抗草鱼出血病病毒工程蛋白TAT-VP7-TAT及制备方法和应用
阅读：255发布：2023-03-14
专利汇可以提供抗草鱼出血病病毒工程蛋白TAT-VP7-TAT及制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了抗草鱼出血病病毒工程蛋白TAT-VP7-TAT及制备方法和应用。TAT-VP7-TAT蛋白的 氨 基酸序列为SEQ ID NO：2所示，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。利用基因工程菌肠埃希氏菌Eschierichia coli BL21(DE3)/pET-32a-TAT-VP7-TAT诱导表达4-5h，可高效表达TAT-VP7-TAT融合蛋白，此蛋白的N端和C端都带有蛋白转导结构域多肽TAT。本发明提供基因工程融合蛋白可用于 预防 草鱼出血病毒病。融合蛋白的表达量大，易于工业化生产，成本低，安全性好。草鱼口服此融合蛋白，达到了很好的免疫保护。，下面是抗草鱼出血病病毒工程蛋白TAT-VP7-TAT及制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种人工制备的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述蛋白对应的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的序列，其特征在于：所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
4.一种表达权利要求1所述蛋白的基因工程菌，其特征在于：大肠埃希氏菌 Eschierichia coli BL21(DE3)/pET-32a-TAT-VP7-TAT，保藏编号：CCTCC NO:M2015111。
5.权利要求1所述蛋白的制备方法，包括将基因工程菌用IPTG或乳糖自动诱导表达4-5h，所述的基因工程菌为：大肠埃希氏菌 Eschierichia coli BL21(DE3)/pET-32a-TAT-VP7-TAT，保藏编号：CCTCC NO:M2015111。
6.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求4所述的基因工程菌在制备治疗或预防草鱼出血病病毒病药物中的应用。
抗草鱼出血病病毒工程蛋白TAT-VP7-TAT及制备方法和应
用
技术领域
[0001] 本发明属于基因生物工程技术领域，具体涉及抗草鱼出血病病毒工程蛋白TAT-VP7-T AT及制备方法和应用，更具体涉及到一种5’和3’端分别连接蛋白转导结构域多肽(TAT-PTD)的基因序列的融合蛋白基因TAT-VP7-TAT亚单位疫苗，同时还涉及到一种大肠杆菌基因工程菌株一种N端和C端都带有蛋白转导结构域多肽的草鱼出血病病毒(GCRV)衣壳蛋白VP7融合蛋白的基因工程菌株；还涉及上述菌株表达的融合蛋白在抗草鱼出血病病毒的药物中的用途。
背景技术
[0002] 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是中国淡水的主要养殖品种，是“四大家鱼”之一。草鱼的饲养成本低，养殖范围广，产量约占中国淡水养殖总产量的20％，对中国农业经济的发展具有重要的意义。但其养殖过程病害较多，除了细菌性疾病和寄生虫病之外，草鱼出血病可引起草鱼大批死亡，其中草鱼种苗阶段受感染的死亡率高达90％，给生产养殖带来了巨大的损失。
[0003] 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)又称草鱼出血病病毒(Grass Carp Hae morrhage Virus,GCHV)主要引起草鱼在鱼种阶段发生出血病。该病主要在草鱼鱼种阶段出现，它能引起鱼种的大量死亡，具有极高的感染率和致死率，并且流行范围广、发病季节长。1983年从草鱼出血病中分离出一株草鱼出血病病毒，根据其特性将其定名为草鱼呼肠孤病毒，该病毒隶属水生呼肠孤病毒属，是中国分离的第一种鱼类病毒。GCRV病毒粒子为二十面体，呈5∶3∶2对称球形颗粒，直径为65～72nm，核心直径约为50nm，无囊膜，具有双层衣壳。GCRV是双链RNA(dsRNA)病毒，基因组由11条分节段的dsRNA组成，基因组片段按分子量分为三组，即大片段(L1-L3)、中片段(M4-M6)和小片段(S7-S11)。这11条dsRNA共编码12种蛋白，包含7种结构蛋白和5种非结构蛋白，根据蛋白电泳迁移率将7种结构蛋白按从大到小的顺序依次命名为VP1-VP7，其中VP1、VP3、VP5、VP6、VP7蛋白是构成病毒蛋白衣壳的组分；5种非结构蛋白分别命名为NS16、NS26、NS31、NS38、NS80，它们在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。
[0004] 免疫预防是有效防治草鱼出血病的主要方法，尽管中国已有灭活的草鱼出血热病毒的传统疫苗，在应用上也有一定的效果，但这种传统的疫苗，用活体鱼来扩增病毒，其病毒来源十分困难、难以形成产业化；即便如此，如采用注射免疫，实际应用不可取，如苗期采用浸泡使用，则到了大塘也用不起，且浸泡法在免疫机制上也说不清道不明,故病毒亚单位疫苗的研究对于防治此病至关重要。VP5-VP7蛋白复合体形成草鱼出血病病毒的外层蛋白衣壳，其中VP5蛋白由M6基因编码，含有648个氨基酸残基，分子量约为68.6kDa，可能在病毒感染过程中起到诸如细胞渗透的作用。VP7蛋白由S10基因编码，含有276个氨基酸残基，分子量约为29.8kDa，它含有1个锌指序列，可以调节基因表达，该蛋白可能与病毒与宿主细胞的相互作用以及病毒入侵宿主有关。