[0001] 本申请要求于2016年11月28日提交的且标题为“Prevention of Muscular Dystrophy by CRISPR/Cpf1-Mediated Gene Editing”的美国临时专利申请序列号62/426,853的优先权，其公开内容在此通过引用整体并入。
联邦资助支持条款

[0002] 本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的DK-099653和U54-HD 087351的政府支持下完成的。政府对本发明具有某些权利。
序列表

[0003] 本申请包含已经以ASCII格式电子提交且在此通过引用整体并入的序列表。2017年11月28日创建的所述ASCII拷贝名称为UTFD_3124WO.txt且大小为189,059字节。

[0004] 本公开内容涉及分子生物学、医学和遗传学的领域。更具体地，本公开内容涉及使用基因组编辑来治疗迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)。

[0005] 迪谢内肌营养不良(DMD)是由编码肌养蛋白(dystrophin)(其是肌细胞膜完整性所必需的大细胞骨架蛋白质)的基因中的突变引起的X连锁隐性疾病。DMD导致进行性肌无力(muscle weakness)，最终导致30岁时过早死亡，通常由于心肌病。对于这种疾病没有有效的治疗。已经尝试了许多挽救DMD中肌养蛋白表达的方法，包括通过重组体腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)递送截短的肌养蛋白或肌营养相关蛋白(utrophin)，以及用反义寡核苷酸和小分子跳读突变体外显子。然而，这些方法不能校正DMD突变或永久地恢复肌养蛋白表达。因此，本领域中需要用于治疗DMD的组合物和方法，其校正DMD突变以解决疾病的潜在原因，从而永久地恢复肌养蛋白表达。

[0006] 本公开内容提供了组合物，其包含编码Cpf1多肽的序列和编码DMD指导RNA(gRNA)的序列，其中DMD gRNA靶向肌养蛋白剪接位点，并且其中DMD gRNA包含SEQ ID No.448至770中的任一个。在一些实施方案中，编码Cpf1多肽的序列分离自或来源于编码毛螺菌科(Lachnospiraceae)Cpf1多肽的序列。在一些实施方案中，编码Cpf1多肽的序列分离自或来源于编码氨基酸球菌属(Acidaminococcus)Cpf1多肽的序列。在一些实施方案中，编码Cpf1多肽的序列或编码DMD gRNA的序列包含RNA序列。在一些实施方案中，RNA序列是mRNA序列。
在一些实施方案中，RNA序列包含至少一个经化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，编码Cpf1多肽的序列包含DNA序列。

[0007] 在一些实施方案中，第一载体包含编码Cpf1多肽的序列，并且第二载体包含编码DMD gRNA的序列。在一些实施方案中，第一载体或编码Cpf1多肽的序列还包含第一poly A序列。在一些实施方案中，第二载体或编码DMD gRNA的序列还包含第二poly A序列。在一些实施方案中，第一载体或第二载体还包含编码可检测标记的序列。在一些实施方案中，可检测标记是荧光标记。

[0008] 在一些实施方案中，第一载体或编码Cpf1多肽的序列还包含第一启动子序列。在一些实施方案中，第二载体或编码DMD gRNA的序列还包含第二启动子序列。在一些实施方案中，所述启动子第一启动子序列和第二启动子序列是相同的。在一些实施方案中，第一启动子序列和第二启动子序列是不相同的。在一些实施方案中，第一启动子序列或第二启动子序列包含组成型启动子。在一些实施方案中，第一启动子序列或第二启动子序列包含诱导型启动子。在一些实施方案中，第一启动子序列或第二启动子序列包含肌细胞特异性启动子。在一些实施方案中，肌细胞特异性启动子是肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋白启动子、肌钙蛋白1启动子、Na+/Ca2+交换体(exchanger)启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑钠肽启动子、αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子或ANF启动子。

[0009] 在一些实施方案中，第一载体或第二载体还包含编码2A样自切割结构域的序列。在一些实施方案中，编码2A样自切割结构域的序列包含TaV-2A肽。

[0010] 在一些实施方案中，载体包含编码Cpf1多肽的序列和编码DMD gRNA的序列。在一些实施方案中，载体还包含poly A序列。在一些实施方案中，载体还包含启动子序列。在一些实施方案中，启动子序列包含组成型启动子。在另一些实施方案中，启动子序列包含诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子序列包含肌细胞特异性启动子。在一些实施方案中，肌细胞特异性启动子是肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋白启动子、肌钙蛋白1启动子、Na+/Ca2+交换体启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑钠肽启动子、αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子或ANF启动子。

[0011] 在一些实施方案中，组合物包含经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达的序列。在另一些实施方案中，组合物包含经密码子优化以在人细胞中表达的序列。在一些实施方案中，编码Cpf1多肽的序列经密码子优化以在人细胞中表达。

[0012] 在一些实施方案中，剪接位点是剪接供体位点。在一些实施方案中，剪接位点是剪接接纳体(splice acceptor)位点。

[0013] 在另一些实施方案中，第一载体或第二载体是非病毒载体。在一些实施方案中，非病毒载体是质粒。在一些实施方案中，脂质体或纳米粒包含第一载体或第二载体。

[0014] 在一些实施方案中，第一载体或第二载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(adeno-associated viral，AAV)载体。在一些实施方案中，AAV载体是复制缺陷型(replication-defector)或条件性复制缺陷型的(conditionally replication defective)。在一些实施方案中，AAV载体是重组体AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体包含分离自或来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任意组合的AAV载体的序列。

[0015] 在一些实施方案中，组合物还包含单链DMD寡核苷酸。在一些实施方案中，组合物还包含可药用载体。

[0016] 还提供了包含本公开内容的组合物的细胞。在一些实施方案中，细胞是肌细胞、卫星细胞或其前体。在一些实施方案中，细胞是iPSC或iCM。

[0017] 还提供了包含本公开内容的细胞的组合物。

[0018] 还提供了校正肌养蛋白基因缺陷的方法，其包括在适于表达Cpf1多肽和gRNA的条件下使本公开内容的细胞与组合物接触，其中所述Cpf1多肽破坏肌养蛋白剪接位点；并且其中剪接位点的破坏导致突变体DMD外显子的选择性跳读。在一些实施方案中，突变体DMD外显子是外显子23。在一些实施方案中，突变体DMD外显子是外显子51。在一些实施方案中，细胞是体内、离体、体外或原位的。

[0019] 本公开内容还提供了在有此需要的对象中治疗肌营养不良的方法，其包括向对象施用治疗有效量的根据本公开内容的组合物。在一些实施方案中，组合物局部施用。在一些实施方案中，组合物直接施用于肌组织。在一些实施方案中，组合物通过肌内输注或注射施用。在一些实施方案中，肌组织包括胫骨前肌组织(tibialis anterior tissue)、四头肌组织(quadricep tissue)、比目鱼肌组织(soleus tissue)、膈肌组织(diaphagm tissue)或心脏组织。在一些实施方案中，组合物全身施用。在一些实施方案中，组合物通过静脉内输注或注射施用。

[0020] 在一些实施方案中，在施用组合物之后，对象表现出正常的肌养蛋白阳性肌纤维和镶嵌的(mosaic)包含集中核(centralized nuclei)的肌养蛋白阳性肌纤维，或其组合。在一些实施方案中，当与在施用组合物之前正常的肌养蛋白阳性肌纤维的不存在或丰度水平相比时，在施用组合物之后，对象表现出正常的肌养蛋白阳性肌纤维的出现或丰度水平提高。在一些实施方案中，当与在施用所述组合物之前镶嵌的包含集中核的肌养蛋白阳性肌纤维的不存在或丰度水平相比时，在施用组合物之后，对象表现出镶嵌的包含集中核的肌养蛋白阳性肌纤维的出现或丰度水平提高。在一些实施方案中，当与在施用组合物之前的血清CK水平相比时，对象表现出降低的血清CK水平。在一些实施方案中，当与在施用组合物之前的握力强度(grip strength)相比时，在施用组合物之后，对象表现出提高的握力强度。

[0021] 在一些实施方案中，所述方法包括施用治疗有效量的本文中公开的组合物，其中所述细胞是自体的。在一些实施方案中，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，其中所述细胞是同种异体的。

[0022] 在一些实施方案中，对象是新生儿、婴儿、儿童、年轻成人或成人。在一些实施方案中，对象患有肌营养不良。在一些实施方案中，对象是肌营养不良的遗传携带者。在一些实施方案中，对象是雄性。在一些实施方案中，对象是雌性。在一些实施方案中，对象表现为无症状，并且其中遗传学诊断(genetic diagnosis)揭示DMD基因的一个或两个拷贝中有损害DMD基因产物的功能的突变。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的早期体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的早期体征或症状包括肌肉量(muscle mass)的损失或近侧肌无力。在一些实施方案中，肌肉量的损失或近侧肌无力发生在一条或两条腿和/或骨盆中，然后在一个或更多个上半身(upper body)肌肉中。在一些实施方案中，肌营养不良的早期体征或症状还包括假性肥大、低耐力、站立困难、行走困难和/或上楼梯困难或其组合。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的进行性体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的进行性体征或症状包括肌组织消耗、肌组织被脂肪替代或肌组织被纤维化组织(fibrotic tissue)替代。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的晚期体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的晚期体征或症状包括异常骨发育、脊柱弯曲(curvature of the spine)、运动丧失和瘫痪(paralysis)。在一些实施方案中，对象呈现肌营养不良的神经病学体征或症状。在一些实施方案中，肌营养不良的神经病学体征或症状包括智力障碍(intellectual impairment)和瘫痪。在一些实施方案中，组合物的施用发生在对象呈现肌营养不良的一种或更多种进行性、晚期或神经病学体征或症状之前。在一些实施方案中，对象小于10岁。在一些实施方案中，对象小于5岁。在一些实施方案中，对象小于2岁。

[0023] 本公开内容还提供了治疗有效量的组合物用于在有此需要的对象中治疗肌营养不良的用途。

[0024] 考虑本文中所述的任何方法或组合物可针对本文中所述的任何其他方法或组合物来实施。

[0025] 通过以下详细描述，本公开内容的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，尽管表明了本公开内容的一些具体实施方案，但是详细描述和具体实施例仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员将变得明显。附图简述

[0026] 以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步示出本公开内容的某些方面。通过参照这些与本文中所示具体实施方案的详细描述组合的附图中的一幅或更多幅，本公开内容可被更好地理解。

[0027] 图1A至1E.通过Cpf1介导的基因组编辑校正DMD突变。(图1A)外显子48至50的DMD缺失导致外显子47至51的剪接，产生肌养蛋白的框外突变(out-of-frame mutation)。两种策略用于通过Cpf1恢复肌养蛋白表达。在“重构(reframing)”策略中，外显子51中的小INDEL恢复了肌养蛋白的蛋白质阅读框。“外显子跳读”策略通过破坏外显子51的剪接接纳体来实现，这导致外显子47至52的剪接以及蛋白质阅读框的恢复。(图1B)内含子的3’末端是富含T的，这产生能够通过Cpf1进行基因组切割的Cpf1 PAM序列。(图1C)靶向DMD外显子51的Cpf1gRNA的图示。富含T的PAM(红线)位于剪接接纳体位点附近的外显子51的上游。示出了靶向外显子51的Cpf1 g1 gRNA的序列，以蓝色突出了互补的核苷酸。Cpf1切割在PAM位点远端产生交错末端(由红色箭头区分)。外显子51的5’区域以浅蓝色阴影显示。外显子序列是大写的。内含子序列是小写的。(图1D)编码具有核定位信号(nuclear localization signal，NLS)和2A-GFP的人经密码子优化的Cpf1(human codon-optimized Cpf1，hCpf1)之质粒的图示。质粒还编码由U6启动子驱动的Cpf1 gRNA。用该质粒转染的细胞表达GFP，允许通过FACS选择表达Cpf1的细胞。(图1E)使用用表达LbCpf1或AsCpf1、gRNA和GFP的质粒转染的人293T细胞或DMD iPSC(RIKEN51)的T7E1测定示出了在DMD外显子51处的基因组切割。红色箭头指向切割产物。M，标记。

[0028] 图2A至2I.DMD iPSC来源的心肌细胞在通过重构进行的Cpf1介导的基因组编辑之后表达肌养蛋白。(图2A)DMD皮肤成纤维细胞来源的iPSC使用gRNA通过Cpf1进行编辑(校正的DMD-iPSC)，并随后分化成心肌细胞(校正的心肌细胞)用于分析DMD突变的遗传校正。(图2B)外显子48至50的DMD缺失导致外显子47至51的剪接，产生肌养蛋白的框外突变。靶向外显子47的正向引物(F)和靶向外显子52的反向引物(R)用于RT-PCR以在心肌细胞中通过Cpf1介导的基因组编辑来证实重构策略。未校正的心肌细胞缺乏外显子48至50。相反，在重构之后，外显子51与外显子47一起放回框内。(图2C)代表性RT-PCR产物的测序显示未校正的DMD iPSC来源的心肌细胞在外显子51中具有过早的终止密码子，这产生了无义突变。在Cpf1介导的重构之后，肌养蛋白的ORF恢复。虚的红线表示外显子边界。(图2D)Western印迹分析示出了用LbCpf1或AsLpf1和g1 gRNA通过重构编辑的DMD iPSC来源的心肌细胞的混合物中的肌养蛋白表达。即使没有克隆选择，Cpf1介导的重构也高效且足以恢复心肌细胞混合物中的肌养蛋白表达。αMHC是加载对照。(图2E)免疫细胞化学示出了在LbCpf1介导的或AsCpf1介导的重构之后iPSC来源的心肌细胞(cardiomyocyte，CM)混合物中的肌养蛋白表达。肌养蛋白染色(红色)；肌钙蛋白I染色(绿色)。比例尺＝100微米。(图2F)Western印迹分析示出了在LbCpf1介导的重构之后的克隆选择之后iPSC来源的心肌细胞的单克隆(#2和#
5)中的肌养蛋白表达。αMHC是加载对照。(图2G)免疫细胞化学示出了在LbCpf1编辑的iPSC来源的心肌细胞克隆#2中的肌养蛋白表达。比例尺＝100微米。(图2H)LbCpf1编辑的iPSC来源的心肌细胞的单克隆(#2和#5)中线粒体DNA拷贝数的量化。数据表示为平均值±SEM(n＝
3)。(&)P＜0.01；(#)P＜0.005；(ns)不显著。(图2I)LbCpf1编辑的iPSC来源的心肌细胞的单克隆(#2和#5)的基础氧消耗速率(oxygen consumption rate，OCR)以及响应于寡霉素、FCCP以及鱼藤酮和抗霉素A的OCR，其相对于细胞数进行归一化(对于每个测试从左至右的顺序与图2H相同)。数据表示为平均值±SEM(n＝5)。(*)P＜0.05；(&)P＜0.01；(#)P＜
0.005；(ns)不显著。

