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复合体及其制备方法

阅读：1034发布：2020-05-22

专利汇可以提供复合体及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提出了一种复合体及其制备方法，该复合体包括：固相颗粒载体；桥联试剂，所述桥联试剂具有可自由旋转的空间结构；以及目标化合物，其中，桥联试剂分别与固相颗粒载体和目标化合物相连。本发明所提出的复合体及其制备方法，能够高效地将目标化合物固载在固相颗粒载体表面，并且能够保持被固定在颗粒表面的目标化合物的生物活性及功能，并增强目标化合物的识别活性。，下面是复合体及其制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种复合体，其特征在于，包括；
固相颗粒载体；
桥联试剂，所述桥联试剂具有可自由旋转的空间结构；以及
目标化合物，
其中，所述桥联试剂分别与所述固相颗粒载体和所述目标化合物相连。
2.根据权利要求1所述的复合体，其特征在于，所述桥联试剂是氯三嗪。
3.根据权利要求1所述的复合体，其特征在于，所述固相颗粒载体表面具有羟基或氨基的至少之一，
任选地，所述固相颗粒载体包括选自金颗粒载体、银颗粒载体、铂颗粒载体、二氧化硅颗粒载体、磁性颗粒载体的至少之一。
4.根据权利要求1所述的复合体，其特征在于，所述目标化合物具有羟基或氨基的至少之一，
任选地，所述目标化合物包括选自单糖、寡糖、多糖、还原糖、非还原糖、糖缀合物、醇类、氨基酸、蛋白质、有机胺的至少之一，
任选地，所述目标化合物包括选自甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖的至少之一。
5.根据权利要求1所述的复合体，所述桥联试剂通过-O-或-NH-与所述固相颗粒载体相连，所述桥联试剂通过-O-或-NH-与所述目标化合物相连。
6.一种复合体，其特征在于，包括：
金纳米颗粒，
氯三嗪，以及
糖，所述糖包括选自甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖的至少之一，其中，
所述氯三嗪通过-O-与所述金纳米颗粒相连，所述氯三嗪通过-O-与所述糖相连。
7.一种制备权利要求1～6任一项所述复合体的方法，其特征在于，包括:
使固相颗粒载体与桥联试剂接触，以便形成固相颗粒载体-桥联试剂复合物，所述桥联试剂具有可自由旋转的空间结构；以及
使所述固相颗粒载体-桥联试剂复合物与目标化合物接触，以便形成固相颗粒载体-桥联试剂-目标化合物复合体，
任选地，所述桥联试剂是氯三嗪。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述固相颗粒载体表面具有氨基和羟基的至少之一以及可衍生出负电荷的基团，
任选地，所述可衍生出负电荷的基团是羧基，
任选地，所述固相颗粒载体是金颗粒载体，所述羟基是通过利用巯基十一醇进行改性处理而形成的，所述羧基是通过利用巯基十一酸进行改性处理而形成的，
任选地，所述固相颗粒载体是二氧化硅颗粒载体，所述氨基是通过利用氨基硅烷化试剂进行改性处理而形成的，所述羧基是通过利用羧基硅烷化试剂进行改性处理而形成的。
9.一种制备糖基化金纳米颗粒复合体的方法，其特征在于，包括：
(1)50mL 0.01％的HAuCl4水溶液加热至沸腾后，向其中加入1mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续煮沸5min完成反应，合成平均粒径大小为13nm的柠檬酸保护的金纳米颗粒，并向柠檬酸保护的金纳米颗粒中加入浓度为0.1％的Tween-20；
(2)4mL的步骤(1)所得的金纳米颗粒-Tween-20溶液中加入50μL的巯基十一醇/巯基十一酸的乙醇溶液，所述巯基的总浓度为20mM，所述巯基十一醇和巯基十一酸的摩尔比为3:
1，室温下搅拌反应4h以上，在12000rpm转速下离心20min收集沉淀，沉淀重新分散于4mL水中，并用1M NaOH溶液将pH调至7.0～8.0，得金纳米颗粒-巯基十一醇/巯基十一酸分散液；
(3)向1mL步骤(2)所得金纳米颗粒-巯基十一醇/巯基十一酸分散液中加入1M的NaOH溶液，调节pH到9.0左右，冰浴搅拌并加入40μL的100mM氯三嗪-丙酮溶液，并用1M NaOH调节pH使之保持在8.0～9.0，反应1.5h；
(4)称取一定量的糖在搅拌条件下加入到步骤(3)所得混合液中，所述糖包括选自甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖的至少之一，所述糖的终浓度为55mM，反应温度为25摄氏度或室温，并用1M NaOH调节pH到8.0～9.0，搅拌反应8h以上，在12000rpm转速下离心20min收集沉淀，以便获得糖基化金纳米颗粒复合物。
10.权利要求1～6任一项所述复合体在分子可视化检测、糖分析和增强催化中的用途。

说明书全文

复合体及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分析化学领域，具体的，本发明涉及一种复合体及其制备方法。

