，由此才获得了本发明的新型结构的吡咯喹啉酮生物碱。发明人前期的研究过程中，如发表的文章“红树林来源白浅灰链霉菌中生物碱类次级代谢产物研究及核糖体工程优化”中，也采用了燕麦培养基液体发酵培养来获得发酵产物，但该方法由于在提取过程中采用了甲酸(离心收集菌体，乙酸乙酯：甲醇：甲酸＝80:15:5(V:V:V)的萃取液重复浸泡萃取5次)，所以获得的产物是2-喹啉酸酯和4(1H)喹唑酮，并未获得本发明式I所述的吡咯喹啉酮生物碱。
[0021] 本发明还提供了一种吡咯喹啉酮生物碱在制备IDO1抑制剂中的应用。
[0022] 本发明还提供了一种IDO1抑制剂，包括如下结构所示的吡咯喹啉酮生物碱：
[0023]
[0024] 其中， 羧基，酰胺基，羧酸酯类；R2＝H，或C1-C4烷基；羧基，酰胺基，醛基，羧酸酯类；R4＝C1-C4烷基类的氧化基团，巯基及其衍生物；R5＝羟基，C1-C4烷基类的氧化基团，氨基。
[0025] 优选地，所述吡咯喹啉酮生物碱的结构如式1或式1’所示：
[0026]
[0027] 优选地，所述吡咯喹啉酮生物碱的结构如式1或式1’所示：
[0028]
[0029] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0031] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0032] 图1为本发明的吡咯喹啉酮生物碱的立体结构图；
[0033] 图2为化合物1和1’、对照1-MT和epacadostat的IDO1抑制活性；
[0034] 图3为化合物1和1’的IDO1抑制类型；
[0035] 图4为化合物1和1’、对照1-MT的IDO1抑制常数。
具体实施方式
[0036] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0037] 实施例1吡咯喹啉酮生物碱(化合物1)的分离精制
[0038] 对Streptomyces albogriseolus MGR072菌株进行燕麦培养基液体发酵培养(10升)，30℃培养7天，将发酵液合并用相同体积的乙酸乙酯溶剂浸泡两天，用分液漏斗振摇萃取两次后，合并有机相溶剂，用旋转蒸发仪浓缩干燥，得到菌株的总提取物约4克。取总提取物(2克)，用适量氯仿-甲醇混合溶剂溶解后加4克200-300目反相硅胶(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，上到装填有50克反相硅胶玻璃减压柱上，以甲醇-水〔30:70,40:60,45:55,50:50,60:40,(体积比)至百分百甲醇〕梯度洗脱，洗脱溶剂的极性通过提高水中甲醇的用量来梯度递减，每个梯度洗脱的流份分别接收400毫升，根据高效液相色谱(HPLC)检测合并流份。取甲醇-水体积比为40:60的组分继续用半制备型HPLC进行分离纯化，采用乙腈-水溶剂系统。以该化合物在244nm和290nm的紫外吸收和保留时间为准，得到如图1所示的吡咯喹啉酮化合物(化合物1和异构体1')分别是6.7毫克和8.2毫克。
[0039] 化合物1的理化性质：黄色油状物； (c 0.41,MeOH)；UV(MeOH)λmax 220,244,291nm；CD(c 1.47mM,MeOH)λmax(Δε)290(+2.63),280(+1.10),257(+6.72),220(-
9.08)；IR(KBr)νmax 3442,2929,1673,1437,1384,1201,1178,1129,1026,761,719cm-1；1H and 13C NMR data,Table 1；HRESIMS m/z 531.2443[M+H]+(calcd for C26H35N4O8,
531.2455).ESI-FT-ICR-MS m/z 531.24486[M+H]+(calcd for C26H35N4O8,531.24494).[0040] 化合物1'的理化性质：黄色油状物； (c 0.34,MeOH)；UV(MeOH)λmax 195,
212,247,289nm；CD(c 1.13mM,MeOH)λmax(Δε)289(+2.36),278(+1.76),257(+5.46),220(-
9.13)；IR(KBr)νmax 3445,1642,1384,1186,1117cm-1；1H and 13C NMR data,Table 1；
HRESIMS m/z 531.2429[M+H]+(calcd for C26H35N4O8,531.2455).ESI-FT-ICR-MS m/z
531.24495[M+H]+(calcd for C26H35N4O8,531.24494).
9.08)；IR(KBr)νmax 3442,2929,1673,1437,1384,1201,1178,1129,1026,761,719cm-1；1H and 13C NMR data,Table 1；HRESIMS m/z 531.2443[M+H]+(calcd for C26H35N4O8,
531.2455).ESI-FT-ICR-MS m/z 531.24486[M+H]+(calcd for C26H35N4O8,531.24494).[0040] 化合物1'的理化性质：黄色油状物； (c 0.34,MeOH)；UV(MeOH)λmax 195,
212,247,289nm；CD(c 1.13mM,MeOH)λmax(Δε)289(+2.36),278(+1.76),257(+5.46),220(-
9.13)；IR(KBr)νmax 3445,1642,1384,1186,1117cm-1；1H and 13C NMR data,Table 1；
HRESIMS m/z 531.2429[M+H]+(calcd for C26H35N4O8,531.2455).ESI-FT-ICR-MS m/z
531.24495[M+H]+(calcd for C26H35N4O8,531.24494).
