发明领域

本发明涉及生物化学内分泌学、分子生物学和蛋白质化学。更具体地，本发 明涉及测定刺激促生长素抑制素和胰岛素产生的化合物的方法。

相关技术描述

葡萄糖的体内稳态需要多种神经内分泌系统的协同作用。然而，胰岛被认为 是哺乳动物体内主要的“葡萄糖感受器”。胰岛包含四种细胞，它们被称为前胰 岛素原(primansulin)、胰高血糖素、促生长素抑制素或胰多肽。其中产生胰岛素 的β细胞占主要地位。血清中葡萄糖的增加刺激了胰岛素的分泌和产生，而该步 骤可使某些组织随后吸收葡萄糖。因此，β细胞的功能异常或破坏将导致血清葡 萄糖含量的升高，最终导致糖尿病。

遗传连锁分析表明遗传因子对获得糖尿病的易感性有很大影响。例如，至少 18个基因座与胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)有一定的关联。一个称为IDDM2的疾 病感受型基因座包括人的胰岛素基因，并与胰岛素启动子功能的改变的转录调节 有关。因此，调节胰岛素基因表达步骤的破坏将部分导致糖尿病原性疾病。与这 种假设一致的是，β细胞功能的损失是糖尿病的一个非常普遍的特征。

非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)被认为是外界影响和复杂的遗传影响两者 共同的结果。令人感兴趣的是，胰岛素基因座本身的等位基因变异与糖尿病有 关。这些变异表现出含有正常的胰岛素基因，但是表现出改变了与转录调节有关 的性质。

调查表明有多达2千万的美国人患有II型糖尿病。疾病的发展需要环境因素 和某些还未被充分鉴定的可能使II型糖尿病有外周胰岛素抗性的糖尿病易感性 基因(diabetes susceptibility gene)，在II型糖尿病中组织就不能响应胰岛素信号来 适当地利用葡萄糖。或者，在这些患者中，遗传因子可能是造成产生胰岛素的胰 β细胞的葡萄糖易感性减少的原因。这两种生理状态的最终结果是显著的高血 糖，而高血糖是糖尿病的主要特征。

胰岛素基因的转录调控是通过与细胞特异性的、对葡萄糖敏感的信号分子相 互作用的短区域侧翼DNA来实现的。尽管已经普遍认为含有碱性螺旋-环-螺旋 (bHLH)和同源异型域的因子是控制β细胞特异性表达胰岛素的转录机理的关键成 分，但是该调节组织的确切特征仍然知之甚少。对胰岛有特异性的碱性螺旋-环- 螺旋复合体与近侧的分别称为Nir、IEB1或ICE的E-框(E-box)相互作用；该元 件存在于鼠的胰岛素I基因中，但在鼠胰岛素II和人胰岛素基因中只出现一次。

在产胰岛素的细胞系中的瞬时测定(transient assay)表明，与E框结合的因子 可与对β细胞有特异性的蛋白质发生协同作用，该蛋白质与邻近的称作FLAT的 富含AT的序列结合，FLAT则具有与同源异型域识别序列的特征。与FLAT结 合的因子包括Isl-1、1mx-1、cdx-3和STF-1。此外，其中的后者与称作P元件 的进化上保守而富含AT的序列有首要的结合活性。Isl-1与FLAT元件的结合很 弱，而且用产胰岛素的细胞抽提物检测时，似乎不存在于结合FLAT的复合体中。 现有的数据支持了Isl-1在神经生长中所起的更重要的作用。同源异型域因子 1mx-3和cdx-3在异源细胞中有令人感兴趣的胰岛素启动子功能的反式激活性 质，但是它们在β-细胞内的细胞分布和与FLAT结合的活性仍是不清楚的。另外， 直接表明这些因子在β细胞系中的功能的数据也很少。

在有与胰岛素启动子结合活性的因子组中，STF-1可能是最有前途的胰岛素 启动子功能的真正调控器。在小鼠中，于胚胎期8.5天在形成胰脏的原基细胞核 中首先检测到有STF-1，略早于该区域内最早测到有胰岛素表达之前。随后通过 内分泌胰的生长，STF-1和胰岛素大量共表达。另外，在产胰岛素细胞系的抽提 物中，STF-1是当胰岛素启动子中同时有FLAT和P元件时有内源DNA结合活 性的成分。STF-1也与与E-框结合的因子Pan-1(估计可从与FLAT结合的因子中 获得)有强的协同作用。然而，DNA结合测定法表明，来自β细胞抽提物的其它 未知因子也对检测到的FLAT结合活性有较大的贡献。FLAT介导的胰岛素启动 活性是否需要全部这些检测到的种类、或仅仅需要一个亚型(subset)仍是不清楚 的。

成熟的胰脏包括内分泌和外分泌两种成分，它们被认为是从生长的肠的普通 前体细胞中产生的。该前体细胞表达出称作STF-1(14，20)(或IPF-1(19)，IDX(17)或 X1Hbox 8(22))的同源异型域蛋白，其重要性在“剔除”研究中有所描述，“剔除” 研究是指寻靶破坏STF-1基因将导致胰的先天性缺失。尽管STF-1最初是由生长 的胰的内分泌细胞和外分泌细胞表达的，但是STF-1的产生逐渐局限于产生胰岛 素和促生长素抑制素的胰岛细胞(7)。在这些细胞中，STF-1的作用对于维持促生 长素抑制素和胰岛素基因的高水平表达显得很重要(14，17，19，20，22)。

STF-1可识别两种确切的胰岛素启动子上的称作FLAT和P的胰岛特异性元 件。当与这些位点结合时，STF-1与E47协同刺激胰岛素的转录，E47是可识别 两种称作Far和Nir的E基因框元件的螺旋-环-螺旋蛋白质。同样的，STF-1通 过两个胰岛特异性元件(称为TSEI和TSEII)来调控胰岛细胞中促生长素抑制素的 表达(14，17)。

除了对某些基因有转录刺激作用，发现同源异型域蛋白质如STF-1在确定细 胞或节段身份(segmental identity)的研究中有重要作用。与它们在体内的特异性和 显著的活性相反，许多同源异型域蛋白质在体外表现出较低的与重叠DNA结合 的特异性。然而，目前的研究暗示，某些蛋白质辅因子可作为体内同源异型域 DNA结合特异性的决定簇(8，13)。例如在果蝇属中，外小齿(extradenticle)(exd) 可调节同源异型蛋白质的活性而不改变它们的表达方式(21，24)。另外，外小齿表 现出通过增强某些同源异型域蛋白质的DNA结合特异性lai促进靶基因的选择 (2，25)。实际上，外小齿在脊椎动物中是高度保守的，其与人原癌基因Pbx1有71 ％的延伸序列相同(23)。

