技术领域：

本发明涉及生物医学技术领域检测方法，是一种用于人体外自身抗体定量检测的放射 配体(纳米磁颗粒)定量分析方法即一种人体外自身抗体放射免疫定量检测方法

背景技术：

自身抗体是指抗自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。人体的生长、发育和生存 有完整的自身免疫耐受机制的维持，正常的免疫反应有保护性防御作用，即对自身组织、 成分不发生免疫反应。一旦自身耐受的完整性遭到破坏，则机体视自身组织、成分为“异 物”，而发生自身免疫反应，产生自身抗体。正常人体血液中可以有低滴度的自身抗体， 但不会发生疾病。但如果自身抗体的滴度超过某一水平，就可能对身体产生损伤，诱发疾 病。自身抗体的产生可能是致病抗原(细菌、病毒等)与自身成分之间存在某些相同的分子 结构：出现了与自身抗原发生交叉反应的免疫应答；也可能是某些感染因素使自身抗原变 性，免疫系统对这些暴露的新抗原产生自身抗体。一些特定自身抗体的定量检测对于许多 疾病的诊断、预防、治疗及疗效评价具有十分重要的意义。

下面以谷氨酸脱羧酶自身抗体为例做具体说明，谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase，GAD)是人及动物体内抑制神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的合成酶，γ- 氨基丁酸有GAD65与GAD67两种形式的同工酶。糖尿病是现代疾病中危害仅次于癌症的 第二杀手，1型糖尿病是遗传易感个体通过自身抗原介导的免疫反应所引起胰岛β细胞破 坏的自身免疫性疾病，GAD65是此免疫反应关键的始动靶抗原，因此GAD65-Ab是糖尿病 前期个体较特异的免疫指标。由于大多数糖尿病患者的死因来自于疾病的长期并发症和后 遗症，而在糖尿病明确诊断以前，患者的并发症其实早已经开始，80％～90％的胰岛β细 胞功能丧失，此时各种免疫干预措施均难以奏效，因此防治工作的关键在于早期诊断。所 以应用适当的诊断标准进行早期诊断对糖尿病的预防和控制以及对其并发症的治疗具有 十分重大的意义。总之，定量检测GAD65自身抗体对临床糖尿病的早期诊断、分型及药物 治疗效果的观察具有十分重要的价值。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种自身抗体放射免疫定量检测方法：建立人血清中自身抗体 的快速、准确的定量检测技术平台，可用于多种自身抗体的定量检测。用谷氨酸脱羧酶 Glutamic acid decarboxylase，GAD65自身抗体放射免疫定量检测方法建立举例说明，

本方法将放射免疫分析(Radioimmunoassay RIA)定量检测技术与纳米磁颗粒配 体技术相结合，是一种基于配体检测原理的直接检测方法，其核心在于巧妙地利用SPA能 与人和小鼠体内的免疫球蛋白IgG的FC结合位点发生反应的共同特性，用自创SPA包被 纳米磁颗粒配体技术建立自身抗体的配体免疫定量分析方法。下面以GAD65自身抗体 (GAD65-Ab)的定量检测为例作具体说明。

首先将蛋白A包被于纳米磁颗粒表面，利用高亲和力、高特异性的单克隆抗体配制标 准品(用以建立标准曲线)，用相对过量的标记抗原*GAD65(高度纯化的125I-GAD65)分 别与标准品中的GAD65单克隆抗体及血清样品中的GAD65自身抗体结合形成免疫复合体 (GAD65-Ab)-*GAD65。在包被于纳米磁性颗粒表面的蛋白A的参与作用下，形成三明治式 复合体系，原因是蛋白A会被(GAD65-Ab)-*GAD65免疫复合体的Fc部分结合。其中蛋白 A部分包被于纳米磁性颗粒表面上，从而形成一个固相，以磁板进行固液相分离，吸去包 含未结合标记物的上清液并洗珠后，直接用γ-计数器检测放射强度(CPM)，根据标准 品的CPM值建立标准曲线，可从标准曲线上查出病人GAD65自身抗体的浓度值。

样品或标准品中GAD65-Ab浓度越高则标记物特异性结合越多，因此所检测到的放射 性强度也越强，即放射强度(CPM)是与GAD65-Ab浓度成正比的。在样品中没有GAD65-Ab 情况下无免疫体系形成，因为标记物仅结合GAD65-Ab，而不结合蛋白A。

