狗源化PD-1基因改造动物模型的制备方法及应用专利检索-体外受精辅助生殖技术生物工程专利检索查询-专利查询网

狗源化PD-1基因改造动物模型的制备方法及应用

阅读：567发布：2021-02-01

专利汇可以提供狗源化PD-1基因改造动物模型的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种能够特异的靶向Pd-1基因的sgRNA、一种PD-1基因狗源化动物模型。本发明还公开了一种制备狗源化动物模型的sgRNA载体的方法、一种狗源化动物模型的制备方法以及相关应用，并制备出世界上首例基因修饰狗源化小鼠，该小鼠能正常表达含有狗PD-1蛋白功能域的PD-1蛋白，可以作为靶向狗PD-1、PD-L1等信号机理研究，抑制剂筛选，毒理研究的动物模型，这对于研究狗PD-1、PD-L1基因的功能，以及在生物医药领域具有重要的应用价值。，下面是狗源化PD-1基因改造动物模型的制备方法及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种经遗传修饰的非人动物或其子代，其特征在于，所述动物的基因组中含有狗源PD-1基因，所述狗源PD-1基因通过所述动物内源性调控元件调控；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。
2.一种经遗传修饰的非人动物或其子代，其特征在于，所述动物体内表达狗或狗源化的PD-1蛋白，同时降低或消除了内源的PD-1蛋白的表达；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。
3.根据权利要求1或2所述的非人动物或其子代，其特征在于，所述动物基因组中PD-1基因包括编码胞外区、跨膜区以及胞内区的序列，其中，编码胞外区的序列包含狗源PD-1基因的全部或部分序列，编码胞内区和跨膜区的序列为动物来源，同时该动物来源部分和狗源PD-1基因序列通过序列拼接连接于所述动物内源的Pd-1基因启动子后。
4.根据权利要求1-3任一所述的非人动物或其子代，其特征在于，所述除狗以外的非人哺乳动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
5.一种经遗传修饰的细胞株，其特征在于，所述细胞株的基因组中含有狗源PD-1基因，所述狗源PD-1基因通过所述细胞株内源性调控元件调控；所述细胞株来源于除狗以外的非人动物。
6.一种经遗传修饰的细胞株，其特征在于，所述细胞株表达狗或狗源化的PD-1蛋白，同时降低或消除了内源来源的PD-1蛋白的表达；所述细胞株来源于除狗以外的非人动物。
7.根据权利要求5或6所述的细胞株，其特征在于，使用靶向Pd-1基因的载体将狗源PD-
1基因导入到细胞株的Pd-1基因座中。
8.根据权利要求5或6所述的细胞株，其特征在于，使用靶向Pd-1基因的载体将细胞株的Pd-1基因部分或全部替换为狗源PD-1基因的部分或全部制备获得。
9.根据权利要求8所述的细胞株，其特征在于，使用靶向Pd-1基因的sgRNA将细胞株Pd-
1基因的第2号外显子的全部或部分替换为狗源PD-1基因的部分或全部制备获得。
10.根据权利要求5-9任一所述的细胞株，其特征在于，所述除狗以外的非人哺乳动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
11.一种构建PD-1基因狗源化的非人动物或其子代的方法，其特征在于，包括导入狗源PD-1基因、使得该狗源PD-1基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生狗或狗源化的PD-1蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的内源/动物来源的PD-1蛋白的表达；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(a)构建含有狗源PD-1基因的载体，通过基因编辑方法将所述狗源PD-1基因的载体导入非人动物的基因组中，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Pd-1基因缺失或降低/消除了内源/动物来源的PD-1蛋白的表达或内源/动物来源的PD-1蛋白不具有功能；并且(b)在所述非人动物或其子代体内表达狗/狗源化PD-1蛋白。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述动物基因组中包括狗源化PD-1基因，所述狗源化PD-1基因编码的蛋白包括胞外域、跨膜区和胞内区，其中，编码胞外域的狗源化PD-1基因包含狗源PD-1基因的全部或部分序列，编码胞内区和跨膜区的狗源化PD-1基因为动物来源，同时该动物来源部分和狗源PD-1基因部分通过序列拼接连接于动物内源Pd-1启动子后。
14.根据权利要求11-13任一所述的方法，其特征在于，所述狗源PD-1基因的mRNA序列的全部或部分片段与SEQ ID NO：3所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列；所述狗PD-1蛋白序列的全部或部分片段与SEQ ID NO：4所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少
100％同一性程度的基因序列。
15.根据权利要求11-14任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提供一种细胞，所述的细胞包含靶向动物Pd-1基因的靶向载体，和/或一种或多种靶向动物Pd-1基因的sgRNA，和/或一种或多种靶向动物Pd-1基因的sgRNA的体外转录产物；优选的，所述的细胞为受精卵细胞；
2)将所述细胞在培养液中进行培养；
3)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
4)鉴定步骤3)怀孕雌性的后代在基因改造狗源化非人类哺乳动物中的种系传递。
16.根据权利要求11-15任一所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行PD-1基因狗源化非人动物或其子代的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行PD-1基因狗源化非人动物或其子代的构建。
17.根据权利要求11-16任一所述的方法，其特征在于，使用靶向动物Pd-1基因的sgRNA将狗源PD-1基因片段的全部或部分导入动物Pd-1基因的第2号外显子位置。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，使用靶向动物Pd-1基因的sgRNA将动物Pd-1基因的第2号外显子全部或部分替换为狗源PD-1基因的全部或部分。
19.根据权利要求11-18任一所述的方法，其特征在于，所述除狗以外的非人哺乳动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
20.根据权利要求17-19任一所述的方法，其特征在于，所述靶向动物Pd-1基因的sgRNA的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：18-21任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：22-25任一项所示。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述小鼠Pd-1基因的mRNA序列的全部或部分片段与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列；所述小鼠PD-1蛋白序列的全部或部分片段与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列。
22.根据权利要求11-21任一所述的方法，其特征在于，所述动物基因组中包括嵌合PD-
1基因，所述嵌合PD-1基因包括小鼠来源的Pd-1基因片段和狗源PD-1基因片段，所述嵌合PD-1基因序列的全部或部分与SEQ ID NO：5所示的全部或部分序列具有至少70％、75％、
80％、85％、90％、95％、99％或至少100％的同一性程度。
23.根据权利要求11-22任一所述的方法，其特征在于，所述动物体内表达狗源化PD-1蛋白，所述的狗源化PD-1蛋白选自下列组中的一种：
a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：8所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；
或
f)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列如SEQ ID NO：4所示；
g)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
h)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：4所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
i)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：4所示的氨基酸的差异不超过
10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
j)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列具有SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；
或
k)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列如SEQ ID NO：2所示；
l)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
m)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
n)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸的差异不超过
10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
o)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列具有SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
24.根据权利要求11-22任一所述的方法，其特征在于，所述动物体内包含嵌合PD-1基因，所述的嵌合PD-1基因选自下列组中的一种：
a)所述嵌合PD-1基因编码权利要求23中所述的狗源化PD-1蛋白序列；
b)所述的嵌合PD-1基因序列的全部或部分如SEQ ID NO：5所示序列的全部或部分；
c)所述的嵌合PD-1基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：6所示；
d)所述的嵌合PD-1基因转录的mRNA序列的全部或部分如SEQ ID NO：7所示序列的全部或部分；
e)所述的嵌合PD-1基因转录的mRNA序列与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
f)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列杂交的基因序列；
或
g)所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因转录的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示；
h)在低严谨条件下，所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因转录的mRNA序列为与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列杂交的基因序列；
i)所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因的序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
j)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：1所示；
k)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列在低严谨条件下，与SEQ ID NO：
1所示的核苷酸杂交的基因序列；
l)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
25.一种由权利要求11-24任一所述的方法产生的非人动物或其子代。
26.一种制备多基因狗源化动物或其子代的方法，其特征在于，包括
(a)利用权利要求1-4、25任一所述的非人动物或其子代；
(b)将步骤(a)所述的动物与其他狗源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因狗源化动物或其子代。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述多基因狗源化动物可以是双基因狗源化动物、三基因狗源化动物、四基因狗源化动物、五基因狗源化动物、六基因狗源化动物、七基因狗源化动物、八基因狗源化动物或九基因狗源化动物。
28.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述的其他狗源化动物选自基因PD-L1，TIGIT、OX40、TIM-3、LAG-3、CD27、CD137、GITR、BTLA、CD3、CTLA-4、CD40、CD47、SIPRA、CD3e狗源化动物中的一种或两种以上。
29.根据权利要求26-28任一所述的方法产生的多基因狗源化动物或其子代。
30.一种靶向载体，其特征在于，其包含a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自Pd-1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自Pd-1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。
31.根据权利要求30所述的靶向载体，其特征在于，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。