已有技术缺少有效的增强同源异型域蛋白如STF-1的结合的方法。本发明满 足了该领域中这一长期存在的需要。

发明概述

许多同源异型域蛋白表现出可通过刺激特异靶基因的转录来调节细胞生 长。与它们在体内的显著活性相比，许多同源异型域蛋白在体外与蛋白质靶部位 的结合是无特异性的，这表明有识别靶部位选择性的辅因子参与。一种辅因子称 为外小齿(exd)，它可通过与某些同源异型域蛋白协同结合到靶调节元件上来影响 果蝇属中的节段形态发生(segmental morphogensis)。本发明证明了STF-1(一种哺 乳动物中胰生长所需要的孤独同源异型域蛋白)通过与Pbx(哺乳动物中外小齿的 同源物)协同结合到DNA上来刺激胰岛激素基因促生长素抑制素的转录。与Pbx 的协同结合需要五肽基序(pentapeptide motif)(FPWMK)，它在同源异型域蛋白的 亚型中是高度保守的。FPMWK基序不足以使其它同源异型域蛋白具有Pbx协同 性，然而，STF-1同源异型域的N末端臂也是必须的。当与Pbx的协同结合发生 在仅一个潜在STF-1靶部位亚型上时，本发明表现出Pbx可通过和STF-1形成异 二聚复合体来选择性识别胰生长中的靶基因。实际上，本发明证明了促生长素抑 制素启动子的TSEII元件可识别胰岛细胞中的由STF-1和Pbx组成的异二聚复合 体。因此，胰中STF-1作用的特异性部分受潜在靶启动子部位识别STF-1 Pbx异 二聚复合体的能力的支配。

因此，本发明的一个方面是提供了一种DNA结合测定法来测定对于促进 STF-1与STF-1接合部位的结合有效的化合物，其步骤包括：使有末端标记的、 有STF-1结合位点的双链DNA与STF-1一起混合，作为第一容器中的对照；使 末端标记的、有STF-1结合位点的双链DNA与STF-1和测定化合物一起混合， 作为第二容器中的样品；培育所述第一和第二容器；将所述对照和所述样品上样 于电泳凝胶；对所述电泳凝胶施加一定电流以使所述对照和所述样品在所述凝胶 中迁移；检测所述对照和所述样品；比较所述对照和所述样品的迁移，其中如果 所述样品的迁移比所述对照慢，则所述测定的化合物是有效地促进了STF-1与所 述STF-1结合位点的结合。

本发明的另一方面是提供了一种DNA结合测定法来测定可有效促进STF-1 与STF-1接合部位的结合的化合物，步骤包括：将组成型表达STF-1的第一表达 质粒和在STF-1结合位点控制下表达受体基因的第二表达质粒转染入合适的细胞 系中；将第三质粒转染入所述转染合适细胞系中，所述第三表达质粒可表达测定 (trest)化合物；测定所述受体基因的转录量，其中如果所述转录发生，则所述测 定化合物可有效促进STF-1与所述STF-1结合位点的结合。

本发明的其它方面、特征和优点可从下面公开给出的本发明的较佳实施例的 描述中明显获得。

附图简述

为使上述的本发明的特征、优点和目的被详细了解，本发明以上概述的详细 描述可参照一些结合附图来描述的实施例。这些附图是说明书的一部分。然而， 应当注意的是，附图描述了本发明的较佳实施例，因此它不能被认为是限制了它 们的范围。

图1表示胰的同源异型框因子STF-1与遍在核因子一起协同结合到促生长素 抑制素启动子中的细胞特异性调节元件上。图1A显示了胰岛Tu-6细胞的粗核抽 提物用促生长素抑制素TSEII从-303延伸至-281的双链寡核苷酸进行的凝胶移位 分析。其中指出了C1、C2和C3是蛋白质DNA复合体。渐增的条带表明核抽 提物的量的增加。STF，只有重组STF-1蛋白质；Tu-6 Ne和Hela NE分别指Tu-6 和Hela细胞的核抽提物。PI指预免疫抗血清。STF-1Ab指抗STF-1蛋白质的C 末端部分产生的抗血清。STF-1 Ab+Oct寡核苷酸指STF-1抗血清加上SV40的 Oct1结合位点(Sph1基序)。Oct.Ab指抗Oct.1蛋白质产生的单克隆Oct1抗血 清(W.Herr赠与)。图1B显示了用如下所述的促生长素抑制素TSEII和Tu6核抽 提物制得的复合体(预先与未标记的Oct1寡核苷酸培育，以只对C1和C2复合体 分析)的解离速率(off-rate)分析。复合体C1和C2如图所示。每条泳道均显示了在 加入1000倍过量的未标记TSEII竞争剂DNA后的时间(分钟表示)。PI指预免疫 的血清；STF-1 Ab指加入凝胶移动测定中的STF-1抗血清。图1C显示了重组 STF-1蛋白质的凝胶移位分析，其中用促生长素抑制素TESII寡核苷酸作为探 针。STF-1结合活性在没有(-)或有(+)Jurkat细胞的异源核抽提物(用Western印迹 法检测，不含可检测水平量的STF-1蛋白质)下测定。渐增条带表明重组STF-1 蛋白质的量的增加。复合体C1和C2如图所述。图1D显示了含有重组STF-1加 上Jurkat核抽提物的重建抽提物中复合体C1和C2的解离速率。每条泳道均显示 了在加入未标记TSE II竞争剂(1000倍过量)后的时间点(分钟表示)。