研究表明，VP5和VP7抗体都能与抗原中和(Yongxing He,Hongxu Xu,Qian Yang,Dan Xu,Liqun Lu.The use of an in vitro micr oneutralization assay to evaluate the potential of recombinant VP5protein as an antigen fo r vaccinating against Grass carp reovirus[J].Virology Journal,20118:132)(Zhang L L，She n J Y,Fang Q，et al.High level expression of grass carp reovirus VP7protein in prokar yotic cells[J].Virologica Siniea,2008,23(1):51-56)。VP7蛋白具有较好的抗原性，其抗体中和活性是VP5的3倍，表明VP7可能是GCRV主要的抗原决定簇(Shao L，Sun X,Fang Q,Antibodies against outer-capsid proteins of grass carp reovirus expressed in E.coli are c apable of neutralizing viral infectivity.Virology Journal,2011，8:347)。体外中和试验也表明VP7多克隆抗体具有中和活性，使研制GCRV亚单位疫苗成为可能(He Y X，Yang Q，Xu H X，et al.Prokaryotic expression and purification of grass carp reovirus capsid protei n VP7and its vaccine potential.African Journal of Microbiology Research,2011，5(13):1643-1648)。在水产养殖中，口服疫苗是一种最有效的防病治病方法。利用基因工程技术，大肠杆菌作为宿主菌表达出亚单位疫苗蛋白，经过分离纯化后作为饲料添加剂，是符合水产养殖的有效途径。
[0005] 蛋白质转导结构域(protein transduction domain，PTD)是一条以肽为载体的有效运输各种物质进入细胞及细胞核的系统。通过PTD携带的物质有全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40nm磁珠和200nm脂质体等。现在研究最多、应用最广的蛋白转导域来源于人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的转录激活因子(Trans-activating transcriptional activator，Tat)。T at蛋白中存在3个功能结构域：位于N-端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Tat蛋白共有86个氨基酸，Schwarze等确定具有蛋白转导功能的最小肽段是47-57，由11个氨基酸组成，其序列为YG RKKRRQRRR，含有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，等电点为12.7，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变，说明TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。TAT可以将与之相连的多肽或蛋白质在数分钟内转导进入细胞，而且在体内可以通过血液循环运输至脑组织，跨越血脑屏障进入神经元或胶质细胞内，转导速度快，效率高。已有研究显示，几十种化合物和蛋白质被成功转导进入不同的细胞或者跨越血脑屏障，并表现出了相应的生物活性(Yi Zhang,Jian-Fang Ning,Xing-qin Qu,X iao-Lin Meng,Jin-Ping Xu。TAT-mediated oral subunit vaccine against white spot syndro me virus in crayfish,Journal of Virological Methods,2012,181:59–67.专利号：CN 102206660B)。
[0006] 尽管对于TAT蛋白质转导结构域的穿膜功能研究的比较多，但是到目前为止，TAT蛋白质转导结构域进入细胞的分子机制还没有完全研究清楚。早期研究认为是通过直接转运机制穿过细胞膜，且是不依赖于能量的，但最近的研究也有与这一观点不同的结果。尽管其进入细胞的机制还没有完全研究透彻，但TAT蛋白质转导结构域的应用已经十分广泛。将TA T的跨膜转导区域编码的基因与外源蛋白基因进行融合表达，为异缘蛋白穿过细胞膜，进入细胞内部提供了一条新的途径。因此，利用首尾TAT与VP7蛋白融合，经草鱼口服产生免疫，是防治草鱼出血病的有效方法，具有重要的科学意义和应用价值。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种融合蛋白TAT-VP7-TAT，其序列为SEQ ID NO.2所示。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供融合蛋白TAT-VP7-TAT对应的的核苷酸序列，优选编码序列为SEQ ID NO.1所示。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种大肠杆菌基因工程菌株，该菌株可以高效表达N端和C端都带有蛋白转导结构域多肽TAT的草鱼出血病病毒衣壳蛋白VP7融合蛋白TAT-VP7-TAT。其优点是融合蛋白表达量大，易于工业化生产，成本低，安全性好。该菌株已于2015年3月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠埃希氏菌Eschierichia coli BL21(DE3)/pET-32a-TAT-VP7-TAT，保藏编号：CCTCC NO:M2015111，地址：中国武汉武汉大学。