[0029] 图3A至3H.在Cpf1介导的外显子跳读之后，DMD iPSC来源的心肌细胞表达肌养蛋白。(图3A)两者之中任一种gRNA(g2或g3)都靶向内含子50的两种gRNA和靶向外显子51的另一种(g1)用于指导Cpf1介导的外显子51剪接接纳体位点的去除。(图3B)使用用LbCpf1和gRNA2(g2)或gRNA3(g3)转染的293T细胞的T7E1测定示出了在内含子50处的DMD基因座的切割。红色箭头表示切割产物。M，标记。(图3C)分离自用表达LbCpf1、g1+g2和GFP的质粒转染的DMD-iPSC的基因组DNA的PCR产物。较低条带(红色箭头)表示外显子51剪接接纳体位点的去除。(图3D)来自图c的较低PCR条带的序列示出了从内含子50的3’末端至外显子51的5’末端的200-bp缺失。这证实了外显子51的“ag”剪接接纳体的去除。未校正的等位基因的序列示出在LbCpf1编辑的等位基因的序列上方。(图3E)使用图2B中描述的引物组的iPSC来源的心肌细胞的RT-PCR。WT泳道中的700bp条带是来自外显子47至52的肌养蛋白转录物；未校正泳道中的300bp条带是在外显子48至50缺失的情况下外显子47至52的肌养蛋白转录物；并且g1+g2混合物泳道(通过LbCpf1编辑)中的较低条带示出了外显子51跳读。(图3F)来自图e的较低条带(g1+g2混合物泳道)的序列证实了外显子51的跳读，其重构了DMD ORF。(图3G)Western印迹分析示出了在通过LbCpf1用g1+g2进行外显子51跳读之后，iPSC来源的心肌细胞混合物中的肌养蛋白蛋白质表达。αMHC是加载对照。(图3H)免疫细胞化学示出了与WT和未校正的CM相比，在用g1+g2 gRNA进行Cpf1介导的外显子跳读之后，iPSC来源的心肌细胞混合物(CM)中的肌养蛋白表达。肌养蛋白染色(红色)。肌钙蛋白I染色(绿色)。比例尺＝100微米。

[0030] 图4A至4D.小鼠DMD基因的外显子23的CRISPR-Cpf1介导的编辑。(图4A)突出在外显子23处的突变的小鼠Dmd基因座的图示。序列示出了由C至T的转换引起的无义突变，其产生过早的终止密码子。(图4B)示出了Dmd基因的外显子23上的gRNA(g1、g2和g3)(以浅蓝色显示)之靶向位置的图示。红线表示LbCpf1 PAM。(图4C)使用用靶向外显子23的不同gRNA(g1、g2或g3)用LbCpf1或AsCpf1转染的小鼠10T1/2细胞的T7E1测定显示LbCpf1和AsCpf1在Dmd外显子23基因座处具有不同的切割效率。红色箭头示出基因组编辑的切割产物。M，标记。(图4D)靶向Dmd外显子23的LbCpf1介导的gRNA(g2)的图示。红色箭头指示切割位点。ssODN HDR模板包含mdx校正、四个沉默突变(绿色)和TseI限制位点(加下划线的)。

[0031] 图5A至5F.在mdx小鼠中CRISPR-LbCpf1介导的Dmd校正。(图5A)通过LbCpf1介导的种系编辑在mdx小鼠中进行基因校正的策略。用基因编辑组分(LbCpf1 mRNA、g2 gRNA和ssODN)注射来自mdx亲本互交的合子并将其重新植入假孕母体中，其产出具有基因校正的幼崽(pup)(mdx-C)。(图5B)示出了通过HDR或NHEJ的mdx等位基因的LbCpf1校正的图示。(图5C)LbCpf1编辑的mdx小鼠的基因型分型结果。顶部的图示出了T7E1测定。蓝色箭头表示未切割的DNA，且红色箭头示出T7E1切割的DNA。底部的图示出了TseI RFLP测定。蓝色箭头表示未校正的DNA。红色箭头指向指示HDR校正的TseI切割。mdx-C1至C5表示LbCpf1编辑的mdx小鼠。(图5D)顶部的图示出了WT Dmd外显子23的序列。中间的图示出了具有C至T的突变的mdx Dmd外显子23的序列，该突变产生终止密码子。底部的图示出了具有通过LbCpf1介导的编辑进行的HDR校正的Dmd外显子23的序列。黑色箭头指向由ssODN HDR模板引入的沉默突变。(图5E)来自WT、mdx和LbCpf1编辑的小鼠(mdx-C)的胫骨前肌(tibialis anterior，TA)和腓肠肌/跖肌(gastrocnemius/plantaris，G/P)肌肉的H&E。(图5F)来自WT、mdx和LbCpf1编辑的小鼠(mdx-C)的TA和G/P肌肉使用肌养蛋白抗体(红色)的免疫组织化学。mdx肌肉示出了纤维化和炎症浸润，而mdx-C肌肉示出了正常的肌肉结构。

[0032] 图6A至6C.通过LbCpf1或AsCpf1在DMD外显子51处的基因组编辑。(图6A)来自通过LbCpf1或AsCpf1使用g1编辑的DMD患者(RIKEN 51)皮肤成纤维细胞来源的iPSC之混合物的DMD外显子51的DNA测序。单个编辑的DMD等位基因的序列示出在未校正的DMD等位基因下方。Δ表示核苷酸缺失。(图6B)来自通过LbCpf1或AsCpf1使用g1编辑的DMD患者皮肤成纤维细胞来源的iPSC之单克隆的DMD外显子51的DNA测序。(图6C)在用g2或g3进行LbCpf1编辑之后，10T1/2细胞的PCR产物的DNA测序。WT序列位于顶部，且INDEL序列位于底部。

[0033] 图7A至7B.来自WT、mdx和LbCpf1编辑的小鼠(mdx-C)的肌肉的组织学分析。(图7A)整个胫骨前肌(TA)肌肉的免疫组织化学和H&E染色。肌养蛋白染色为红色。(图7B)整个腓肠肌/跖肌(G/P)肌肉的免疫组织化学和H&E染色。肌养蛋白染色为红色。发明详述

[0034] 像许多其他遗传起源的疾病一样，迪谢内肌营养不良存在具有挑战性的治疗情景。CRISPR-Cas系统代表了一种用于校正多种遗传缺陷的方法。CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)系统在细菌和古细菌中用作对抗噬菌体感染的适应性免疫系统。在该系统中，通过单指导RNA(single guide RNA，sgRNA)内切核酸酶被引导至特定基因组序列，导致在前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)序列附近切割DNA。先前，CRISPR-Cas9用于校正小鼠和人细胞中的DMD突变。但是，仍有许多挑战需要解决。例如，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)，目前最广泛使用的Cas9内切核酸酶具有富含G的PAM需求(NGG)，其排除了富含AT的区域的基因组编辑。此外，大尺寸的SpCas9降低了低容量病毒载体(例如腺相关病毒(AAV)载体)的包装和递送效率。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9内切核酸酶(SaCas9)(虽然尺寸小于SpCas9)具有更长且更复杂的PAM序列(NNGRRT)，因此限制了其基因组靶标的范围(Ran et al.，2015)。具有在识别序列中的更大柔性和相当的切割效率的较小CRISPR酶将有助于使基因编辑精确，尤其是对于翻译应用。

[0035] 如本公开内容所示出的，RNA指导的内切核酸酶，称为Cpf1(来自普雷沃氏菌属(Prevotella)和弗朗西斯氏菌属1(Francisella 1)的CRISPR)，对哺乳动物基因组切割是有效的。当与Cas9相比时，Cpf1具有数个扩展其基因组编辑潜力的独特特征：Cpf1介导的切割由单个和短的crRNA(缩写为gRNA)指导，而Cas9介导的切割由CRISPR RNA(crRNA)和长反式激活crRNA(tracrRNA)的杂合体指导。Cpf1在前间区序列(protospacer)的5’末端优选富含T的PAM，而Cas9在靶序列的3’末端需要富含G的PAM。Cpf1介导的切割在PAM位点的远端产生黏性末端，其激活DNA修复机制，而Cas9切割产生平端。Cpf1还具有RNase活性，其可将前体crRNA加工成成熟crRNA。与Cas9一样，Cpf1与靶基因组位点结合并产生双链断裂(double-stranded break，DSB)，其然后通过非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)或通过同源定向修复(homology-directed repair，HDR)(如果提供外源模板的话)来修复。在本公开内容之前，既没有认识到Cpf1优于Cas9的优势，也没有示出Cpf1用于校正哺乳动物细胞和疾病的动物模型中的遗传突变的用途。在此，本发明人示出Cpf1提供稳健且高效的RNA指导的基因组编辑系统，其通过不同的策略永久地校正DMD突变，从而恢复肌养蛋白表达并预防疾病的进展。这些发现提供了用于永久校正人基因突变的新的方法。下面再现了本公开内容的这些和其他方面。I.迪谢内肌营养不良
A.背景

[0036] 迪谢内肌营养不良(DMD)是隐性X-连锁形式的肌营养不良，在3,500个男孩中约1个受到影响，其导致肌肉变性和过早死亡。该病症由位于人X染色体上的编码蛋白质肌养蛋白(GenBank登录号AAA53189；SEQ ID NO.383)的基因肌养蛋白(参见GenBank登录号NC_000023.11)中的突变引起，下面再现了肌养蛋白的序列：

[0037] 在人中，肌养蛋白mRNA包含79个外显子。已知肌养蛋白mRNA作为替代地剪接，导致多种同种型(isoform)。示例性肌养蛋白同种型列于表1中。

[0038] 在人中，肌养蛋白mRNA包含79个外显子。已知肌养蛋白mRNA作为替代地剪接，导致蛋白质的多种同种型。示例性肌养蛋白同种型列于表1中。表1：肌养蛋白同种型

[0039] 肌养蛋白是肌组织内的重要组分，为细胞膜的肌养蛋白聚糖复合体(dystroglycan complex，DGC)提供结构稳定性。虽然两性均可携带突变，但是女性很少受到骨骼肌形式的疾病的影响。
B.症状

[0040] 症状通常出现在2岁至3岁的男孩中，并且在婴儿早期可见。即使症状直到婴儿早期仍不出现，实验室测试也可鉴定出生时携带活跃突变的儿童。首先观察到与肌肉量损失相关的腿和骨盆的进行性近侧肌无力。最终这种无力蔓延至手臂、颈部和其他区域。早期体征可包括假性肥大(腓肠肌和三角肌的增大)、低耐力以及无辅助下站立的困难或不能上楼梯。随着病症发展，肌组织经历萎缩，并最终被脂肪和纤维化组织(纤维化)替代。到10岁时，可能需要支具来帮助行走，但是大多数患者到12岁时仍然依赖轮椅。随后的症状可包括导致骨骼畸形(包括脊柱弯曲)的异常骨发育。由于肌肉的进行性恶化，发生运动的丧失，最终导致瘫痪。智力障碍可存在或可不存在，但是如果存在的话，不随着儿童年龄而进行性地恶化。患有DMD的男性的平均寿命期望为约25岁。

[0041] 迪谢内肌营养不良(一种进行性神经肌肉疾病)的主要症状是与肌肉萎缩(muscle wasting)相关的肌无力，其中首先受影响的是随意肌，尤其是臀部、骨盆区域、大腿、肩膀和小腿的那些。随后在手臂、颈部和其他区域也发生肌无力。小腿经常增大。症状通常在6岁以前出现，并且可出现在婴儿早期。另一些身体症状有：·不便的行走、踏步或跑步方式-(患者倾向于靠其前趾行走，原因是腓肠肌张力增大。
而且，脚趾行走是对膝伸肌无力的补偿性适应)。
·频繁跌倒
·疲劳
·运动技能(跑步、跳跃、跳高)困难
·腰椎脊柱前凸过度(lumbar hyperlordosis)，可能导致髋-屈肌缩短。这对整体姿势以及步行、踏步或跑步的方式有影响。
·跟腱和腘旁腱(hamstring)的肌肉挛缩损害功能，原因是肌纤维缩短和结缔组织中的纤维化
·进行性行走困难
·肌纤维畸形
·舌和腓肠肌的假性肥大(增大)。肌组织最终被脂肪和结缔组织替代，因此称为假性肥大。
·神经行为障碍(例如，ADHD)、学习障碍(诵读困难)和特定认知技能(特别是短期言语记忆)的非进行性虚弱的较高风险，这被认为是脑缺乏肌养蛋白或肌养蛋白功能障碍的结果。
·最终丧失行走能力(通常到12岁时)
·骨骼畸形(包括某些情况中的脊柱侧凸)
·由躺卧或坐姿站起来困难