图2表示遍在同源异型框蛋白质Pbx与STF-1在促生长素抑制素TSEII元件 上形成异二聚复合体。图2A显示了用TSE II寡核苷酸作为探针对Tu6 NE的凝 胶移位分析。复合体C1、C2和C3如图所示。PBX Ab指反应中包含的Pbx抗 血清。PI指预免疫血清。STF-1 Ab指STF-1抗血清。图2B显示了体外翻译的 Pbx蛋白质(PBX)对于STF-1结合活性的影响。如每条泳道中所示，凝胶移位分 析采用TSE II寡核苷酸加上STF-1和/或Pbx。TNT指对照的裂解液。图2C显 示了PBX使STF-1与TSEII复合体的结合稳定。STF-1和STF-1 Pbx复合体的解 离速率分析用促生长素抑制素TSE II寡核苷酸作为探针。加入过量未标记TSE II 寡核苷酸后的时间(分钟表示)如图所示。如图所述，复合体C1和C2分别与STF-1 单体和STF-1/PBX异二聚体对应。图2D显示在促生长素抑制素和胰岛素启动子 序列上STF-1/Pbx异二聚体的形成的分析结果。TSEII指野生型TSE II寡核苷 酸。图3D和3E显示了M1、M2和M3以及突变型TSEII寡核苷酸(TAAT基序 发生突变)。P和FLAT是可高度亲和识别STF-1的胰岛素I元件。TSEI是与 STF-1结合的促生长素抑制素启动子元件。PBX指加入结合反应中的体外翻译 PBX蛋白；STF指全长重组STF-1蛋白质。图2E显示了图3B的凝胶移位分析 中采用的野生型和突变型寡核苷酸。连括号表示诱变寻靶的共有序列TAAI基 序。图2F显示了STF-1和Pbx协同作用在启动子位点的亚型上。每条线条下指 出了用STF-1和E2A-Pbx效应质粒进行的GC细胞瞬时转染测定法。线条框图显 示了从受体构建物获得的萤光素酶活性，受体构建物包括含有单个的最小生长激 素(GH)的启动子(Luc)，两个拷贝的GH启动子上游的促生长素抑制素TSEII元件 (TSEII-Luc)、或两个拷贝的胰岛素P元件(P-Luc)。使活性标准化以共转染入 RSV-CAT对照质粒中。

图3表示STF-1中保守的五肽基序对于与Pbx的协同结合是关键的。图3A 显示了野生型和截短重组的STF-1多肽形成的STF-1单体(复合体C1)和STF- 1/Pbx异二聚体(复合体C2)的分析结果。每条泳道中指出了突变的STF-1多肽中 缺失端点。例如，D1-70指出STF-1多肽缺少残基1-70。Hox140-215指STF-1 的同源异型域多肽。图3B显示上述凝胶移位测定中所用的构建物的示意图。H.D. 指STF-1同源异型域(氨基酸残基140-215)。全长STF-1蛋白质从氨基酸残基1 延伸至284。图3C显示保守的五肽基序的诱变破坏了与有所示氨基酸数目的野 生型和突变型STF-1蛋白质的Pbx序列协同性。图3D显示了单独的以及与体外 翻译PBX或E.Jurkat核抽提物组合使用的野生型(WT)和突变型(MUT)STF蛋白 的凝胶移位分析。

图4表示STF-1内的五肽基序(其对于STF-1与Pbx在促生长素抑制素TSEII 位点上形成异二聚体是必须的)在多个同源异型框蛋白中是保守的。不同的同源异 型框蛋白根据种类来分类并根据名字排列。对于每种蛋白质，与STF-1中基序对 应的序列以单字母氨基酸码表示，右侧显示了N端至同源异型域的距离。

图5表示与PBX相互作用的保守基序(Pim)对于促进PBX和同源异型框蛋白 质间的协同结合是必须的，但量不足。图5A显示了下面凝胶移位测定中所用的 重组GST-融合蛋白质的示意图。Isl1 H.D.指Isl1因子lim域的同源异型域。PBX 相互作用基序-Isl1 H.D.指含有融合入Isl1同源异型域的STF-1 PBX相互作用基序 区(氨基酸残基110-138)的STF-1-Isl1融合蛋白。cdx3 H.D.指胰同源异型框蛋白 cdx3的同源异型域(氨基酸残基143-253)。PBX相互作用基序-cdx3指含有与cdx3 同源异型域(氨基酸176-253)融合的STF-1 PBX相互作用基序区(氨基酸110-138) 的融合蛋白。PBX相互作用基序-STF-1指含有与STF-1同源异型域(氨基酸残基 140-215)融合的PBX相互作用基序区(110-138)的STF-1多肽。STF-1 H.D.指单 独STF-1同源异型域而没有PBX相互作用基序区。图5B显示了用促生长素抑制 素TSEII位点作为32P标记的探针进行的凝胶移位测定。-和+表示没有或含有用 PBX RNA控制的网织红细胞裂解液。每条泳道显示了用同源异型域融合蛋白测 得的PBX协同性。单体和异二聚复合体如标记所示。

图6表示STF-1同源异型域的N末端臂是与Pbx协同性所必需的。其显示了 PBX相互作用基序-cdx3融合构建物的凝胶移位分析结果，该构建物含有STF-1 PBX相互作用基序(氨基酸残基110-138)以及STF-1同源异型域的各个被cdx3的 同源异型域取代的区域。图6A显示了STF-1/cdx3融合构建物的结构和活性。 cdx3的序列为阴影部分，而STF-1的序列为白色部分。并指出了N末端臂(N)和 Helices 1，2和3(H1，H2，H3)的相对位置。凝胶移位测定中与Pbx的协同结合在右 侧表示成(+，-)。图6B显示了STF-1和cdx3(显示在下面)同源异型域的氨基酸排 列，右侧显示了C端残基的氨基酸数。破折号表示STF-1和cdx3间的氨基酸身 份。箭头所指地方是用于融合构建物的氨基酸端点(I，II，III)。图6C显示了重 组的STF-1/cdx3融合蛋白的凝胶移位测定结果。构建物数字指上面示意图中所述 的构建物。如图所示，体外翻译的Pbx(PBX)或未控制的网织红细胞裂解液(TNT) 存在于结合反应中。C1、C2复合体分别与STF-1单体和Pbx/STF-1异二聚体对 应。

发明详述

入的基因组含有四簇称为Hox基因的同源异型选择者基因，它们是胚胎发育 中轴体模式形成(axial body pattern formation)的关键决定簇(Krumlauf 1994，Cell 78：191-201)。四个簇各含有多达13个基因，而一个簇中的一个给定基因通常与 其它三个家族中的一个有高度的同源性。这种对应的基因称为共生同源基因 (paralog)；因此HoxA1，HoxB1，HoxC1和HoxD1均是紧密对应的共生同源基因， 而每个在不同的簇的不同的染色体上。例如，HoxB复合体位于染色体17的长臂 上，且HoxB1至HoxB9已被鉴定。