[0010] 本发明的另一个目的是在于提供了一种重组基因工程融合蛋白TAT-VP7-TAT亚单位疫苗的制备方法，能够预防草鱼出血病，在预防草鱼出血病上有较好的保护效果。
[0011] 本发明的最后一个目的是基因工程融合蛋白TAT-VP7-TAT在制备和预防草鱼出血病病毒的药物中的应用。
[0012] 本发明提供本发明提供的融合蛋白TAT-VP7-TAT能够有效的预防草鱼出血病。重组融合蛋白TAT-VP7-TAT经过草鱼口服后，融合蛋白TAT-VP7-TAT可以穿过肠组织而进入血液，使亚单位疫苗可以不经肌肉注射而直接进入血液中，通过血液循环，使其融合蛋白到达不同的组织，主动刺激机体产生抗病毒作用。
[0013] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0014] 本发明的技术要点之一是表达基因工程重组融合蛋白TAT-VP7-TAT的大肠杆菌基因工程菌株的构建及诱导表达。
[0015] 一种重组融合蛋白TAT-VP7-TAT亚单位疫苗的制备方法，其步骤如下：
[0016] 1.获得大肠杆菌密码子优化的GCRV外衣壳蛋白TAT-VP7-TAT基因。
[0017] 人工合成基因TAT-VP7-TAT，其序列为SEQ ID NO.1所示，并连接在pGEM-T载体上，即构建了质粒pGEM-T-TAT-VP7-TAT。
[0018] 将质粒pGEM-T-TAT-VP7-TAT转化大肠杆菌E.coli DH5α，得到菌株E.coli DH5αpG EM-T-TAT-VP7-TAT，用于基因的增值和保藏。
[0019] 2.融合基因pET32a-TAT-VP7-TAT表达载体的构建
[0020] 从菌株E.coli DH5αpGEM-T-TAT-VP7-TAT中提取质粒pGEM-T-TAT-VP7-TAT，经B amHⅠ和HindⅢ酶切，得到目的片段TAT-VP7-TAT。将pET32a载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切，琼脂糖凝胶电泳，胶回收，得到载体pET32a(+)。将目的片段和载体22℃连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经鉴定，得到的阳性重组子即为含有TAT-VP7-TAT基因的大肠杆菌，该质粒命名为：pET32a-TAT-VP7-TAT。
[0021] 3.大肠杆菌工程菌的制备
[0022] 将质粒pET32a-TAT-VP7-TAT转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。得到的阳性转化子经PCR鉴定为阳性的菌落即为能表达融合蛋白的大肠杆菌重组基因工程菌BL21(DE3)p ET32a-TAT-VP7-TAT。
[0023] 通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-32a-TAT-VP7-TAT，该菌株已于2015年3月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠埃希氏菌Eschierichia coli BL21(DE3)/pET-32a-TAT-VP7-TAT，保藏编号：CCTCC N O:M2015111，地址：中国武汉武汉大学。
[0024] 该工程菌具有如下特征：(1)显微镜下观察，大小1-3微米，周身鞭毛，能运动，无芽孢，为革兰氏阴性短杆菌。(2)在普通的LB平板中培养，其菌落菌落形态为光滑型，菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈白灰色，氨苄霉素抗性，好氧性细菌，培养基为L B培养基，配方为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，pH 7.0。(3)兼性厌氧性菌，最适生长温度为37℃，可用IPTG或乳糖自动诱导表达，代谢旺盛，诱导表达4-5h即可达蛋白最大表达量。
[0025] 一种重组基因工程融合蛋白TAT-VP7-TAT亚单位疫苗的制备方法，如下：
[0026] 重组基因工程菌株Escherichia coli BL21pET32a-TAT-VP7-TAT的单菌落接种于含100μg/ml Amp的20ml LB液体培养基中，于37℃摇床300rpm过夜培养10-12h。第二天，按1：100的比例接种到100ml新鲜的含100μg/ml Amp的2×YT培养基液体培养基中，37℃、250rpm培养3h左右，至OD600为0.6-0.8时，在超净台里取1ml菌液作为诱导前的对照。加诱导剂IPTG至终浓度为0.6mM，于37℃摇床250rpm诱导表达4-5h。将菌液4℃，
12000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。用适量PBS缓冲液重悬菌体，400W超声破碎20min，
8000rpm离心20min。破碎后的沉淀经8M尿素变性后4℃，8000rpm，离心10min，收集上清，融合蛋白TAT-VP7-TAT的纯化按Ni-NTA说明书进行，用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果，得到纯化的TAT-VP7-TAT。TAT-VP7-TAT进行复性透析后，即为具有生物学活性的基因工程融合蛋白。其序列为SEQ ID NO.2所示，其特征在于：融合蛋白具有草鱼穿肠功能，融合蛋白的分子量为50.9kDa。
12000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。用适量PBS缓冲液重悬菌体，400W超声破碎20min，
