一种手性分子的识别方法
阅读：3发布：2020-11-14
专利汇可以提供一种手性分子的识别方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于分析检测技术领域，具体涉及一种 手性 分子的识别方法。该方法利用酶促反应体系介导纳米 复合体 的形成与否来识别手性分子。酶促反应体系可介导 碳 点-贵金属 纳米粒子 复合体原位生成并形成FRET体系，进而通过比色- 荧光 双模式实现手性分子的识别。本发明无需对纳米粒子进行表面修饰，操作简单，响应速度快。，下面是一种手性分子的识别方法专利的具体信息内容。
1.一种手性分子的识别方法，其特征在于，利用酶促反应体系介导纳米复合体的形成与否来识别手性分子。
2.根据权利要求1所述的一种手性分子的识别方法，其特征在于，所述纳米复合体为碳纳米复合体。
3.根据权利要求1所述的一种手性分子的识别方法，其特征在于，所述纳米复合体以碳点和贵金属盐为原料生成。
4.根据权利要求3所述的一种手性分子的识别方法，其特征在于，所述碳点掺杂有能与贵金属发生螯合作用的元素，所述元素为硫、氮、氧、砷或锡中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的一种手性分子的识别方法，其特征在于，所述碳点的前驱体为柠檬酸、柠檬酸铵、乙二胺、尿素、豆浆、蜡烛灰、大蒜、乙二胺四乙酸二钠、壳聚糖、硫代硫酸钠盐、甲苯磺酸钠、硫酸、D-半胱氨酸、L-半胱氨酸或N-乙酰-L-半胱氨酸中的一种或多种。
6.根据权利要求3～5任一项所述的一种手性分子的识别方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将碳点与贵金属盐混合，形成碳点贵金属盐混合溶液；
步骤2：将手性分子作为底物和酶混合形成酶促反应体系；
步骤3：将酶促反应体系加到碳点贵金属盐混合溶液中，形成检测液，根据检测液的紫外吸收峰和荧光强度变化识别手性分子。
7.根据权利要求6所述的一种手性分子的识别方法，其特征在于，所述酶具有立体异构专一性，能特异性催化所述底物产生还原性产物。
8.根据权利要求6所述的一种手性分子的识别方法，其特征在于，所述酶为葡萄糖氧化酶、L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-古洛糖酸内酯氧化酶、D-甘露醇氧化酶、D-天冬氨酸氧化酶、L-谷氨酸氧化酶、D-谷氨酸氧化酶、L-精氨酸氧化酶、D-乳酸脱氢酶、L-乳酸脱氢酶、L-抗坏血酸氧化酶、S-扁桃酸脱氢酶、R-扁桃酸脱氢酶、L-乙醇脱氢酶、L-亮氨酸脱氢酶、D-苹果酸脱氢酶、D-松醇脱氢酶、L-乙二醇脱氢酶或D-苏糖醇脱氢酶中的一种。
9.根据权利要求6所述的一种手性分子的识别方法，其特征在于，所述底物为葡萄糖、古洛糖酸内酯、甘露醇、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、乳酸、扁桃酸、亮氨酸、苹果酸或苏糖醇中的一种。
一种手性分子的识别方法
技术领域
[0001] 本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种手性分子的识别方法。
背景技术
[0002] 手性分子识别在生命科学、药物研究、食品、材料等领域起着重要的作用。当前主要的手性识别方法有高效液相色谱、圆二色谱、核磁共振、毛细管电泳等，这些方法依赖的设备昂贵、样品前处理复杂、难以实现实时分析。因此，寻找一种成本低廉、响应速度快、灵敏度高且能实时检测的手性分子识别方法一直是研究的热点。近年来，纳米材料，像半导体量子点与贵金属纳米粒子等，因成本低廉、光学性能好、高灵敏、可实现在线分析等特点，在手性分子识别领域得到广泛关注。