胰岛素基因的葡萄糖依赖性调控随着胰岛素分泌中葡萄糖介导的增加而产 生。这可以部分地源于胞间钙的增加。另外，响应葡萄糖的胰岛素启动子功能可 至少部分地通过调节FLAT结合蛋白的活性来产生。HoxB13与胰岛素启动子的 有重要功能的FLAT元件高亲和性地结合。此外，HoxB13和胰岛素ICE/Nir元 件-结合因子Pan-1在组合加入时大大地激活了胰岛素启动子。这与FLAT和Nir 元件协同作用于产生胰岛素的细胞的结果是一致的。这些收集数据表明，钙依赖 性信号途径可调节HoxB13的功能。

根据本发明，可采用常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术领域中 的已有技术。这些技术在文献中有充分描述。例如见Maniatis，Fritsh&Sambrook， “分子克隆实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；“DNA克 隆实践方法(DNA Cloning：A Practical approach)，”第I和II卷(D.N.Glover ed. 1985)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”(M.J.Gait ed.1984)；“核酸 杂交(Nucleic Acid Hybridiation)”[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)]；“转录 和翻译(Transcription and Translation)”[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1984)]；“动 物细胞培养(Animal Cell Culture)”[R.I.Freshney，ed.(1986)]；“固定化细胞和酶 (Immobilized Cells And Enzymes)”[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，“分子克隆指 导(A Practical Guide To Molecular Cloning)”(1984)。

因此，如果在这里出现，下述术语应有下列定义。

这里所述的氨基酸最好是“L”异构型的。然而，“D”异构型的残基可代 替任何L-氨基酸残基，只要多肽保留有与免疫球蛋白结合的所需功能性质。NH2 指多肽的氨基末端存在的游离氨基基团。COOH指存在于多肽的羧基末端的游 离的羧基基团。为与标准的多肽术语(J Biol.Chem.，243：3552-59(1969))保持一 致，下面的对应表显示了氨基酸残基的缩写：

                   对应表

符号                                氨基酸

1个字母            3个字母

Y                  Tyr              酪氨酸

G                  Gly              甘氨酸

F                  Phe              苯丙氨酸

M                  Met              甲硫氨酸

A                  Ala              丙氨酸

S                  Ser              丝氨酸

I                  Ile              异亮氨酸

L                  Leu              亮氨酸

T                  Thr              苏氨酸

V                  Val              缬氨酸

P                  Pro              脯氨酸

K                  Lys              赖氨酸

H                  His              组氨酸

Q                  Gln              谷氨酰胺

E                  Glu              谷氨酸

W                  Trp              色氨酸

R                  Arg              精氨酸

D                  Asp              天冬氨酸

N                  Asn              天冬酰胺

C                  Cys              半胱氨酸

应当注意，所有的氨基酸残基序列在这里以式子表示，其从左到右是按常规 的氨基端到羧基端的方向排列的。而且，应当注意，氨基酸残基序列的开始或结 尾处的破折号表示与另一有一个或多个氨基酸残基的序列相连的肽键。上述表格 与这里出现的三个字母和一个字母的记号对应。

“复制子”是任何在体内有自动复制DNA功能的遗传元件(如质粒、染色体、 病毒)，即在其控制下能够进行复制。

“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，另一个DNA片段可与其 连接从而来复制所连着的片段。

“DNA分子”指单链或双链螺旋型的脱氧核苷(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶 或胞嘧啶)的聚合体形式。该术语仅仅指分子的一级和二级结构，不局限于任何特 定的三级结构。因此，该术语包括所发现的双链DNA、inter alia、线性DNA分 子(如限制片段)、病毒、质粒和染色体。在讨论这里的结构时，根据常规只给出 了沿DNA非转录链(即有与mRNA相同序列的链)的5′到3′的序列。

“复制起点”指参与DNA合成的DNA序列。

DNA“编码序列”指在合适的调节序列控制下在体内转录并翻译成多肽的 双链DNA。编码序列的界限是5′端(相当蛋白质的氨基端)的起始密码子和3′端 (相当蛋白质的羧基端)的翻译终止密码子。编码序列包括(但不局限于)原核细胞序 列、来自真核细胞mRNA的cDNA甚至是合成的DNA序列。聚腺苷酸信号和转 录终止序列通常位于编码序列的3′端。

控制转录和翻译的序列是DNA调控序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸信 号、终止子等，它们可提供宿主细胞中的编码序列的表达。

“启动子序列”是可以与细胞中RNA聚合酶结合并引发下游(3′方向)编码序 列转录的DNA调控区。为详细说明本发明，启动子序列的3′端与转录起始部位 连接，其上游(5′方向)延伸包括在上述背景下引发可检测水平的转录所需的最小数 量的碱基或元件。在启动子序列中会发现有转录起始位点(常规情况下用核酸酶 S1作图来确定)，还有与RNA聚合酶结合的蛋白质结合区域(共有序列)。真核生 物启动子通常(但不总是)含有“TATA”框和“CAT”框。原核生物启动子除- 10和-35共有序列外还含有SD序列。

“表达控制序列”是控制并调节另一DNA序列转录和翻译的DNA序列。当 RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，编码序列是处于转录和翻译控制序列 的“控制”下，然后mRNA被翻译成由编码序列编码的蛋白质。

“信号序列”可以包括编码序列之前的部分。该序列编码信号肽，即多肽的 N末端，其与宿主细胞联系并使多肽到达细胞表面或分泌入基质，该信号肽在蛋 白质离开细胞前被宿主细胞切下。信号序列可与多种原核和真核生物天然蛋白质 关联。

术语“寡核苷酸”在这里指本发明的探针，其被定义为包括两个或多个核糖 核苷酸的分子，最好超过三个。其确切大小与许多因素有关，而这些因素反过来 与寡核苷酸的最终功能和用途有关。

术语“引物”在这里指一种寡核苷酸，无论其是天然存在于纯化的限制性消 化物中或是合成的，当在诱导引物延伸产物的合成(与核酸链互补)的条件下，即 在有核苷酸、诱导剂如DNA聚合酶和合适的温度pH下，它可作为合成的引发点。 引物可以是单链或双链的，且必须有足够的长度，以在诱导剂存在时引发合成所 需的延伸产物。引物的确切长度依赖于许多因素，其包括温度、引物来源及其使 用方法。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25 或更多的核苷酸，尽管它可含有较少的核苷酸。

这里的引物的选择应“基本上”与特定靶DNA序列的不同链互补。这意味 着引物必须足够互补来与它们各自的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的 确切序列。例如，非互补的核苷酸片段可与引物的5′端连接，而引物序列的其余 部分与链互补。或者，非互补的碱基或更长的序列可散布在引物中，只要引物序 列与序列有足够的互补性或与其杂交，从而制成延伸产物的合成模板。