8000rpm离心20min。破碎后的沉淀经8M尿素变性后4℃，8000rpm，离心10min，收集上清，融合蛋白TAT-VP7-TAT的纯化按Ni-NTA说明书进行，用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果，得到纯化的TAT-VP7-TAT。TAT-VP7-TAT进行复性透析后，即为具有生物学活性的基因工程融合蛋白。其序列为SEQ ID NO.2所示，其特征在于：融合蛋白具有草鱼穿肠功能，融合蛋白的分子量为50.9kDa。
[0027] 一种重组融合蛋白TAT-VP7-TAT在制备预防或治疗草鱼出血病毒病药物中的应用，直接将该蛋白口服投喂草鱼，或是与其他辅料混合制备成其他生物疫苗口服投喂草鱼即可。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0028] 本发明与现有报道的VP7亚单位疫苗相比，其优势在于：
[0029] 1)本发明所涉及的N端和C端都带有蛋白转导结构域多肽TAT的融合蛋白TAT-VP7-TAT，TAT可以携带VP7蛋白不经肌肉注射而直接进入血液中，解决了亚单位疫苗可以不经肌肉注射而直接进入血液中，具有实际操作的可行性。与单一的TAT-VP7融合蛋白相比，TAT-VP7-TAT蛋白由于N,C两末端分别带有一个TAT序列，其所带的正电荷要远远高于T AT-VP7蛋白，而TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，所以TAT-VP7-TAT蛋白的穿膜活性会大大增强，用量减少，免疫反应更迅速，起到更强的抗病毒作用，对于草鱼出血病有更高、更长久的保护效果。
[0030] 2)利用大肠杆菌表达TAT蛋白转导结构域和GCRV外衣壳蛋白VP7的融合蛋白，将融合蛋白作为亚单位疫苗防治草鱼出血病。TAT-VP7-TAT重组蛋白通过血液在鱼体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了对于GCRV病毒的竞争中和的作用，同时也增强了鱼体内的免疫酶活作用，使鱼体产生更强的免疫因子，抗病能力更强。
[0031] 3)将蛋白转导结构域多肽TAT和VP7融合表达。TAT可以携带VP7蛋白不经肌肉注射而直接进入血液中。解决了亚单位疫苗可以不经肌肉注射而直接进入血液中，解决了疫苗的群体免疫问题，具有实际操作的可行性。因为TAT-VP7-TAT蛋白的穿膜活性更高，其作为抗病毒药物的用量将减少，效率提高，经济效益更好。因此本发明公开的基因工程菌株的构建方法，其表达量大，操作简单，成本低，安全性好，可以应用于大规模的草鱼养殖业中。
[0032] 4)本发明专利提供的基因工程融合蛋白TAT-VP7-TAT的N端和C端都带有蛋白转导结构域多肽TAT。虽然TAT与蛋白质结合转导进入细胞已被作为制备多种抗病毒药物的方法，如专利CN 102206660 B，并且专利CN 103184230 A中也提到将TAT与VP7蛋白融合表达。但是，到目前为止，在国内外还未见在目的蛋白的N端和C端同时带有TAT序列的报道。从理论上，TAT-VP7-TAT蛋白由于带有两个TAT序列，其所带的正电荷要远远高于TAT-VP7蛋白，而TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，所以TAT-VP7-TAT蛋白的穿膜活性将会大大增强，蛋白的利用率有明显的提高。
[0033] 5)利用大肠杆菌表达TAT蛋白转导结构域和GCRV外衣壳蛋白VP7的融合蛋白，将融合蛋白作为亚单位疫苗防治草鱼出血病。由于TAT-VP7-TAT蛋白的正电荷的增强、N端和C末端都可穿膜，大大提高跨膜活性，其进入草鱼体内的效率增强，免疫反应更迅速，起到更强的抗病毒作用。因此，TAT-VP7-TAT融合蛋白可以作为抗草鱼出血病病原的疫苗药物应用于草鱼养殖业，能够显著提高草鱼的抗病能力，有更高、更长久的保护效果。附图说明
[0034] 图1为一种重组表达质粒pET-32a(+)-TAT-VP7-TAT的构建过程示意图。
[0035] 图2为一种重组表达质粒pET-32a(+)-TAT-VP7-TAT的酶切鉴定示意图。
[0036] 图2中：1，DL2000分子标准；2，质粒pET32a-TAT-VP7-TAT经BamHⅠ和HindⅢ双酶切；3，质粒pET32a-TAT-VP7-TAT经HindⅢ单酶切；4，质粒pET32a-TAT-VP7-TAT经B amHⅠ单酶切；5，质粒pET32a-TAT-VP7-TAT；6，DNA MarkerⅣ分子标准。
[0037] 图3为TAT-VP7-TAT经大肠杆菌诱导表达及其融合蛋白的纯化电泳示意图。
[0038] 图3中：M，蛋白Marker；2，未诱导的BL21pET32a-TAT-VP7-TAT菌液；3，未诱导的BL21pET32a-TAT-VP7-TAT破碎液上清；4，未诱导的BL21pET32a-TAT-VP7-TAT破碎液沉淀；5，诱导后的BL21pET32a-TAT-VP7-TAT菌液；6，诱导后的BL21pET32a-TAT-VP7-TAT破碎液上清；7，诱导后的BL21pET32a-TAT-VP7-TAT破碎液沉淀；8，纯化的T AT-VP7-TAT融合蛋白；9，纯化的TAT-VP7融合蛋白。
[0039] 图4为一种草鱼血清的ELISA检测示意图。
[0040] 图5为一种重组融合蛋白TAT-VP7-TAT亚单位疫苗和TAT-VP7亚单位疫苗穿肠能力的ELISA检测示意图。具体实施方式：
[0041] 下面结合附图及具体实施例子对本发明作进一步的说明。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的内容请参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。
[0042] 实施例1：
[0043] 融合基因TAT-VP7-TAT的制备，包括以下步骤：
[0044] 从美国生物技术中心(NCBI)基因库中获得了成熟的GCRV的VP7蛋白的氨基酸序列，将VP7基因的序列转换成含有大肠杆菌偏好密码子的核苷酸序列，并根据蛋白转导结构域多肽TAT编码的基因与外源蛋白基因能够进行融合表达的特性，在优化后的VP7基因序列的5’和3’端分别连接TAT的核苷酸序列，命名为：TAT-VP7-TAT，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