背景技术

[0002] 颗粒分析是分析化学领域中很重要的一个领域，其中纳米颗粒因其体积小、比表面积大而具有独特的光学、磁学、电子学和力学等特性，已得到广泛的关注。纳米颗粒的表面修饰，即功能化是其得以进一步应用的基础。如贵金属纳米颗粒的局域表面等离子体共振吸收光谱会随着颗粒尺寸、形状、表面的介电性质及微环境等因素的不同而发生相应的改变，利用功能化纳米颗粒可实现分子的特异性可视化检测。利用纳米技术的检测方法成本低廉，操作简便，符合绿色化学，已被用来研究许多生物识别过程，包括细胞识别、酶催化过程、蛋白质相互作用、DNA杂交等。

[0003] 糖是自然界中最重要的生命物质之一。已有研究表明，细胞识别，包括免疫过程、代谢调控、生殖受精机制以及形态的发生、发育、癌变、衰老等，都与生物膜表面的糖链组成和结构密切相关。对于糖分子相互作用行为的研究，纳米颗粒是一个重要而独特的分析平台。糖基化的纳米颗粒已被广泛应用到生物分子的识别过程、糖类生物传感器制造、活细胞成像分析、疫苗的研究发展等诸多领域，在未来也有可能成为许多相关疾病诊断和治疗的手段。

[0004] 但是在纳米颗粒表面固载糖分子的方法非常有限，这主要是因为纳米颗粒在化学处理过程中不稳定、容易聚集，同时所固载糖分子的活性可能受到一定程度的损失，因而制备具有良好溶解性、稳定性，且功能保真的糖基化纳米颗粒仍是一个挑战。

发明内容

[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出一种普适通用、简便快捷、经济廉价、功能保真的糖基化纳米颗粒复合物的制备方法。

[0006] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种复合体。根据本发明的实施例，所述复合体包括：固相颗粒载体；桥联试剂，所述桥联试剂具有可自由旋转的空间结构；以及目标化合物，其中，所述桥联试剂分别与所述固相颗粒载体和所述目标化合物相连。本发明实施例的复合体中的桥联试剂具有可自由旋转的空间结构，能够方便的将未经任何化学修饰的天然分子，如糖分子固载在颗粒表面，从而颗粒表面上可自由旋转的空间结构能够赋予被固定的目标化合物一定的空间自由度，从而有利于“簇效应”的形成，从而能够保持被固定在颗粒表面的目标化合物的生物活性及功能，并增强其识别活性。根据本发明的实施例，本发明实施例的复合体具有溶解性高、稳定性高的特点。

[0007] 根据本发明的实施例，上述复合体还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一：

[0008] 根据本发明的实施例，所述桥联试剂是氯三嗪。氯三嗪具有可自由旋转的空间结构，能够方便的将未经任何化学修饰的天然分子，如糖分子固载在颗粒表面，从而颗粒表面上三嗪环结构的自由旋转的结构能够赋予被固定的目标化合物一定的空间自由度，从而有利于“簇效应”的形成，从而能够进一步保持被固定在颗粒表面的目标化合物的生物活性及功能，并进一步增强其高识别活性。

[0009] 根据本发明的实施例，所述固相颗粒载体表面具有羟基或氨基的至少之一。固相颗粒载体表面具有羟基或氨基可进一步有利于固相颗粒载体与桥联试剂相连。

[0010] 根据本发明的实施例，所述固相颗粒载体包括选自金颗粒载体、银颗粒载体、铂颗粒载体、二氧化硅颗粒载体、磁性颗粒载体的至少之一。上述颗粒载体表面可衍生羟基或氨基，进而可进一步有利于固相颗粒载体与桥联试剂相连；同时上述颗粒载体表面可衍生带电基团，以调节颗粒表面电荷，进而可避免颗粒衍生出羟基或氨基后发生聚集，进而可进一步提高本发明实施例复合体的溶解性和稳定性。

[0011] 根据本发明的实施例，所述目标化合物含有羟基或氨基的至少之一，进而可进一步有利于桥联试剂与目标化合物相连。

[0012] 根据本发明的实施例，所述目标化合物包括选自单糖、寡糖、多糖、还原糖、非还原糖、糖缀合物、醇类、氨基酸、蛋白质、有机胺的至少之一。上述目标化合物具有羟基或氨基，进而可进一步有利于桥联试剂与目标化合物相连。

[0013] 根据本发明的实施例，所述目标化合物包括选自甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖的至少之一。上述目标化合物具有羟基，进而可进一步有利于桥联试剂与目标化合物相连。

[0014] 根据本发明的实施例，所述桥联试剂通过-O-或-NH-与所述固相颗粒载体相连，所述桥联试剂通过-NH-或-O-与所述目标化合物相连。进而可进一步提高本发明实施例复合体的稳定性和溶解性。

[0015] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种复合体。根据本发明的实施例，所述复合体包括金纳米颗粒，氯三嗪，以及糖，所述糖包括选自甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖的至少之一，其中，所述氯三嗪通过-O-与所述金纳米颗粒相连，所述氯三嗪通过-O-与所述糖相连。上述复合体中的氯三嗪具有可自由旋转的空间结构，能够方便的将未经任何化学修饰糖固载在金纳米颗粒表面，从而颗粒表面上三嗪环结构的自由旋转能够赋予被固定的糖一定的空间自由度，从而有利于“糖簇效应”的形成，从而能够保持被固定在颗粒表面的糖的生物活性及功能，并增强其识别活性。另外，本发明实施例的复合体还具有溶解性高、稳定性高的特点。