如这里所用的，术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”均指在特异性核 苷酸序列处或附近切开双链DNA的细菌酶。

当这种DNA被引入细胞内，细胞就被外源或异源DNA“转化”。转化的 DNA可以或不必整合(共价连接)入细胞的基因组。例如在原核生物、酵母和哺乳 动物细胞中，转化DNA可以维持在如质粒那样的附加型元件中。对于真核细胞， 稳定转化的细胞中转化的DNA已整合入染色体中，这样就能通过染色体的复制 遗传给子代细胞。这一稳定性是由真核细胞建立的由一群含有转化DNA的子代 细胞组成的细胞系或克隆系的能力来证明。“克隆系”是一群从单个细胞或单一 祖细胞(monnon ancestor)通过有丝分裂获得。“细胞系”是可以在体外稳定生长 许多代的原始细胞的克隆系。

当DNA序列确定长度内至少约75％(较佳至少约80％，最佳至少约90或 95％)的核苷酸相同时，两个DNA序列是“基本上同源的”。基本上同源的序列 可通过用标准软件比较序列来鉴定，其中序列从序列数据库或Southern杂交实验 在例如该特定系统确定的严格条件下获得。确定的合适杂交条件是该领域已知 的。例如见Maniatis等人，同上；DNA Cloning，Vols.I&II，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。

DNA构建物的“异源”区是在较大DNA分子中可鉴别的DNA片段，其在 自然界中没有发现与较大分子连接。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，基因 通常被DNA侧接(flank)，而该DNA不与源有机物基因组中的哺乳动物基因组 DNA侧接。在另一个例子中，编码序列是一个构建物，其中的编码序列在自然界 中没有发现(如含有内含子的基因组编码序列cDNA，或含有与天然基因不同的密 码子的合成序列)。等位变异或天然发生的突变不会产生这里定义的DNA异源 区。

这些研究中最常用的标记是放射性元素、酶、暴露在紫外光下时产生荧光的 化学物质等。许多荧光性物质是已知的，并可用作标记。它们包括例如荧光素、 若丹明、金胺、得克萨斯红(Texas Red)、AMCA蓝和Lucifer黄。特别的检测物 是在山羊中制备的与荧光素通过异硫氰酸酯共轭的抗兔抗体。

蛋白质也可用放射性元素或酶来作标记。放射性标记可用任何现有的计量方 法来检测。较佳的同位素可选自3H、14C、32C、35S、36Cl、51Cr、57Co、 58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。

同样可使用酶标记，其可用任何现在采用的比色法、分光法、荧光分光光度 法、电流分析法或气体计量法技术来检测。酶通过与桥接分子如碳化二亚胺、二 异氰酸酯、戊二醛等反应来共轭连接到选择的颗粒上。可用于这些步骤的许多酶 是已知的并可被采用。较佳的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β- D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加上过氧化物酶和碱性磷酸酶。美国专利 No.3,654,090，3,850,752和4,016,043公开了不同标记物和方法的实施例。

该领域研究出并采用的特别测定系统是受体测定法。在受体测定法中，对待 测物作适当的标记，然后对某种细胞测试菌落用一定量的标记接种，然后进行结 合研究以测定标记物与细胞受体的结合情况。通过这种方法就可确定物体间的亲 和性差别。

该领域已知的有用的测定方法是“顺/反”测定法。简单的说，该测定法采用 了两种基因构建物，一种通常是在转染入合适细胞系后可连续表达感兴趣的特定 受体的质粒，第二种是在受体/配体复合体的控制下表达报道分子如萤光素酶的质 粒。因此，例如，如果要评价一种作为特定受体的配体的化合物，一种质粒应是 一种导致受体在所选细胞系中表达的构建物，而第二种质粒应有与萤光素酶基因 连接的启动子，而萤光素酶基因中插入有特定受体的效应元件。如果待测化合物 是受体的刺激物时，配体将与受体复合，得到的复合体与效应元件结合并启动萤 光素酶基因的转录。然后光计量测定得到的化学发光值，获得剂量效应曲线并与 已知的配体比较。前述的过程在美国专利No.4,981,784和PCT国际公开号No. 88/03168中有详细描述。

本发明公开了STF-1与Pbx结合，且该结合可增强促生长素抑制素和尽可能 的胰岛素的转录。STF-1与Pbx的结合需要五肽(FPWMK)。STF-1和Pbx仅仅协 同作用于能识别STF-1-Pbx异二聚体的亚型位点上。如下所示，STF-1的氨基酸 115-123需要有与Pbx的协同性。这就是说，由于突变的STF-1 cDNA不能与Pbx 协同作用，因此需要Pim。还显示了包括氨基酸残基145-153的STF-1同源异型 域的柔性N端臂(art)对于与Pbx的协同性是必需的。

为描述本发明的各种例子给出了下列实施例，它们不意味着以任何方式来限 制本发明。

实施例1

质粒构建物和蛋白质的表达

图3B中显示的STF-1缺失的构建物以前已有描述(20)。STF-1缺失的质粒 用聚合酶链反应(PCR)扩增过程来构建。用STF-1 cDNA作为模板，使跨过缺失 部分的有义寡核苷酸和与STF-1 cDNA 3′端对应的反义寡核苷酸培育。用Taq聚 合酶通过PCR扩增获得编码区内有合适缺失的STF-1 cDNA片段。用Promega TNT兔网织红细胞裂解物偶联转录/翻译系统根据生产商的方法制得Pbx1 cDNA(C.Murre所赠)和STF-1缺失突变型D1-70、D1-115、D1-139和D216- 284。在大肠杆菌中用细菌表达载体pGEX3X表达STF-1全长蛋白质和STF-1缺 失突变体hox140-215、1-140和110-215(见图3A)。重组蛋白质如前所述(14)进 行纯化；最初表达STF-1多肽作为融合蛋白，融合蛋白的N端含有谷胱甘肽-S- 转移酶(GST)。GST-STF-1多肽在谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂上用亲和层析从细菌 裂解物中纯化获得。然后纯化后的蛋白质可用谷胱甘肽(10mM)从树脂上洗脱下 来，或利用插入在GST和STF-1序列间的因子X断裂位点的蛋白裂解来获得。 重组的蛋白质用4μg因子Xa在室温下消化16小时来从谷胱甘肽-琼脂糖凝胶粒 上洗脱获得。