现存的基于纳米粒子的手性化学传感器主要有：①荧光手性传感器，多以半导体量子点作为信号响应元件（Cuiping Han,Haibing Li. Small, 2008, 4(9): 1344-1350.），然而量子点含有重金属元素镉、铅等，极大地限制了其应用；而碳点用于手性分子识别的报道相对较少；②贵金属比色传感器（Min Zhang, Bangce Ye. Anal. Chem. 2011, 83(5):1504-1509.），利用表面离子共振能频率对粒子之间的距离高灵敏性，呈现不同的颜色变化，从而实现手性分子识别的目的。该方法直观、廉价、无需借助任何仪器；③电化学传感器（Qiao Xia, Yihan Huang,et al. Biochemical Engineering Journal,2016, 113:1-6.），将手性识别元件修饰在玻碳电极表面，借助循环伏安电流或圆二色信号识别手性分子。
[0003] 然而，这些传感器的构建通常需借助各种表面修饰手段将手性选择剂修饰在纳米粒子表面以形成手性复合物。目前常用的表面修饰方法主要为化学交联。该策略操作复杂需进一步纯化、影响纳米粒子稳定性并降低表面锚定分子的生物学活性等，因此，发展一种生物兼容性好、响应速度快、简单易操作、无需复杂修饰的手性识别方法是避免上述问题的有效途径。
发明内容
[0004] 本发明目的在于克服现有技术的不足，提出了一种手性分子的识别方法，该方法利用酶促反应体系介导纳米复合体的形成与否，并通过荧光和紫外光谱的双模式信号输出，实现手性分子识别。该方法响应速度快、操作简单、无需复杂的修饰步骤、能够实时监测。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供一种手性分子的识别方法，该方法利用酶促反应体系介导纳米复合体的形成与否来识别手性分子。
[0006] 优选地，所述纳米复合体为碳纳米复合体。
[0007] 优选地，所述纳米复合体以碳点和贵金属盐为原料生成。
[0009] 更为优选地，所述元素为硫。
[0010] 优选地，所述碳点的前驱体为柠檬酸、柠檬酸铵、乙二胺、尿素、豆浆、蜡烛灰、大蒜、乙二胺四乙酸二钠、壳聚糖、硫代硫酸钠盐、甲苯磺酸钠、硫酸、D-半胱氨酸、L-半胱氨酸或N-乙酰-L-半胱氨酸中的一种或多种。
[0011] 更为优选地，所述前驱体为L-半胱氨酸。
[0012] 所述一种手性分子的识别方法，包括以下具体步骤：步骤1：将碳点与贵金属盐混合，形成碳点贵金属盐混合溶液；
步骤2：将手性分子作为底物和酶混合形成酶促反应体系；
步骤3：将酶促反应体系加到碳点贵金属盐混合溶液中，形成检测液，根据检测液的紫外吸收峰和荧光强度变化识别手性分子。
步骤2：将手性分子作为底物和酶混合形成酶促反应体系；
步骤3：将酶促反应体系加到碳点贵金属盐混合溶液中，形成检测液，根据检测液的紫外吸收峰和荧光强度变化识别手性分子。
[0013] 当紫外检测有吸收峰，荧光强度较对照下降时，所述底物的构型为所述酶特异性识别的构型，所述酶促反应体系介导碳点和贵金属盐生成碳点-贵金属纳米粒子复合体；当紫外检测无吸收峰，荧光强度较对照相比几乎无变化时，所述底物为不能被酶特异性催化的构型，酶促反应体系不能介导碳点-贵金属纳米粒子复合体形成；所述对照为未加入酶促反应体系的碳点贵金属盐混合溶液。
[0014] 进一步地，所述酶具有立体异构专一性，能特异性催化所述底物产生还原性产物。
[0015] 优选地，所述酶为葡萄糖氧化酶、L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-古洛糖酸内酯氧化酶、D-甘露醇氧化酶、D-天冬氨酸氧化酶、L-谷氨酸氧化酶、D-谷氨酸氧化酶、L-精氨酸氧化酶、D-乳酸脱氢酶、L-乳酸脱氢酶、L-抗坏血酸氧化酶、S-扁桃酸脱氢酶、R-扁桃酸脱氢酶、L-乙醇脱氢酶、L-亮氨酸脱氢酶、D-苹果酸脱氢酶、D-松醇脱氢酶、L-乙二醇脱氢酶或D-苏糖醇脱氢酶中的一种。
[0016] 优选地，所述底物为葡萄糖、古洛糖酸内酯、甘露醇、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、乳酸、扁桃酸、亮氨酸、苹果酸或苏糖醇中的一种。