[0016] 在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备前面所述复合体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使固相颗粒载体与桥联试剂接触，以便形成固相颗粒载体-桥联试剂复合物，所述桥联试剂具有可自由旋转的空间结构；以及使所述固相颗粒载体-桥联试剂复合物与目标化合物接触，以便形成固相颗粒载体-桥联试剂-目标化合物复合体。本发明实施例的制备前面所述复合体的方法反应条件温和、容易控制、简便快捷、环境友好、且经济廉价，且能够保持目标化合物的生物活性。相比于利用光化学试剂在纳米颗粒上固定非衍生糖，光化学试剂本身合成复杂且成本较高，本发明实施例的制备方法简便快捷且经济廉价。相比于在纳米颗粒表面引入羟胺和酰肼，纳米颗粒表面引入羟胺和酰肼仅适用于还原糖的固定并且不利于保持糖分子的生物活性，本发明实施例的制备方法可用于多种目标化合物的固载且能够保持目标化合物的生物活性和识别活性。

[0017] 根据本发明的实施例，上述制备前面所述复合体的方法还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一；

[0018] 根据本发明的实施例，所述桥联试剂是氯三嗪。氯三嗪可将未经任何化学修饰的天然分子固载在颗粒表面，表面上自由旋转的空间结构能够赋予被固定的化合物一定的空间自由度，从而能够保持被固定在颗粒表面的化合物的生物活性及功能，并增强其高识别活性。

[0019] 根据本发明的实施例，所述固相颗粒载体表面具有氨基和羟基的至少之一以及可衍生出负电荷的基团。固相颗粒载体表面具有氨基和羟基的至少之一，进而可进一步有利于固相颗粒载体与桥联试剂相连；同时上述颗粒载体表面具有可衍生出负电荷的基团，以调节颗粒表面电荷，进而可避免颗粒发生聚集，进而可进一步提高固相颗粒载体与桥联试剂的连接效率，进一步提高所制备的复合体的溶解性和稳定性。

[0020] 根据本发明的实施例，所述可衍生出负电荷的基团是羧基，羧基可衍生负电荷，进而可有效调节固相颗粒载体的表面电荷，进一步避免颗粒发生聚集，进而可进一步提高固相颗粒载体与桥联试剂的连接效率，进一步提高所制备的复合体的溶解性和稳定性。

[0021] 根据本发明的实施例，所述固相颗粒载体是金颗粒载体，所述羟基是通过利用巯基十一醇进行改性处理而形成的，所述羧基是通过利用巯基十一酸进行改性处理而形成的。巯基十一醇可有效在金颗粒载体表面衍生羟基，进而进一步与桥联试剂相连，进一步提高金颗粒载体与桥联试剂的连接效率。巯基十一酸可有效在金颗粒载体表面衍生羧基，进而可有效调节金颗粒载体的表面电荷，进一步避免颗粒发生聚集，进而可进一步提高金颗粒载体与桥联试剂的连接效率，进一步提高所制备的复合体的溶解性和稳定性。

[0022] 根据本发明的实施例，所述固相颗粒载体是二氧化硅颗粒载体，所述氨基是通过利用硅烷化试剂进行改性处理而形成的，所述羧基是通过利用羧基硅烷化试剂进行改性处理而形成的。硅烷化试剂可有效在二氧化硅颗粒载体表面衍生氨基，进而进一步与桥联试剂相连，进一步促进二氧化硅颗粒载体与桥联试剂的连接效率。羧基硅烷化试剂可有效在二氧化硅颗粒载体表面衍生羧基，进而可有效调节二氧化硅颗粒载体的表面电荷，进一步避免颗粒发生聚集，进而可进一步提高二氧化硅颗粒载体与桥联试剂的连接效率，进一步提高所制备的复合体的溶解性和稳定性。

[0023] 在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备糖基化金纳米颗粒复合体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)50mL 0.01％的HAuCl4水溶液加热至沸腾后，向其中加入1mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续煮沸5min完成反应，合成平均粒径大小为13nm的柠檬酸保护的金纳米颗粒，并向柠檬酸保护的金纳米颗粒中加入浓度为0.1％的Tween-20；(2)
4mL的步骤(1)所得的金纳米颗粒-Tween-20溶液中加入50μL的巯基十一醇/巯基十一酸的乙醇溶液，所述巯基的总浓度为20mM，所述巯基十一醇和巯基十一酸的摩尔比为3:1，室温下搅拌反应4h以上，在12000rpm转速下离心20min收集沉淀，沉淀重新分散于4mL水中，并用
1M NaOH溶液将pH调至7.0～8.0，得金纳米颗粒-巯基十一醇/巯基十一酸分散液；(3)向1mL步骤(2)所得金纳米颗粒-巯基十一醇/巯基十一酸分散液中加入1M的NaOH溶液，调节pH到
9.0左右，冰浴搅拌并加入40μL的100mM氯三嗪-丙酮溶液，并用1M NaOH调节pH使之保持在
8.0～9.0，反应1.5h；(4)称取一定量的糖在搅拌条件下加入到步骤(3)所得混合液中，所述糖包括选自甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖的至少之一，所述糖的终浓度为55mM，反应温度为25摄氏度或室温，并用1M NaOH调节pH到8.0～9.0，搅拌反应8h以上，在12000rpm转速下离心20min收集沉淀，以便获得糖基化金纳米颗粒复合物。上述制备糖基化金纳米颗粒复合体的方法反应条件温和、容易控制、简便快捷、环境友好、经济廉价，糖未经任何化学修饰，上述方法能够保持所连接糖的生物活性和功能。