本方法中作为标准品的单克隆抗体与血清样品中的自身抗体并不进入同一反应体系， 只是利用了它们具有与SPA特异结合的共性进行对照，因此不会发生交叉反应，所以检测 效果具有特异性强、灵敏度及准确度高等优点，且不会出现假阴性或假阳性现象。

本方法包括以下步骤：

(一)试剂盒组成成分：

GAD65-Ab放射免疫配体定量分析诊断试剂盒主要组分为：标记物(125I-GAD65)，标 准品(GAD65单抗)，配体试剂(SPA-纳米磁颗粒)，洗涤液。

(二)试剂盒各组分的制备：

1、标记抗原的制备：采用乳过氧化物酶法标记技术制备125I-GAD65，使其放化纯度达到 95％以上。

2、特异性单克隆抗体的制备：用GAD65抗原免疫小鼠，通过细胞融合杂交瘤技术制备 GAD65单克隆抗体(GAD65-Ab)，作为绘制参照曲线的标准品。

3、葡萄球菌蛋白A(SPA)-纳米磁颗粒的制备：将SPA通过碳二亚胺包被于有机硅烷化磁 性纳米粒子表面，作为进行固液分离的配体试剂。

(二)GAD65-Ab放射配体(纳米磁颗粒)定量分析方法及临床检测标准的建立。

1、建立人血清中GAD65-Ab的放射配体(纳米磁颗粒)定量分析方法，并制定试剂盒的实验 操作方法及质量控制标准。

2、经大量临床试验结果显示，用本项目完成的试剂盒测定受检者血清中GAD65-Ab的含量， 用以判断糖尿病的诊断及分型，其临床符合率≥95％。因此，本试剂盒的GAD65-Ab临床 测定值，可为糖尿病早期诊断及其正确分型，早期干预治疗、正确用药及疗效评价提供可 靠依据。

附图说明

图1是放化纯度图

图2是结合率图

具体实施方式：

本方法的内容，通过以下实施例作具体说明：

GAD65自身抗体化学发光配体(纳米磁颗粒)定量分析方法的建立

(一)试剂盒各组分的制备：

1、标记抗原(125I-GAD65)的制备

(1)采用改进的乳过氧化物酶法标记技术制备125I-GAD65：

称GAD6510～50μg溶于PH6.5磷酸缓冲液50～200μl中，加入Na125I 1～8mCi、乳过 氧化物酶溶液40～150ng(10～50μl)、过氧化氢(H2O2)400～800ng(50～100μl)，37℃ 温育中，滴加H2O2400～800ng(50～100μl)，5～10分钟内完成，再继续反应2～5分钟 后，加入0.5～2.0ml 20mmol/L巯基乙醇30～60秒以终止反应，反应液迅速转移到预先用 PH6.5～7.5磷酸缓冲液平衡的Sephadex G50或Sephadex G25柱上层析分离，以平衡液洗 脱，自动收集，用γ-计数器检测放射强度。收集第一峰。以纸层析法鉴定125I-谷氨酸脱 羧酶(GAD65)的放化纯度，以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定125I-谷氨酸脱羧酶(GAD65)的化学纯 度。

(2)放化纯度的测定

放化纯度指在标记物中结合在抗原上的放射性活度占该标记物总放射性活度的百分 比。我们采用两种方法进行鉴定：

a、纸层析法鉴定

1)将1cm×12cm滤纸浸于1％KI溶液中过夜备用。

2)使用前将浸过的滤纸吹干，并按每1cm距离用铅笔标出。

3)将待鉴定的标记物5μL～10μL点样于距端点1cm处，晾干。

4)将已点样的滤纸条放于层析缸内，然后加展开剂。展开剂为正丁醇∶乙醇∶氨水∶水 ＝20∶1∶0.5∶1。层析时间为2小时。

5)展开后将滤纸取出并吹干，然后按每1cm距离剪开，并分段进行计数。以每段的cpm 为纵坐标，分段纸条的序号为横坐标作图。近原点的第一峰为标记抗原峰。

参见图1

6)按下列公式计算放化纯度：

$=\frac{1285740\left(\mathrm{cpm}\right)}{1306471\left(\mathrm{cpm}\right)}\times 100\%=98.41\%\left(\mathrm{cpm}\right)$

b、游离碘检查法

检查方法如下：取0.1mL收集液，加入1％载体蛋白溶液和5％三氯乙酸(TCA)4.8mL， 立即出现白色沉淀，静置数小时，4000rpm下离心10min，分别测上清液和沉淀部分的放 射性强度：