32.根据权利要求31所述的靶向载体，其特征在于，与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000067.6的第94041502-94043271位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段即3’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000067.6的第94039436-94041168位核苷酸。
33.根据权利要求32所述的靶向载体，其特征在于，所述5’臂序列如SEQ ID NO：9，所述
3’臂序列如SEQ ID NO：10所示。
34.根据权利要求30-33任一所述的靶向载体，其特征在于，所述待改变的转换区位于Pd-1基因的第2号外显子。
35.根据权利要求30-34任一所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包括可选择的标记基因和/或阳性克隆筛选的抗性基因和/或特异性重组系统。
36.根据权利要求30-35任一所述的靶向载体，其特征在于，所述的插入或替换的供体DNA序列片段来自狗。
37.根据权利要求36所述的靶向载体，其特征在于，其中插入或替换的供体DNA序列为狗源PD-1基因核苷酸序列的部分或全部。
38.根据权利要求37所述的靶向载体，其特征在于，所述核苷酸序列包括狗源PD-1基因DNA序列的第2号外显子的全部或部分。
39.根据权利要求37或38所述的靶向载体，其特征在于，所述狗源PD-1基因的核苷酸序列选自NCBI登录号为NC_006607.3的第51611212-51611544位核苷酸有1处突变的序列。
40.根据权利要求39所述的靶向载体，其特征在于，所述突变为第203位T点突变为C。
41.根据权利要求37-40任一所述的靶向载体，其特征在于，所述狗源PD-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
42.一种用于构建狗源化非人动物的sgRNA序列，其特征在于，所述的sgRNA序列靶向非人动物Pd-1基因，同时所述的sgRNA在待改变的非人动物Pd-1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则，所述动物为除狗以外的非人哺乳动物。
43.根据权利要求42所述的sgRNA序列，其特征在于，所述除狗以外的非人哺乳动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
44.根据权利要求42或43所述的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列在小鼠Pd-1基因的靶位点位于小鼠Pd-1基因的第2号外显子上。
45.根据权利要求42-44任一所述的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：18-21任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：22-25任一项所示。
46.一种编码权利要求42-45任一所述的sgRNA的DNA分子。
47.根据权利要求46所述的DNA分子，其特征在于，DNA双链序列分别如SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28，或SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32所示。
48.一种包含权利要求42-45任一所述的sgRNA序列和/或权利要求46-47任一所述的DNA分子的构建体。
49.一种制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Pd-1基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Pd-1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA、sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
50.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO：18-21所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：22-25所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：25，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：31所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：33所示，其中SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29为A组，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33为B组；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA、sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA、sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：34所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
51.根据权利要求49-50任一所述的方法产生的sgRNA载体。
52.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求30-41任一所述的靶向载体，和/或一种或多种权利要求42-45任一所述的sgRNA序列，和/或一种或多种权利要求46-47任一所述的DNA分子，和/或一种或多种权利要求48所述的构建体，和/或一种或多种权利要求48所述构建体的体外转录产物，和/或权利要求51所述的sgRNA载体。
53.根据权利30-41任一所述的靶向载体、权利要求42-45任一所述的sgRNA序列、权利要求46-47任一所述的DNA分子、权利要求48所述的构建体、权利要求51所述的sgRNA载体或权利要求52所述的细胞在构建包含PD-1基因狗源化非人动物或其子代及Pd-1基因敲除动物或其子代中的应用。
54.一种荷瘤动物模型，其特征在于，来源于权利要求1-4、25任一所述的非人动物或其子代，或权利要求29所述的多基因狗源化非人动物或其子代。
55.根据权利要求54所述的荷瘤动物模型，其特征在于，所述的动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
56.一种嵌合PD-1蛋白，其特征在于，选自下列组中的一种：
a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：8所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；
或
f)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列如SEQ ID NO：4所示；
g)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
h)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：4所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
i)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：4所示的氨基酸的差异不超过
10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
j)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列具有SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；
或
k)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列如SEQ ID NO：2所示；
l)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
m)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
n)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸的差异不超过
10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
o)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列具有SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
57.一种嵌合PD-1基因，其特征在于，所述的嵌合PD-1基因选自下列组中的一种：
a)所述嵌合PD-1基因编码权利要求56中所述的嵌合PD-1蛋白序列；
b)所述的嵌合PD-1基因序列的全部或部分如SEQ ID NO：5所示序列的全部或部分；
c)所述的嵌合PD-1基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：6所示；
d)所述的嵌合PD-1基因转录的mRNA序列的全部或部分如SEQ ID NO：7所示序列的全部或部分；
e)所述的嵌合PD-1基因转录的mRNA序列与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
f)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列杂交的基因序列；
或
g)所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因的序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示；
h)在低严谨条件下，所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因的序列转录的mRNA序列为与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列杂交的基因序列；
i)所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因的序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
j)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：1所示；
k)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列，在低严谨条件下，与SEQ ID NO：1所示的核苷酸杂交的基因序列；
l)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
58.根据权利要求57所述的嵌合PD-1基因，其特征在于，其中，嵌合小鼠PD-1的DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ ID NO：7。
59.一种小鼠的基因组DNA，其特征在于，所述基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的cDNA序列，与权利要求57-58任一所述的嵌合PD-1基因序列一致或互补。
60.一种表达狗源化小鼠PD-1蛋白的构建体。
61.一种包含权利要求60所述构建体的细胞。
62.一种包含权利要求61所述细胞的组织。
63.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求1-4、25任一所述的非人动物或其子代，或权利要求29所述的多基因狗源化动物或其子代，或权利要求54-55任一所述的荷瘤动物模型。
64.一种组织或器官，其特征在于，所述组织或器官来源于权利要求1-4、25任一所述的非人动物或其子代，或权利要求29所述的多基因狗源化动物或其子代，或权利要求54-55任一所述的荷瘤动物模型。
65.根据权利要求64所述的组织或器官，其特征在于，所述的组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。
66.一种权利要求1-4、25任一所述的非人动物或其子代、权利要求5-10任一所述的细胞株、权利要求29所述的多基因狗源化动物或其子代、权利要求56所述的嵌合PD-1蛋白、权利要求57-58任一所述的嵌合PD-1基因、权利要求59所述的基因组DNA、权利要求60所述的构建体、权利要求61所述细胞、权利要求62所述的组织、权利要求63所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求64-65任一所述的组织或器官在制备动物模型中的用途。
67.一种权利要求1-4、25任一所述的非人动物或其子代、权利要求5-10任一所述的细胞株、权利要求29所述的多基因狗源化动物或其子代、权利要求54-55任一所述的荷瘤动物模型、权利要求56所述的嵌合PD-1蛋白、权利要求57-58任一所述的嵌合PD-1基因、权利要求59所述的基因组DNA、权利要求60所述的构建体、权利要求61所述细胞、权利要求62所述的组织、权利要求63所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求64-65任一所述的组织或器官在在与PD-1基因或者蛋白相关的领域中的应用。
68.根据权利要求67所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在需要涉及狗类细胞的免疫过程的产品开发，制造狗类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及狗类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、狗PD-1、PD-L1 信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究PD-1基因功能研究、狗PD-1抗体、PD-L1抗体、针对狗PD-1、PD-L1靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。