[0042] 通常在临床上从患者迈出他的第一步的那一刻起就可观察到该病症，并且行走的能力通常在男孩9至12岁之间完全丧失。大多数受DMD影响的男性到21岁时基本上“从颈部以下瘫痪”。肌肉萎缩始于腿和骨盆，然后发展至肩膀和颈部的肌肉，随后丧失手臂肌肉和呼吸肌。腓肠肌增大(假性肥大)相当明显。心肌病特别是(扩张型心肌病)是常见的，但是充血性心力衰竭或心律失常(不规则心跳)的发生只是偶尔的。

[0043] 阳性高尔斯征(Gowers’sign)反映下肢肌肉更严重的损伤。儿童用上肢帮助自己站起来：首先靠他的胳膊和膝盖立起来，并随后用手沿着他的腿向上“走”以直立。受影响的儿童通常比同龄儿童更容易疲倦并且总体力量更小。血流中的肌酸激酶(CPK-MM)水平极高。肌电图(electromyography，EMG)示出无力是由肌组织的破坏而不是由神经的损伤引起的。遗传测试可揭示Xp21基因中的遗传错误。肌肉活检(免疫组织化学或免疫印迹)或遗传测试(血液测试)证实缺乏肌养蛋白，虽然遗传测试的改进通常使得这不必要。·心肌异常(心肌病)
·充血性心力衰竭或不规则的心律(心律失常)
·胸部和背部的畸形(脊柱侧凸)
·小腿、臀部和肩膀的肌肉增大(约4或5岁)。这些肌肉最终被脂肪和结缔组织替代(假性肥大)。
·肌肉量损失(萎缩)
·脚跟、腿部肌肉挛缩
·肌肉畸形
·呼吸系统病症，包括肺炎和吞咽食物或流体进入肺中(在疾病的晚期)
C.原因

[0044] 迪谢内肌营养不良(DMD)由位于X染色体短臂上的基因座Xp21处的肌养蛋白基因突变引起。肌养蛋白负责通过含有许多亚基的蛋白质复合体连接每个肌纤维的细胞骨架与下面的基板(basal lamina)(胞外基质)。肌养蛋白的缺乏允许过量的钙穿透肌膜(细胞膜)。钙和信号转导通路的改变导致水进入线粒体中，然后破裂。

[0045] 在骨骼肌营养不良中，线粒体功能障碍引起应激诱导的胞质钙信号的放大和应激诱导的活性氧类(reactive-oxygen species，ROS)产生的放大。在涉及几种途径并且尚未清楚理解的复杂级联过程中，细胞内提高的氧化应激损害肌膜，并最终导致细胞死亡。肌纤维经历坏死并最终被脂肪和结缔组织替代。

[0046] DMD以X连锁隐性模式遗传。女性一般是疾病的携带者，而男性将受到影响。一般来说，女性携带者不知道她们携带突变，直到她们生了一个受影响的儿子。携带者母亲的儿子有50％的机会从他的母亲遗传有缺陷的基因。携带者母亲的女儿有50％的机会成为携带者，而有50％的机会具有两个正常的基因拷贝。在所有情况下，一个未受影响的父亲将正常的Y传给他的儿子或将正常的X传给他的女儿。X连锁隐性病症(例如DMD)的女性携带者可显示出根据其X失活模式的症状。

[0047] 人DMD基因外显子51之前的外显子缺失通过框外并置外显子来破坏开放阅读框(open reading frame，ORF)，代表了人DMD突变的最常见类型。原则上，外显子51的跳读可在13％具有外显子缺失的DMD患者中恢复DMD ORF。

[0048] 迪谢内肌营养不良的发病率为1/3,500名男性婴儿。肌养蛋白基因内的突变可遗传或者在种系传递过程中自发发生。D.诊断

[0049] 建议有该病症家族史的人进行遗传咨询。迪谢内肌营养不良可通过在妊娠期间进行的遗传研究以约95％的准确度检测。

[0050] DNA测试。肌养蛋白基因的肌肉特异性同种型由79个外显子构成，并且DNA测试和分析通常可鉴定外显子突变的特定类型或受影响的外显子。在大多数情况下DNA测试证实了诊断。

[0051] 肌肉活检。如果DNA测试未能发现突变，可进行肌肉活检测试。提取小份肌组织样品(通常用手术刀而不是针)，并且使用揭示肌养蛋白存在的染料。完全缺失该蛋白质表明患有该病症。

[0052] 在过去几年中，已经开发了检测更多的导致该病症之许多突变的DNA测试，并且不需要频繁地进行肌肉活检以确认迪谢内肌营养不良的存在。

[0053] 产前测试。DMD由X连锁隐性基因携带。男性只有一个X染色体，所以一个拷贝的突变基因将导致DMD。父亲不能将X连锁的性状传递给他们的儿子，所以突变由母亲传递。

[0054] 如果母亲是携带者，因此她的两个X染色体之一具有DMD突变，那么女孩将有50％的机会遗传该突变作为她的两个X染色体之一，并且成为携带者。男孩将有50％的机会遗传该突变作为他的一个X染色体，因此患有DMD。

[0055] 产前测试可判断他们未出生的孩子是否具有最常见的突变。有许多突变导致DMD，并且一些还没有被鉴定出来，所以遗传测试只有当患有DMD的家庭成员具有已经被鉴定的突变时才发挥作用。

[0056] 在侵入性测试(invasive testing)之前，重要的是确定的胎儿性别；尽管男性有时受这种X连锁疾病的影响，但女性DMD极为罕见。这可通过在16周时的超声扫描或更最近地通过胎儿游离DNA测试来实现。绒毛膜绒毛采样(chorion villus sampling，CVS)可在11至14周进行，并具有1％的流产风险。羊膜腔穿刺术可在15周之后进行，并具有0.5％的流产风险。胎儿血液采样可在约18周进行。在不清楚的基因测试结果的情况下，另一个选择是胎儿肌肉活检。E.治疗

[0057] 目前无法治愈DMD，并且管理机构已经认识到存在持续的医疗需求。对于某些突变使用外显子跳读治疗的1-2a期试验已经阻止其下降并且在行走方面产生小的临床改善。治疗通常旨在控制症状的发作以最大限度地提高生活质量，并且包括以下：·皮质类固醇(例如泼尼松龙和地夫可特)提高了能量和力量，并推迟某些症状的严重程度。
·随机对照试验(randomised control trial)已显示β-2-激动剂提高肌肉力量，但不改变疾病进展。大多数RCT对β2激动剂的随访时间仅约12个月，并因此在超过该时间框架之外不能外推结果。
·鼓励轻度、不刺激(non-jarring)的身体活动，例如游泳。不活动(例如卧床休息)可使肌肉疾病恶化。
·物理治疗有助于维持肌肉力量、灵活性和功能。
·矫形器具(例如支具(brace)和轮椅)可改善移动性和自我护理能力。在睡眠期间将脚踝保持在适当位置的合身可移动的腿部支具可推迟挛缩的发生。
·随着疾病的进展，适当的呼吸支持是重要的。
DMD的综合性多学科护理标准/指南已经由疾病控制和预防中心(the Centers for Disease Control and Prevention，CDC)制定，并且可在www.treat-nmd.eu/dmd/care/diagnosis-management-DMD获得。

[0058] 如在Bushby et al.，Lancet Neurol.，9(1)：77-93(2010)和Bushby et al.，Lancet Neurol.，9(2)：177-198(2010)(通过引用整体并入)中概述的，DMD通常通过五个阶段进展。在症状发生之前的阶段期间，患者通常表现出发育迟缓，但没有步态障碍。在早期可走动阶段期间，患者通常表现出高尔斯征、蹒跚的步态和脚趾行走。在晚期可走动阶段期间，患者通常表现出越来越吃力的步态，并且开始失去爬楼梯和从地板起来的能力。在早期不可走动阶段期间，患者通常能够自我行进一段时间，能够保持姿势，并且可发展为脊柱侧凸。在晚期不可走动阶段期间，上肢功能和姿势维持越来越受限。

[0059] 在一些实施方案中，治疗在疾病的症状发生之前的阶段开始。在一些实施方案中，治疗在早期可走动阶段开始。在一些实施方案中，治疗在晚期可走动阶段开始。在一些实施方案中，治疗在早期不可走动阶段期间开始。在一些实施方案中，治疗在晚期不可走动阶段期间开始。1.物理治疗

[0060] 物理治疗师关注使患者能够达到其最大身体潜能。他们的目的是：·通过制定适当的伸展和锻炼计划，使挛缩和畸形的发生最小化
·通过推荐支具和耐用的医疗设备，期望并最小化物理性质的其他继发性并发症·监测呼吸功能并对辅助呼吸训练的技术和清除分泌物的方法提供建议
2.呼吸辅助

[0061] 现代的“体积通气机/呼吸机(volume ventilator/respirator)”每次呼吸向人递送可调节体积(量)的空气，其对于治疗患有肌营养不良相关呼吸问题的人是有价值的。通气机可需要通过其直接递送空气的侵入性气管导管或气管切开插管，但是对于一些人来说，通过面罩或口器(mouthpiece)的非侵入性递送就足够了。在后一种方式中，有时使用气道正压力机(Positive airway pressure machine)，特别是双水平的压力机。呼吸设备可容易地安装在具有外部电池的电动轮椅底部或背部上的通气机托盘上以便携带。

[0062] 通气机治疗可从当呼吸肌开始衰竭的青少年的中后期开始。如果肺活量降至低于正常值的40％，则可在睡眠时间(即人最可能在低通气(“通气不足”)的时候)期间使用体积通气机/呼吸机。在睡眠期间的通气不足是由睡眠障碍的详尽病史以及血氧定量(oximetry)研究和毛细血管血气决定的(参见肺功能测试)。咳嗽辅助装置可通过用正气压的肺过度充气，然后用负压使黏液上升来帮助处理肺中的过多黏液。如果肺活量继续下降至少于正常值的30％，白天期间还可需要体积通气机/呼吸机以获得更多帮助。人们将根据需要在白天期间逐渐提高使用通气机/呼吸机的时间量。F.预后

[0063] 迪谢内肌营养不良是一种进行性疾病，其最终影响所有的随意肌并在后期涉及心肌和呼吸肌。目前估计寿命期望为约25岁，但这随患者而异。最近在医学上的进展正在延长那些患病者的生命。肌营养不良运动(Muscular Dystrophy Campaign)是关注所有肌肉疾病的主要英国慈善机构，其指出“随着高标准的医疗护理，患有迪谢内肌营养不良的年轻人通常在他们30多岁后仍生活得很好”。

[0064] 在极少数情况下，如果需要，使用在轮椅和床上适当的定位、通气机支持(通过气管切开术或口器)、气道清除和心脏药物，已看到患有DMD的人生存到四十多岁或五十多岁出头。对于晚年护理所需支持的早期计划已经表明患有DMD的人寿命更长了。

[0065] 奇怪的是，在迪谢内肌营养不良的mdx小鼠模型中，肌养蛋白的缺乏与提高的钙水平和骨骼肌肌坏死相关。喉内肌(intrinsic laryngeal muscle，ILM)受到保护，不会发生肌坏死。ILM具有钙调节系统谱，表明与其他肌肉相比，处理钙变化的能力更好，并且这可为其独特的病理生理学性质提供机理性启示。ILM可促进开发用于在多种临床情景下预防和治疗肌肉萎缩的新策略。II.CRISPR系统
A.CRISPR

[0066] CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)是包含碱基序列的短重复的DNA基因座。每个重复之后是来自先前暴露于病毒的“间隔区DNA”的短区段。在约40％的测序的真细菌基因组和90％的测序的古细菌中发现CRISPR。CRISPR通常与编码与CRISPR相关的蛋白质的cas基因相关。CRISPR/Cas系统是原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件(例如质粒和噬菌体)的抗性并提供获得性免疫的形式。CRISPR间隔区识别并沉默真核生物体中的这些外源遗传元件(例如RNAi)。

[0067] CRISPR重复序列的大小为24至48个碱基对。它们通常显示一些二重对称，这意味着形成二级结构例如发夹，但不是真正的回文结构。重复序列被相似长度的间隔区分开。一些CRISPR间隔区序列与来自质粒和噬菌体的序列准确地匹配，尽管一些间隔区与原核生物的基因组匹配(自靶向间隔区)。响应于噬菌体感染，可迅速添加新的间隔区。B.Cas核酸酶

[0068] CRISPR相关(cas)基因通常与CRISPR重复-间隔区阵列相关。截至2013年，已描述了超过四十个不同的Cas蛋白家族。在这些蛋白家族之中，Cas1看来在不同的CRISPR/Cas系统中是普遍存在的。cas基因和重复序列结构的特定组合已用于限定8种CRISPR亚型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube)，其中一些与编码重复序列相关神秘蛋白(repeat-associated mysterious protein，RAMP)的另外的基因模块相关。在单个基因组中可存在多于一种CRISPR亚型。CRISPR/Cas亚型的散发性分布(sporadic distribution)表明该系统在微生物进化期间经历水平基因转移。