[0024] 在本发明的第五方面，本发明提出了前面所述复合体在分子可视化检测、糖分析和增强催化中的用途。所述复合体上的目标化合物物能够同任何与目标化合物发生相互作用的分子相互作用，进而可有效用于分子的可视化检测、糖分析、增强催化等。根据本发明的具体实施例，本发明实施例的糖基化金纳米颗粒复合体可与任何所固载的糖分子发生相互作用的蛋白质(如凝集素)或其它生物活性分子相互作用，进而实现了糖分子-蛋白质相互作用的可视化检测。附图说明

[0025] 图1是根据本发明实施例的制备复合体的方法示意图；

[0026] 图2是根据本发明实施例的制备糖基化金纳米颗粒复合体的方法示意图，[0027] 其中，1表示金纳米颗粒修饰MUOH/MUA,

[0028] 2表示金纳米颗粒修饰CC,

[0029] 3表示是金纳米颗粒修饰糖；

[0030] 图3是根据本发明实施例的制备糖基化金纳米颗粒过程中所得产物的紫外可见吸收响应图；

[0031] 图4是根据本发明实施例的MUOH/MUA比例对糖基化金纳米颗粒复合体的影响；

[0032] 图5是根据本发明实施例的糖基化金纳米颗粒与凝集素相互作用示意图；

[0033] 图6是根据本发明实施例的甘露糖糖基化金纳米颗粒与凝集素相互作用的紫外可见吸收响应图；

[0034] 图7是根据本发明实施例的糖基化金纳米颗粒的合成及相互作用的SEM表征图；

[0035] 其中，图a表示GNP-Tween20的SEM表征，

[0036] 图b表示GNP-MUOH/MUA的SEM表征，

[0037] 图c表示GNP-mannose的SEM表征，

[0038] 图d表示GNP-mannose与ConA相互作用的SEM表征；

[0039] 图8是根据本发明实施例的葡萄糖糖基化金纳米颗粒与凝集素相互作用的紫外可见吸收响应图；

[0040] 图9是根据本发明实施例的果糖糖基化金纳米颗粒与凝集素相互作用的紫外可见吸收响应图；

[0041] 图10是根据本发明实施例的半乳糖糖基化金纳米颗粒与凝集素相互作用的紫外可见吸收响应图；

[0042] 图11是根据本发明实施例的麦芽糖糖基化金纳米颗粒与凝集素相互作用的紫外可见吸收响应图；

[0043] 图12是根据本发明实施例的海藻糖糖基化金纳米颗粒与凝集素相互作用的紫外可见吸收响应图；

[0044] 图13是根据本发明实施例的纤维二糖糖基化金纳米颗粒与凝集素相互作用的紫外可见吸收响应图；

[0045] 图14是根据本发明实施例的蔗糖糖基化金纳米颗粒与凝集素相互作用的紫外可见吸收响应图；

[0046] 图15是根据本发明实施例的乳糖糖基化金纳米颗粒与凝集素相互作用的紫外可见吸收响应图；

[0047] 图16是根据本发明实施例的乳糖糖基化金纳米颗粒与PNA相互作用的紫外可见吸收响应图；以及

[0048] 图17是根据本发明实施例的二氧化硅颗粒表面固载氨基酸的方法示意图。

具体实施方式

[0049] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0050] 复合体

[0051] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种复合体。根据本发明的实施例，该复合体包括：固相颗粒载体；桥联试剂，所述桥联试剂具有可自由旋转的空间结构；以及目标化合物，其中，桥联试剂分别与固相颗粒载体和目标化合物相连。本发明实施例的复合体中的桥联试剂具有可自由旋转的空间结构，能够方便的将未经任何化学修饰的天然分子，如糖分子固载在颗粒表面，从而颗粒表面上可自由旋转的空间结构能够赋予被固定的目标化合物一定的空间自由度，从而有利于“簇效应”的形成，从而能够保持被固定在颗粒表面的目标化合物的生物活性及功能，并增强其识别活性。

[0052] 根据本发明的实施例，所采用的桥联试剂并不受特别限制，桥联试剂具有可自由旋转的空间结构，并且桥联试剂可与固相颗粒载体和目标化合物有效连接即可。根据本发明的实施例，可以采用的桥联试剂包括但不限于氯三嗪，氯三嗪的结构如式I所示，[0053]

[0054] 氯三嗪可将未经任何化学修饰的天然分子固载在颗粒表面，表面上自由旋转的空间结构能够赋予被固定的化合物一定的空间自由度，从而能够保持被固定在颗粒表面的化合物的生物活性及功能，并增强其高识别活性。桥联试剂氯三嗪具有一个六元芳香杂环结构，在1,3,5-三个碳原子上分别连有一个氯原子。三嗪环上的三个氯原子能够在不同温度下被亲核试剂(如羟基或氨基)分步取代，能够方便地将未经任何化学修饰的天然分子固载在颗粒表面，表面上三嗪环结构的自由旋转能够赋予被固定的化合物一定的空间自由度，从而有利于“簇效应”的形成，从而能够保持被固定在颗粒表面的化合物的生物活性及功能，并增强其高识别活性。