$=\frac{751\left(\mathrm{cpm}\right)}{63760+751\left(\mathrm{cpm}\right)}\times 100\%=1.16\%\left(\mathrm{cpm}\right)$

2、GAD65单克隆抗体的制备及性能检测：

(1)抗原提纯与动物免疫：

谷氨酸脱羧酶(GAD65)加完全福氏佐剂并经充分乳化，选择与所用骨髓瘤细胞同源的 BALB/c健康小鼠进行动物免疫。末次免疫后3～4天，分离融合后的脾细胞。

(2)骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备

采用Sp2/0骨髓瘤细胞株进行培养，在融合前先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作 适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2×105/ml，次日一般 即为对数生长期细胞。采用小鼠腹腔细胞为饲养细胞(feedercell)。

(3)细胞融合

将骨髓瘤细胞与脾细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG， 消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。

(4)有限稀释法筛选阳性细胞株

筛选阳性株选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释 后，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化， 然后进行抗原特异的ELISA测定，选择高分泌特异性细胞株进行扩大培养或冻存。下面是 其中一个杂交瘤融合板的ELISA筛选结果，阳性克隆用蓝色斜体字体表示，H12 为阳性对照。

一个典型的杂交瘤融合板的ELISA筛选结果

  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   A   0.368   1.53   1.24   1.806   2.537   1.634   2.604   2.404   0.668   2.563   0.092   2.382   B   1.918   1.733   0.082   2.186   2.361   0.071   1.446   0.77   2.413   0.915   1.603   0.732   C   2.326   0.077   2.209   2.105   0.082   0.784   0.989   1.97   0.784   1.399   0.906   1.771   D   1.101   1.911   0.455   0.288   1.26   2.111   0.6   1.59   1.381   0.785   1.334   1.523   E   2.327   0.779   1.679   0.605   0.075   1.439   0.547   0.7   1.664   1.687   1.508   2.217   F   2.432   1.848   2.457   2.675   0.694   1.358   0.871   0.741   2.524   2.906   0.803   1.660   G   0.245   2.759   0.864   1.406   0.074   2.442   1.64   1.917   1186   2.181   0.083   2.227   H   1.028   2.964   1.033   2.829   1.205   2.193   0.08   0.587   2.45   1.617   2.818   3.043

(5)单克隆抗体的制备和冻存

抗体制备采用小鼠腹腔接种法，选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠进行腹腔注射。通常 在接种一周后即有明显的腹水产生。选出阳性细胞株并及早冻存。

(6)单克隆抗体的纯化

用葡萄球菌A亲和层析柱纯化单克隆抗体，回收率达90％以上。洗脱液中的抗体浓度 用紫外光吸收法粗测。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液，以保持纯化 抗体的活性。

(7)单克隆抗体的性能检测

我们对单克隆抗体的滴度、纯度及特异性和亲和力等进行了全面鉴定，其主 要技术指标如下：

GAD65单克隆抗体的主要技术指标

  ELISA滴度(于1.0mg/ml)   1∶105   检测灵敏度   ＜5.0pg/ml   交叉反应率   ＜0.1％   亲和常数   4.97×1010M-1

滴度检测：以GAD65为检测抗原，通过间接ELISA测定抗体滴度，其滴度(于 1.0mg/ml)＝1∶105。

纯度检测：经提取纯化后用非还原SDS-PAGE法检测单抗纯度，结果在160kD左右 有一条清晰的条谱带，经蛋白A亲和层析其纯度达95％以上。

特异性：抗GAD65单抗的特异性良好，不与人血清白蛋白结合反应，来自ANA、DNA 以及风湿因子的干扰很小，交叉反应率＜0.1％。

亲和力检测：根据Beatty等人所建立的方法，以5、2.5、1.25和0.625μg/ml 4个浓度 GAD65稀释液依次包被微孔板，通过作图法取其最大OD值一半(即OD的50％)处对应的抗 体浓度。代入公式K＝(n-1)/2(nAb’-Ab)计算亲和常数，式中Ab和Ab’分别表示当抗原浓 度为Ag和Ag’时，产生半数吸光值的抗体浓度(mol/L)，n＝Ag/Ag’。求其平均数得亲和常 K＝4.97×1010M-1。

