一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯
阅读：459发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域和LED照明技术领域，特涉及一种基于 光遗传学 杀死细胞的 LED灯 。通过遗传学方法，将编码 光敏剂 miniSOG(或KillerRed)的基因靶向到特定的细胞中，在蓝光(或绿光)照射下，光敏剂将产生足够的 活性 氧 ，毁坏细胞内的 氨 基酸、脂肪、核酸，进而引起细胞死亡。通过调节LED灯光照时间、强度，在特定的时间选择性杀死特定的细胞，可用于研究特定细胞的功能。，下面是一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯专利的具体信息内容。
1.一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，包括控制箱、灯箱和发光部，电源部、开关与控制器安装在控制箱内，灯箱包含培养皿、摆放架、抽屉、透光隔热板和LED灯组，其特征在于：
多个培养皿抽屉可插入摆放架内，抽屉把手设置在培养皿抽屉外，培养皿抽屉放置培养皿，培养皿中放置生物体或细胞；发光部包括风扇外罩、风扇、散热器、和LED灯珠组成的LED灯组，LED灯组安装在透光隔热板上方，风扇外罩内设置风扇、下置散热器，LED灯珠发470nm波长光或540nm波长光。
2.根据权利要求1所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：培养皿中放置的生物体为秀丽隐杆线虫、转基因斑马鱼、非洲爪蟾胚胎或透明组织的细胞。
3.根据权利要求1所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：光敏剂为miniSOG蛋白或者KillerRed蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：LED灯组至少包括一组正反向并联的两个LED灯串。
5.根据权利要求4所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：每组LED灯串串联一个限流电阻。
6.根据权利要求1所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：恒流器控制经过LED灯组的线路电流恒定。
7.根据权利要求1所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：控制部通过控制LED灯的开关、时间和光照强度，控制讯号传输到每组LED灯串。
8.根据权利要求1所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：LED灯组为
6个。
一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯
技术领域
背景技术
[0002] 选择性的杀死特定的细胞是研究多细胞生物神经环路功能的关键技术。目前常用的杀死细胞的方法主要包括：物理方法、化学阻断和遗传手段。物理方法一般采用激光照射细胞，通过热效应导致细胞死亡。受制于激光光斑大小的限制，一般无法精准的杀死细胞。化学阻断，如河豚毒素，毒性太大，容易造成安全事故。遗传手段则是通过转基因的方式，将可导致细胞凋亡的基因导入到特定的细胞中。
[0003] 表达导致细胞程序化死亡的关键酶，是常用的遗传学杀死细胞的方式，然而这类诱导杀死细胞的方法过分依赖细胞类型和状态。最近，一些条件性诱导性杀死细胞的方法开始用于神经生物学的研究中，这种方式可以定时定点的杀死特定的细胞。KillerRed和miniSOG是两种完全通过遗传学编码的光敏剂，在光的照射下，会释放ROS(活性氧)，当靶向细胞中的线粒体时，可以导致细胞死亡。
[0004] KillerRed为红色荧光蛋白KillerRed完全基因编码的光敏剂，在520-590nm波长的绿光照射下产生ROS，当靶向细胞膜时可以消融细胞，溶酶体，线粒体和细胞核。作为一种光遗传工具，KillerRed是I型光敏剂，它会产生自由基和过氧化氢，可能导致周围非目标细胞的死亡。