[0055] 另外，根据本发明的实施例，固相颗粒载体表面具有羟基或氨基的至少之一。根据本发明的具体实施例，羟基或氨基可有效取代本发明实施例的氯三嗪中的氯离子，从而实现固相颗粒载体与本发明实施例的氯三嗪有效连接，从而，固相颗粒载体表面具有羟基或氨基可进一步有利于固相颗粒载体与桥联试剂相连。

[0056] 根据本发明的实施例，固相颗粒载体的材质和尺寸不受特别限制，只要能够在固相颗粒载体表面衍生羟基或氨基即可。根据本发明实施例，固相颗粒载体的材质包括但不限于选自金、银、铂、二氧化硅、磁性材料的至少之一，固相颗粒的尺寸包括但不限于选自微米颗粒和纳米颗粒的至少之一。上述颗粒载体表面可衍生羟基或氨基，进而可进一步有利于固相颗粒载体与桥联试剂相连；同时上述颗粒载体表面可衍生带电基团，以调节颗粒表面电荷，进而可避免颗粒衍生出羟基或氨基后发生聚集，进而可进一步提高本发明实施例复合体的溶解性和稳定性。

[0057] 另外，根据本发明的实施例，目标化合物具有羟基或氨基的至少之一。根据本发明的具体实施例，羟基或氨基可有效取代本发明实施例的氯三嗪中的氯离子，从而实现目标化合物与本发明实施例的氯三嗪有效连接，从而，目标化合物具有羟基或氨基可进一步有利于目标化合物与桥联试剂相连。

[0058] 根据本发明的实施例，目标化合物可以是任何能与桥联试剂反应的物质，包括选自单糖、寡糖、多糖、还原糖、非还原糖、糖缀合物、醇类等含羟基的化合物以及氨基酸、蛋白质、有机胺等含氨基的化合物。上述目标化合物具有羟基或氨基，进而可进一步有利于桥联试剂与目标化合物相连。

[0059] 根据本发明的具体实施例，上述目标化合物中的糖类化合物可包括但不限于甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖的至少之一，上述单糖和双糖可在未经任何化学修饰的情况下与桥联试剂有效连接。

[0060] 根据本发明的实施例，所述桥联试剂通过-O-或-NH-与所述固相颗粒载体相连，所述桥联试剂通过-O-或-NH-与所述目标化合物相连，进而可进一步提高本发明实施例复合体的稳定性和溶解性。

[0061] 根据本发明的具体实施例，本发明提出了一种糖基化金纳米颗粒复合体。根据本发明的实施例，该复合体包括金纳米颗粒，氯三嗪，以及糖，所述糖包括选自甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖的至少之一，其中，氯三嗪通过-O-与所述金纳米颗粒相连，氯三嗪通过-O-与所述糖相连。以甘露糖为例，该糖基化金纳米颗粒复合体结构如式II所示，

[0062]

[0063] 该糖基化金纳米颗粒复合体中的氯三嗪具有可自由旋转的空间结构，能够方便的将未经任何化学修饰糖固载在颗粒表面，从而颗粒表面上三嗪环结构的自由旋转能够赋予被固定的糖一定的空间自由度，从而有利于“糖簇效应”的形成，从而能够保持被固定在颗粒表面的糖的生物活性及功能，并增强其识别活性，同时该复合体具有溶解性高、稳定性高的特点。

[0064] 制备方法

[0065] 在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备前面所述复合体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使固相颗粒载体与桥联试剂接触，以便形成固相颗粒载体-桥联试剂复合物，所述桥联试剂具有可自由旋转的空间结构；以及使所述固相颗粒载体-桥联试剂复合物与目标化合物接触，以便形成固相颗粒载体-桥联试剂-目标化合物复合体。本发明实施例的制备前面所述复合体的方法反应条件温和、容易控制、简便快捷、环境友好、经济廉价、固载效率高，且能够保持目标化合物的生物活性。相比于利用光化学试剂在纳米颗粒上固定非衍生糖，光化学试剂本身合成复杂且成本较高，本发明实施例的制备方法简便快捷且经济廉价。相比于在纳米颗粒表面引入羟胺和酰肼，纳米颗粒表面引入羟胺和酰肼仅适用于还原糖的固定并且不利于保持糖分子的生物活性，本发明实施例的制备方法可用于多种目标化合物的固载且能够保持目标化合物的生物活性和识别活性。

[0066] 根据本发明的另外一个实施例，本发明实施例的制备前面所述复合体的方法也可以包括：使固相颗粒载体与桥联试剂、目标化合物同时接触，以便形成固相颗粒载体-桥联试剂-目标化合物复合体。