[0045] 人工合成TAT-VP7-TAT基因，并连接到pGEM-T载体上，即合成了质粒pGEM-T-TAT-VP7-TAT。
[0046] 将质粒pGEM-T-TAT-VP7-TAT转化大肠杆菌E.coli DH5α(由Novagen公司购得，本实验室保种)，得到菌株E.coli DH5α(pGEM-T-TAT-VP7-TAT)，用于基因的增值和保藏。
[0047] 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞，大肠杆菌感受态细胞采用E.coli DH5α，其步骤和方法，按照分子克隆实验指导进行。
[0048] 大肠杆菌感受态细胞制备，其步骤是：
[0049] ①用接种环挑取固体LB平板上新活化的大肠杆菌DH5α单菌落，接种到20ml液体L B培养基中，37℃，300rpm摇动活化过夜。(以下步骤均需无菌操作)
[0050] ②取200ul上述活化的大肠杆菌于新鲜的20ml液体LB培养基中，37℃，300rpm摇床培养2-3小时至OD600值约为0.6。
[0051] ③取1.5ml上述菌液于无菌Eppendorf管中，冰上放置30min。4000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。
[0052] ④加入200ul冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬菌体沉淀，冰浴30分钟，4000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。
[0053] ⑤加入100ul冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬沉淀，即为感受态细胞，置于4℃保存，24h内使用为宜。
[0054] 取1ul质粒pGEM-T-TAT-VP7-TAT转化大肠杆菌BL21DH5α感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为含有融合基因TAT-VP7-TAT的E.coli DH5αpGEM-T-TAT-VP7-TAT。
[0055] 实施例2：
[0056] 表达质粒的构建。
[0057] 实施例1中质粒pGEM-T-TAT-VP7-TAT经BamHⅠ和HindⅢ酶切后，在琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下迅速切下欲回收的条带，用康为世纪琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，将单一的目的DNA条带放入干净的Eppendorf管中，称取重量。向胶块中加入三倍体积的溶胶液PG(凝胶重为0.1g，其体积可视为100uL，以此类推)。60℃水浴10分钟，其间每隔2分钟温和上下翻转Eppendorf管，以确保胶块充分溶解。向吸附柱中添加250μl的Bu ffer PS，静置2min后12000rpm离心2min，倒掉收集管中的液体。将所得溶液取750ul加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温(20-25℃)放置2分钟，12000rpm离心
2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。将溶胶液转移到吸附柱中，在室温静止2min后12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。向吸附柱中加入500μl Bu ffer PG，室温下作用1min后，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。再向吸附柱中加入650μl Buffer PW，室温下静置1min后，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。再重复加一次
650μl Buffer PW，室温下静置1min后，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。再次
12000rpm离心2min，37℃下放置几分钟至乙醇彻底晾干。将吸附柱放入无菌的Eppendorf管中，在膜中间悬空加入30μl的经过60℃水浴预热处理过的ddH2O，室温下放置2min，在
12000rpm离心2min，Eppendorf管中收集获得的溶液即为酶切产物。
2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。将溶胶液转移到吸附柱中，在室温静止2min后12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。向吸附柱中加入500μl Bu ffer PG，室温下作用1min后，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。再向吸附柱中加入650μl Buffer PW，室温下静置1min后，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。再重复加一次
650μl Buffer PW，室温下静置1min后，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。再次
12000rpm离心2min，37℃下放置几分钟至乙醇彻底晾干。将吸附柱放入无菌的Eppendorf管中，在膜中间悬空加入30μl的经过60℃水浴预热处理过的ddH2O，室温下放置2min，在