[0069] 外源DNA明显地由Cas基因编码的蛋白质加工成小元件(长度为～30个碱基对)，然后以某种方式将其插入到靠近前导序列的CRISPR基因座中。来自CRISPR基因座的RNA是组成型表达的，并且被Cas蛋白加工成由具有侧翼重复序列的单独外源来源序列元件构成的小RNA。RNA指导其他Cas蛋白在RNA或DNA水平上沉默外源遗传元件。证据表明CRISPR亚型之间的功能多样性。Cse(Cas亚型Ecoli)蛋白(在大肠杆菌(E.coli)中称为CasA-E)形成功能复合体Cascade，其将CRISPR RNA转录物加工成保留Cascade的间隔区-重复序列单元。在另一些原核生物中，Cas6加工CRISPR转录物。有趣的是，大肠杆菌中基于CRISPR的噬菌体灭活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1和Cas2。在激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和另一些原核生物中发现的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白与小的CRISPR RNA形成功能性复合体，其识别和切割互补靶RNA。RNA指导的CRISPR酶被分类为V型限制酶。

[0070] Cas9是核酸酶(专用于切割DNA的酶)，具有两个活性切割位点，双螺旋的每条链各一个。该团队示出他们可使一个或这两个位点失效，同时保留Cas9之定位其靶DNA的能力。将tracrRNA和间隔区RNA合并成“单指导RNA”分子，其与Cas9混合，可找到并切割正确的DNA靶标，提出这样的合成指导RNA可能能够用于基因编辑。

[0071] Cas9蛋白在致病菌和共生细菌中高度富集。CRISPR/Cas介导的基因调节可有助于内源细菌基因的调节，特别是在与真核宿主的细菌相互作用期间。例如，新凶手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)的Cas蛋白Cas9使用独特的小的CRISPR/Cas相关RNA(scaRNA)来抑制编码细菌脂蛋白的内源性转录物，所述细菌脂蛋白对于新凶手弗朗西斯氏菌(F.novicida)抑制宿主应答和促进毒力是至关重要的。Wang et al.示出Cas9 mRNA和sgRNA共注射到种系(合子)产生的具有突变的小鼠中。也考虑了Cas9 DNA序列的递送。

[0072] 系统CRISPR/Cas分为三类。1类使用数种Cas蛋白与CRISPR RNA(crRNA)一起构建功能性内切核酸酶。2类CRISPR系统使用单个Cas蛋白和crRNA。Cpf1最近已被鉴定为含有1,300个氨基酸蛋白质的II类V型CRISPR/Cas系统。还参见美国专利公开No.2014/0068797，其通过引用整体并入。
C.Cpf1核酸酶

[0073] 来自普雷沃氏菌属和弗朗西斯氏菌属1的成簇规律间隔短回文重复序列或CRISPR/Cpf1是与CRISPR/Cas9系统共享一些相似性的DNA编辑技术。Cpf1是II类CRISPR/Cas系统的RNA指导的内切核酸酶。这种获得性免疫机制在普雷沃氏菌属和弗朗西斯氏菌属细菌中发现。其防止来自病毒的遗传损害。Cpf1基因与CRISPR基因座相关，编码使用指导RNA来发现和切割病毒DNA的内切核酸酶。Cpf1是比Cas9更小且更简单的内切核酸酶，克服了一些CRISPR/Cas9系统限制。

[0074] Cpf1出现在许多细菌物种中。被开发成用于基因组编辑的工具的最终Cpf1内切核酸酶取自已知携带它的前16种物种之一。

[0075] 在一些实施方案中，Cpf1是来自氨基酸球菌属(物种BV3L6，UniProt登录号U2UMQ6；SEQ ID NO.442)的Cpf1酶，其具有如下所示的序列：

[0076] 在一些实施方案中，Cpf1是来自毛螺菌科(物种ND2006，UniProt登录号A0A182DWE3；SEQ ID NO.443)的Cpf1酶，其具有如下所示的序列：

[0077] 在一些实施方案中，Cpf1经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，Cpf1经密码子优化以在人细胞中表达。

[0078] 在一些实施方案中，本公开内容的组合物包含来自细菌金黄色葡萄球菌的小型Cas9。小型Cas9提供优于野生型Cas9或全长Cas9的优势。

[0079] Cpf1基因座包含混合的α/β结构域、RuvC-I、其后是螺旋区、RuvC-II和锌指样结构域。Cpf1蛋白具有与Cas9的RuvC结构域类似的RuvC样内切核酸酶结构域。此外，Cpf1不具有HNH内切核酸酶结构域，并且Cpf1的N末端不具有Cas9的α-螺旋识别叶。

[0080] Cpf1 CRISPR-Cas结构域结构显示Cpf1在功能上是独特的，被归类为2类V型CRISPR系统。Cpf1基因座编码Cas1、Cas2和Cas4蛋白，其相比于II型系统更类似于I型和III型。数据库检索示出了许多细菌物种中Cpf1家族蛋白的丰度。

[0081] 功能性Cpf1不需要tracrRNA。因此，本公开内容的功能性Cpf1 gRNA可包含crRNA或由其组成。这有利于基因组编辑，因为Cpf1不仅是比Cas更小的核酸酶，而且它还具有更小的sgRNA分子(大约与Cas9的一半核苷酸一样多)。

[0082] Cpf1-gRNA(例如Cpf1-crRNA)复合体通过鉴定前间区序列邻近基序5’-YTN-3’(其中“Y”是嘧啶且“N”是任何核碱基)或5’-TTN-3’来切割靶DNA或RNA，与Cas9靶向的富含G的PAM相反。在鉴定PAM之后，Cpf1引入了4或5个核苷酸突出端的黏性末端样DNA双链断裂。

[0083] CRISPR/Cpf1系统包含Cpf1酶和指导RNA或由其组成，其存在于双螺旋上的正确位点处并定位复合体以切割靶DNA。在其天然细菌宿主中，CRISPR/Cpf1系统活动具有三个阶段：适应，在适应期间Cas1和Cas2蛋白促进DNA的小片段适应CRISPR阵列；
crRNA的形成：处理pre-er-RNA产生成熟crRNA以指导Cas蛋白；
以及
干扰，其中Cpf1与crRNA结合形成二元复合体以鉴定并切割靶DNA序列。

[0084] 该系统已被修改成利用非天然存在的crRNA，其将Cpf1指导至非细菌细胞(例如哺乳动物细胞)中的期望的靶序列。D.gRNA

[0085] 作为RNA指导的蛋白，Cas9需要短RNA以指导DNA靶标的识别。虽然Cas9优先地探询含有PAM序列NGG的DNA序列，但其可在没有前间区序列靶标的情况下在此结合。然而，Cas9-gRNA复合体需要与gRNA紧密匹配以产生双链断裂。细菌中的CRISPR序列在多个RNA中表达，并随后被加工以产生RNA的指导链。因为真核系统缺乏处理CRISPR RNA所需的一些蛋白质，所以创建合成构建体gRNA以将用于Cas9靶向的RNA的必需片段结合到用RNA聚合酶III型启动子U6表达的单个RNA中。合成的gRNA的最小长度稍微超过100bp，并且包含靶向就在PAM序列NGG之前的20个前间区序列核苷酸的部分；gRNA不包含PAM序列。

[0086] 在一些实施方案中，gRNA靶向野生型肌养蛋白基因内的位点。在一些实施方案中，gRNA靶向突变体肌养蛋白基因内的位点。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白内含子。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白外显子。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白外显子中的位点，该外显子以表1中所示一种或更多种肌养蛋白同种型表达并存在。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白剪接位点。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白基因上的剪接供体位点。在一些实施方案中，gRNA靶向肌养蛋白基因上的剪接接纳体位点。

[0087] 在一些实施方案中，指导RNA靶向突变体DMD外显子。在一些实施方案中，突变体外显子是外显子23或51。在一些实施方案中，指导RNA靶向肌养蛋白基因的外显子1、23、41、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55中的至少一个。在一些实施方案中，指导RNA靶向肌养蛋白基因的内含子44、45、50、51、52、53、54或55中的至少一个。在一些优选的实施方案中，指导RNA被设计成诱导外显子51或外显子23的跳读。在一些实施方案中，gRNA靶向外显子51或外显子23的剪接接纳体位点。

[0088] 用于本文中公开的方法和组合物的合适的gRNA作为SEQ ID NO.60至382提供。(表E)。在一些优选的实施方案中，gRNA选自SEQ ID No.60至SEQ ID No.382中的任一个。

[0089] 在一些实施方案中，本公开内容的gRNA包含与编码序列或对应于DMD基因的非编码序列内的靶序列互补的序列，并因此与靶序列杂交。在一些实施方案中，Cpf1的gRNA包含单个crRNA，其包含直接重复支架序列，然后是24个核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，crRNA的“指导”序列包含与靶序列互补的gRNA序列。在一些实施方案中，本公开内容的crRNA包含与靶序列不互补的gRNA序列。本公开内容的“支架”序列将gRNA与Cpf1多肽连接。本公开内容的“支架”序列不等同于gRNA-Cas9构建体的tracrRNA序列。
E.Cas9对比Cpf1

[0090] Cas9需要两个RNA分子来切割DNA，而Cpf1需要一个。所述蛋白质还在不同的地方切割DNA，为研究人员在选择编辑位点时提供了更多选择。Cas9在相同的位置切割DNA分子中的两条链，留下“平”末端。Cpf1留下比另一条更长的一条链，产生更易于使用的“黏性”末端。与Cas9相比，Cpf1看来更能够在切割位点插入新的序列。虽然CRISPR/Cas9系统可高效地使基因失能，但插入基因或产生敲入是具有挑战性的。Cpf1缺乏tracrRNA，利用富含T的PAM并通过交错的DNA DSB切割DNA。

[0091] 总之，Cpf1与Cas9系统之间的重要差异是Cpf1识别不同的PAM，实现新的靶向的可能性，产生4至5个nt长的黏性末端，而不是由Cas9产生的平端，提高遗传插入的效率和NHEJ或HDR期间的特异性，并远离PAM、远离Cas9切割位点切割靶DNA，实现切割DNA的新的可能性。F.CRISPR/Cpf1介导的基因编辑

[0092] 使用CRISPR/Cpf1编辑DMD基因的第一步是鉴定基因组靶序列。本公开内容的gRNA的基因组靶标可以是肌养蛋白基因内的任何～24个核苷酸DNA序列，前提是该序列与基因组的其余部分相比是独特的。在一些实施方案中，基因组靶序列在人肌养蛋白基因的外显子51、外显子45、外显子44、外显子53、外显子46、外显子52、外显子50、外显子43、外显子6、外显子7、外显子8和/或外显子55中。在一些实施方案中，基因组靶序列是人肌养蛋白基因的外显子51、外显子45、外显子44、外显子53、外显子46、外显子52、外显子50、外显子43、外显子6、外显子7、外显子8和/或外显子55的5’或3’剪接位点。在一些实施方案中，基因组靶序列是紧邻人肌养蛋白基因的外显子51、外显子45、外显子44、外显子53、外显子46、外显子52、外显子50、外显子43、外显子6、外显子7、外显子8和/或外显子55的上游或下游的内含子。示例性基因组靶序列可见于表D中。

[0093] 使用CRISPR/Cpf1编辑DMD基因的下一步是鉴定待靶向的遗传区域内的所有前间区序列邻近基序(PAM)序列。Cpf1利用富含T的PAM序列(TITN，其中N是任何核苷酸)。靶序列必须紧邻PAM的上游。一旦确定了所有可能的PAM序列和推定的靶位点，下一步就是选择哪个位点可能导致最高效的靶上切割。gRNA靶向序列需要匹配靶序列，并且gRNA靶向序列必须不匹配基因组内的其他位点。在一些优选的实施方案中，gRNA靶向序列与靶标具有完美的同源性而在基因组的其他地方没有同源性。在一些实施方案中，给定的gRNA靶向序列将在整个基因组中在存在部分同源性的地方具有另外的位点。这些位点被称为“脱靶”，并在设计gRNA时应予以考虑。一般来说，当在PAM序列附近发生错配时，脱靶位点不会被高效地切割，因此没有同源性的gRNA或具有邻近PAM序列的错配的那些将具有最高的特异性。除了“脱靶活性”之外，必须考虑使期望的靶序列的切割最大化的因子(“靶上活性”)。两种gRNA靶向序列(每种与靶DNA具有100％同源性)可以不产生相等的切割效率是本领域技术人员已知的。事实上，切割效率可依赖于所选的靶序列内的具体核苷酸而提高或降低。仔细检查每个潜在的gRNA靶向序列的预测的靶上活性和脱靶活性是设计最佳gRNA所必需的。已经开发了数种gRNA设计操作，其能够定位潜在的PAM和靶序列，并基于其的预测的靶上活性和脱靶活性对相关的gRNA进行排序(例如，CRISPRdirect，可在www.crispr.dbcls.jp获得)。

[0094] 下一步是合成并且克隆期望的gRNA。可以合成、退火靶寡聚物并使用标准限制性连接克隆将其插入到包含gRNA支架的质粒中。然而，准确的克隆策略将取决于所选择的gRNA载体。Cpf1的gRNA明显比Cas9的gRNA更简单，并且仅由单个crRNA组成，该单个crRNA包含直接重复支架序列，然后是～24个核苷酸的指导序列。Cpf1需要最少16个核苷酸的指导序列以实现可检测的DNA切割，并且最少18个核苷酸的指导序列以实现在体外的高效DNA切割。在一些实施方案中，使用20至24个核苷酸的指导序列。Cpf1 gRNA的种子区域通常在指导序列的5’末端上的前5个核苷酸内。Cpf1在靶基因组DNA中交错切割。在AsCpf1和LbCpf1中，切割发生在靶标(+)链上PAM之后的19bp和另一条链上的23bp处。

[0095] 然后，应在一个或更多个靶细胞系中验证每种gRNA。例如，在CRISPR和gRNA递送至细胞之后，可使用PCR扩增基因组靶区域并根据本领域技术人员已知的方法进行测序。