[0005] miniSOG(微型单线态制氧器)是一种通过植物基因编码的光敏剂，由拟南芥嗜光蛋白2中的106个氨基酸组成，在蓝光照射下可产生足够的ROS，引起二氨基联苯胺的聚合反应，最后导致细胞死亡。因为miniSOG是由单基因编码的蛋白，可以方便地与其它启动子或荧光蛋白融合，从而精确地定位到线虫、果蝇、甚至哺乳动物的细胞中，用于使蛋白质分子失活或杀死整个细胞。
[0006] 基于光遗传学的方式可以定时定点的杀死细胞，但是不同的光敏剂需要在特定波长的光照射下，才能产生ROS。目前国内外没有相关的发明。本发明所研制的基于光遗传学杀死细胞的LED灯，具有低热损伤、高通量的优点，不仅有助于神经生物学的研究，而且可用于临床上杀死致病性细胞。
发明内容
[0007] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种低热损伤、高通量的LED光源设备，配合现有的光遗传蛋白miniSOG在不损伤正常组织细胞的情况下，定点杀死目的细胞。神经生物学领域中，杀死特定的神经元或阻断神经递质的传递，是研究神经环路关键的实验技术。在470nm光照射下，线粒体中光敏蛋白miniSOG产生单线态氧，靶向目的细胞中的线粒体，使目标细胞中的靶向线粒体过度氧化而促使杀死细胞，基因编码的光敏剂具有诱导选择性的促使杀死细胞，从而提供了更好的时间和空间控制，通过本发明的LED生物灯可方便的对反应时间，反应量进行测量，从而便于该方法的科学应用。
[0008] 本发明的技术方案是：一种基于光遗传学杀死细胞的LED生物灯，包括控制箱、灯箱和发光部，电源、开关与控制器安装在控制箱内，灯箱包含培养皿、摆放架、抽屉、透光隔热板和LED灯组，其特征在于：多个培养皿抽屉可插入摆放架内，抽屉把手设置在培养皿抽屉外，培养皿抽屉放置培养皿，培养皿中放置微生物和光敏剂；发光部包括风扇外罩、风扇、散热器、和LED灯珠组成LED灯组，LED灯组安装在透光隔热板上方，风扇外罩内设置风扇、下置散热器，LED灯珠发470nm波长光(蓝光)或540nm波长光(绿光)。
[0010] 根据如上所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：光敏剂为微型单线态制氧器。
[0011] 根据如上所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：LED灯组至少包括一组正反向并联的两个LED灯串。
[0013] 根据如上所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：光敏剂为基因编码的光敏剂miniSOG或KillerRed光敏剂中的一种。
[0014] 根据如上所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：恒流器控制经过LED灯组的线路电流恒定。
[0015] 根据如上所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：控制部通过控制LED灯的开关、时间和光照强度，控制讯号传输到每组LED灯串。
[0016] 根据如上所述的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，其特征在于：LED灯组为6个。
[0017] 本发明的有益效果是：本发明通过调节蓝光的光照时间(或间歇式调节光照时间)、强度，有条件性的观察培养皿中细胞在不同条件下的杀死细胞得进展，该方法在细胞成长过程中使用也是有效的，从而提供了更好的时间与空间控制，评估光敏剂对于细胞的作用效果，从而便于临床应用。附图说明：
[0018] 下面结合附图对本发明作进一步描述：
[0019] 图1是本发明的LED灯的实施例的结构示意图。
[0020] 图2是本发明装置的结构示意图。
[0022] 图4是3中控制电路的电路路线图。
[0023] 图5是利用光遗传学杀死细胞原理图。
[0024] 图6是秀丽隐杆线虫神经元细胞内线粒体凋亡原理图。
[0025] 图7是mito-miniSOG在秀丽隐杆线虫神经元细胞内表达示意图
[0026] 图8～10是秀丽隐杆线虫神经元细胞在显微镜观察下细胞逐渐消融的示意图。
[0027] 附图标记说明：LED灯体1、驱动模块2、第一LED灯串3、第二LED灯串4、第三LED灯串5、第四LED灯串6、第五LED灯串7、第六LED灯串8、开关9、控制箱10、摆放架11、培养皿抽屉
12、抽屉把手13、LED灯组14、第一培养皿15、第二培养皿16、隔热板17、风扇外罩18、风扇19、散热器20、LED灯21、恒流电源模板22、散热模块23、LED灯控制电路24、过载保护电路25。