说明书全文

狗源化PD-1基因改造动物模型的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本申请涉及狗源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种狗源化PD-1基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。

背景技术

[0002] 犬类是最早被人类驯化的动物，是人类重要的伴侣动物。已有研究表明伴侣动物尤其是宠物犬能提供情感支持，让人的身心更加健康、生活满意度更高。在实践中豢养宠物犬作为一种替代疗法，可使抑郁患者、有社会退缩行为的患者有所康复。还有研究表明宠物犬对控制和降低国民健康医疗费用有所帮助(傅纳等，中国心理卫生杂志，2003，17(8)：569-571；郭君钰等，临床心身疾病杂志，2015(5)：74-77；王嘉顺等，医学与社会，2011，24(3)：85-87)。现代生活中有许多人饲养宠物犬，并视其为家庭的一员。根据统计数据，目前美国有7750万宠物狗，其中63.2％的家庭将宠物视为“家庭成员”，每年平均花费225美元用于宠物狗保健，仅次于人类接受医疗保健水平(U.S.Pet Ownership&Demographics Sourcebook，2012；http://nationalveterinarycancerregistry.org/about-nvcr/pets-models)。在我国，2016年宠物狗的数量达到4990万只，年均医疗支出约为908元(数据来源：
2017年中国宠物行业白皮书)。可见随着人们养宠观念的根本性转变，宠物健康问题越来越受到重视。

[0003] 癌症是导致犬类死亡的主要原因，50％的高龄犬(10岁以上)会发展自发性肿瘤，约有1/4的宠物犬死于癌症。目前犬类癌症的治疗以手术治疗、化学治疗和放射治疗为主，专门用于治疗动物尤其是犬类癌症的药物非常少，多数情况下兽医只能用最初为人类开发的药物治疗犬类癌症(Daniela O.H.Suzuki，etc，Artif Organs.2015Feb；39(2):192-7；Maina E，etc，Vet Dermatol.2014Dec；25(6):559-62，Brian W.DavisandElaine A.Ostrander，ILAR J.2014；55(1):59–68)。虽然大多数犬类可能对治疗有一定效果，但具有较大个体差异，且化疗和放疗持续时间通常较短。而且有些类型的癌症，如口腔黑色素瘤(oral malignant melanoma，OMM)是狗中常见的口腔恶性肿瘤，可能在任何口腔粘膜部位产生。由于具有高度侵袭和高转移倾向，OMM被认为是极度恶性的癌症，通常化疗无效，选择手术或放射治疗后生存率也不高(Bergman PJ，Clin Tech Small Anim Pract.2007May；22(2):55-60；Brockley LK,etc,N Z Vet J.2013Jan；61(1):25-31)。因此有必要开发新的治疗方法来改善犬类癌症治疗的舒适度和生存率。

[0004] 肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞，是近年来肿瘤研究的一个重要领域。目前和肿瘤免疫治疗相关的一些人用药物已经用于治疗，已有药品上市并应用在多个适应症，其中，以免疫检查点CTLA-4、PD-1及其配体PD-L1为靶点的免疫调节剂已经取得确切疗效。例如，在许多人类癌症中均可检测到异常的PD-L1蛋白表达，并被认为是癌症的免疫逃逸主要机制之一。已有研究表明犬类某些恶性肿瘤，如，狗黑色素瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、肥大细胞肿瘤、乳腺癌和前列腺癌均表达PD-L1，显示临床应用PD-1/PD-L1抑制剂作为对犬类癌症的新型治疗剂的治疗前景(Maekawa N等，PLoS One.2016Jun 8；11(6):e0157176，PD-L1；Naoya Maekawa ect，PLoS One.2014；9(6):e98415)。然而，狗PD-1蛋白和鼠PD-1蛋白同源性56％，狗PD-1蛋白和人PD-1蛋白同源性65％。所以，一般情况下识别人PD-1蛋白的抗体，无法识别犬PD-1蛋白，即在犬类癌症治疗中，使用人PD-1药物治疗，可能会由于抗体靶向性和特异性不强，没有治疗效果或效果差。此外，免疫疗法有较明显的免疫毒性，在小鼠和人体中都有验证，如皮炎、大肠炎、垂体炎等，这种副作用与免疫应答程度直接相关，很难通过剂量调整避免，严格的药物筛选程序非常必要。