[0041]
[0042]
[0043] 本表信号归属基于DEPT、1H-1H COSY、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用C(单重峰)、CH(二重峰)、CH2(三重峰)和CH3(四重峰)表示。
[0044] 实施例2吡咯喹啉酮生物碱与IDO1蛋白的结合活性实验
[0045] 材料如下：
[0046] 蛋白：来源于鼠的IDO1蛋白(所述IDO1蛋白的制备方法参考文献“郭占领，李娟娟，杨青，鼠源吲哚胺2，3一双加氧酶活性检测方法的建立，复旦学报(医学版)，2016,43(3)，350-356)”)；药物：由上述实施例得到的化合物1，对照：epacadostat。
[0047] 方法：利用SPR(Surface Plasmon Resonance，表面等离子共振)测定吡咯喹啉酮底物和IDO1蛋白的解离和结合常数，最终得到底物和蛋白的亲和力的大小。使用复旦大学药学院的Biacore T200仪器，CM5传感器芯片(GE Healthcare)，实验温度为室温。活化芯片：用体积比为1:1的0.2M的N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)碳-二亚胺(EDC)和0.05M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合液预活化。最适pH值确定：用pH值不同的缓冲液稀释蛋白，选择蛋白耦合量最大的pH值作为后续实验的pH。IDO1确定的合适缓冲液pH为5.0。蛋白小分子耦合：将蛋白固定在芯片上后，以空白甬道作为阴性对照，依次将化合物按照100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.5625,0.78125μM梯度稀释，检测结合解离过程。通过SPR测定化合物1和1'与IDO1蛋白的动力学结合与解离常数，得到结合解离曲线，计算出结合常数。数据分析处理用Biacore evaluation 3.0软件。
[0048] 实验结果可得知：以进入临床Ⅲ期研究的IDO1抑制剂Epacadostat为阳性对照，化合物1和1'展现了与对照相当的IDO1结合活性。
[0049] 实施例3吡咯喹啉酮生物碱对IDO1蛋白体外活性抑制作用的实验
[0050] 材料如下：蛋白：IDO1蛋白；药物：由上述实施例得到的化合物1和1'，对照：1-甲基色氨酸(1-MT)，epacadostat。
[0051] 方法：为了进一步研究化合物1和1'对于IDO1蛋白的抑制作用，在体外进行IDO1蛋白催化的酶反应，并检测化合物1和1'的抑制活性。通过体外反应验证，化合物1和1'能够抑制IDO体外反应的酶活。反应体系设置如下：20nM IDO1蛋白，2mM D-色氨酸，20mM抗坏血酸(配制时需要用NaOH中和至中性)，3.5μM亚甲基蓝，200μg/mL过氧化氢酶，50mM磷酸buffer(pH 6.5)共90μL体系。在室温条件下，最后加入IDO1蛋白时开始反应，酶标仪连续检测反应体系的321纳米的吸光度增加。反应速率利用剂量反应方程，通过函数计算得到抑制剂的IC50(用GraphPad Prism 7处理数据)，实验重复3次。选择抑制剂1-MT和epacadostat作为阳性对照，分别加入不同浓度的抑制剂(化合物1和1')，化合物1和1'的浓度范围设置为50nM,200nM,800nM,2.5μM,10μM,50μM.
[0052] 实验结果如图2，表1所示，由附图2可得知：通过体外反应验证，化合物1和1'能够抑制IDO体外反应的酶活。在此条件下，而化合物1和1'的IC50分别是12.2μM和10.8μM，明显优于1-MT的56.4μM。说明化合物1和1'具有一定IDO1抑制活性。
[0053] 表1 IDO1与化合物1和1'的结合常数
[0054]
[0055] Ka,结合常数；Kd,解离常数；KD,平衡解离常数.
[0056] 实施例4吡咯喹啉酮生物碱抑制类型和抑制常数实验
[0057] 材料如下：蛋白：IDO1蛋白；药物：由上述实施例得到的化合物1和1'，对照：1-甲基色氨酸(1-MT)。
[0058] 方法：进一步研究化合物1和1'的抑制反应类型。通过改变反应体系中酶IDO1的用量来比较反应速率，根据反应速率和酶用量来作图，确定抑制类型。反应体系中2mM D-色氨酸，20mM抗坏血酸(配制时需要用NaOH中和至中性)，3.5μM亚甲基蓝，200μg/mL过氧化氢酶，50mM磷酸buffer(pH 6.5)共90μL体系，抑制剂用量为10μM，酶用量设置为10nM,20nM,50nM,
100nM共四个不同浓度。得到化合物1和1'不同酶浓度下的反应速率曲线。
100nM共四个不同浓度。得到化合物1和1'不同酶浓度下的反应速率曲线。
[0059] 实验结果如图3所示，由附图可得知：化合物1和1'是可逆性抑制剂。
[0060] 在确定了化合物1和1'的IC50之后，进一步检测它们的抑制常数(the inhibitory constant,Ki)。底物D-色氨酸的浓度范围设置为500μM，1mM，2mM。抑制剂浓度根据IC50在半数抑制浓度的上下三倍浓度范围内变化，其它条件同上，测定不同反应体系的反应速率，根据[S]/[V]与抑制剂浓度作图，其中[S]代表底物D-色氨酸浓度，[V]代表反应速度，计算得到抑制剂的抑制常数Ki。以1-MT为阳性对照，同样评估了它的Ki值。可以看出化合物1和1'的Ki明显优于1-MT。
[0061] 实验结果如图4，表2所示，由附图4可得知：化合物1和1'的Ki明显优于1-MT。
[0062] 表2化合物1和1'的IDO1抑制活性的动力学参数
[0063]
[0064] 经实验证实，本发明的吡咯喹啉酮生物碱可以与IDO1蛋白结合，抑制IDO1蛋白活性，具有较好的IDO1抑制活性。因此，本发明的吡咯喹啉酮生物碱可用于IDO1蛋白抑制剂的药物研究。
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