12、抽屉把手13、LED灯组14、第一培养皿15、第二培养皿16、隔热板17、风扇外罩18、风扇19、散热器20、LED灯21、恒流电源模板22、散热模块23、LED灯控制电路24、过载保护电路25。
[0028] 具体实施方法：
[0029] 以下结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0030] 本发明的具有诱导性杀死细胞的方法的步骤为：将光敏剂与靶向培养细胞混合，在波长为400nm-450nm蓝光下照射光敏剂与细胞的混合物，光敏剂产生足够的活性氧，活性氧与靶向培养细胞中的线粒体发生氧化反应，使靶向细胞中的靶向线粒体过度氧化而致使杀死细胞，不会对邻近细胞造成可识别的损伤。
[0031] 本发明的光敏剂最好为微型单线态制氧器，其能产生足够的活性氧。
[0032] 本发明的实施对象为秀丽隐杆线虫、转基因斑马鱼、非洲爪蟾胚胎和小鼠的特定神经元等特定神经元细胞。
[0033] 如图1和图2所示，本发明提供的LED灯的实施例的结构示意图。该LED灯主要包括：LED灯体1和驱动模块2。LED灯体1至少包括一组正反向并联的两个LED灯串，每个LED灯串至少包含一个LED灯串。图2中，第一LED灯串3、第二LED灯串4为一组，第三LED灯串5、第四LED灯串6为一组，第五LED灯串7、第六LED灯串8为一组。驱动模块2输出两个端口，分别与每组正反向并联的灯串连接。本发明的每个LED灯串采用6个蓝色灯珠或灯芯(可根据需求调整灯珠数目和颜色)。为了保证LED灯正常工作和灯光强度的稳定，各个LED灯串最好串联一个限流电阻，以实现限流处理和分压作用。
[0034] 本发明的驱动模块2分别与第一输入端In1和第二输入端In2连接构成驱动回路，然后驱动模块2向各个LED灯串发送用于控制能量大小的能量脉冲信号，达到调节LED灯的光照强度和光照时间的目的，具体描述该调节原理：
[0035] 正向能量脉冲和负向能量脉冲，其中正向能量脉冲可用于驱动第一LED灯串所在的回路，单独实现第一LED灯串3的光照强度和光照时间；负向能量脉冲信号可用于驱动第二LED灯串4所在的回路，单独实现第二LED灯串的光照强度和光照时间，第三LED灯串5到第六LED灯串8的调节方式按照上述交替方式发送正、负向能量脉冲信号驱动LED灯串回路,即在工作过程中，能量脉冲信号呈现周期性的变化，从而造成正、负能量脉冲信号呈现交替方式。
[0036] 本发明的驱动模块2通过控制正向能量脉冲信号和负向能量脉冲信号的持续时间和/或幅值控制所述六串LED灯串在同一周期内的能量大小，从而达到控制灯光强度和光照时间。
[0037] 如图2至图8所示，本发明的一种基于光遗传学杀死细胞的LED灯，包括电源部、控制部、灯箱和发光部，电源部、开关9与控制器安装在控制箱10内，灯箱包括摆放架11、培养皿抽屉12、抽屉把手13、培养皿,培养皿包括第一培养皿15、第二培养皿16。摆放架11设置在控制箱10内，多个培养皿抽屉12可插入摆放架11内，抽屉把手13设置在培养皿抽屉12外侧，便于培养皿抽屉12的抽取，培养皿抽屉12放置第一培养皿15、第二培养皿16，第一培养皿15、第二培养皿16中放置细胞和光敏剂。
[0038] 本发明的第一培养皿15直径可以为60mm，第二培养皿16直径可以为35mm。
[0039] 本发明的发光部包括为LED灯组14，LED灯组14包括风扇外罩18、风扇19、散热器20、LED灯21，LED灯21组成LED灯体1，LED灯体1固定安装在风扇外罩18后为LED灯组14，风扇外罩18内分别设置风扇19和散热器20，用于对发电部进行散热。如图2所示，6组LED灯组14置于透明隔热板17上方，透明隔热板17的作用是防止LED灯组14的温度对培养皿里的细胞生理造成影响，
[0040] 本发明摆放架11靠近发光部一侧的板最好为玻璃板或其他透光隔热板，摆放架11最好设置高度调节滑轨，用于对培养皿抽屉12的高度进行调整。LED灯组14中部分或全部LED灯21的灯光为蓝光，在应用本发明的装置时，先通过外部电路启动，如蓄电池，启动后，通过LED灯组14所发射的蓝光使培养皿16中的细胞走向坏死，即启动后LED灯组14相当于驱动模块2，从而使本发明的装置能够持续供电。
[0041] 图3为驱动模块2的实施例的结构示意图，其包括：提供电压信号的恒流电源模板22；散热模块23用于驱动风扇19运行；LED灯控制电路24用于控制灯串，过载保护电路25用于电路电流或电压过载时关闭电源，保护设备的安全下面结合实际电路，具体说明驱动模块中的控制电路的结构。