[0005] 狗作为重要的实验动物，一直以来广泛的用于实验外科(如心血管外科、组织移植等)、药理学(毒理学研究和药物代谢研究)、慢性实验研究(如条件反射实验、内分泌腺摘除试验等)以及医学研究(如失血性休克、脊髓传导实验、脂质在动脉壁中的沉积等)。此外，利用犬类自发性肿瘤的特点，以及多种犬类癌症与人类癌症有相似的症状和临床表现，加上宠物狗预期寿命较长，又暴露在与人类相似的环境中(毒素和致癌物质)，宠物犬正逐渐被认为是研究人类疾病及治疗的有价值的工具(Knapp DW etc，ILAR J.2014；55(1):100-18.doi:10.1093/ilar/ilu018；Vail DM ect，Clin Cancer Res.2009May 15；15(10):
3503-10)。理论上也可以直接使用狗作为实验动物，进行犬用抗肿瘤药物的筛选和研究，但存在明显缺陷及实际困难，如国际上公认的比较理想的近交系比格犬(beagles)，该犬类对气候要求高，繁育较难、成活率低、价格高，在国内科研中应用受到很大限制。小鼠作为更常用的实验动物，具有高繁殖、易饲养，繁殖周期短等特点，更容易开展大规模筛选试验，在药物筛选和药效初步验证等临床前研究方面具有明显优势。
发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本申请发明人提出可以将狗的基因放置在非人哺乳动物(除狗类外)，如，小鼠体内，制备得到的小鼠体内可表达狗蛋白或狗源化蛋白。特别是，由于抗体一般结合在抗原的胞外区，可以将小鼠体内编码抗原胞外区的基因序列全部或部分用狗的对应序列进行替换，这样得到的小鼠体内表达狗抗原蛋白或狗源化抗原蛋白，表达的抗原蛋白能被识别并结合抗狗抗体，且小鼠体内不表达内源性蛋白。该方法及制备的非人动物在狗用药物筛选、有效性验证等方面有着广阔的应用前景。此外，本方法得到的非人动物还可与其它狗源化非人动物交配，或进行进一步的基因编辑，得到双或多基因狗源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的更多的狗用药及药效研究。

[0007] 鉴于PD-1基因在肿瘤和免疫治疗领域具有巨大应用价值。为了使狗用药物药效试验更有效并提高研发成功率，本发明将以PD-1为例，在世界范围内首次提供一种建立PD-1基因狗源化改造动物模型的新方法，并得到PD-1基因狗源化动物，该动物体内可正常表达PD-1蛋白，且表达的PD-1蛋白能被识别并结合抗狗PD-1抗体。可以改造的其它基因包括但不限于：PD-L1，TIGIT、OX40、TIM-3、LAG-3、CD27、CD137、GITR、BTLA、CD3、CTLA-4、CD40、CD47、SIPRA、CD3e等。

[0008] 本发明的第一方面，涉及一种经遗传修饰的非人动物或其子代，所述动物的基因组中含有狗源PD-1基因，所述狗源PD-1基因通过所述动物内源性调控元件调控；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。

[0009] 本发明还涉及一种经遗传修饰的非人动物或其子代，其特征在于，所述动物体内表达狗或狗源化的PD-1蛋白，同时降低或消除了内源/动物来源的PD-1蛋白的表达；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。

[0010] 优选的，所述调控元件为动物内源启动子。

[0011] 优选的，所述动物基因组中PD-1基因包括编码胞外区、跨膜区以及胞内区的序列，其中，编码胞外区的序列包含狗源PD-1基因的全部或部分序列，编码胞内区和跨膜区的序列为动物来源，同时该动物来源部分和狗源PD-1基因序列通过序列拼接连接于所述动物内源的Pd-1基因启动子后。

[0012] 优选的，本发明还获得了一种Pd-1基因敲除的非人动物或其子代，所述动物基因组中不含有Pd-1基因。进一步优选的，使用靶向Pd-1基因的载体将动物体内的Pd-1基因全部或部分敲除制备获得。更进一步优选的，使用靶向Pd-1基因的sgRNA将动物体内的Pd-1基因的第2号外显子全部或部分敲除制备获得。

[0013] 优选的，所述动物为除狗外的非人哺乳动物；进一步优选的，所述除狗外的非人哺乳动物为啮齿类动物；最优选的，所述啮齿类动物为小鼠。

[0014] 本发明的第二方面，涉及一种经遗传修饰的细胞株，所述细胞株的基因组中含有狗源PD-1基因，所述狗源PD-1基因通过所述细胞株内源性调控元件调控；所述细胞株来源于除狗以外的非人动物。

[0015] 本发明还涉及一种经遗传修饰的细胞株，其特征在于，所述细胞株表达狗或狗源化的PD-1蛋白，同时降低或消除了内源来源的PD-1蛋白的表达；所述细胞株来源于除狗以外的非人动物。

[0016] 优选的，使用靶向Pd-1基因的载体将狗源PD-1基因导入到细胞株的Pd-1基因座中。

[0017] 优选的，使用靶向Pd-1基因的载体将细胞株的Pd-1基因部分或全部替换为狗源PD-1基因的部分或全部制备获得。

[0018] 进一步优选的，使用靶向Pd-1基因的sgRNA将细胞株Pd-1基因的第2号外显子的全部或部分替换为狗源PD-1基因的部分或全部制备获得。

[0019] 优选的，所述除狗以外的非人哺乳动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。

[0020] 优选的，本发明还获得了一种Pd-1基因敲除细胞株，使用靶向Pd-1基因的载体将细胞株中Pd-1基因部分或全部敲除。进一步优选的，使用靶向Pd-1基因的sgRNA或编码sgRNA的DNA分子或包含sgRNA的载体敲除细胞株Pd-1基因的第2号外显子的全部或部分制备获得。

[0021] 本发明的第三方面，涉及一种构建PD-1基因狗源化的非人动物或其子代的方法，包括导入狗源PD-1基因、使得该狗源PD-1基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生狗或狗源化的PD-1蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的PD-1蛋白的表达；其中，所述动物为除狗以外的非人动物。

[0022] 优选的，所述的方法包括：

[0023] (a)构建含有狗源PD-1基因的载体，通过基因编辑方法将所述狗源PD-1基因的载体导入非人动物的基因组中，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Pd-1基因缺失或降低/消除了内源/动物来源的PD-1蛋白的表达或内源/动物来源的PD-1蛋白不具有功能；并且

[0024] (b)在所述非人动物或其子代体内表达狗/狗源化PD-1蛋白。

[0025] 优选的，所述动物基因组中包括狗源化PD-1基因，所述狗源化PD-1基因编码的蛋白包括胞外域、跨膜区和胞内区，其中，编码胞外域的狗源化PD-1基因包含狗源PD-1基因的全部或部门片段，编码胞内区和跨膜区的狗源化PD-1基因为动物来源，同时该动物来源部分和狗源PD-1基因部分通过序列拼接连接于动物内源Pd-1启动子后。

[0026] 优选的，所述狗源PD-1基因的mRNA序列的全部或部分片段与SEQ ID NO：3所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列；所述狗PD-1蛋白序列的全部或部分片段与SEQ ID NO：4所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列。

[0027] 优选的，所述的方法，包括如下步骤：

[0028] 1)提供一种细胞，所述的细胞包含靶向动物Pd-1基因的靶向载体，和/或一种或多种靶向动物Pd-1基因的sgRNA，和/或一种或多种靶向动物Pd-1基因的sgRNA的体外转录产物；优选的，所述的细胞为受精卵细胞；