[0017] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：1、本发明选用的荧光碳纳米材料价格低廉、光学性能优异、生物兼容性良好。
[0018] 2、本发明利用一步合成的硫和/或氮掺杂的碳点作为构筑元件，加入贵金属盐，借助酶促反应体系，实现手性异构体的识别，操作简便，生物兼容性较好。
[0019] 3、本发明中酶促反应体系可介导碳点-贵金属纳米粒子复合体原位生成，并形成FRET（荧光能量共振转移）体系，进而通过比色-荧光双模式实现手性分子的识别。本发明方法无需对纳米粒子进行表面修饰，操作简单，响应速度快。附图说明
[0020] 图1为实施例1中过氧化氢介导的碳点-金纳米粒子复合体构建的原理图。
[0021] 图2为实施例1中碳点、氯金酸、柠檬酸钠混合溶液加入过氧化氢后可见光下显色图，左边为对照，右边为过氧化氢实验组。
[0022] 图3为实施例1中碳点、氯金酸、柠檬酸钠混合溶液加入过氧化氢后紫外响应图。
[0023] 图4为实施例1中碳点、氯金酸、柠檬酸钠混合溶液加入过氧化氢后荧光响应图。
[0024] 图5为实施例1中过氧化氢加入前碳点的电镜图。
[0025] 图6为实施例1中过氧化氢加入后碳点-金纳米粒子复合物的电镜图。
[0026] 图7为实施例2中葡萄糖氧化酶酶促反应体系介导的碳点-金纳米粒子的构建及手性识别的原理图。
[0027] 图8为实施例2中D-葡萄糖及L-葡萄糖的手性识别显色图；左边为D-葡萄糖，右边为L-葡萄糖。
[0028] 图9为实施例2中D-葡萄糖及L-葡萄糖的手性识别紫外响应图。
[0029] 图10为实施例2中D-葡萄糖及L-葡萄糖的手性识别荧光响应图。
[0030] 图1和图7中，C-dots为碳点，the C-dots quenched为荧光淬灭的碳点，Au NPs为金纳米粒子，C-dots@Au NPs complex为碳点-金纳米粒子复合体。
具体实施方式
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032] 实施例1过氧化氢介导碳点-金纳米粒子复合体的构建包括以下步骤：
步骤1.1：以D-半胱氨酸和柠檬酸为碳点的前驱体，采用水热法，180℃下反应1h合成硫、氮共掺杂的碳点；
步骤1.2：向9.8 mL超纯水中，加入0.138mg/mL的碳点50μL、1%柠檬酸钠25μL，磁力搅拌器搅拌5min，再加入2%的氯金酸16.5μL，磁力搅拌器搅拌5min，得到碳点、氯金酸、柠檬酸钠混合溶液，然后将22μL的1×10-3M过氧化氢加入到上述混合溶液中，对照则加入22μL的超纯水；室温磁力搅拌10～15 min，检测紫外吸收峰及荧光强度的变化。
步骤1.1：以D-半胱氨酸和柠檬酸为碳点的前驱体，采用水热法，180℃下反应1h合成硫、氮共掺杂的碳点；
步骤1.2：向9.8 mL超纯水中，加入0.138mg/mL的碳点50μL、1%柠檬酸钠25μL，磁力搅拌器搅拌5min，再加入2%的氯金酸16.5μL，磁力搅拌器搅拌5min，得到碳点、氯金酸、柠檬酸钠混合溶液，然后将22μL的1×10-3M过氧化氢加入到上述混合溶液中，对照则加入22μL的超纯水；室温磁力搅拌10～15 min，检测紫外吸收峰及荧光强度的变化。
[0033] 结果显示：紫外检测：与对照组相比，有过氧化氢加入的体系，520nm左右处有紫外吸收峰出现，表示有金纳米粒子的生成；
荧光检测：与对照组相比，有过氧化氢加入的体系，荧光强度显著下降，原因：金纳米粒子由于FRET作用淬灭了碳点的荧光。
荧光检测：与对照组相比，有过氧化氢加入的体系，荧光强度显著下降，原因：金纳米粒子由于FRET作用淬灭了碳点的荧光。
[0034] 实施例2葡萄糖氧化酶酶促反应介导的葡萄糖手性识别包括以下步骤：
步骤2.1：以L-半胱氨酸及柠檬酸为碳点前驱体，采用水热法，180℃下反应1h合成硫、氮共掺杂的碳点；