[0096] 在一些实施方案中，基因编辑可在体外或离体进行。在一些实施方案中，细胞在体外或离体与Cpf1和靶向肌养蛋白剪接位点的gRNA接触。在一些实施方案中，细胞与编码Cpf1和指导RNA的一种或更多种核酸接触。在一些实施方案中，使用例如脂质体转染或电穿孔将一种或更多种核酸引入细胞。基因编辑也可在合子中进行。在一些实施方案中，可用编码Cpf1和靶向肌养蛋白剪接位点的gRNA的一种或更多种核酸注射合子。随后可将合子注射到宿主中。

[0097] 在一些实施方案中，在载体上提供Cpf1。在一些实施方案中，载体包含来源于毛螺菌科细菌的Cpf1序列。参见例如Uniprot登录号A0A182DWE3；SEQ ID NO.443。在一些实施方案中，载体包含来源于氨基酸球菌属细菌的Cpf1序列。参见例如Uniprot登录号U2UMQ6；SEQ ID NO.442。在一些实施方案中，Cpf1序列经密码子优化以在人细胞中表达。在一些实施方案中，载体还包含编码荧光蛋白(例如GFP)的序列，其允许使用荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)来分选表达Cpf1的细胞。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体。

[0098] 在一些实施方案中，gRNA在载体上提供。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体。在一些实施方案中，Cpf1和指导RNA在相同载体上提供。在一些实施方案中，Cpf1和指导RNA在不同载体上提供。

[0099] 在一些实施方案中，细胞另外地与单链DMD寡核苷酸接触以实现同源定向修复。在一些实施方案中，小的INDEL恢复肌养蛋白的蛋白质阅读框(“重构”策略)。当使用重构策略时，细胞可与单种gRNA接触。在一些实施方案中，剪接供体位点或剪接接纳体位点被破坏，这导致外显子跳读和蛋白质阅读框的恢复(“外显子跳读”策略)。当使用外显子跳读策略时，细胞可与两种或更多种gRNA接触。

[0100] 可使用本领域技术人员已知的技术(例如T7E1测定)来评估体外或离体Cpf1介导的DNA切割的效率。可使用本领域技术人员已知的技术(例如RT-PCR、western印迹和免疫细胞化学)来证实DMD表达的恢复。

[0101] 在一些实施方案中，体外或离体基因编辑在肌细胞或卫星细胞中进行。在一些实施方案中，基因编辑在iPSC或iCM细胞中进行。在一些实施方案中，iPSC细胞在基因编辑之后分化。例如，iPSC细胞可在编辑之后分化成肌细胞或卫星细胞。在一些实施方案中，iPSC细胞分化成心肌细胞、骨骼肌细胞或平滑肌细胞。在一些实施方案中，iPSC细胞分化成心肌细胞。可根据本领域技术人员已知的方法诱导iPSC细胞分化。

[0102] 在一些实施方案中，使细胞与Cpf1和gRNA接触恢复了肌养蛋白表达。在一些实施方案中，已经在体外或离体编辑的细胞或由其来源的细胞显示出与野生型细胞相当的肌养蛋白蛋白质水平。在一些实施方案中，编辑的细胞或由其来源的细胞以野生型肌养蛋白表达水平的50％、60％、70％、80％、90％、95％或其间的任何百分比的水平表达肌养蛋白。在一些实施方案中，已经在体外或离体编辑的细胞或由其来源的细胞具有与野生型细胞相当的线粒体数量。在一些实施方案中，编辑的细胞或由其来源的细胞具有50％、60％、70％、80％、90％、95％或其间的任何百分比的与野生型细胞一样多的线粒体。在一些实施方案中，与基线处的未编辑细胞相比，编辑的细胞或由其来源的细胞显示氧消耗速率(OCR)的提高。
III.核酸递送

[0103] 如上所述，在某些实施方案中，表达盒(expression cassette)用于表达转录因子产物，以用于随后纯化和递送至细胞/对象，或直接用于基于遗传的递送方法。本文中提供了表达载体，其包含编码Cpf1和至少一种靶向肌养蛋白剪接位点的DMD指导RNA的一种或更多种核酸。在一些实施方案中，在相同载体上提供编码Cpf1的核酸和编码至少一种指导RNA的核酸。在另一些实施方案中，在分开的载体上提供编码Cpf1的核酸和编码至少一种指导RNA的核酸。

[0104] 表达需要在载体中提供适当的信号，并且包括多种来自病毒和哺乳动物来源二者的驱动目的基因在细胞中表达的调节元件(例如增强子/启动子)。还定义了设计用于优化宿主细胞中信使RNA稳定性和可翻译性的元件。还提供了使用多种显性药物选择标志物以建立表达产物的永久稳定细胞克隆的条件，以及将药物选择标志物的表达与多肽的表达联系起来的元件。A.调节元件

[0105] 在本申请通篇，术语“表达盒”意在包括含有编码基因产物的核酸的任何类型遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录和翻译，即，在启动子的控制下。“启动子”是指由起始基因的特异性转录所需的细胞的合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。短语“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向中以控制RNA聚合酶起始和基因的表达。“表达载体”意在包括包含在遗传构建体中的能够复制的表达盒，并因此包括一个或更多个复制起点、转录终止信号、poly A区、可选择标志物和多用途克隆位点。

[0106] 术语启动子在此将用于指在RNA聚合酶II的起始位点周围簇集的一组转录控制模块。关于如何组织启动子的大多数想法来自对数种病毒启动子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单位的那些。通过更新的工作而加强的这些研究已经示出启动子由离散的功能模块构成，各自由约7至20bp的DNA组成，并含有转录激活蛋白或阻遏蛋白的一个或更多个识别位点。

[0107] 每个启动子中至少一个模块用于定位RNA合成的起始位点。其最著名的实例是TATA盒(TATA box)，但是在缺少TATA盒的一些启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于固定起始位置。

[0108] 在一些实施方案中，本公开内容的Cpf1构建体由肌细胞特异性启动子表达。该肌细胞特异性启动子可以是组成型活性的或者可以是诱导型启动子。

[0109] 另外的启动子元件调节转录起始的频率。一般来说，这些位于起始位点上游30至110bp的区域中，但是最近已经示出许多启动子在起始位点下游也包含功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，以使得当元件相对于彼此倒置或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔在活性开始下降之前可提高至相距50bp。根据启动子，看来单个元件可合作地或独立地发挥作用以激活转录。

[0110] 在某些实施方案中，病毒促进例如人巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(Rous sarcoma virus long terminal repeat)、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶可用于获得目的编码序列的高水平表达。还考虑使用本领域中公知的另一些病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子来实现目的编码序列的表达，前提是表达水平对于给定目的是足够的。通过使用具有公知性质的启动子，可优化转染或转化之后目的蛋白质的表达水平和模式。此外，选择响应于特定生理信号而被调节的启动子可允许基因产物的诱导型表达。

[0111] 增强子是提高来自位于相同DNA分子上的远端位置之启动子的转录的遗传元件。增强子的组织很像启动子。也就是说，它们由许多单个元件构成，其各自与一个或更多个转录蛋白结合。增强子与启动子之间的基本区别是可操作性。增强子区域作为整体必须能够在一定距离处刺激转录；对于启动子区或其组成元件不需要这样。另一方面，启动子必须具有在特定位点和特定方向上指导起始RNA合成的一种或更多种元件，而增强子缺乏这些特异性。启动子和增强子通常是重叠和连续的，通常看来具有非常相似的模块化组织。

[0112] 启动子和/或增强子可以是例如：免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、T细胞受体、HLA DQ a和/或DQβ、β-干扰素、白介素-2、白介素-2受体、MHC II类5、MHC II类HLA-Dra、β-肌动蛋白、肌肉肌酸激酶(muscle creatine kinase，MCK)、前清蛋白(甲状腺素视黄质运载蛋白(transthyretin))、弹性蛋白酶I、金属硫蛋白(MTII)、胶原酶、白蛋白、甲胎蛋白、t-珠蛋白、β-球蛋白、c-fos、c-HA-ras、胰岛素、神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM)、α1-胰蛋白酶(α1-antitrypain)、H2B(TH2B)组蛋白、小鼠和/或I型胶原蛋白、葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA)、肌钙蛋白I(TN I)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、迪谢内肌营养不良、SV40、多瘤(polyoma)、逆转录病毒、乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus)。

[0113] 在一些实施方案中，可使用诱导型元件。在一些实施方案中，诱导型元件是例如：MTII、MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)、β-干扰素、腺病毒5 E2、胶原酶、溶基质蛋白酶、SV40、鼠MX基因、GRP78基因、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、MHC I类基因H-2κb、HSP70、增殖蛋白(proliferin)、肿瘤坏死因子和/或促甲状腺激素α基因。在一些实施方案中，诱导物是佛波酯(TFA)、重金属、糖皮质激素、聚(rI)x、聚(rc)、E1A、佛波酯(TPA)、干扰素、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)、A23187、IL-6、血清、干扰素、SV40大T抗原、PMA和/或甲状腺激素。本文中描述的任何诱导型元件可与本文中描述的任何诱导物一起使用。

[0114] 下面是可与表达构建体中编码目的基因的核酸组合使用的启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表。另外地，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动基因的表达。如果提供合适的细菌聚合酶作为递送复合体的一部分或作为另外的遗传表达构建体，则真核细胞可支持来自某些细菌启动子的胞质转录。

[0115] 特别感兴趣的是肌肉特异性启动子。这些包括：肌球蛋白轻链-2启动子、α-肌动蛋+ 2+白启动子、肌钙蛋白1启动子；Na/Ca 交换体启动子、肌养蛋白启动子、α7整联蛋白启动子、脑钠肽启动子和αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子、α-肌球蛋白重链启动子和ANF启动子。

[0116] 在一些实施方案中，本公开内容的Cpf1-gRNA构建体由肌细胞特异性启动子表达。该肌细胞特异性启动子可以是组成型活性的或者可以是诱导型启动子。

[0117] 在使用cDNA插入片段的情况下，通常将期望包含多腺苷酸化信号以实现基因转录物的适当多腺苷酸化。不认为多腺苷酸化信号的性质对于本文中所公开的方法的成功实施是至关重要的，并且可使用任何这样的序列，例如人生长激素和SV40多腺苷酸化信号。还考虑作为表达盒元件的是终止子。这些元件可用于增强信息水平并使从盒到其他序列中的通读最小化。B.2A肽

[0118] 本发明人利用来自昆虫病毒明脉扁刺蛾(Thosea asigna)β四体病毒的2A样自切割结构域(TaV 2A肽；SEQ ID NO.444；EGRGSLLTCGDVEENPGP)。已经显示这些2A样结构域在整个真核生物中发挥作用并导致氨基酸的切割在2A样肽结构域内共翻译地发生。因此，包含TaV 2A肽允许从单个mRNA转录物表达多种蛋白质。重要的是，当在真核系统中测试时，TaV的结构域表现出了大于99％的切割活性(Donnelly et al.，2001)。另一些可接受的2A样肽包括但不限于：马鼻炎病毒(equine rhinitis A virus，ERAV)2A肽(SEQ ID NO.445；QCTNYALLKLAGDVESNPGP)、猪捷申病毒1(porcine teschovirus-1，PTV1)2A肽(SEQ ID NO.446；ATNFSLLKQAGDVEENPGP)和口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，FMDV)2A肽(SEQ ID No.447；PVKQLLNFDLLKLAGDVESNPGP)或其经修饰形式。

[0119] 在一些实施方案中，2A肽用于同时表达报道分子(reporter)和Cfp1。报道分子可以是例如GFP。

[0120] 可使用的另一些自切割肽包括但不限于：核内含物蛋白a(nuclear inclusion protein a，Nia)蛋白酶、P1蛋白酶、3C蛋白酶、L蛋白酶、3C样蛋白酶或其经修饰形式。C.表达载体的递送

[0121] 存在许多可将表达载体引入到细胞中的方式。在某些实施方案中，表达构建体包含病毒或来自于病毒基因组的工程构建体。某些病毒通过受体介导的胞吞作用进入细胞，整合到宿主细胞基因组中并稳定且高效地表达病毒基因的能力已使其成为将外源基因转移到哺乳动物细胞中的有吸引力的候选物。这些对外来DNA序列具有相对低的容纳力，并且具有受限的宿主谱。此外，它们在允许细胞中的致癌潜力和细胞病变效应引起了安全性问题。它们可仅容纳达8kB的外来遗传物质，但可容易地引入多种细胞系和实验动物中。

[0122] 用于体内递送的一种优选方法涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意在包括含有足以(a)支持构建体包装和(b)表达其中已克隆的反义多核苷酸的腺病毒序列的那些构建体。在本发明上下文中，表达不需要合成基因产物。

[0123] 表达载体包括基因工程形式的腺病毒。对腺病毒(36kB的线性双链DNA病毒)的遗传组织的了解允许用高至7kB的外来序列取代大片段腺病毒DNA。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，原因是腺病毒DNA可以以附加体方式复制而没有潜在的遗传毒性。此外，腺病毒在结构上是稳定的，并且在大量扩增之后没有检测到基因组重排。腺病毒可感染几乎所有上皮细胞，而不论其细胞周期阶段如何。迄今为止，腺病毒感染看来仅与轻度疾病(例如人的急性呼吸系统疾病)相关。

[0124] 腺病毒特别适合用作基因转移载体，原因是其具有中等大小的基因组、易于操作、高效价、宽靶细胞范围和高感染性。病毒基因组的两端均含有100至200个碱基对的反向重复序列(inverted repeat，ITR)，其是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域包含不同的转录单位，其被病毒DNA复制的起始分开。E1区(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组和少数细胞基因的转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白质的合成。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭。晚期基因的产物(包括大多数病毒衣壳蛋白)仅在由主要晚期启动子(major  late promoter，MLP)产生的单一初级转录物的显著加工之后表达。在感染的晚期期间MLP(位于
16.8m.u.)特别有效，并且从该启动子产生的所有mRNA具有5’-三联前导(tripartite leader，TPL)序列，这使其成为用于翻译的优选mRNA。