[0029] 2)将所述细胞在培养液中进行培养；

[0030] 3)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；

[0031] 4)鉴定步骤3)怀孕雌性的后代在基因改造狗源化非人类哺乳动物中的种系传递。

[0032] 优选的，使用基因编辑技术进行PD-1基因狗源化非人动物或其子代的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。更优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行PD-1基因狗源化非人动物或其子代的构建。

[0033] 优选的，使用靶向动物Pd-1基因的sgRNA将狗源PD-1基因片段的全部或部分导入动物Pd-1基因的第2号外显子位置。

[0034] 进一步优选的，使用靶向动物Pd-1基因的sgRNA将动物Pd-1基因的第2号外显子的全部或部分替换为狗源PD-1基因的全部或部分。

[0035] 优选的，所述动物为除狗外的非人哺乳动物；进一步优选的，所述除狗外的非人哺乳动物为啮齿类动物；最优选的，所述啮齿类动物为小鼠。

[0036] 优选的，所述靶向动物Pd-1基因的sgRNA的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：18-21任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：22-25任一项所示。

[0037] 优选的，所述小鼠Pd-1基因的mRNA序列的全部或部分片段与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列；小鼠PD-1蛋白序列的全部或部分片段与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度的基因序列。

[0038] 优选的，所述动物基因组中包括嵌合PD-1基因，所述嵌合PD-1基因包括小鼠来源的Pd-1基因片段和狗源PD-1基因片段，所述嵌合PD-1基因序列的全部或部分与SEQ ID NO：5所示的全部或部分序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％的同一性程度。

[0039] 优选的，本发明还提供了一种构建Pd-1基因敲除非人动物或其子代的方法，将动物体内的Pd-1基因的第2号外显子全部或部分敲除，使得内源PD-1蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：18-21任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：22-25任一项所示。

[0040] 优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：20所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：25所示。

[0041] 优选的，一种Pd-1基因敲除动物的制备方法，包括如下步骤：

[0042] 第一步：制备获得sgRNA载体；

[0043] 第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至动物受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管中发育，得到F0代小鼠；

[0044] 第三步：将F0代动物利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Pd-1基因被敲除，获得Pd-1基因敲除阳性动物；

[0045] 第四步：将第三步筛选的阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Pd-1基因敲除动物。

[0046] 在本发明的一个具体实施例中，所述的动物为小鼠。所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：14-15所示。

[0047] 本发明的第四方面，涉及一种上述的方法产生的非人动物或其子代；优选的，所述的动物为啮齿类动物；更优选的，所述的啮齿类动物为小鼠。

[0048] 本发明的第五方面，涉及一种制备多基因狗源化动物或其子代的方法，包括[0049] (a)利用上述的非人动物或其子代；

[0050] (b)将步骤(a)所述的动物与其他狗源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因狗源化动物或其子代。

[0051] 优选的，所述多基因狗源化动物可以是双基因狗源化动物、三基因狗源化动物、四基因狗源化动物、五基因狗源化动物、六基因狗源化动物、七基因狗源化动物、八基因狗源化动物或九基因狗源化动物。

[0052] 优选的，所述的其他狗源化动物选自基因PD-L1、TIGIT、OX40、TIM-3、LAG-3、CD27、CD137、GITR、BTLA、CD3、CTLA-4、CD40、CD47、SIPRA、CD3e狗源化动物中的一种或两种以上。

[0053] 本发明的第六方面，涉及根据上述的方法产生的多基因狗源化动物或其子代。优选的，所述的动物为啮齿类动物。更优选的，所述的啮齿类动物为小鼠。

[0054] 本发明的第七方面，涉及一种靶向载体，其包含a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自Pd-1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自Pd-1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。

[0055] 优选的，所述的靶向载体，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。

[0056] 进一步优选的，与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000067.6的第94041502-94043271位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段即3’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000067.6的第94039436-94041168位核苷酸。

[0057] 在本发明的一个具体实施例中，所述5’臂序列如SEQ ID NO：9，所述3’臂序列如SEQ ID NO：10所示。

[0058] 优选的，所述待改变的转换区位于Pd-1基因的第2号外显子。

[0059] 优选的，所述靶向载体还包括可选择的基因标记。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。最优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

[0060] 进一步优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。最优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

[0061] 进一步优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。最优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。

[0062] 优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段来自狗。

[0063] 进一步优选的，其中插入或替换的供体DNA序列为狗源PD-1基因核苷酸序列的部分或全部。

[0064] 最优选的，所述核苷酸序列包括狗源PD-1基因DNA序列的第2号外显子的全部或部分。

[0065] 优选的，所述狗源PD-1基因的核苷酸序列选自NCBI登录号为NC_006607.3的第51611212-51611544位核苷酸有1处突变的序列。其中，所述突变为第203位T点突变为C。

[0066] 在本发明的一个具体实施例中，所述狗源PD-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

[0067] 本发明的第八方面，涉及一种用于构建狗源化非人动物的sgRNA序列，所述的sgRNA序列靶向非人动物Pd-1基因，同时所述的sgRNA在待改变的非人动物Pd-1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则。

[0068] 优选的，所述动物为除狗以外的非人哺乳动物；进一步优选的，所述除狗外的非人哺乳动物为啮齿类动物；最优选的，所述啮齿类动物为小鼠。

[0069] 优选的，所述sgRNA序列在小鼠Pd-1基因的靶位点位于小鼠Pd-1基因的第2号外显子上。

[0070] 优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：18-21任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：22-25任一项所示。

[0071] 进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：20任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：25任一项所示。

[0072] 本发明的第九方面，涉及一种编码上述的sgRNA的DNA分子。

[0073] 优选的，DNA双链序列分别如SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28，或SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32所示。

[0074] 本发明的第十方面，涉及一种包含上述的sgRNA序列和/或上述的DNA分子的构建体。

[0075] 本发明的第十一方面，涉及一种制备sgRNA载体的方法，包括如下步骤：

[0076] (1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Pd-1基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Pd-1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；

[0077] (2)合成含有T7启动子及sgRNA、sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

[0078] (3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；

[0079] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。

[0080] 优选的，所述的方法，包括如下步骤：

[0081] (1)将序列如SEQ ID NO：18-21所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：22-25所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

[0082] 优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：25，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：31所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：33所示，其中SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29为A组，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33为B组；

[0083] (2)合成含有T7启动子及sgRNA、sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNA、sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：34所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

[0084] (3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；

[0085] (4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。

[0086] 本发明的第十二方面，涉及根据上述的方法产生的sgRNA载体。

[0087] 本发明的第十三方面，涉及一种细胞，所述细胞包含上述的靶向载体，和/或上述的sgRNA序列，和/或上述的DNA分子，和/或上述的构建体，和/或上述构建体的体外转录产物，和/或上述的sgRNA载体。