步骤2.2：向9.8 mL超纯水中，加入0.138mg/mL的碳点50μL、1%柠檬酸钠25μL，磁力搅拌器搅拌5min，再加入2%的氯金酸16.5μL，磁力搅拌器搅拌5min，得碳点氯金酸混合溶液；
步骤2.3：酶促反应体系包括：pH 6.0的100 mM PBS 溶液95μL，新鲜配制的1×10-2M的D-葡萄糖与L-葡萄糖溶液各100μL作为底物，5U/μL的葡萄糖氧化酶5μL，充分混匀，37℃反应10min，得酶促反应体系；
步骤2.4：将酶促反应体系加到步骤2.2所得的碳点氯金酸混合溶液中，形成检测液，对照为在所述的碳点氯金酸混合溶液中加入200μL超纯水，37℃条件下快速搅拌30 min。在可见光下：底物为D-葡萄糖时，检测液颜色呈淡紫色，而底物为L-葡萄糖时，检测液无颜色变化，如图8所示。检测紫外吸收峰及荧光强度变化，结果如图9～10所示：紫外检测时，当底物为D-葡萄糖时，约500 nm处有新的吸收峰出现，原因为葡萄糖氧化酶特异性识别D-葡萄糖，将D-葡萄糖氧化生成葡萄糖酸与过氧化氢，过氧化氢进而还原氯金酸为金纳米粒子；当底物为L-葡萄糖时，紫外吸收较对照组几乎无变化。荧光检测时，底物为D-葡萄糖的反应组，相较于对照在426 nm处的荧光强度下降明显，其可能的机制为基于碳点和金纳米粒子的荧光共振能量转移体系的形成，淬灭了碳点的荧光；而底物为L-葡萄糖的反应组，荧光淬灭不明显。
步骤2.1：以L-半胱氨酸及柠檬酸为碳点前驱体，采用水热法，180℃下反应1h合成硫、氮共掺杂的碳点；
步骤2.2：向9.8 mL超纯水中，加入0.138mg/mL的碳点50μL、1%柠檬酸钠25μL，磁力搅拌器搅拌5min，再加入2%的氯金酸16.5μL，磁力搅拌器搅拌5min，得碳点氯金酸混合溶液；
步骤2.3：酶促反应体系包括：pH 6.0的100 mM PBS 溶液95μL，新鲜配制的1×10-2M的D-葡萄糖与L-葡萄糖溶液各100μL作为底物，5U/μL的葡萄糖氧化酶5μL，充分混匀，37℃反应10min，得酶促反应体系；
步骤2.4：将酶促反应体系加到步骤2.2所得的碳点氯金酸混合溶液中，形成检测液，对照为在所述的碳点氯金酸混合溶液中加入200μL超纯水，37℃条件下快速搅拌30 min。在可见光下：底物为D-葡萄糖时，检测液颜色呈淡紫色，而底物为L-葡萄糖时，检测液无颜色变化，如图8所示。检测紫外吸收峰及荧光强度变化，结果如图9～10所示：紫外检测时，当底物为D-葡萄糖时，约500 nm处有新的吸收峰出现，原因为葡萄糖氧化酶特异性识别D-葡萄糖，将D-葡萄糖氧化生成葡萄糖酸与过氧化氢，过氧化氢进而还原氯金酸为金纳米粒子；当底物为L-葡萄糖时，紫外吸收较对照组几乎无变化。荧光检测时，底物为D-葡萄糖的反应组，相较于对照在426 nm处的荧光强度下降明显，其可能的机制为基于碳点和金纳米粒子的荧光共振能量转移体系的形成，淬灭了碳点的荧光；而底物为L-葡萄糖的反应组，荧光淬灭不明显。
[0035] 实施例3 亮氨酸脱氢酶介导的亮氨酸的手性识别包括以下步骤：
步骤3.1：以豆浆为原料，采用水热法，200℃下反应1h合成氮掺杂的碳点；
步骤3.2：向9.8 mL超纯水中，加入0.138mg/mL的碳点50μL、1%柠檬酸钠25μL，磁力搅拌器搅拌5min，再加入2%的氯金酸16.5μL，磁力搅拌器搅拌5min，得碳点氯金酸混合溶液；
步骤3.3：酶促反应体系包括：pH 10.3的100 mM PBS 溶液 95μL，新鲜配制的1×10-3 M的L-亮氨酸与D-亮氨酸溶液各100 μL作为底物，5U/μL的亮氨酸脱氢酶5μL，充分混匀，37℃反应15min，得酶促反应体系；
步骤3.4：将酶促反应体系加入步骤3.2所得的碳点氯金酸混合溶液中，形成检测液，对照为在所述碳点氯金酸混合溶液中加入200μL超纯水，37℃条件下快速搅拌25～30min。检测紫外吸收峰及荧光强度变化。
步骤3.1：以豆浆为原料，采用水热法，200℃下反应1h合成氮掺杂的碳点；