[0125] 在一个系统中，重组体腺病毒由穿梭载体与原病毒载体之间的同源重组产生。由于两种原病毒载体之间的可能的重组，因此可从该过程产生野生型腺病毒。因此，从单个噬斑(plaque)分离单个病毒克隆并检查其基因组结构是至关重要的。

[0126] 产生和扩增复制缺陷型的现有腺病毒载体取决于独特的称为293的辅助细胞系，其通过Ad5 DNA片段从人胚肾细胞转化并组成型表达E1蛋白。由于E3区是腺病毒基因组所必需的，因此现有腺病毒载体在293细胞的帮助下在E1、D3或这两个区域中携带外来DNA。在自然界中，腺病毒可包装大约105％的野生型基因组，提供额外约2kb DNA的容量。加上在E1和E3区域中可被替代的约5.5kb的DNA，现有腺病毒载体的最大容量为7.5kb或载体总长度的约15％。载体骨架中保留超过80％的腺病毒病毒基因组并且是载体携带的细胞毒性的来源。此外，E1缺失的病毒的复制缺陷是不完全的。

[0127] 辅助细胞系可来自于人细胞，例如人胚胎肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或者其他人胚胎间充质或上皮细胞。或者，辅助细胞可来自于允许人腺病毒的其他哺乳动物物种的细胞。这样的细胞包括例如Vero细胞或其他猴胚胎间充质或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。

[0128] Racher et al.公开了用于培养293细胞和繁殖腺病毒的改进方法。在一种形式中，通过将单独细胞接种到含有100至200ml培养基的1升硅化旋转瓶(Techne，Cambridge，UK)中来培养天然细胞聚集体。在以40rpm搅拌后，用台盼蓝评估细胞生存力。在另一种形式中，如下使用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。将悬浮在5ml培养基中的细胞接种物添加至250ml锥形瓶中的载体(50ml)并静置1至4小时，偶尔进行搅拌。然后用50ml新鲜培养基更换培养基并开始摇动。对于病毒产生，允许细胞生长至约80％汇合，此后更换培养基(至最终体积的25％)，并添加0.05MOI的腺病毒。将培养物静置过夜，然后将体积提高至100％，并再开始摇动72小时。

[0129] 本公开内容的腺病毒是复制缺陷的或至少条件性复制缺陷的。除了要求腺病毒载体是复制缺陷型的或至少条件性缺陷的之外，不认为腺病毒载体的性质对成功实施本文中公开的方法至关重要。腺病毒可以是已知的42种不同血清型或A至F亚组中的任一种。亚组C的5型腺病毒是优选的起始材料以获得用于本公开内容的条件性复制缺陷型腺病毒载体。

[0130] 如上所述，根据本公开内容的典型载体是复制缺陷型的，并且不具有腺病毒E1区。因此，最方便的将是在E1编码序列已被去除的位置处引入编码目的基因的多核苷酸。然而，构建体在腺病毒序列内的插入位置不是关键的。如Karlsson et al.(1986)所述，编码目的基因的多核苷酸也可插入E3替代载体中来代替缺失的E3区，或者其中插入辅助细胞系或辅助病毒补充E4缺陷的E4区。

[0131] 腺病毒易于生长和操作并在体外和体内展示出广泛的宿主范围。这组病毒可以以高滴度获得，例如，109至1012噬斑形成单位/ml，并且它们是高度感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外来基因是附加体，因此对宿主细胞的遗传毒性低。在用野生型腺病毒进行疫苗接种的研究中未报道有副作用(Couch et al.，1963；Top et al.，1971)，表明了它们作为体内基因转移载体的安全性和治疗潜力。

[0132] 腺病毒载体已经用于真核基因表达和疫苗开发。动物研究表明，重组体腺病毒可用于基因治疗。将重组体腺病毒施用于不同组织的研究包括气管滴注(trachea instillation)、肌肉注射、外周静脉内注射以及向脑中立体定向(stereotactic)接种。

[0133] 逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征在于在所感染的细胞中通过逆转录过程将其RNA转化为双链DNA的能力。然后所得DNA稳定地整合到细胞染色体中作为原病毒(provirus)并指导病毒蛋白的合成。整合导致在接受细胞及其后代中保留病毒基因序列。逆转录病毒基因组含有分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分的三个基因gag、pol和env。
在gag基因上游存在的序列含有用于将基因组包装到病毒粒子中的信号。病毒基因组的5’和3’端有两个长末端重复(long terminal repeat，LTR)序列。这些含有强启动子和增强子序列，并且也是整合到宿主细胞基因组中所需要的。

[0134] 为了构建逆转录病毒载体，将编码目的基因的核酸插入到病毒基因组中某些病毒序列位置处以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子，构建了含有gag、pol和env基因但无LTR的包装细胞系和包装组分。当将含有cDNA的重组体质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起引入(例如通过磷酸钙沉淀)到该细胞系中时，包装序列使重组体质粒的RNA转录物包装成病毒颗粒，其随后分泌到培养基中。然后收集含有重组体逆转录病毒的培养基，任选地进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染很多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂。

[0135] 基于逆转录病毒的化学修饰，通过将乳糖残基化学添加至病毒包膜，最近开发了设计为使逆转录病毒载体特异性靶向的新方法。这种修饰可使得通过唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。

[0136] 可使用重组体逆转录病毒靶向的不同方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特定细胞受体的生物素化抗体。该抗体通过使用链霉亲和素通过生物素组分偶联。使用针对主要组织相容性复合体I类和II类抗原的抗体，其已经示出在体外用同向性病毒(ecotropic virus)感染带有那些表面抗原的多种人细胞(Roux et al.，1989)。

[0137] 在本公开内容的所有方面中使用逆转录病毒载体存在某些限制。例如，逆转录病毒载体通常整合到细胞基因组中的随机位点中。这可通过中断宿主基因或通过插入可干扰侧翼基因功能的病毒调节序列而导致插入诱变(insertional mutagenesis)。使用缺陷型逆转录病毒载体的另一个问题是在包装细胞中潜在出现有复制能力的野生型病毒。这可由其中来自重组体病毒的完整序列插入整合在宿主细胞基因组中的gag、pol、env序列的上游的重组事件引起。然而，现在可用的新的包装细胞系可大大降低重组的可能性(参见例如，Markowitz et al.，1988；Hersdorffer et al.，1990)。

[0138] 另一些病毒载体可用作本公开内容中的表达构建体。可采用来源于例如以下病毒的载体：痘苗病毒(vaccinia virus)、腺相关病毒(AAV)和疱疹病毒。它们为多种哺乳动物细胞提供了数个有吸引力的特征。

[0139] 在一些实施方案中，AAV载体是复制缺陷型的或条件性复制缺陷型的。在一些实施方案中，AAV载体是重组体AAV载体。在一些实施方案中，AAV载体包含分离自或来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或其任意组合的AAV载体的序列。在一些实施方案中，AAV载体不是AAV9载体。

[0140] 在一些实施方案中，使用单一病毒载体来将编码Cpf1和至少一种gRNA的核酸递送至细胞。在一些实施方案中，使用第一病毒载体向细胞提供Cpf1，并使用第二病毒载体向细胞提供至少一种gRNA。为了实现有义或反义基因构建体的表达，必须将表达构建体递送到细胞中。细胞可以是肌细胞、卫星细胞、成血管细胞(mesoangioblast)、骨髓来源的细胞、基质细胞或间充质干细胞。在一些实施方案中，细胞是心肌细胞、骨骼肌细胞或平滑肌细胞。在一些实施方案中，细胞是胫骨前肌、四头肌、比目鱼肌、膈肌或心脏中的细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)或内细胞团细胞(inner cell mass cell，iCM)。在另一些实施方案中，细胞是人iPSC或人iCM。在一些实施方案中，本公开内容的人iPSC或人iCM可来自于培养的干细胞系、成体干细胞、胎盘干细胞，或来自成体干细胞或胚胎干细胞的其他来源，其不需要破坏人胚胎。递送至细胞可在体外实现，如在用于转化细胞系的实验室过程中，或者在体内或离体实现，如在某些疾病状态的治疗中。一种递送机制是通过病毒感染，其中表达构建体被包封在感染性病毒颗粒中。

[0141] 本公开内容也考虑了用于将表达构建体转移到培养的哺乳动物细胞中的数种非病毒方法。这些包括磷酸钙沉淀(Graham and Van Der Eb，1973；Chen and Okayama，1987；Rippe et al.，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa et al.，1986；
Potter et al.，1984)、直接显微注射(Harland and Weintraub，1985)、负载DNA的脂质体(Nicolau and Sene，1982；Fraley et al.，1979)和lipofectamine-DNA复合体、细胞声处理(Fechheimer et al.，1987)、使用高速微粒的基因轰击(Yang et al.，1990)和受体介导的转染(Wu and Wu，1987；Wu and Wu，1988)。这些技术中的一些可成功地适于体内或离体使用。

[0142] 一旦表达构建体已被递送到细胞中，编码目的基因的核酸可在不同位点定位和表达。在某些实施方案中，编码基因的核酸可稳定整合到细胞的基因组中。这种整合可通过同源重组(基因置换)处于同源的位置和方向，或者其可整合到随机的非特异性位置中(基因增强)。在另一些实施方案中，核酸可作为单独的DNA的附加体区段稳定地保持在细胞中。这样的核酸区段或“附加体”编码这样的序列，所述序列足以允许独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步地维持和复制。如何将表达构建体递送至细胞以及在细胞中核酸保留在何处取决于所使用的表达构建体的类型。

[0143] 在另一个实施方案中，表达构建体可简单地由裸重组体DNA或质粒组成。构建体的转移可通过上述的物理或化学渗透细胞膜的任何方法进行。这特别地适用于体外转移，但也可应用于体内使用。Dubensky et al.(1984)成功地将磷酸钙沉淀形式的多瘤病毒DNA注射到成年和新生小鼠的肝和脾中，示出活性病毒复制和急性感染。Benvenisty and Neshif(1986)也示出直接腹膜内注射磷酸钙沉淀的质粒导致所转染基因的表达。编码目的基因的DNA也可以以类似的方式在体内转移并表达基因产物。

[0144] 在用于将裸DNA表达构建体转移到细胞中的另一个实施方案中，可涉及粒子轰击。这种方法取决于将DNA包被的微粒加速至高速以使其穿刺细胞膜并进入细胞而不杀伤它们的能力。已经开发了用于加速小颗粒的数种装置。一种这样的装置依赖于高电压放电以产生电流，其进而提供动力(Yang et al.，1990)。所用的微粒由生物惰性物质(例如钨或金珠)组成。

[0145] 在一些实施方案中，表达构建体直接递送至对象的肝、皮肤和/或肌组织。这可需要组织或细胞的手术暴露以消除枪和靶器官之间的任何中介组织，即离体处理。同样，编码特定基因的DNA可通过该方法递送，并且仍通过本公开内容并入。

[0146] 在另一个实施方案中，表达构建体可包载(entrap)在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊状结构。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自身重排，并且在脂质双层之间包载水和所溶解的溶质。还考虑了lipofectamine-DNA复合体。

[0147] 脂质体介导的体外核酸递送和外来DNA的表达已经非常成功。Wong et al.，(1980)示出在培养的鸡胚、HeLa和肝细胞肿瘤(hepatoma)细胞中脂质体介导的递送和外来DNA的表达的可行性。Nicolau et al.，(1987)在静脉内注射后在大鼠中实现了成功的脂质体介导的基因转移。称为Lipofectamine 2000TM的试剂被广泛使用并可商购。

[0148] 在某些实施方案中，脂质体可与血凝病毒(hemagglutinating virus，HVJ)复合。这已经示出促进与细胞膜的融合和促进脂质体包封的DNA的细胞进入。在另一些实施方案中，脂质体可与核的非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或联合使用。在另一些实施方案中，脂质体可与HVJ和HMG-1二者复合或联合使用。由于这样的表达构建体已经成功地用于体外和体内核酸的转移和表达，因此它们适用于本公开内容。当在DNA构建体中使用细菌启动子时，也将期望在脂质体内包括合适的细菌聚合酶。

[0149] 可用于将编码特定基因的核酸递送到细胞中的另一些表达构建体是受体介导的递送载剂。这些利用在几乎所有真核细胞中通过受体介导的胞吞作用选择性摄取大分子。由于多种受体的细胞类型特异性分布，因此递送可以是高度特异性的。

[0150] 受体介导的基因靶向载剂通常由两种组分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。数种配体已经用于受体介导的基因转移。最广泛表征的配体是无唾液酸血清类黏蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)和运铁蛋白(transferrin)。与ASOR识别相同的受体的合成拟糖蛋白(neoglycoprotein)已经用作基因递送载剂，而表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)也已经用于递送基因至鳞状癌细胞。IV.药物组合物和递送方法

[0151] 对于临床应用，药物组合物以适于预期应用的形式制备。通常来说，这需要制备基本上不含热原以及可对人或动物有害的其他杂质的组合物。

[0152] 使用合适的盐和缓冲液以使药物、蛋白质或递送载体稳定并允许被靶细胞摄取。本公开内容的水性组合物包含溶解或分散在可药用载体或水性介质中的有效量的药物、载体或蛋白质。短语“可药用的或药理学上可接受的”是指当向动物或人施用时不产生不利的、变应性的或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文中所用，“可药用的载体”包括用于配制药物(例如适合向人施用的药物)可接受的溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中公知的。可使用与本公开内容的活性成分不相容的任何常规介质或试剂、其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可并入到组合物中，前提是它们不使组合物的载剂或细胞失活。