[0088] 本发明的第十四方面，涉及根据上述的靶向载体、上述的sgRNA序列、上述的DNA分子、上述的构建体、上述的sgRNA载体或上述的细胞在构建包含PD-1基因狗源化非人动物或其子代及Pd-1基因敲除动物或其子代中的应用。

[0089] 本发明的第十五方面，涉及一种荷瘤动物模型，来源于上述的非人动物或其子代，或上述的多基因狗源化非人动物或其子代。

[0090] 优选的，所述的动物为啮齿类动物；更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。

[0091] 本发明的第十六方面，涉及一种嵌合PD-1蛋白或狗源化PD-1蛋白，选自下列组中的一种：

[0092] a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

[0093] b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：8所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；

[0094] c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

[0095] d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

[0096] e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：8所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；

[0097] 或

[0098] f)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列如SEQ ID NO：4所示；

[0099] g)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；

[0100] h)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：4所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

[0101] i)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：4所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

[0102] j)所述氨基酸序列中狗PD-1蛋白的序列具有SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；

[0103] 或

[0104] k)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列如SEQ ID NO：2所示；

[0105] l)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；

[0106] m)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

[0107] n)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

[0108] o)所述氨基酸序列中小鼠PD-1蛋白的序列具有SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

[0109] 本发明的第十七方面，涉及一种嵌合PD-1基因，所述的嵌合PD-1基因选自下列组中的一种：

[0110] a)所述嵌合PD-1基因编码上述的嵌合PD-1蛋白序列；

[0111] b)所述的嵌合PD-1基因序列的全部或部分如SEQ ID NO：5所示序列的全部或部分；

[0112] c)所述的嵌合PD-1基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：6所示；

[0113] d)所述的嵌合PD-1基因转录的mRNA序列的全部或部分如SEQ ID NO：7所示序列的全部或部分；

[0114] e)所述的嵌合PD-1基因转录的mRNA序列与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；

[0115] f)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列杂交的基因序列；

[0116] 或

[0117] g)所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因的序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示；

[0118] h)在低严谨条件下，所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因的序列转录的mRNA序列为与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列杂交的基因序列；

[0119] i)所述的嵌合PD-1基因中狗源PD-1基因的序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；

[0120] 或

[0121] j)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列如SEQ ID NO：1所示；

[0122] k)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列在低严谨条件下，与SEQ ID NO：1所示的核苷酸杂交的基因序列；

[0123] l)所述嵌合PD-1基因序列中鼠源序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。

[0124] 优选的，所述的嵌合PD-1基因，嵌合小鼠PD-1的DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ ID NO：7。

[0125] 本发明的第十八方面，涉及一种小鼠的基因组DNA，所述基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的cDNA序列，与上述的嵌合PD-1基因序列一致或互补。

[0126] 本发明的第十九方面，涉及一种表达狗源化小鼠PD-1蛋白的构建体。

[0127] 本发明的第二十方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。

[0128] 本发明的第二十一方面，涉及一种包含上述细胞的组织。

[0129] 本发明的第二十二方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物或其子代，或上述的多基因狗源化动物或其子代，或上述的荷瘤动物模型。

[0130] 本发明的第二十三方面，涉及一种组织或器官，所述组织或器官来源于上述的非人动物或其子代，或上述的多基因狗源化动物或其子代，或上述的荷瘤动物模型。

[0131] 优选的，所述的组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。

[0132] 本发明的第二十四方面，涉及一种上述的非人动物或其子代、上述的细胞株、上述的多基因狗源化动物或其子代、上述的嵌合PD-1蛋白、上述的嵌合PD-1基因、上述的基因组DNA、上述的构建体、上述细胞、上述的组织、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官在制备动物模型中的用途。

[0133] 本发明的第二十五方面，涉及一种上述的非人动物或其子代、上述的细胞株、上述的多基因狗源化动物或其子代、上述的荷瘤动物模型、上述的嵌合PD-1蛋白、上述的嵌合PD-1基因、上述的基因组DNA、上述的构建体、上述细胞、上述的组织、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官在与PD-1基因或者蛋白相关的领域中的应用。

[0134] 优选的，所述的应用包括在需要涉及狗类细胞的免疫过程的产品开发，制造狗类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及狗类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、狗PD-1、PD-L1信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究PD-1基因功能研究、狗PD-1抗体、PD-L1抗体针对狗PD-1、PD-L1靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。

[0135] 本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

[0136] 本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，
31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，
46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，
70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，
94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，
99.7％，99.8％，99.9％的同源性。

[0137] 本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和狗序列。

[0138] 本发明所述的狗选自泰迪、博美、金毛、金巴串、中华田园犬、萨摩、贵宾、吉娃娃或德牧中的一种。

[0139] 在一个方面，所述非人动物是除狗外的非人类哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

[0140] 在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。

[0141] 本发明所述“癌”选自下组，该组由以下各项组成：白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自下组，该组由以下各项组成：急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；并且所述肉瘤选自下组，该组由以下各项组成：骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。

[0142] 除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&
S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，
1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；
Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

[0143] 以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

[0144] 本发明提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。附图说明

[0145] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

[0146] 图1：鼠Pd-1基因与狗PD-1基因对比示意图(非按比例)；

[0147] 图2：PD-1狗源化小鼠基因示意图(非按比例)；

[0148] 图3：打靶策略示意图；

[0149] 图4：图A为pClon-4G-DPD-1质粒酶切结果图，其中，ck为未经酶切对照，M为Marker，序号1-10为质粒编号，图B为分子量对照；

[0150] 图5：pClon-4G-DPD-1质粒酶切结果图，其中，ck为未经酶切对照，M为Marker，序号2、3、5、6、7、9、10为质粒编号；

[0151] 图6：sgRNA活性检测结果，其中，sgRNA1-sgRNA4识别5’端靶位点，sgRNA5-sgRNA8识别3’端靶位点，Con.为阴性对照，PC为阳性对照，Blank为空白对照；

[0152] 图7：F0代小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，M为Marker，H2O为水对照，F0-1至F0-10为小鼠编号；

[0153] 图8：F0代小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，M为Marker，H2O为水对照，F0-1至F0-10为小鼠编号；

[0154] 图9：Pd-1基因敲除小鼠PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H2O为水对照，M为Marker，KO-1至KO-3为小鼠编号；

[0155] 图10：小鼠结肠癌细胞MC38植入狗源化PD-1小鼠纯合子体内，并利用狗PD-1抗体Ab1、Ab2和Ab3进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验动物体重；

[0156] 图11：小鼠结肠癌细胞MC38植入狗源化PD-1小鼠纯合子体内，并利用狗PD-1抗体Ab1、Ab2和Ab3进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验动物体重变化；

[0157] 图12：小鼠结肠癌细胞MC38植入狗源化PD-1小鼠纯合子体内，并利用狗PD-1抗体Ab1、Ab2和Ab3进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验动物肿瘤体积。

具体实施方式

[0158] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0159] 本申请实施例所用的小鼠品系、生化试剂、实验仪器为：