图5中描述的GST-融合蛋白也用pGEX3X载体在大肠杆菌中表达。编码鼠 Isl1同源异型域(12)(氨基酸176至248)、仓鼠cdx3同源异型域(6)(氨基酸143至 253)和STF-1同源异型域(氨基酸140至215)的序列用聚合酶链反应扩增并融合入 pGEX3X质粒的框架中。对于PBX相互作用基序-同源异型域融合蛋白，STF-1 编码序列的残基110-138(包括FPWMK基序)插入pGEX3X载体并与Isl1同源异 型域(氨基酸176至248)、cdx3同源异型域(氨基酸176至253)和STF-1同源异型 域(氨基酸140至215)的编码序列的上游框架连接。GST-融合蛋白如前所述(14) 表达和纯化，并用5mM减少量的谷胱甘肽从珠粒上洗脱下来。

实施例2

凝胶移位测定

凝胶移位测定用0.1ng的末端标记过的双链寡核苷酸(其序列表示在图2C中) 如前所述(20)进行。对于解离速率(off-rate)分析，TSEII探针首先在室温下与蛋白 质一起培育30分钟，然后加入1000倍过量的未标记过的TSEII寡核苷酸，并将 等份量在不同的时间点加样在凝胶上。在上移位测定(supershift assay)中，在加入 TSEII探针前，TU6核细胞抽提物在室温下预先用1μl Pbx(11)或STF-抗血清(20) 培育15分钟。Pbx抗血清不能区别Pbx家族内的成员(Pbx1，2，3)。

实施例3

特异性蛋白质DNA复合体C1、C2和C3

在胰肿瘤细胞系中，胰岛激素基因的促生长素抑制素和胰岛素表达与同源异 型框因子STF-1有关。STF-1通过与两种称为TSEI和TSEII的组织特异性调节 元件结合来调节Tu-6细胞中促生长素抑制素的表达(14)。在Tu-6粗核抽提物的 凝胶移位测定中，用32P-标记过的TSEII位点寡核苷酸探针可检测三种特异性蛋 白质DNA复合体，它们在这里称为复合体C1、复合体C2和复合体C3(图1A)。 复合体C1和C2只发现存在于胰岛细胞抽提物中，而复合体C3可在非胰岛细胞 系如Hela中检测到有相当水平。通过用Oct-1抗血清的“上移位测定”，表明复 合体C3含有遍在Oct-1蛋白。相反，通过测得复合体C1和C2对加入的STF-1 抗血清敏感表明复合体C1和C2含有STF-1蛋白。

在凝胶移位测定中，复合体C2随抽提物浓度呈指数型增长，而复合体C1 呈线性增长。重组的全长STF-1蛋白质产生一个迁移至复合体C1相同位置处的 复合体(图1A，泳道6)，这表明复合体C1只含有STF-1蛋白，而复合体C2是高 亲和性的异聚STF-1复合体。关于这一点，解离速率研究表明，与异聚的STF-1 复合体C2约15分钟的半衰期相比，复合体C1的半衰期小于1分钟(图1B)。

为确定复合体C2不与STF-1的同源二聚体型对应，在凝胶移位测定中用 TSEII探针测定增加浓度的重组STF-1蛋白(图1C)。在高含量的STF-1蛋白质下 没有发现有迁移较慢的复合体，这表明复合体C2一定含有能使STF-1与DNA的 结合大大稳定的其它蛋白质组分。

为证明该组分是普遍表达的，将Jurkat(或Hela)粗核抽提物加入含有重组 STF-1蛋白质的反应中。在这些条件下，很容易发现有复合体C2形成，且与加 入重组STF-1有关(图1C)。重建抽提物中的复合体C2的解离速率与Tu-6抽提物 中的相当(约15分钟)，这表明遍在因子使STF-1和TESII位点的结合稳定(图 1D)。

果蝇同源异型框蛋白(称为外小齿)与其它同源异型域蛋白协同结合到靶启动 子位点上(2，25)。下面测定复合体C2中是否含有哺乳动物同源外小齿(称为 Pbx)(23)。当将Pbx抗血清加入Tu-6粗核抽提物中，前者可特异性封闭复合体C2 的形成，但是该抗血清对只含STF-1的C1的形成没有影响(图2A，泳道2)。而 且，Pbx和重组STF-1蛋白的共同培育在凝胶移位测定中导致异聚C2复合体的 形成(图2B)。该Pbx-STF-1复合体的稳定性经解离速率测定，与Tu-6核抽提物 中的内源C2复合体相当(图2C)。

为测定Pbx能否与STF-1协同结合到TSEII外的其它STF-1靶位点上，用重 组STF-1和Pbx蛋白在促生长素抑制素TESI或胰岛素P和FLAT元件上进行凝 胶移位测定，与STF-1结合的位点和胰岛细胞所需的位点在胰细胞中分别限制了 鼠促生长素抑制素和胰岛素I基因的表达(图2D和图2E)。与TSEII元件相反(图 2D，泳道1-4)，在TSEI、P或FLAT元件上没有发现有异聚STF-1-Pbx复合体。 实际上，当TSEI、P或FLAT元件用于胰细胞粗抽提物的凝胶移位测定时，异 聚STF-1复合体也是不能被检测出的(数据未显示)(20)。

为测定STF-1和Pbx能否以协同方式刺激转录，用报道基因载体进行瞬时转 录，该载体含有两个拷贝的位于最小生长激素启动子上游的促生长素抑制素TSE II位点(图2F)。为优化转染的Pbx表达质粒的调控作用，采用了可表达与Pbx融 合的E2A激活域的E2A-Pbx载体(15)。当STF-1和E2a-Pbx分别转染入GC细胞 中时，它们对TSE II萤光素酶报道分子活性的影响可以忽略。然而，STF-1和 E2a-Pbx效应物质粒的共转染可显著提高TSE II报道分子的活性，这表明STF-1 实际上是与Pbx协同作用于TSE II位点上。相反，用含有胰岛素P元件(P-Luc) 的报道质粒没有发现有这种STF-1和E2A-Pbx间的协同性。由于P元件不能在 DNA结合测定中形成STF-1-Pbx异二聚体(图2D)，因此这些结果证明STF-1和 Pbx仅仅协同作用于可识别STF-1-Pbx异二聚体的位点亚型上。