[0153] 在一些实施方案中，本公开内容的活性组合物包括经典的药物制剂。根据本公开内容的这些组合物的施用可通过任何常见途径，只要通过该途径可到达靶组织即可，但通常包括全身施用。这包括经口、经鼻或含服(buccal)。或者，施用可通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射，或通过直接注射到肌组织中。如上所述，这样的组合物通常作为可药用组合物施用。

[0154] 活性化合物也可肠胃外或腹膜内施用。例如，作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在水中与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当地混合而制备。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制备物通常含有防腐剂以防止微生物的生长。

[0155] 可适于注射使用的药物形式包括例如无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。通常来说，这些制备物是无菌的和流动的，达到容易注射的程度。制备物在制造和储存条件下应当是稳定的，并且应当防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。合适的溶剂或分散介质可含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，以及植物油。可通过例如使用包衣(例如卵磷脂)，通过在分散体的情况下维持所需的粒度并通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。微生物作用的预防可通过多种抗细菌抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。

[0156] 可通过将适量的活性化合物以及所期望的任何其他成分(例如如上所列的)一起并入到溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常来说，通过将多种灭菌的活性成分并入到含有基础分散介质和所期望的其他成分(例如，如上面列举的)的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生来自其先前无菌过滤溶液的活性成分的粉末以及任何另外的所期望成分。

[0157] 在一些实施方案中，本公开内容的组合物配制成中性或盐形式。可药用盐包括例如来自于无机酸(例如，盐酸或磷酸)，或来自于有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等)的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。与蛋白质的游离羧基形成的盐也可来自于无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或来自于有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

[0158] 在配制时，优选以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的量施用溶液。制剂可易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。对于水溶液中的肠胃外施用，例如，溶液通常进行适当地缓冲，并且首先例如用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这样的水溶液可用于例如静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。优选地，特别是根据本公开内容，使用本领域技术人员已知的无菌水性介质。例如，单剂量可溶解在1ml的等张NaCl溶液中，并且添加至1000ml的皮下输液流体(hypodermoclysis fluid)或在所推荐的输注部位注射(参见例如″Remington′s Pharmaceutical Sciences″15th Edition，pages 1035-1038 and 1570-1580)。根据被治疗的对象的病症，剂量将必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定个体对象的适当剂量。此外，对于人施用，制备物应满足FDA生物制品标准办公室(FDA Office of Biologics standards)要求的无菌性、热原性、整体安全性和纯度标准。

[0159] 在一些实施方案中，可使用过继细胞转移(adoptive cell transfer，ACT)将本文中所述的Cpf1和gRNA递送至患者。在过继细胞转移中，将一种或更多种表达构建体离体提供给源自患者(自体)或源自除患者之外的一个或更多个个体(同种异体)的细胞。随后将细胞引入或重新引入到患者中。因此，在一些实施方案中，在将细胞引入或重新引入至患者之前，将编码Cpf1和靶向肌养蛋白剪接位点的指导RNA的一种或更多种核酸离体提供给细胞。V.序列表

[0160] 下表提供了与本文中公开的组合物和方法联合使用的示例性引物序列和gRNA序列。表C-引物序列
表D-基因组靶序列
*在该表中，大写字母表示与基因的外显子序列匹配的核苷酸。小写字母表示与基因的内含子序列匹配的核苷酸。
表E-gRNA序列
*在该表中，大写字母表示与基因的外显子序列匹配的sgRNA核苷酸。小写字母表示与基因的内含子序列匹配的sgRNA核苷酸。
VI.实施例

[0161] 包括以下实施例以示出本公开内容的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表由本发明人发现的用于实施本公开内容的运行良好的技术，并因此被认为是实施本发明的一些优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。实施例1-材料和方法

[0162] 产生pLbCpf1-2A-GFP和pAsCpf1-2A-GFP质粒。从由Feng Zhang惠赠的(Addgene质粒#69988)pY016质粒(Zetsche et al.，2015)(pcDNA3.1-hLbCpf1)和由Feng Zhang惠赠的(Addgene质粒#69982)pY010质粒(Zetsche et al.，2015)(pcDNA3.1-hAsCpf1)分别PCR扩增人经密码子优化的LbCpf1和AsCpf1。将Cpf1 cDNA和T2A-GFP DNA片段克隆到由Feng Zhang(Addgene质粒#48138)惠赠的pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒的主链中(Ran et al.，2015)，所述质粒用AgeI/EcoRI切割以去除SpCas9(BB)-2A-GFP。使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara Bio)。使用BbsI消化和T4连接将靶向人DMD或小鼠Dmd基因座的Cpf1指导RNA(gRNA)亚克隆到新产生的pLbCpf1-2A-GFP质粒和pAsCpf1-2A-GFP质粒中。详细的引物序列可见于表C中，基因组靶序列可以见于表D中，并且gRNA序列可以见于表E中。

[0163] 人iPSC维持、核转染和分化。将人iPSC在mTeSRTM1培养基(STEMCELL Technologies)中培养，并且大约每4天传代一次(1∶18分流比(split ratio))。在核转染之前1小时，用10μM ROCK抑制剂(Y-27632)处理iPSC，并使用Accutase(Innovative Cell 
6
Technologies，Inc.)将其解离成单个细胞。将1×10个iPSC细胞与5μg pLbCpf1-2A-GFP或pAsCpf1-2A-GFP质粒混合，并使用P3原代细胞4D-Nucleofector X试剂盒(Lonza)根据制造商的方案进行核转染。在核转染之后，在补充有10μM ROCK抑制剂、青霉素-链霉素(1∶100)(ThermoFisher Scientific)和100μg/ml Primosin(InvivoGen)的mTeSRTM1培养基中培养iPSC。在核转染之后3天，通过FACS分选GFP(+)和(-)细胞并对其进行T7E1测定。单克隆来自于GFP(+)。挑选iPSC并进行测序。如先前所述(Burridge et al.2014)，诱导iPSC分化成心肌细胞。

[0164] 基因组DNA分离。使用Quick-gDNA MiniPrep试剂盒(Zymo Research)根据制造商的方案分离小鼠10T1/2成纤维细胞和人iPSC的基因组DNA。

[0165] RT-PCR。使用TRIzol(ThermoFisher Scientific)根据制造商的方案分离RNA。使用iScript逆转录Supermix(Bio-Rad Laboratories)根据制造商的方案合成cDNA。使用DMD外显子47和52侧翼的引物进行RT-PCR：正向：5’-CCCAGAAGAGCAAGATAAACTTGAA-3’(SEQ ID NO：1)；
反向：5’-CTCTGTTCCAAATCCTGCTTGT-3’(SEQ ID NO：2)
从WT心肌细胞、未校正的心肌细胞和外显子51跳读的心肌细胞扩增的RT-PCR产物分别为717bp、320bp和87bp。

[0166] 肌养蛋白Western印迹分析。如先前所述(Long et al.，2014)使用兔抗肌养蛋白抗体(Abcam，ab15277)和小鼠抗心肌肌球蛋白重链抗体(Abcam，ab50967)进行Western印迹分析。

[0167] 肌养蛋白免疫细胞化学和免疫组织化学。iPSC来源的心肌细胞用丙酮固定、用血清混合物(2％正常马血清/2％正常驴血清/0.2％牛血清白蛋白(BSA)/PBS)封闭并用肌养蛋白抗体(MANDYS8，1∶800，Sigma-Aldrich)和肌钙蛋白-I抗体(H170，1∶200，Santa Cruz Biotechnology)在0.2％BSA/PBS中孵育。在4℃过夜孵育之后，将其用二抗(生物素化的马抗小鼠IgG，1∶200，Vector Laboratories，荧光素缀合的驴抗兔IgG，1∶50，Jackson Immunoresearch)孵育1小时。将细胞核用Hoechst 33342(Molecular Probes)复染。

[0168] 如先前所述(Long et al.，2014)使用肌养蛋白抗体(MANDYS8，1∶800，Sigma-Aldrich)进行骨骼肌的免疫组织化学。将细胞核用碘化丙啶(Molecular Probes)复染。

[0169] 线粒体DNA拷贝数的量化。使用Trizol分离基因组DNA和线粒体DNA，然后如先前所述(Zechner et al.，2010)进行反向提取(back extraction)。使用KAPA SYBR FAST qPCR试剂盒(Kapa Biosystems)进行实时PCR以定量地确定线粒体DNA拷贝数。使用引物(正向：5’-CGCCACATCTACCATCACCCTC-3’(SEQ ID NO：3)；反向：5’-CGGCTAGGCTAGAGGTGGCTA-3’(SEQ ID NO：4))扩增人线粒体ND1基因。使用引物(正向：5’-GAGTATGCAGAAGCCCCGAGTC-3’(SEQ ID NO：5)；反向：5’-TCAACATGCCCAACTGGTTTCTGG-3’(SEQ ID NO：6))扩增人基因组LPL基因。使用以下公式计算每个二倍体基因组的mtDNA拷贝数：
ΔCT＝(mtND1 CT-LPL CT)
每个二倍体基因组的mtDNA拷贝数＝2×2-ΔCT

[0170] 细胞呼吸速率。如先前所述(Baskin et al.，2014)使用XF24胞外通量分析仪(Extracellular Flux Analyzer)(Seahorse Bioscience)按照制造商的方案在人iPSC来源的心肌细胞中确定氧消耗速率(OCR)。

[0171] LbCpf1 mRNA和gRNA的体外转录。从pLbCpf1-2A-GFP PCR扩增人经密码子优化的LbCpf1以包含T7启动子序列(表S1)。使用mMESSAGE mMACHINE T7转录试剂盒(ThermoFisher Scientific)根据制造商的方案转录PCR产物。合成的LbCpf1 mRNA用大肠杆菌聚(A)聚合酶(New  England Biolabs)进行聚-A加尾并使用NucAway离心柱
(ThermoFisher Scientific)进行纯化。

[0172] 从pLbCpf1-2A-GFP质粒PCR扩增用于LbCpf1 gRNA体外转录的模板，并使用Wizard SV凝胶和PCR净化系统(PCR clean-up system)(Promega)进行纯化。使用MEGAshortscript T7转录试剂盒(ThermoFisher Scientific)根据制造商的方案合成LbCpf1 gRNA。使用NucAway离心柱(ThermoFisher Scientific)纯化所合成的LbCpf1 gRNA。

[0173] 单链寡脱氧核苷酸(Single-stranded oligodeoxynucleotide，ssODN)。ssODN用作HDR模板，并通过Integrated DNA Technologies合成为4nM的超聚体寡核苷酸(Ultramer Oligonucleotide)。将ssODN与LbCpf1 mRNA和gRNA直接混合，无需纯化。ssODN的序列为：

[0174] 通过单细胞胚胎注射的CRISPR-Cpf1介导的基因组编辑。所有动物操作均由德克萨斯大学西南医学中心的机构动物管理和使用委员会(the Institutional Animal Care and Use Committee at the University of Texas Southwestern Medical Center)批准。如先前所述(Long et al.，2014)进行注射操作。唯一的修改是用LbCpf1 mRNA和LbCpf1 gRNA替换Cas9 mRNA和Cas9 sgRNA。

[0175] 基因组DNA的PCR扩增、T7E1测定和TseI RFLP分析。如先前所公布的(Long et al.，2014)进行这些方法。

[0176] 统计分析。通过双尾t检验(two-tailed Student’s t-test)评估统计分析。数据作为平均值±SEM示出。P＜0.05的值被认为是统计学上显著的。实施例2-结果

[0177] 通过Cpf1介导的基因组编辑校正DMD iPSC来源的心肌细胞。人DMD基因外显子51之前的外显子缺失通过框外并置外显子来破坏开放阅读框(ORF)，代表了人DMD突变的最常见类型(Aartsma-Rus et al.，2009)。原则上，外显子51的跳读可在13％具有外显子缺失的DMD患者中恢复DMD ORF(Cirak et al.，2011)。为了测试Cpf1校正这种类型的“热点”突变的潜力，本发明人使用DMD成纤维细胞来源的iPSC(Riken HPS0164，缩写为Riken51)，其具有外显子48至50的缺失，引入外显子51内的过早终止密码子(图1A)。

[0178] 剪接接纳体区域通常富含T/C(Padgett，2012)，其产生用于通过Cpf1内切核酸酶进行的基因组编辑的理想PAM序列(图1B)。为了挽救Riken51 iPSC中的肌养蛋白表达，本发明人使用Cpf1 gRNA靶向外显子51，通过NHEJ在外显子51中引入小的插入和缺失(insertion and deletion，INDEL)并随后理论上地在三分之一的经校正基因中重构肌养蛋白ORF，这是本发明人称为“重构”的过程(图1A)。他们还比较了两种Cpf1种间同源物(ortholog)、LbCpf1(来自毛螺菌科细菌物种ND2006；UniProt登录号A0A182DWE3；SEQ ID No.443)和AsCpf1(来自氨基酸球菌属物种BV3L6；SEQ ID No.442)，其使用相同的PAM序列用于基因组切割。

[0179] 使用克隆到质粒pLbCpf1-2A-GFP和pAsCpf1-2A-GFP中(图1D)的指导RNA(称为g1)将Cpf1切割靶向外显子51的富含T的剪接接纳体位点(图1C)。这些质粒表达人经密码子优化的LbCpf1或AsCpf1，加上GFP；使得能够对表达Cpf1的细胞进行荧光激活细胞分选(FACS)(图1D)。最初，本发明人评价了在人293T细胞中用g1进行的Cpf1编辑的切割效率。LbCpf1和AsCpf1二者都高效地诱导用g1进行DNA切割，如使用识别和切割非完美匹配的DNA的T7E1测定所检测的(图1E)。