[0160] C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

[0161] EcoRI、BamHI、HindIII、EcoRV、KpnI酶购自NEB，货号分别为：R3101M、R3136M、R3104M、R0195S、R0142S；

[0162] Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；

[0163] UCA试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-001；

[0164] 逆转录试剂盒来源TakaRa，货号6110A；

[0165] 大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104－02；

[0166] Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；

[0167] AIO试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-004；

[0168] pHSG299质粒购自Takara，货号3299；

[0169] 流式细胞仪生产厂家BD，型号为Calibur。

[0170] 实施例1序列设计

[0171] 非人动物，如小鼠的Pd-1基因和狗的PD-1基因均含有多个转录本，本实施例的序列设计主要以其中一个转录本为例进行阐述。即，将小鼠Pd-1基因(Gene ID：18566)第2号外显子的主要部分(基于NCBI登录号为NM_008798.2→NP_032824.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：1所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示)用狗PD-1基因(Gene ID：486213)的相应片段替换(基于NCBI登录号为NM_001314097.1→NP_001301026.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：3所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：4所示)。其中，鼠Pd-1基因与狗PD-1基因对比示意图见图1，最终得到的改造后的狗源化小鼠PD-1基因示意图见图2，狗源化小鼠PD-1基因DNA序列(嵌合PD-1基因)如SEQ ID NO：5所示：

[0172] CCCCAATGGGccctggagcccgctcaccttctccccggcgcagctcacggtgcaggagggagagaacgccacgttcacctgcagcctggccgacatccccgacagcttcgtgctcaactggtaccgcctgagcccccgcaaccagacggacaagctggccgccttccaggaggaccgcatcgagccgggccgggacaggcgcttccgcgtcaCgcggctgcccaacgggcgggacttccacatgagcatcgtcgctgcgcgcctcaacgacagcggcatctacctgtgcggggccatctacctgccccccaacacacagatcaacgagagtccccgcgcagagCTCGTGGTAA

[0173] SEQ ID NO：5仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为狗源PD-1基因序列片段。

[0174] 改造后的狗源化小鼠PD-1的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

[0175] 实施例2载体pClon-4G-DPD-1的设计及构建

[0176] 根据序列设计，发明人进一步的设计了如图3所示的打靶方案和包含5’同源臂、狗PD-1基因片段、3’同源臂的载体。其中5’同源臂(SEQ ID NO：9)为NCBI登录号为NC_000067.6的第94041502-94043271位核苷酸，3’同源臂(SEQ ID NO：10)为NCBI登录号为NC_
000067.6的第94039436-94041168位核苷酸，狗PD-1基因片段(SEQ ID NO：11)为NCBI登录号与NC_006607.3的第51611212-51611544位核苷酸有1处序列不同，即该序列第203位T点突变为C，该突变不影响蛋白表达。

[0177] 载体的构建过程如下：设计扩增5’同源臂、3’同源臂的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。其中，5’同源臂对应LR片段，3’同源臂对应RR片段，引物序列如下：

[0178] LR：F：5’-tttaagaaggagatatacatggctcgagtggcccatagagaccaatgtggac-3’(SEQ ID NO：12)

[0179] R：5’-gagcgggctccagggcccattggggacctctgaaatgcag-3’(SEQ ID NO：13)[0180] RR：F：5’-agtccccgcgcagagctcgtggtaacaggtgaggctagtag-3’(SEQ ID NO：16)[0181] R：5’-ttgttagcagccggatctcagtctagatgtgcacacaggcgg-3’(SEQ ID NO：17)[0182] 以C57BL/6小鼠DNA或BAC文库为模板PCR扩增获得LR、RR片段，经外部序列合成公司合成SEQ ID NO：11所示的狗源序列。通过AIO试剂盒将片段连接至试剂盒配备的pClon-4G质粒上，最终获得载体pClon-4G-DPD-1。

[0183] 随机挑选10个pClon-4G-DPD-1克隆，使用3组限制性内切酶进行酶切验证，其中，HindIII应出现5984bp+1098bp+270bp，EcoRV+EcoRI应出现5540bp+1812bp，KpnI+BamHI应出现5554bp+1798bp。酶切结果参见图4-5，编号为2、3、5、6、7、9、10的质粒酶切结果均符合预期，表明这些质粒酶切验证结果正确。质粒3、5经测序公司测序验证正确，选择质粒3进行后续实验。

[0184] 实施例3靶向Pd-1基因的sgRNA的设计和筛选

[0185] 靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。

[0186] 根据打靶方案，设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA4)、3’端靶位点(sgRNA5-sgRNA8)的sgRNA序列。

[0187] 以小鼠为例，根据Pd-1基因的功能和序列特征，5’端靶位点和3’端靶位点均位于小鼠Pd-1基因的第2号外显子上，各sgRNA在Pd-1上的靶位点序列如下：

[0188] sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：18)：5’-agggacctccagggcccattggg-3’[0189] sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：19)：5’-cagaggtccccaatgggccctgg-3’[0190] sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：20)：5’-gtagaaggtgagggacctccagg-3’[0191] sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：21)：5’-ccctcaccttctacccagcctgg-3’[0192] sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：22)：5’-gcaccccaaggcaaaaatcgagg-3’[0193] sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：23)：5’-ggagcagagctcgtggtaacagg-3’[0194] sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：24)：5’-gttaccacgagctctgctccagg-3’[0195] sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：25)：5’-gcaaaaatcgaggagagccctgg-3’[0196] 利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见表1和图6。其中UCA的检测结果表明，所有靶位点中sgRNA-5活性最低，sgRNA-3活性最高，这可能由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实验，sgRNA-5的数值仍显著高于Con组数值，仍可判断sgRNA-5是具有活性的，活性满足基因打靶实验要求。从中优先选择sgRNA-3和sgRNA-8并在其上游序列的5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，在其互补链(下游序列)的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸，合成正向、反向寡核苷酸后进行后续实验。具体序列如下：

[0197] sgRNA-3：

[0198] 上游序列：5’-TAGAAGGTGAGGGACCTCC-3’(SEQ ID NO：26)

[0199] 正向寡核苷酸：5’-TAGGTAGAAGGTGAGGGACCTCC-3’(SEQ ID NO：27)

[0200] 下游序列：5’-GGAGGTCCCTCACCTTCTA-3’(SEQ ID NO：28)

[0201] 反向寡核苷酸：5’-AAACGGAGGTCCCTCACCTTCTA-3’(SEQ ID NO：29)

[0202] sgRNA-8：

[0203] 上游序列：5’-CAAAAATCGAGGAGAGCCC-3’(SEQ ID NO：30)

[0204] 正向寡核苷酸：5’-TAGGCAAAAATCGAGGAGAGCCC-3’(SEQ ID NO：31)

[0205] 下游序列：5’-GGGCTCTCCTCGATTTTTG-3’(SEQ ID NO：32)