12000rpm离心2min，Eppendorf管中收集获得的溶液即为酶切产物。
[0058] 将纯化的酶切产物和质粒pET32a连接，连接体系如下：
[0059]
[0060] 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，其步骤是：
[0061] ①无菌条件下取连接产物10ul，加入到100ul大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。(以下步骤均需无菌操作)
[0062] ②42℃水浴中热激90秒，迅速移至冰中冰浴2-3分钟。
[0063] ③加入800ul液体LB培养基，37℃，150rpm轻摇，温育45min使细胞复苏。
[0064] ④4000rpm离心10分钟，吸取800ul上清弃去，将剩余菌液用移液枪轻轻混匀。
[0065] ⑤将上述菌液用无菌三角玻棒均匀涂布在含100μg/ml Amp的固体LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被全部吸收，倒置平板于37℃培养箱中培养过夜。得到E.coli DH5αpET32a-TAT-VP7-TAT的菌落。
[0066] 阳性重组子pET32a-TAT-VP7-TAT的酶切鉴定：
[0067] 用碱裂解法提取E.coli DH5αpET32a-TAT-VP7-TAT质粒，对提取的质粒进行单、双酶切反应，酶切体系如下：
[0068]
[0069] 酶切反应条件为37℃，时间为3h，产物经琼脂糖凝胶电泳分析结果。
[0070] 实施例3：
[0071] pET32a-TAT-VP7-TAT工程菌的构建。
[0072] 取1ul质粒pET32a-TAT-VP7-TAT转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为能够融合表达TAT-VP7-TAT的重组基因工程菌株Esch erichia coli BL21pET32a-TAT-VP7-TAT。
[0073] 该菌株已于2015年3月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：大肠埃希氏菌Eschierichia coli BL21(DE3)/pET-32a-TAT-VP7-TAT，保藏编号：CCTCC NO:M2015111，地址：中国武汉武汉大学。
[0074] 实施例4：
[0075] 基因工程融合蛋白TAT-VP7-TAT的表达。
[0076] ①重组基因工程菌株Escherichia coli BL21pET32a-TAT-VP7-TAT的单菌落接种于含100μg/ml Amp的20ml LB液体培养基中，于37℃摇床300rpm过夜培养10-12h。
[0077] ②第二天，按1：100的比例接种到100ml新鲜的含100μg/ml Amp的2×YT液体培养基中，37℃、250rpm培养3h左右，至OD600为0.6-0.8时，在超净台里取1mL菌液作为诱导前的对照。加诱导剂IPTG至终浓度为0.6mM，于37℃摇床250rpm诱导表达4-5h。
[0078] ③将菌液4℃，12000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。用适量PBS缓冲液重悬菌体，400W超声破碎破3s，停5s，20min，然后4℃，12000rpm离心2min，取50μL上清与等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液混匀，制得破碎上清样品。弃去上清，用适量无菌水重悬沉淀，取50μL与等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液混匀，制得破碎沉淀样品。
[0079] ④将每组样品置于沸水中煮5-10min，进行SDS-PAGE电泳，检测TAT-VP7-TAT蛋白是否表达，并且是可溶性表达还是形成包涵体。电泳结束后，卸下凝胶，在考马斯亮蓝染色液(2.0g考马斯亮蓝R-250，450ml甲醇，450ml ddH2O，100ml冰醋酸)中染色3个小时，然后用脱色液(40ml甲醇，10ml乙酸，50mlddH2O)脱色，每隔30分钟换液一次，直至背景脱干净为止。
[0080] ⑤观察凝胶发现在沉淀中有与预期大小50.9kDa相符合的目的蛋白条带，并且大部分以包涵体形式存在，表达量较高。融合蛋白TAT-VP7-TAT的SDS-PAGE鉴定见附图3。
[0081] 实施例5：
[0082] 融合蛋白TAT-VP7-TAT的纯化。
[0083] (1)融合蛋白TAT-VP7-TAT的提取和变性。
[0084] ①将实施例4中发酵好的100ml的菌液在4000rpm离心30min，收集菌体，用10ml Lysis Buffer重悬菌体，-20℃冻融一次，再加20ml Lysis Buffer，400W超声破碎细胞(破碎3s，停5s，40min)，4℃，12000rpm离心10min，弃上清。
[0085] ②沉淀用2M尿素洗涤两次，4℃，12000rpm离心10min弃上清后，加入适量包涵体裂解液，4℃裂解过夜，溶液变澄清，将上清液经0.45μm的滤膜过滤，得到的溶液既是变性好的蛋白溶液。
[0086] (2)Ni-NTA Superflow柱亲和层析法纯化重组蛋白。
[0087] ①用移液器吸取1ml Ni-NTA Agarose装入层析柱底部，用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用10倍柱体积的Lysis Buffer平衡柱子。
[0089] ③用50ml Lysis Buffer以1ml/min的速率洗柱，以洗脱下柱内未与Ni2+结合的蛋白。
[0090] ④依次用含20mM Imidazole、40mM Imidazole、60mM Imidazole的Wash Buffer2+