[0067] 如前所述，所采用的桥联试剂并不受特别限制，所述桥联试剂具有可自由旋转的空间结构，并且桥联试剂可与固相颗粒载体和目标化合物有效连接即可。根据本发明的实施，可以采用的桥联试剂包括但不限于氯三嗪。根据本发明的实施例，本发明实施例的制备前面所述复合物的方法，充分利用了桥联试剂氯三嗪中三个氯原子可在不同温度下与羟基或氨基发生分步反应和三嗪环可自由旋转的特点。根据本发明的一个实施例，具体为在低温弱碱性条件下(0摄氏度，pH 8.0～9.0)，氯三嗪(CC)通过一个氯原子与固相颗粒载体表面上衍生的羟基共价反应，固定到颗粒表面，再在室温弱碱性条件(25摄氏度，pH 8.0～9.0)下通过CC的第二个氯原子与待固载的目标化合物，如糖类化合物(通过羟基或氨基)共价反应；或者在低温弱碱性条件下(0摄氏度，pH 8.0～9.0)CC通过一个氯原子与固相颗粒载体表面上衍生的氨基共价反应，固定到颗粒表面，再在室温弱碱性条件下(25摄氏度，pH
8.0～9.0)通过CC的第二个氯原子与待固载的目标化合物，如糖类化合物(通过氨基)共价反应。从而将目标化合物，如糖类化合物固载在颗粒载体表面，并且能够非常好地保持目标化合物的生物活性及功能。上述制备复合体的方法示意图如图1所示,其中表示固相颗粒载体。

[0068] 另外，根据本发明的实施例，固相颗粒载体表面具有氨基和羟基的至少之一以及可衍生出负电荷的基团。固相颗粒载体表面具有氨基和羟基的至少之一，进而可进一步有利于固相颗粒载体与桥联试剂相连；同时上述颗粒载体表面具有可衍生出负电荷的基团，以调节颗粒表面电荷，进而可避免颗粒发生聚集，进而可进一步提高固相颗粒载体与桥联试剂的连接效率，进一步提高所制备的复合体的溶解性和稳定性。

[0069] 根据本发明的实施例，可衍生出负电荷的基团包括但不限于是羧基，羧基可衍生负电荷，进而可有效调节固相颗粒载体的表面电荷，进一步避免颗粒发生聚集，进而可进一步提高固相颗粒载体与桥联试剂的连接效率，进一步提高所制备的复合体的溶解性和稳定性。

[0070] 另外，固相颗粒载体表面衍生羟基或氨基或羧基所用的相关试剂本领域技术人员可以根据实验室条件和实验需要选择，根据本发明的一个具体实施例，本发明实施例的固相颗粒载体是金颗粒载体时，羟基是通过利用巯基十一醇进行改性处理而形成的，羧基是通过利用巯基十一酸进行改性处理而形成的，巯基十一醇可有效在金颗粒载体表面衍生羟基，进而进一步与桥联试剂相连，进一步促进金颗粒载体与桥联试剂的连接效率；巯基十一酸可有效在金颗粒载体表面衍生羧基，进而可有效调节金颗粒载体的表面电荷，进一步避免颗粒发生聚集，进而可进一步提高金颗粒载体与桥联试剂的连接效率，进一步提高所制备的复合体的溶解性和稳定性。根据本发明的另一个具体实施例，本发明实施例的固相颗粒载体是二氧化硅颗粒载体时，氨基是通过利用氨基硅烷化试剂进行改性处理而形成的，羧基是通过利用羧基硅烷化试剂进行改性处理而形成的。所采用的氨基硅烷化试剂不受特别限制，能在二氧化硅颗粒载体表面衍生氨基即可。根据本发明的实施例，采用的氨基硅烷化试剂包括但不限于氨丙基三甲氧基硅烷，氨丙基三甲氧基硅烷可有效在二氧化硅颗粒载体表面衍生氨基，进而进一步与桥联试剂相连，进一步促进二氧化硅颗粒载体与桥联试剂的连接效率；所采用的羧基硅烷化试剂不受特别限制，能在二氧化硅颗粒载体表面衍生羧基即可，根据本发明的实施例，采用的羧基硅烷化试剂包括但不限于羧基硅烷聚乙二醇(silane-PEG-COOH)，羧基硅烷聚乙二醇可有效在二氧化硅颗粒载体表面衍生羧基，进而可有效调节二氧化硅颗粒载体的表面电荷，进一步避免颗粒发生聚集，进而可进一步提高二氧化硅颗粒载体与桥联试剂的连接效率，进一步提高所制备的复合体的溶解性和稳定性。

[0071] 根据本发明的另外一些实施例，在固相颗粒载体表面衍生羟基或氨基以及相应的带电基团时，如在金颗粒载体衍生羟基和羧基时，考虑到空间利用率及空间布局，所用巯基十一醇(MUOH)和巯基十一酸(MUA)的摩尔比应在1:1～5:1，优选3:1。

[0072] 具体地，在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备糖基化金纳米颗粒复合体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)50mL 0.01％的HAuCl4水溶液加热至沸腾后，向其中加入1mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续煮沸5min完成反应，合成平均粒径大小为13nm的柠檬酸保护的金纳米颗粒，并向柠檬酸保护的金纳米颗粒中加入浓度为0.1％的Tween-20(Tween-20有利于金纳米颗粒的稳定)；(2)4mL的步骤(1)所得的金纳米颗粒-Tween-20溶液中加入50μL的巯基十一醇/巯基十一酸的乙醇溶液，所述巯基的总浓度为
20mM，所述巯基十一醇和巯基十一酸的摩尔比为3:1，室温下搅拌反应4h以上，在12000rpm转速下离心20min收集沉淀，沉淀重新分散于4mL水中，并用1M NaOH溶液将pH调至7.0～
8.0，得金纳米颗粒-巯基十一醇/巯基十一酸分散液；(3)向1mL步骤(2)所得金纳米颗粒-巯基十一醇/巯基十一酸分散液中加入1M的NaOH溶液，调节pH到9.0左右，冰浴搅拌并加入40μL的100mM氯三嗪-丙酮溶液，并用1M NaOH调节pH使之保持在8.0～9.0，反应1.5h；(4)称取一定量的糖在搅拌条件下加入到步骤(3)所得混合液中，糖的终浓度为55mM，反应温度为25摄氏度或室温，并用1M NaOH调节pH到8.0～9.0，搅拌反应8h以上，在12000rpm转速下离心
20min收集沉淀，以便获得糖基化金纳米颗粒复合物，根据本发明的具体实施例，发明人通过上述方法，成功地将糖甘露糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖通过氯三嗪连接到金纳米颗粒的载体上。上述制备糖基化金纳米颗粒复合体的方法反应条件温和、容易控制、简便快捷、环境友好、经济廉价、固载效率高，所连接的糖未经任何化学修饰，上述方能够保持所连接糖的生物活性和功能。