[0042] 图4为的恒流电源模板22由稳压管VDw提供的基准电压通过电位器RP加到运放A1的同相输入端，稳压电源的输出电压Vsc又反馈到A1的反相输入端，当Vsc发生变化时，它与同相输入端电压的差值被运放放大，以控制调整晶体管VT的基极电流，改变发射极与集电极间电压降，从而使输出电压保持稳定。此电路虽然简单，但克服了取样电阻分压比对稳定性的影响，在不同的Vsc时有同样的反馈深度，反馈最深，Vsc的稳定性好。又因为Vsc就等于同相输入端电压，调节电位器RP就可以使Vsc在电压范围内任意改变。经过调节后的电源电路与LED灯体电路的正、负极端口相接为电路提供恒定电流，LED灯体电路图中，每个LED灯串均串联一个限流电阻、二极管和一个开关，起到可单独控制每个LED灯串。
[0043] 图5为利用光遗传学杀死细胞原理图。作为荧光黄素蛋白，miniSOG由拟南芥光促性蛋白2中的106个氨基酸组成。在蓝光照射下，miniSOG吸收光照能量，使其从基态(S0)跃迁到第一激发态(S1)，S1经过内部跃迁能量被激发为第二激发态(S2)，在S2基础上激发成单线态状态，被激发的单线态经历内部能量跃迁，形成一个具有更稳定的被激发的三线态，miniSOG也可以衰变回基态(发出磷光光子)，被激发的三线态通过与分子氧(O2)碰撞转移能量，这个能量转移步骤导致(1O2)形成，这个光化学反应过程最终形成活性氧ROS，进而毁灭细胞内的氨基酸、脂肪以及不饱和脂肪酸，进而引起细胞死亡，整个过程可以通过衰变回基态的miniSOG发出的荧光现象观察到。
[0044] 图6是秀丽隐杆线虫神经元细胞内线粒体凋亡原理图。基因编码的光敏剂miniSOG诱导和选择靶向细胞中的靶向线粒体，在470nmLED蓝光照射下，靶向线粒体上的miniSOG产生ROS促使靶向线粒体过度氧化而促使杀死细胞的生物特性，mini-SOG产生ROS，线粒体大约在2min后开始被ROS破坏，在大约15min后线粒体凋亡，该方法相比其他促使杀死细胞的方法，明显的优势使通过靶向细胞自身自发性的方式进行自身坏死而不损伤邻近细胞，提高了实验效率，同时也提供了更好的时间与空间上的控制。
[0045] 图7为mito-miniSOG在秀丽隐杆线虫神经元细胞内表达示意图。目的细胞启动子、mito-miniSOG和标记蛋白发生连接反应，构建DNA片段，最后形成可在目的细胞中表达的质粒，在显微注射下。利用荧光挑选含mito-miniSOG的线虫细胞。
[0046] 图8～10为秀丽隐杆线虫神经元细胞消融示意图。通过显微镜观察，秀丽隐杆线虫神经元细胞在光敏剂mito-miniSOG的作用下，不同阶段神经元细胞消融情况直至最终被杀死。
[0047] 作为进一步扩展方法，可以采用红色荧光蛋白KillerRed完全基因编码的光敏剂，通过更换灯珠的颜色，使其绿光(520-590nm)光照射下产生ROS，并且当靶向细胞膜时可以消融细胞，溶酶体，线粒体和细胞核。作为一种光遗传工具，此外，KillerRed是I型光敏剂，它产生自由基和过氧化氢，相比miniSOG，KillerRed不产生单线态氧。
[0048] 本发明的有益效果是：基因编码的光敏剂miniSOG，在蓝光照射下，miniSOG产生足够的ROS(活性氧)，毁坏细胞内的氨基酸、脂肪、核酸，进而引起细胞死亡。在特定的时间选择性杀死特定的细胞，不会对邻近细胞造成可识别的损伤。应用细胞内线粒体容易受到ROS过度氧化而促使杀死细胞的生物特性，基因编码的光敏剂miniSOG靶向细胞中的靶向线粒体(由于线粒体在细胞死亡过程中的调节起着关键作用，又容易受到ROS氧化作用)，利用miniSOG在蓝光照射下产生ROS特性，从而使靶向细胞内的靶向线粒体受到ROS过度氧化，促使细胞以自发性的方式有效的杀死细胞，通过调节蓝光的光照时间和光照强度，有条件性的观察培养皿中特定细胞在不同条件下的杀死细胞的情况，该方法在细胞成长过程中使用也是有效的，从而提供了更好的时间与空间控制。
[0049] 依据杀死细胞的目标，光的属性和光照时间的调整由计算机智能演算，自动控制LED灯发出相对应的光照强度、光照时间，通过恒流器控制流通LED灯串的电流，为电流电路提供恒定的电流，从而保证灯的光照强度恒定，其中正、负向能量脉冲信号的持续时间和/或幅值控制所述6串LED灯串在同一周期内的能量大小，从而达到控制灯光强度和光照时间。
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