以0.5ml/min的速率洗脱柱子，洗脱Ni 柱上结合的非目的蛋白。用核酸蛋白检测仪检测每次洗脱后的流出液的OD280，至基线平稳时停止洗涤。
以0.5ml/min的速率洗脱柱子，洗脱Ni 柱上结合的非目的蛋白。用核酸蛋白检测仪检测每次洗脱后的流出液的OD280，至基线平稳时停止洗涤。
[0091] ⑤用含250mM Imidazole的Elution Buffer以0.2ml/min的速率洗脱柱子，用Eppendo rf管收集目的蛋白，直到OD280持续为0时停止收集。进行SDS-PAGE电泳，检测所收集的蛋白的纯化效果。
[0092] (3)融合蛋白TAT-VP7-TAT的复性。
[0093] ①将新购买的透析袋(截流分子量为8-14kDa)置于含10mM NaHCO3、1mM EDTA的溶液中煮沸10min，除去透析袋表面的一些杂质。
[0094] ②将上述收集到的目的蛋白装入处理好的透析袋中，透析袋两端用夹子夹好，置于蛋白复性液中4℃透析复性24h。
[0095] ③为了除去蛋白中高浓度的尿素，将透析袋放入PBS缓冲液中，4℃梯度透析约24h。期间更换一次或两次透析缓冲液，即可将尿素完全除去。
[0096] ④将透析后的蛋白质溶液用PEG20000浓缩至约为原体积的1/3，分装后保存于-20℃备用。
[0098] 实施例6：
[0099] 多克隆抗体的制备与纯化及其效价测定。
[0100] (1)多克隆抗体的制备。
[0101] 将400-600μg TAT-VP7-TAT纯化蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合后皮下注射免疫新西兰大白兔，每次免疫间隔周期为2周，一共免疫3次。第三次免疫后第11天取血，全血37℃静置1h，然后在4℃静置过夜，4℃，2000g，离心20min，取上清冻存于-20℃备用。
[0102] (2)多克隆抗体的纯化。
[0103] ①用移液器吸取1ml Protein A Sepharose装入Protein A Sepharose TMCL-4B柱底部，用大量去离子水冲洗填料，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子。
[0104] ②取1ml抗血清用Binding Buffer稀释到10ml，4℃，8000g离心10min，收集上清并用0.45μm滤膜过滤。
[0105] ③将处理好的样品以0.2ml/min的速度加入到平衡好的柱子中，循环重复上样2次。
[0106] ④再用Binding Buffer以0.5ml/min的速率冲洗柱子，流出液用蛋白核酸检测仪检测OD280，待OD280值持续为0时停止洗涤。
[0107] ⑤最后用Elution Buffer以0.25ml/min的速率洗脱多克隆抗体，分步收集洗脱液。为保持抗体的活性，收集洗脱液的同时在每1ml洗脱液中加入200μl Neutralizing Buffer并立即混匀。
[0108] ⑥将收集到的抗体装入透析袋中透析过夜，再用PEG20000浓缩抗体溶液至原体积的三分之一，分装后保存于-20℃备用。用SDS-PAGE电泳检测抗体的纯化效果。
[0109] (3)采用间接ELISA法检测抗体效价。
[0110] ①将纯化得到的抗体梯度稀释100-25600倍。
[0111] ②用PBST稀释纯化的TAT-VP7-TAT蛋白至终浓度为10μg/ml，每孔100μl添加到酶标板中，4℃包被过夜。
[0112] ③弃去酶标板小孔中的样品，每孔中加入约300μl PBST缓冲液，浸泡5min，并间歇振动酶标板洗涤，并重复洗涤三次。
[0113] ④每孔添加100μl 0.5％BSA，37℃封闭2h。
[0114] ⑤重复步骤③，每孔加入100μL100-25600倍梯度稀释的兔抗血清，阴性对照为稀释100倍的免疫前血清，空白对照为PBS，每个浓度3个平行，37℃孵育2h。
[0115] ⑥重复步骤③，每孔加入100μl稀释10000倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，37℃孵育2h。
[0116] ⑦重复步骤③，每孔加入100μl OPD显色液，37℃避光反应10-20min。
[0117] ⑧每孔加入50μl终止液，终止显色。
[0118] ⑨用Bio-Rad450全自动酶标仪检测在490nm波长下每孔的吸光值，取平均值，出现阳性反应的最大稀释度即为抗体的效价。
[0119] 经测定，本实验制备的兔抗血清效价为1：12800。
[0120] 实施例7：
[0121] ELISA检测TAT-VP7-TAT蛋白的穿肠功能。
[0122] (1)实验材料：
[0123] 实验用草鱼购自鄂州市梁子岛养殖基地，体重50g±5，购回后饲养于本实验室，饲养温度28℃左右，同时每天喂食换水一次。新购买的草鱼于实验室至少喂养十五天，待草鱼状态稳定后方用于实验。
[0124] (2)血清的制备：
[0125] 将纯化并已测定浓度(480μg/ml)的TAT-VP7-TAT融合蛋白投喂草鱼，每只草鱼投喂200μL蛋白溶液，连续投喂3天。同时将只投喂PBS缓冲液的草鱼作为阴性对照。草鱼在30℃恒温饲养，在最后一次投喂TAT-VP7-TAT融合蛋白后，分别于2h、6h、12h、24h尾静脉取血，室温放置1h，4℃静置过夜。将血液在离心机中于3000g离心5min后，吸取上清液用于ELISA检测。
[0126] (3)双抗体夹心ELISA检测TAT-VP7-TAT蛋白的穿肠功能。
[0127] ①将鼠抗His6抗体用PBST稀释1000倍，用移液枪加入到酶标板孔中，每孔100μl。用封口膜封住加样的酶标板的小孔，4℃孵育过夜，使抗His6抗体充分包被于酶标板底部。
[0128] ②倒掉酶标板孔中的His6抗体，每孔加入100μl 0.5％BSA，用封口膜封口后置于37℃，封闭3-4h。
[0129] ③倒掉酶标板小孔中的液体，每孔中加入约300μl PBST缓冲液，浸泡5min，并间歇振动酶标板洗涤，重复洗涤三次。