3、SPA-纳米磁颗粒的制备：

(1)SPA-纳米磁颗粒的制备：我们对纳米磁颗粒与SPA的反应比例进行了一系列探讨 试验。具体制备方法如下：

①取5～10mg有机硅烷化磁性粒子，用重蒸水洗1-2次；

②用0.01～0.5mol/L pH5.6-6.2的PBS洗一次；

③用0.01～0.5mol/L pH5.6-6.2的PBS调整总体积约为10ml；

④加一定量SPA放在摇床上进行匀化10-60分钟，SPA的具体质量根据纳米磁颗粒 与SPA的反应质量比而定；

⑤加入碳二亚胺(EDAC)约5.0～10mg；

⑥室温反应，放在摇床上进行匀化10～48小时；

⑦用0.1mol/L pH7.4PBS+0.1％BSA洗涤三次；

⑧用重蒸水洗3次；

⑨用0.1mol/L pH7.4PBS洗3次；

⑩用0.05mol/L Tris+0.004mol/L EDTA pH 7.5缓冲液洗3次；

用0.05mol/L Tris+0.004mol/L EDTA pH 7.5缓冲液定容为1.0mg/ml，2-4℃保存， 待用。

(2)SPA结合量的测定：SPA结合量一般以每毫升或每克有机硅烷化纳米磁颗粒偶联SPA 的量表示，其数值可用作决定亲和吸附剂实际用量的参数，采用直接测定法或间接测定法 测定结合量。

将纳米磁颗粒与SPA按不同比例进行包被反应，测定SPA的结合率。测定结果显示， 当磁颗粒与SPA的比例至1∶50时，SPA的结合量近乎饱和，因此，我们所采用的磁颗粒 与SPA的比例为1∶50。

SPA结合率测定结果

  纳米磁颗粒/SPA   1∶5   1∶10   1∶20   1∶50   1∶75   100   SPA结合率(％)   25.64   38.13   47.18   62.71   63.76   64.97

参见图2

(二)试剂盒实验操作方法及步骤：

建立GAD65-Ab放射配体定量分析方法，采取的实验操作步骤如下：

1、将实验所需试剂及样本放置室温，平衡至少30分钟以上才可进行操作；

2、去所需试管若干进行编号，所有实验均做双管重复，并将其按顺序排列于试管架上；

3、取各个浓度的标准品、质控血清和样品25～200μl加入相应编号的试管中；

4、每管均各加入50～200μl 125I-GAD65溶液；

5、倒置充分混匀SPA-纳米磁颗粒，每管均各加入25～100μl SPA-纳米磁颗粒；

6、充分混匀，室温振荡1～6小时；

7、将试管架放在磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；

8、去除磁板，每管均各加入500～1000μl洗涤液；

9、振荡5秒后，将试管架置于磁板上吸附磁颗粒，吸去上清液；

10、重复一遍步骤8、9；

11、用γ-计数器检测每管的放射性强度；

12、从标准曲线上读取样品及质控血清的浓度。

(三)、临床检测应用情况统计分析：

1、糖尿病及对照组GAD65-Ab检测结果比较

2、数据统计

3、临床结果分析

用本试剂盒测定受检者血清中GAD65-Ab的含量，正常人血清中GAD65-Ab检出率为 0；1型糖尿病患者中青少年发病者GAD65-Ab检出率为96.08％，明显高于2型糖尿病组的 10.38％；成人迟发自身免疫型糖尿病组GAD65抗体检出率为97.69％，亦明显高于2型糖尿 病组的检出率，与文献报道吻合。

因此，本试剂盒的GAD65-Ab临床测定值，具有灵敏度及准确度高，特异性强，检测 结果准确可靠等优点，可为糖尿病早期诊断及其正确分型、早期干预治疗、正确用药及疗 效评价提供可靠依据，争取在糖尿病前期甚至更早给予免疫干预或使用外源性胰岛素保护 剩余的胰岛β细胞功能，对糖尿病及其并发症的治疗具有十分重要的意义。