为鉴别对Pbx-STF-1协同性重要的促生长素抑制素TESII元件的序列，构建 了几个突变TSEII寡核苷酸(图2D和图2E)。TSEII位点含有3个TAAT基序， 而其是同源异型域蛋白的主要识别基序。TAAT基序1或3的突变型(M1和M3， 正链)对STF-1和Pbx间协同结合的影响最小，但TAAT基序2(负链)完全清除了 Pbx-STF-1的协同性，这表明STF-1-Pbx复合体构成中那些特殊的TAAT基序是 重要的。第三个TAAT基序的突变型(M3)也影响STF-1单聚体C1复合体的形成。

为鉴别STF-1中促进与Pbx协同结合的残基，在凝胶移位测定中用TSEII探 针测定一系列截短的STF-1多肽(图3A和图3B)。C端至同源异型框区域的残基 缺失对与Pbx的协同结合性没有影响(D216-284突变型)。N端截短的缺少STF-1 转录激活区(trans-activation domain)的STF-1多肽(氨基酸1-115)也保留了结合到 TSEII位点上的协同性。但再缺失氨基酸115至123的残基将使其丧失Pbx协同 性，这表明STF-1同源异型域外的区域对于异二聚体的形成是重要的(图3A和图 3B)。实际上，STF-1的同源异型框区域(Hox140-215)在TSEII位点形成了单体复 合体，但不与Pbx协同结合。除STF-1同源异型域外还含有N端序列的STF-1多 肽(氨基酸110-215)表现出有Pbx协同性，这表明与STF-1同源异型框侧接的N 端残基可在与TSEII位点结合时与Pbx形成蛋白质-蛋白质接触。

在比较STF-1和果蝇的其它与外小齿(Pbx果蝇同源物)协同结合DNA的同源 异型域蛋白的过程中，注意到STF-1的该N端区(氨基酸115-123)有五肽基序 FPWMK，其在各种后生动物的许多同源异型蛋白质中是保守的(5)。为描述该肽 基序对于Pbx协同性的重要性，构建一个突变型STF-1 cDNA，其基序中的每个 残基均被氨基酸取代(FPWMK变为AAGGQ)(图3C)。在凝胶移位测定中与野生型 STF-1蛋白质比较，诱变的STF-1蛋白质没有与重组Pbx或来自Jurkat抽提物的 内源Pbx协同结合的能力(分别在图3D和图3E中)。相反，突变型STF-1蛋白质 在胰岛素P和FLAT元件上(不形成异二聚体复合体的位点处)显示出了野生型结 合活性。这些结果证明STF-1中与Pbx相互作用的基序(称为PBX相互作用基序 区或pim)实际上是Pbx协同性所必需的。

为测定PBX相互作用基序区对于Pbx协同性来说是否足够，测定该基序在 融合入异源的同源异型框蛋白中时赋予Pbx协同性的能力(图5B)。在凝胶移位测 定中，lim同源异型域蛋白Isl1可高亲和性地识别促生长素抑制素TSEII位点， 但是不能与Pbx异源二聚体化。很明显，Isl1同源异型框上游的PBX相互作用 基序区不能促进Pbx协同性。尾状因子cdx3含有与其同源异型域上游的基序 CEWMR对应的PBX相互作用基序。但是，同Isl1一样，cdx3不与Pbx异源二 聚体化；且在edx3同源异型域中加入PBX相互作用基序区不会促进Pbx协同性。 很明显，PBX相互作用基序区和同源异型框之间的间距与STF-1和PBX相互作 用基序-Isl1以及PBX相互作用基序-cdx3融合蛋白之间的间距是相当的，这表明 从同源异型框区域的间距不能解释它们的Pbx协同性丧失的原因。另外，嵌合蛋 白(PBX相互作用基序-Isl1，PBX相互作用基序-cdx3)可以以野生型亲和力与 DNA结合，这表明缺少协同性将不反映错误的折叠。综合考虑，这些结果表明， 尽管PBX相互作用基序区是与Pbx形成异二聚复合体所需的，但是STF-1同源 异型域中的其它残基是协同结合到促生长素抑制素TSE II位点上所需的。

为表征STF-1同源异型域中除PBX相互作用基序区外的残基对于Pbx协同 结合性在功能上是重要的，将cdx3同源异型域中的片段用STF-1的相应片段代 替(图6C)。用PBX相互作用基序-cdx3作为该实验的融合模板，测得STF-1的N 端臂减少了Pbx协同性，但是STF-1同源异型域的其它区域(helices 1，2或3)没有 显示出这种活性。这些结果证明了PBX相互作用基序和STF-1的N端臂是与Pbx 形成复合物所必需的。

Pbx的果蝇同源物外小齿对于生长时靶基因如无翅(wingless)、teashirt、 decapentaplegic的亚型的合适激活是必需的(24)。外小齿通过与不同的同源异型 蛋白质协同结合到DNA上来诱导这些靶基因(2，25)。本发明证明外小齿的人同 源物Pbx在促生长素抑制素TSEII元件上与STF-1形成了异二聚复合体。如凝胶 移位测定中所测得的该复合体的解离速率降低，STF-1-Pbx与单用STF-1比较是 高度稳定的。然而，重要的是应注意，这些结果没有区别均明显有与HOX蛋白 质协同结合的Pbx家族的不同成员(Pbx-1，2，3)。

促生长素抑制素TSEII位点上STF-1-Pbx异二聚体的形成需要五肽基序 (FPWMK)，而该基序在许多同源异型蛋白质中(不仅仅是脊椎动物，而且在果蝇 (5)和C.elegans)是保守的。因此，含有该基序的C.elegans同源异型蛋白质mab5 或lin-39可同样与蛋白质ceh-20(与Pbx有同源性)协同(1)。通过用人工靶序列来 诱导Pbx：hox异二聚体形成，Chang等人注意到该保守基序对于与Pbx协同结合 DNA的重要性(3)。这些结果表明，Pbx的作用不局限于hox复合体中的蛋白质， 也包括孤独同源异型框蛋白如STF-1。

尽管Chang等人发现保守的YPMWK基序与Hox A10的融合足以促进与Pbx 的协同性(3)，但是当该基序转移到胰岛细胞同源异型域蛋白如isl-1和cdx-3上 时，没有发现诱导出协同性。这些结果表明同源异型域本身的其它残基是STF- 1/Pbx复合体形成所需的。关于这一点，发现STF-1同源异型域的柔性N端臂(氨 基酸145-153)对于Pbx协同性是必需的。N端臂表现出赋予同源异型域蛋白如 Antennapedia功能同源性，尽管潜在机理仍是未知的(4；26)。结构研究揭示了N 端臂位于DNA的小沟处，在那里它提供了DNA结合或蛋白质-蛋白质相互作用 时的微小区别。尽管这些结果没有对这些模型作出区别，但是，它试图推测 STF-1/Pbx复合体的形成与N端臂形成同源性小沟接触部位的能力是部分有关 的。