[0180] 接下来，本发明人使用LbCpf1和AsCpf1用g1来编辑Riken51 iPSC，并且通过T7E1测定，本发明人观察到DMD外显子51处的基因组切割(图1E)。将来自Cpf1编辑的DMD外显子51的基因组PCR产物克隆并测序(图6A)。他们在LbCpf1编辑的和AsCpf1编辑的Riken51 iPSC二者中均观察到外显子51剪接接纳体位点附近的INDEL(图6A)。挑选来自重构的Riken51 iPSC混合物的单克隆并扩增，并对编辑的基因组区域进行测序。在12种克隆中，本发明人观察到4种具有重构DMD外显子51的克隆，其恢复了ORF(图6B)。

[0181] 在Cpf1介导的重构之后，在DMD iPSC来源的心肌细胞中恢复肌养蛋白表达。使用重构策略通过CRISPR-Cpf1编辑的Riken51 iPSC被诱导以分化成心肌细胞(Burridge et al.，2014)(图2A)。通过RT-PCR使用靶向外显子47的正向引物和靶向外显子52的反向引物来鉴定具有重构的DMD基因的心肌细胞，并对PCR产物进行测序(图2B至2C)。未校正的iPSC来源的心肌细胞在外显子51编码的前8个氨基酸之后具有过早的终止密码子，其产生过早终止密码子(图2C)。从Cpf1编辑的Riken51 iPSC分化的心肌细胞显示了DMD ORF的恢复，如通过来自外显子47至52的扩增之RT-PCR产物的测序所见到的(图2C)。本发明人还使用肌养蛋白抗体通过Western印迹分析和免疫细胞化学证实了肌养蛋白蛋白质表达的恢复(图2D至2E)。令人惊讶的是，即使没有克隆选择和扩增，从Cpf1编辑的iPSC混合物分化的心肌细胞示出了与WT心肌细胞相当的肌养蛋白蛋白质水平(图2D)。

[0182] 从LbCpf1编辑的Riken51 iPSC的混合物中，本发明人挑选了具有不同尺寸的框内INDEL的两个克隆(克隆#2和#5)，并将克隆分化成心肌细胞。克隆#2具有在外显子51的5’末端的8bp缺失，以及外显子48至50的内源性缺失。总的405bp的缺失恢复了DMD ORF并允许产生具有135个氨基酸缺失的截短的肌养蛋白蛋白质。克隆#5具有在外显子51中的17bp缺失并产生具有138个氨基酸缺失的肌养蛋白蛋白质。尽管Cpf1切割的效率高，但是在切割位点插入或缺失的DNA的量不同。另外地，INDEL可在编辑的基因座处产生额外的密码子，引起ORF的改变。由克隆#2心肌细胞表达的肌养蛋白蛋白质在外显子47与外显子51之间产生额外的四个氨基酸(Leu-Leu-Leu-Arg)，而由克隆#5心肌细胞表达的肌养蛋白蛋白质仅产生一个另外的氨基酸(Leu)。从克隆#2和#5二者，本发明人通过Western印迹分析和免疫细胞化学观察到恢复的肌养蛋白蛋白质(图2F至2G)。由于肌养蛋白的大尺寸，内部缺失的形式在SDS-PAGE上与WT肌养蛋白类似地迁移。

[0183] 本发明人还通过测量线粒体DNA拷贝数和细胞呼吸速率进行DMD iPSC来源的心肌细胞的功能分析。未校正的DMD iPSC来源的心肌细胞具有比LbCpf1校正的心肌细胞显著更少的线粒体(图2H)。在LbCpf1介导的重构之后，两种经校正的克隆将线粒体数量恢复至与WT心肌细胞的线粒体数量相当的水平(图2H)。与在基线处的未校正的iPSC来源的心肌细胞相比，克隆#2iPSC来源的心肌细胞也显示出氧消耗速率(OCR)的提高(图2I)。在所有iPSC来源的心肌细胞中寡霉素抑制OCR，并且用解偶联剂FCCP的处理增强OCR。最后，用鱼藤酮和抗霉素A的处理进一步抑制了所有心肌细胞中的OCR。这些结果示出，Cpf1介导的DMD校正改善了校正的iPSC-心肌细胞中线粒体的呼吸能力。我们的发现表明，Cpf1介导的重构是挽救人心肌细胞中DMD表型的高效策略。

[0184] 通过Cpf1介导的外显子跳读恢复DMD iPSC来源的心肌细胞中的肌养蛋白表达。与引入小INDEL的单gRNA介导的重构方法相反，外显子跳读使用两种gRNA来破坏剪接位点并产生大的缺失(图3A)。作为恢复Riken51 iPSC中肌养蛋白表达的独立策略，本发明人设计了靶向内含子50的3’末端的两种LbCpf1 gRNA(g2和g3)并测试了在人293T细胞中的切割效率。T7E1测定显示，与g3相比，g2在内含子50内具有更高的切割效率(图3B)。因此，本发明人将LbCpf1、g2和g1(g1靶向外显子51的5’区域)共递送到Riken51 iPSC中，目的是破坏外显子51的剪接接纳体位点。基因组PCR在LbCpf1编辑的iPSC中示出了较低的条带(图3C)并且测序数据证实了内含子50与外显子51之间～200bp缺失的存在，这破坏了保守的剪接接纳体位点(图3D)。

[0185] 通过外显子跳读策略用g1和g2编辑的Riken51 iPSC分化为心肌细胞。通过RT-PCR使用靶向外显子47的正向引物和靶向外显子52的反向引物来鉴定携带所编辑的DMD等位基因的细胞；其示出了外显子51剪接接纳体位点的缺失，这允许外显子51的跳读(图3E)。RT-PCR产物的测序证实了外显子47被剪接至外显子52，这恢复了DMD ORF(图3F)。Western印迹分析和免疫细胞化学证实了用g1和g2进行LbCpf1编辑的心肌细胞的混合物中肌养蛋白蛋白质表达的恢复(图3G至3H)。因此，通过外显子跳读策略的Cpf1编辑在挽救人心肌细胞中的DMD表型中是高效的。

[0186] 通过Cpf1介导的校正恢复mdx小鼠中的肌养蛋白。为了进一步评价体内Cpf1介导的Dmd校正的潜力，本发明人使用LbCpf1通过HDR介导的校正或NHEJ介导的重构来永久地校正mdx小鼠种系中的突变。由于C至T的转换，mdx小鼠携带在Dmd基因的外显子23中的无义突变(图4A)。筛选靶向外显子23的三种gRNA(g1、g2和g3)并在小鼠10T1/2成纤维细胞中测试其切割效率(图4B)。T7E1测定揭示了LbCpf1和AsCpf1在Dmd外显子23处具有不同的切割效率(图4C)。基于测序结果，与g3相比，使用g2的LbCpf1介导的基因组编辑在小鼠成纤维细胞中产生更多的INDEL发生(图6C)。

[0187] 使用g2的LbCpf1编辑识别突变位点上游9bps的PAM序列，并在突变位点的下游8bp产生交错的双链DNA(图4D)。为了获得HDR基因组编辑，本发明人使用与LbCpf1和g2组合的180bp单链寡脱氧核苷酸(ssODN)，因为已经显示ssODN在引入基因组修饰方面比双链供体质粒更高效(Wu et al.，2013；Long et al.，2014)。如先前所述(Long et al.，2014)，他们产生了包含切割位点侧翼的90bp同源序列的ssODN，其包含四个沉默突变和TseI限制位点，以促进基因型分型。该ssODN被设计成与LbCpf1和g2一起使用以通过HDR校正Dmd外显子23内的C至T突变并恢复mdx小鼠中的肌养蛋白。

[0188] 通过LbCpf1介导的HDR校正mdx小鼠中的肌营养不良。用体外转录的LbCpf1 mRNA、体外转录的g2 gRNA和180bp ssODN共注射mdx合子并将其重新植入假孕雌性中(图5A)。通过T7E1测定和TseI RFLP(限制性片段长度多态性)分析LbCpf1编辑的mdx小鼠的三窝幼崽(litter)(图5B至5C)。在出生的24只幼崽中，12只是T7E1阳性的并且5只携带经校正的等位基因(mdx C1至C5)，如通过TseI RFLP和测序所检测的(图5C至5D)。在4周龄时分析来自WT、mdx和LbCpf1校正的mdx-C小鼠的骨骼肌(胫骨前肌和腓肠肌-跖肌)。肌肉的苏木精和伊红(Hematoxylin and eosin，H&E)染色示出了mdx肌肉中的纤维化和炎性浸润，而LbCpf1校正的(mdx-C)肌肉显示出了正常的肌肉形态并且没有营养不良表型的体征(图5E和图7A至7B)。免疫组织化学显示mdx小鼠的肌肉切片中不存在肌养蛋白阳性纤维，而通过LbCpf1介导的HDR校正的mdx-C肌肉示出了大多数肌纤维中的肌养蛋白蛋白质表达(图5F和图7A至
7B)。这些发现表明，LbCpf1介导的种系DNA的编辑可有效地预防小鼠中的肌营养不良。
实施例3-讨论

[0189] 在该研究中，本发明人示出了新发现的CRISPR-Cpf1核酸酶可高效地校正患者来源的iPSC和mdx小鼠中的DMD突变，从而允许恢复肌养蛋白表达。已经显示DMD中缺乏肌养蛋白会破坏肌膜的完整性，导致线粒体功能障碍和氧化应激(Millay et al.，2008；Mourkioti et al.，2013)。他们发现，与未校正的DMD iPSC来源的心肌细胞相比，LbCpf1校正的iPSC来源的心肌细胞中线粒体DNA提高并且氧消耗速率更高。通过Cpf1介导的基因组编辑还挽救了人DMD iPSC来源的心肌细胞的代谢异常。本发明人的发现还示出了Cpf1在小鼠基因组编辑中的稳健性和效率。通过使用HDR介导的校正，小鼠Dmd基因的ORF完全恢复，并且还挽救了营养不良表型(例如纤维化和炎性浸润)的病理生理学特征。

[0190] 使用LbCpf1介导的基因组编辑，应用两种不同的策略-“重构”和“外显子跳读”来恢复DMD基因的ORF。重构通过将框外密码子置于框内来产生小的INDEL并恢复ORF。重构需要仅一种gRNA。尽管通过免疫细胞化学本发明人未观察到在WT肌养蛋白蛋白质与重构的肌养蛋白蛋白质之间亚细胞定位的任何差异，但他们在单独的编辑的克隆中观察到肌养蛋白表达水平、线粒体DNA量和氧消耗速率的差异，表明重构的肌养蛋白与WT肌养蛋白可以不是结构上或功能上相同的。

[0191] 关于与Cpf1编辑一起使用一种或两种gRNA，应考虑多种问题。在此，本发明人表明，对于与重构相比的剪接接纳体位点的破坏，两种gRNA比一种gRNA更有效。当使用两种gRNA时，Cpf1编辑切除间插区域，且不仅去除了剪接接纳体位点，而且还可被设计成去除有害的“AG”核苷酸，消除产生假剪接接纳体位点的可能性。然而，对于两种gRNA，存在这两种gRNA同时切割的必要，这可以不发生。如果两种gRNA中仅一种切割，则不会产生期望的缺失。然而，依然存在用两种gRNA中的一种切割将在靶向的外显子区域处产生INDELS从而重构ORF的可能性，因为理论上，INDELS的三分之一将在框内。使用一种gRNA来破坏剪接接纳体位点看来更高效，因为其消除了发生两种同时切割的需要。然而，关于通过一种gRNA介导的编辑产生的INDEL的长度存在不确定性。更重要的是，对于一种gRNA，依然存在在切割位点附近留下可充当替代的假剪接接纳体位点的外显子“AG”核苷酸的可能性。

[0192] 凭借其独特的富含T的PAM序列，Cpf1进一步扩展了CRISPR家族的基因组编辑范围，这对于其他疾病相关突变的潜在校正是重要的，因为并非所有突变位点都包含用于SpCas9的富含G的PAM序列或用于其他Cas9直系同源物的PAM。此外，通过Cpf1产生的交错切割对于NHEJ介导的基因组编辑也可以是有利的(Maresca et al.，2013)。最后，本研究中使用的LbCpf1比最广泛使用的SpCas9小140个氨基酸，这将增强AAV的包装和递送。为了评价Cpf1的靶向特异性，两个组(Kim et al.，2016；Tsai et al.，2016)通过多种方法确定了LbCpf1和AsCpf1的全基因组编辑效率。这两项研究均表明LbCpf1和AsCpf1具有与SpCas9的效率相当的高的全基因组靶向效率以及高的靶向特异性，因为LbCpf1和AsCpf1不可耐受5’PAM近端区域的错配，从而降低了脱靶效应的频率。

[0193] 这些发现表明，Cpf1在体外和体内校正人DMD和小鼠Dmd突变中是高度地高效的。CRISPR-Cpf1介导的基因组编辑代表了永久地消除基因突变并挽救与DMD和其他病症相关的异常的新且强大的方法。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊

[0194] 根据本公开内容，可制备和实施本文中公开和要求保护的所有组合物和/或方法而无需过度实验。虽然已经根据一些优选实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员将明显的是，在不脱离本公开内容的概念、精神和范围的情况下可对本文中描述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，明显的是，化学和生理学二者相关的某些试剂可代替本文中所述的试剂，而会获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有此类类似的替代和修改均被认为在由所附权利要求书所限定的本公开内容的精神、范围和概念内。VI.参考文献

[0195] 以下参考文献就其提供补充本文中阐述内容的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。Angel et al.，Mol.Cell.Biol.，7：2256，1987a.
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