步骤3.2：向9.8 mL超纯水中，加入0.138mg/mL的碳点50μL、1%柠檬酸钠25μL，磁力搅拌器搅拌5min，再加入2%的氯金酸16.5μL，磁力搅拌器搅拌5min，得碳点氯金酸混合溶液；
步骤3.3：酶促反应体系包括：pH 10.3的100 mM PBS 溶液 95μL，新鲜配制的1×10-3 M的L-亮氨酸与D-亮氨酸溶液各100 μL作为底物，5U/μL的亮氨酸脱氢酶5μL，充分混匀，37℃反应15min，得酶促反应体系；
步骤3.4：将酶促反应体系加入步骤3.2所得的碳点氯金酸混合溶液中，形成检测液，对照为在所述碳点氯金酸混合溶液中加入200μL超纯水，37℃条件下快速搅拌25～30min。检测紫外吸收峰及荧光强度变化。
[0036] 当底物为L-亮氨酸时，亮氨酸脱氢酶特异性识别L-亮氨酸并催化其生成还原型辅酶Ⅰ，还原型辅酶Ⅰ进而还原氯金酸为金纳米粒子，碳点-金纳米粒子复合物形成，因此紫外检测时有与金纳米粒子表面等离子共振吸收峰一致的新的紫外吸收峰出现。
[0037] 当底物为D-亮氨酸时，亮氨酸脱氢酶不能催化其产生还原型辅酶Ⅰ，金纳米粒子不能生成，故紫外吸收峰较对照而言，几乎无变化。
[0038] 荧光检测：L-亮氨酸为底物的酶促反应体系对碳点的荧光淬灭程度明显，而底物为D-亮氨酸时，荧光淬灭不明显。
[0039] 实施例4 L-乳酸脱氢酶介导的乳酸手性识别包括以下步骤：
步骤4.1：以N-乙酰-L-半胱氨酸和柠檬酸为碳点前驱体，采用水热法，180℃下反应1h合成硫、氮共掺杂的碳点；
步骤4.2：向9.8 mL超纯水中，加入0.138mg/mL的碳点50μL、1%柠檬酸钠25μL，磁力搅拌器搅拌5min，再加入2%的氯金酸16.5μL，磁力搅拌器搅拌5min，得碳点氯金酸混合溶液；
步骤4.3：酶促反应体系包括：pH 8.0的100 mM PBS 溶液 95μL，新鲜配制的1×10-3M的D-乳酸与L-乳酸溶液各100μL作为底物，5U/μL 的L-乳酸脱氢酶 5μL，充分混匀，37℃反应10min，得酶促反应体系；
步骤4.4：将酶促反应体系分别加入步骤4.2所得的碳点氯金酸混合溶液中，形成检测液，对照为在所述的碳点氯金酸混合溶液中加入200μL超纯水，37℃条件下快速搅拌30min。
检测紫外吸收峰与荧光强度变化。
步骤4.1：以N-乙酰-L-半胱氨酸和柠檬酸为碳点前驱体，采用水热法，180℃下反应1h合成硫、氮共掺杂的碳点；
步骤4.2：向9.8 mL超纯水中，加入0.138mg/mL的碳点50μL、1%柠檬酸钠25μL，磁力搅拌器搅拌5min，再加入2%的氯金酸16.5μL，磁力搅拌器搅拌5min，得碳点氯金酸混合溶液；
步骤4.3：酶促反应体系包括：pH 8.0的100 mM PBS 溶液 95μL，新鲜配制的1×10-3M的D-乳酸与L-乳酸溶液各100μL作为底物，5U/μL 的L-乳酸脱氢酶 5μL，充分混匀，37℃反应10min，得酶促反应体系；
步骤4.4：将酶促反应体系分别加入步骤4.2所得的碳点氯金酸混合溶液中，形成检测液，对照为在所述的碳点氯金酸混合溶液中加入200μL超纯水，37℃条件下快速搅拌30min。
检测紫外吸收峰与荧光强度变化。
[0040] 当底物为L-乳酸时，L-乳酸脱氢酶特异性识别L-乳酸，将L-乳酸氧化生成丙酮酸酯与还原性辅酶Ⅰ，还原性辅酶Ⅰ进而还原氯金酸为金纳米粒子，碳点-金纳米粒子复合物形成。紫外检测时，有代表金纳米粒子生成的新的紫外吸收峰出现。
[0041] 当底物为D-乳酸时，L-乳酸脱氢酶对其无催化反应，故无金纳米粒子生成，紫外检测时，无新的吸收峰出现。
[0042] 荧光检测：L-乳酸为底物的酶促反应体系对碳点的淬灭效应较D-乳酸为底物的酶促反应体系明显。
[0043] 以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
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