[0073] 复合体在分子可视化检测、糖分析和增强催化中的用途

[0074] 在本发明的第五方面，本发明提出了前面所述复合体在分子可视化检测和增强催化中的用途。所述复合体上的目标化合物物能够同任何与目标化合物发生相互作用的分子相互作用，进而可有效用于分子的可视化检测、糖分析和增强催化等。根据本发明的具体实施例，本发明实施例的糖基化金纳米颗粒复合体可与任何所固载的糖分子发生相互作用的蛋白质(如凝集素)或其它生物活性分子相互作用，进而实现了糖分子-蛋白质相互作用的可视化检测。

[0075] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0076] 实施例1

[0077] 本实施例以金纳米颗粒载体表面衍生羟基并固载甘露糖为例(固载过程如图2所示)，具体描述复合体的制备步骤：

[0078] 一、糖基化金纳米颗粒复合体的制备

[0079] 1、金纳米颗粒(Gold nanoparticles,GNP)的合成

[0080] 金纳米颗粒可购买或合成。本实施例所用金纳米颗粒为发明人自己合成，具体步骤如下：

[0081] 50mL 0.01％的HAuCl4水溶液加热至沸腾后，在剧烈搅拌下向其中加入1mL 1％的柠檬酸钠溶液。溶液约25s后变蓝，约70s后变成亮红色。继续将溶液煮沸5min完成反应，以合成平均粒径大小为13nm的柠檬酸保护的金纳米颗粒。合成的GNP的紫外可见吸收响应图如图3所示及GNP的SEM图如图7(a)所示。继续向上述柠檬酸保护的金纳米颗粒中加入浓度约0.1％的Tween-20后，该步结果中其(GNP-Tween 20)紫外吸收峰位置与柠檬酸保护的金纳米颗粒(GNP)无任何区别,结果如图3所示，表明颗粒十分稳定。

[0082] 2、GNP表面羟基基团的衍生

[0083] 本实施例采用巯基十一醇(MUOH)在金纳米颗粒表面衍生出羟基，为避免发生聚集，在MUOH中混合巯基十一酸(MUA)，以同时衍生带电基团调节纳米颗粒表面电荷，衍生过程如图2所示。两种基团的比例需要针对性调节，在本实施例中，考察了MUOH/MUA混合物比例分别为1:1、3:1、5:1、8:1时对金纳米颗粒的影响，考察结果如图4所示。可见，随着比例升高，金纳米颗粒的分散性变差。发明人考率到空间利用率及空间布局，优选MUOH/MUA混合物比例为3:1。

[0084] 具体操作步骤为：在4mL的GNP-Tween-20溶液中加入50μL的MUOH/MUA的乙醇溶液(溶液中巯基的总浓度为20mM，二者比例为3:1)，室温(25℃)搅拌4h以上。离心(12000rpm，20min)收集沉淀。进而沉淀重新分散于4mL水中，并加入少许1M NaOH溶液将pH调至7.0～
8.0，在弱碱性条件下该溶液呈酒红色，符合颗粒稳定分散的特征。其合成结果中GNP-MUOH/MUA(3:1)的紫外吸收光谱如图4所示，及SEM图如图7(b)所示。

[0085] 3、GNP与CC的反应

[0086] 取1mL上述GNP-MUOH/MUA分散液，用1M的NaOH溶液调节pH到9.0左右，冰浴搅拌下分批加入40μL的CC-丙酮溶液(100mM)，并用1M NaOH调节pH使之保持在8.0～9.0(弱碱性)。整个反应持续1.5h。该步合成结果中GNP-CC的紫外可见吸收光谱如图3所示，由此可见，其吸收峰有较大的红移，证明固载成功，这与CC的疏水性及结构有关。

[0087] 4、GNP上非衍生糖的固载

[0088] 本实施例以甘露糖(mannose)为例，称取一定量的甘露糖于搅拌下加入到上述反应液中(保证糖溶液的终浓度为55mM)，水浴控温25℃，或保持室温。用1M NaOH调节pH到8.0～9.0。搅拌8h以上。离心(12000rpm，20min)收集沉淀。将该颗粒用超纯水清洗三次。最后将沉淀重新分散于水中，并将溶液的pH调节到7.0～8.0。其合成结果中GNP-mannose的紫外可见吸收光谱如图3所示及SEM图如图7(c)所示。从图3中可以看到GNP-mannose相比较于GNP-CC的紫外吸收峰位置有一定的蓝移，这与糖分子是亲水性分子相关。上述过程也适用于其它糖基在纳米颗粒表面的固载。