[0130] ④将上述制备的血清，每孔100μl加入到酶标板中，同时以只加PBS缓冲液的酶标板小孔作为空白对照，每个样品加三个孔。用封口膜封住加样的酶标板的小孔，4℃孵育过夜，使血清中的抗原与抗His6抗体充分结合。
[0131] ⑤重复步骤③，每孔中加入1:500稀释的VP7抗体，用封口膜封住加样的酶标板的小孔，37℃孵育2h。
[0132] ⑥重复步骤③，每孔加入100μl按1:10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，用封口膜封住加样的酶标板的小孔，37℃孵育2h。
[0133] ⑦重复步骤③，每孔加入100μl显色液，用封口膜封口后置于37℃恒温培养箱中避光显色20min。
[0134] ⑧每孔加入50μl反应终止液，终止显色反应。用酶标仪检测每孔在490nm处的吸光值，结果如图4。
[0135] ELISA检测数据说明，与空白对照组比较，草鱼口服TAT-VP7-TAT亚单位疫苗2小时后，在草鱼血液中即可检测到VP7抗原，表明TAT可以携带VP7蛋白不经肌肉注射而直接进入血液中。在喂食蛋白3-12h之后，TAT-VP7-TAT在血清中的含量有所升高，但在12h-24h开始下降，说明TAT-VP7-TAT在口服12h后开始在体内降解。
[0136] 实施例8：
[0137] 融合蛋白TAT-VP7-TAT和TAT-VP7穿肠能力的比较：
[0138] (1)TAT-VP7融合蛋白的制备
[0139] 人工直接合成TAT-VP7融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.3所示。
[0140] (2)穿肠模型的制备
[0141] 实验用草鱼购自鄂州市梁子岛养殖基地，体重50g±5，购回后饲养于本公司实验池，饲养温度28℃左右，同时每天喂食换水一次。新购买的草鱼于实验池至少喂养十五天，待草鱼状态稳定后处死，取5cm草鱼肠管用于实验。用PBS冲洗草鱼肠管，将肠管一端扎紧，用移液枪吸取100μl待测溶液至扎好的草鱼肠管，扎好肠管的另一端，投入到装有10ml P BS缓冲液的试管中，并使PBS缓冲液完全浸没草鱼肠管。样品分3组，TAT-VP7-TAT组，TAT-VP7组，均用PBS缓冲液调节蛋白浓度至200μg/ml，PBS组作为阴性对照。每组溶液均按以上步骤操作，每根肠管均浸没于独立的PBS试管中。
[0142] (3)穿肠样品的制备
[0143] 浸没肠管的PBS缓冲液试管在30℃下静置，分别于1h，2h，4h，8h，12h吸取试管中PBS溶液，每次取100μl。
[0144] 通过穿肠模型ELISA检测TAT-VP7-TAT、TAT-VP7蛋白的穿肠功能。方法按照实例7中所述的ELISA方法实施，最后所得结果的数据整理为图5。
[0145] 结果显示，2小时后即能在TAT-VP7-TAT的穿肠样品中检测到VP7抗原的存在，这说明与TAT-VP7相比，TAT-VP7-TAT能够更早更快的穿过肠膜；而在相同时间内，穿过肠膜的TAT-VP7-TAT蛋白的光密度值比TAT-VP7大0.6-1.1。说明在单位时间内，穿过肠膜的T AT-VP7-TAT蛋白的量比TAT-VP7更大。
[0146] 实施例9：
[0147] 融合蛋白TAT-VP7-TAT在制备抗GCRV感染药物中的应用
[0148] (1)试验样品及来源：
[0149] TAT-VP7-TAT融合蛋白亚单位疫苗制备方法如下：将TAT-VP7-TAT融合蛋白的浓度为480μg/ml的蛋白溶液，按照1mL蛋白溶液和4g饲料(正大饲料，088型号)混合，即制备得到TAT-VP7-TAT融合蛋白亚单位疫苗，备用。
[0150] 阴性和阳性对照的所用的饲料为用1mL PBS溶液和4g饲料混合得到。
[0151] 将GCRV病毒提取液依次进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释，以200μl/只的剂量腹部注射感染草鱼，以15天内死亡率达到90％以上的最高稀释倍数作为实验注-6射浓度，本实施例所用的注射浓度是10 稀释的病毒原液。
[0152] (2)试验设计：
[0153] ①选取健康鲜活的草鱼鱼苗，体重50g±5，按其平均体长和体重分为3组，每组60尾。饲养在同一室内同样规格的水箱中，室温控制在20-30℃，24h通氧，饲喂时间为40-50天。试验设有阴性对照，阳性对照，TAT-VP7-TAT融合蛋白亚单位疫苗共3组处理，每组处理各设三个重复，各处理养殖水箱贴上相应标签。每天的饲料量为鱼体重的2％，融合蛋白亚单位疫苗的量为每g鱼2μg融合蛋白。
[0154] 第一组(阴性对照)喂食PBS混合的饲料，20天后注射200μl 0.65％无菌生理盐水。
[0155] 第二组(阳性对照)喂食PBS混合的鱼饲料，20天后直接注射GCRV病毒(病毒浓-6度为原提取液的10 倍稀释，注射量为200μl/只)。
[0156] 第三组(实验组)每天喂食步骤(1)制得的TAT-VP7-TAT融合蛋白亚单位疫苗的-6饲料，20天后直接注射GCRV病毒(病毒浓度为原提取液的10 倍稀释，注射量为200μl/只)。
[0157] ②调查及统计：每天早晚观察记录各组水箱内的死鱼，统计累计死亡数。20天实验结束后，统计各处理养殖箱内剩余的活鱼，计算最后的存活率，结果见表1。
[0158] ③试验结果及分析：
[0159] 表1中可以看出口服基因工程融合蛋白TAT-VP7-TAT亚单位疫苗的水箱，经注射GCRV病毒感染20天后，草鱼鱼苗的存活率为80.00-86.67％，未经口服基因工程融合蛋白TAT-VP7-TAT亚单位疫苗的阳性对照，经注射GCRV病毒感染20天后草鱼鱼苗的存活率仅为20.00-28.33％。这表明草鱼口服基因工程融合蛋白TAT-VP7-TAT亚单位疫苗后能有效预防GCRV的侵染。
[0160] 表1各处理项目累计死亡尾数及其存活率统计结果表
[0161]
[0162]
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