STF-1-Pbx异二聚体的形成仅仅发生在潜在STF-1靶位点的亚型上。这些结 果表明，这一偏爱可能形成了胰岛细胞生长中靶部位的选择性基础。以前就注意 到，例如，在胰岛的不同细胞(分别为β和d)中，STF-1诱导胰岛素和促生长素抑 制素两者的表达。在β细胞中，STF-1可通过与螺旋环螺旋蛋白质E47协同作用 诱导胰岛素表达。相反，STF-1通过与Pbx协同结合到TSEII位点上来促进d细 胞中的表达。这些观察结果表明，帮助胰岛谱系中的细胞表达胰岛素或促生长素 抑制素都与E框与Pbx型蛋白结合的相对表达有关。

和这里对胰生长的预想一样，也描述了酵母中生长调控的组合机理。关于这 一点，同源异型域蛋白Mata2与二倍体/细胞中的Matal协同结合hsg操纵基因并 抑制单倍体特异性基因。但是在单倍体或细胞中，Mata2表现出与不同的激活物 MCM1协同，从而来激活不同的基因程序(9)。

使得Pbx和某些同源异型框蛋白质间能相互作用的保守基序的存在可部分解 释生长中该调控器的全局性作用。除了胰外，促生长素抑制素还在许多组织中如 脑、胃和髓甲状腺中表达。尽管在这些组织中能控制促生长素抑制素表达的因子 还未被证实，但是该结果表明这些蛋白质可通过与Pbx形成异二聚复合体来刺激 TSEII元件上促生长素抑制素的表达。

该领域技术人员应容易理解本发明能够实现所提到的以及潜在的目的、最终 产品和优点。本发明的实施例以及这里描述的方法、步骤、处理、分子和特定的 化合物是较佳实施例的代表，是典型的而不限制本发明的范围。该领域技术人员 可在有权利要求范围确定的本发明精神包括范围内作变化和其它应用。

                           发明背景

这里引用了下列文献：

1.Burglin T.R.等人，Nature Genet.1：319-320，1992.

2.Chan S.等人，Cell 78：603-615，1994.

3.Chang C.等人，Cenes&Dev.9：663-674，1995.

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25.van Dijk M.，等人，Cell78：616-624，1994.

26.zeng W.，等人，Development 118：339-352，1993.

本说明书中提及的任何专利或出版物表现出本发明所属领域技术人员的水 平。这些专利和出版物在这里以相同程度作引证参考，就如每个单独的出版物特 别单独结合入本发明作参考一样。

                             序列表 (1)一般信息：    (i)申请人：Montminy，Marc和Peers，Bernard    (ii)发明名称：刺激促生长素抑制素和胰岛素产生的化合物的筛选方法    (iii)序列数目：15    (iv)通信地址：

  (A)收信人：Sarah Brashears，MCGRGOR&ADLER，P.C.

  (B)街道：8011 Candle Lane

  (C)城市：Houston

  (D)州：Texas

  (E)国家：USA

  (F)邮编：77071    (v)计算机可读形式：

  (A)记录介质类型：软盘

  (B)计算机：Apple Macintosh

  (C)操作系统：Macintosh

  (D)软件：Microsoft Word for Macintosh    (vi)本申请资料：

  (A)申请号：

  (B)申请日：

  (C)分类：    (viii)律师/代理人信息：

  (A)姓名：Brashears，Sarah J.

  (B)登记号：38,087

  (C)参考/案卷号：D-5849    (ix)通讯信息：

  (A)电话：713-777-2321

  (B)传真：713-777-6908 (2)SEQ ID NO：1的信息：    (i)序列特征：

  (A)长度：22bp

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

  (H)细胞系：    (xi)序列描述：SEQ ID NO：1： GATCTCAGTA ATTAATCATG CA 22 (3)SEQ ID NO：2的信息：    (i)序列特征：

  (A)长度：22bp

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

  (H)细胞系：    (xi)序列描述：SEQ ID NO：2： AGTCATTAAT TAGTACGTCA TG  22 (4)SEQ ID NO：3的信息：    (i)序列特征：

  (A)长度：22

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

  (H)细胞系：    (xi)序列描述：SEQ ID NO：3： GATCTCAGC TATTAATCATG CA  22 (5)SEQ ID NO：4的信息：    (i)序列特征：

  (A)长度：22bp

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

  (H)细胞系：    (xi)序列描述：SEQ ID NO：4： AGTCGATAAT TAGTACCTCA TC 22 (6)SEQ ID NO：5的信息：    (i)序列特征：

  (A)长度：23

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

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  (A)长度：22

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

  (H)细胞系：    (xi)序列描述：SEQ ID NO：6： AGTCATTAAT ATGTACGTCA TG  22 (8)SEQ ID NO：7的信息：    (i)序列特征：

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  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

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  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

  (H)细胞系：    (xi)序列描述：SEQ ID NO：7： GATCTCAGTA ATTATACATG CA  22 (9)SEQ ID NO：8的信息：    (i)序列特征：

  (A)长度：22bp

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

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  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

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  (F)组织型：

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  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

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  (A)长度：25bp

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

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  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

  (H)细胞系：    (xi)序列描述：SEQ ID NO：11： GATCTTGCGA GGCTAATGGT GCG 23 (13)SEQ ID NO：12的信息：    (i)序列特征：

  (A)长度：23bp

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

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  (A)长度：28bp

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

  (H)细胞系：    (xi)序列描述：SEQ ID NO：13： GATCTTGTTA ATAATCTAAT TACCCTAG  28 (15)SEQ ID NO：14的信息：    (i)序列特征：

  (A)长度：27bp

  (B)类型：核酸

  (C)链型：双链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：其它核酸    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

  (H)细胞系：    (xi)序列描述：SEQ ID NO：14： AACAATTATT AGATTAATGG GATCCAT  27 (16)SEQ ID NO：15的信息：    (i)序列特征：

  (A)长度：5碱基

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型单链

  (D)拓扑结构：线性    (ii)分子类型：

  (A)描述：肽    (iii)假设：否    (iv)反义：否    (vi)最初来源：

  (B)菌株：

  (C)单独分离物：

  (D)发展阶段：

  (F)组织型：

  (G)细胞型：

  (H)细胞系：    (xi)序列描述：SEQ ID NO：15： Phe Pro Trp Met Lys  5