[0089] 二、活性鉴定与分析应用

[0090] 为证明步骤一所制备的糖基化金纳米颗粒具有生物活性，将其与伴刀豆凝集素(Con A)进行相互作用考察(如图5所示)，基于紫外可见吸收光谱的检测及肉眼观察，实现了糖基化金纳米颗粒生物活性的鉴定，其操作方法如下：

[0091] 1、糖基化金纳米颗粒的表面封闭处理

[0092] 为降低与凝集素作用时的非特异性吸附，需先封闭糖基化金纳米颗粒表面的羧基。本实施例采用乙醇胺(EOA)封闭，具体为：向GNP-mannose水溶液中加入50mM的碳二亚胺(EDC)和25mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，观察到溶液很快变成蓝紫色，室温静置20min后，离心(12000rpm，20min)收集沉淀。将沉淀重新分散于封闭试剂100mM的EOA水溶液中(pH 8.6)，室温静置1h后，离心清洗金纳米颗粒三次。将沉淀重新分散于水溶液中，制成EOA-GNP-mannose溶液。其封闭结果中GNP-mannose的紫外可见吸收响应图如图6所示，紫外吸收峰无明显的红移或蓝移现象，证明颗粒的分散性良好。

[0093] 2、糖基化金纳米颗粒同ConA相互作用

[0094] 利用25mM的Tris-HCl缓冲溶液(含有1mM的CaCl2、1mM的MnCl2、及0.1％的Tween-20)配置Con A溶液。将此凝集素溶液加入到上述制备的EOA-GNP-mannose溶液中，并保证溶液中Con A的终浓度为200nM。于室温(25℃)下静置孵育0.5h，之后可直接用于肉眼观察或利用紫外可见吸收检测。溶液若出现变色现象或沉淀，则证明所合成的糖基化纳米颗粒具有生物活性，GNP-mannose+Con A组分的紫外可见吸收响应图如图6所示，结果可见GNP-mannose+Con A紫外吸收峰出现了很明显的红移，最大吸收红移到553nm附近，说明纳米颗粒发生明显聚集，该结果也可从图7(d)的SEM表征和图6照片中的离心管c通过肉眼(纳米颗粒溶液变成明显的蓝紫色)观察到。与此同时，作为对比的GNP-mannose+Tris组分，无论从紫外吸收峰的位置，溶液颜色及聚集状态观察，均没有明显变化。由此可以说明；Con A与糖的识别可导致糖基化纳米颗粒的聚集，所合成糖基化纳米颗粒具有生物活性，并可用于凝集素的分析。

[0095] 实施例2

[0096] 另外，发明人在金纳米颗粒载体表面衍生羟基并成功固载了葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、乳糖，固载过程如实施例1所述，所形成的糖基化金纳米颗粒同Con或PNA(花生凝集素)相互作用的紫外可见吸收响应如图8～16所示，结果可见所形成的糖基化金纳米颗粒同Con或PNA相互作用后，其紫外吸收峰出现了很明显的红移，说明纳米颗粒发生明显聚集。

[0097] 实施例3

[0098] 以二氧化硅颗粒表面衍生氨基(同理可根据需要衍生羟基基团)固载氨基酸(AA)为例(固载过程如图17所示)，具体制备复合体的实施步骤如下所述：

[0099] 1、二氧化硅颗粒的合成

[0100] 二氧化硅颗粒可购买或合成。本实施例为发明人自己合成，具体合成过程如下：通过Stober-Fink-Bohn方法，无乳化剂聚合合成单分散性二氧化硅颗粒。将73.8mL乙醇,10.8mL水和9.8mL氨水(28％)在圆底烧瓶中混合，于25℃恒温水浴中充分搅拌得混合物。然后将5.6mL正硅酸乙酯迅速加入至混合物中。反应12h后，得到粒径500nm的二氧化硅颗粒。
乙醇离心洗涤胶体悬浮液4次，然后用水离心(10000rpm，20min)洗涤直至胶体悬浮液的pH变为7.0左右。其它粒径的二氧化硅颗粒可通过改变反应物的量和温度获得。

[0101] 2、二氧化硅颗粒的表面氨基化

[0102] 在剧烈搅拌下向上述所合成颗粒中加入16mmol氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，1mL(28％)氨水和10mL超纯水。其中各组分的最终浓度分别为APTMS(0.02M)，氨水(0.02M)，水(0.8M)，乙醇(16.7M)。所得颗粒分别用乙醇和水离心清洗3～4次。

[0103] 3、二氧化硅颗粒表面固载AA

[0104] 将已氨基化的二氧化硅颗粒，NaOH(48mg,1.2mmol)溶解于6mL水中，待此溶液冷却至0℃后将其加入到预冷于冰水浴中的1.5mL CC(111mg,600μmol)的丙酮溶液中。在0℃搅拌反应1.5h后，将4.2mL AA标准品溶液加入反应体系。将此反应溶液升温至25℃，并在此温度下保持8h以实现AA的固载。最后，将所得颗粒用水离心(10000rpm，20min)清洗3～4次。固载过程相关反应如图17所示。

[0105] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

[0106] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

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