[0206] 反向寡核苷酸：5’-AAACGGGCTCTCCTCGATTTTTG-3’(SEQ ID NO：33)

[0207] 表1 UCA检测结果

[0208]名称相对值
Con. 1.0±0.10
sgRNA1 16.8±0.11
sgRNA2 21±0.07
sgRNA3 25.5±0.09
sgRNA4 10.2±0.05
sgRNA5 7.0±0.12
sgRNA6 11.9±0.06
sgRNA7 18.3±0.02
sgRNA8 17.9±0.01
PC 18.3±0.01
Blank 0.03±0.03

[0209] 实施例4pT7-sgRNA G2质粒构建

[0210] pT7-sgRNA G2质粒来源：由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：34)并通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体pHSG299质粒上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。

[0211] 含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：34)：

[0212] Gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc

[0213] 实施例5pT7-sgRNA-DPD3和pT7-sgRNA-DPD8重组表达载体的构建

[0214] 将实施例3中获得的正向、反向寡核苷酸退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒，获得表达载体pT7-sgRNA-DPD3和pT7-sgRNA-DPD8。连接反应体系(10μL)：sgRNA退火产物，1μL(0.5μM)；pT7-sgRNA G2载体，1μL(10ng)；T4DNA Ligase，1μL(5U)；10×T4DNA Ligase buffer，1μL；50％PEG4000，1μL；H2O，补至10μL。

[0215] 反应条件为：室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5mL)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。

[0216] 随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-sgRNA-DPD3和pT7-sgRNA-DPD8进行后续实验。

[0217] 实施例6显微注射及胚胎移植

[0218] 取小鼠的受精卵，如，C57BL/6小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-sgRNA-DPD3、pT7-sgRNA-DPD8质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA，pClon-4G-DPD-1质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造狗源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。将获得的F0代小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。

[0219] 实施例7基因改造狗源化小鼠的鉴定

[0220] 1、F0代基因型鉴定

[0221] 分别使用两对引物得到的F0代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物位置L-GT-F位于5’同源臂左侧，R-GT-R位于3’同源臂右侧，Mut-R1和Mut-F1均位于狗源化片段上，具体序列如下：

[0222] 5’端引物：

[0223] 上游引物：L-GT-F：5’-CATCATACTGGCAACCCCTAGCCTG-3’(SEQ ID NO：35)下游引物：Mut-R1：5’-GCTGTCGTTGAGGCGCGCAGCGAC-3’(SEQ ID NO：36)

[0224] 3’端引物：

[0225] 上游引物：Mut-F1：5’-CTGGCCGACATCCCCGACAGCTTCG-3’(SEQ ID NO：37)下游引物：L-GT-R：5’-TGACAATAGGAAACCGGGAAGCCTG-3’(SEQ ID NO：38)

[0226] PCR反应体系(20μL)如下：2×PCR buffer，10μL；dNTP(2μM)，4μL；上游引物(10μM)，0.6μL；下游引物(10μM)，0.6μL；鼠尾基因组DNA，100ng；KOD-FX(1U/μL)，0.4μL；H2O，补至20μL；

[0227] PCR扩增反应条件：94℃，2min；(98℃，10sec；67℃(-0.7℃/cycle)，30sec；68℃，1kb/min，15个循环)(98℃，10sec；56℃，30sec；68℃，1kb/min，25个循环)；68℃，10min；4℃保温。

[0228] 如果重组载体插入位置正确，则应只有1条PCR条带，5’端引物产物长度应为2100bp，3’端引物产物长度应为2353bp。

[0229] F0代小鼠PCR鉴定结果见图7-8，其中编号为F0-1至F0-10的10只小鼠为阳性小鼠。

[0230] 实施例8基因敲除小鼠的鉴定

[0231] 由于Cas9的切割造成DNA双链断裂，而同源重组的修复方式会产生插入/缺失突变，可能在制备PD-1基因狗源化小鼠的同时，得到鼠PD-1蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物进行检测，分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，序列如下：

[0232] KO-F：5’-GGGAAGGTAGAGACATCTTCGGGGA-3’(SEQ.ID.NO：14)

[0233] KO-R：5’-CGAGGGGCTGGGATATCTTGTTGAG-3’(SEQ.ID.NO：15)

[0234] 野生型小鼠PCR产物长度应为970bp，基因敲除小鼠产物长度应为约650bp。PCR扩增体系和条件参见F0代鼠尾检测。PCR结果见图9。所检测的3只小鼠中，编号为KO-1、KO-3的小鼠为Pd-1基因敲除杂合子。

[0235] 实施例9双重狗源化或多重狗源化小鼠的制备及鉴定

[0236] 包含狗源PD-1基因的小鼠(如利用本方法或制得的dPD-1动物模型)还可以用于制备双重狗源化或多重狗源化动物模型。如，前述实施例6中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞进行注射，或对dPD-1小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到PD-1狗源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。另外，也可将本方法得到的dPD-1动物模型纯合或杂合子与其它基因突变或基因修饰纯合或杂合动物模型交配或进行体外受精(IVF)，再对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到PD-1狗源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合动物模型，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子动物模型。

[0237] 实施例10狗源化PD-1动物模型体内药效验证

[0238] 取本方法制备的狗源化PD-1基因纯合小鼠(4-6周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择3种狗PD-1单克隆抗体(Ab1、Ab2、Ab3，均为使用常规方法免疫小鼠得到，参见Janeway'sImmunobiology(9thEdition))中的1种，给药剂量均为10mg/kg，对照组注射生理盐水。给药方式：腹腔注射，每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。

[0239] 表2中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时(第0天)和分组后18天时的肿瘤体积、实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumor free)的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGITV)。

[0240] 表2肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率

[0241]

[0242] 整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重增长良好(图10)，且所有治疗组与对照组相比，动物体重无明显差异，表明动物对所述3种抗体耐受良好。所有实验治疗组(G2-G4)和对照组(G1)小鼠平均体重增长变化在整个实验周期内均无明显区别(图11)，表明这三种抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。治疗效果上，抗体Ab3(G4)治疗组与对照组(G1)相比，肿瘤体积差别不明显(见图12)，抗体Ab1(G2)和Ab2治疗组(G3)的小鼠平均肿瘤体积分别为1402±529mm3，1021±633mm3，与对照组(G1)相比(平均肿瘤体积为2099±551mm3)，肿瘤体积呈现明显的缩小，表明这2种狗PD-1单抗在抑制肿瘤生长方面具有一定的作用，且抗体Ab2体内治疗肿瘤效果稍优于抗体Ab1。证明了本方法制备的狗源化PD-1基因改造小鼠可用于筛选靶向狗PD-1抗体及体内药效检测，可作为体内研究的活体替代模型，用于狗PD-1信号通路调节剂的筛选、评估和治疗。

[0243] 实施例11基于胚胎干细胞的制备方法

[0244] 采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。鉴于本发明的目的之一是将小鼠Pd-1基因的2号外显子全部或部分用狗PD-1基因片段替换，为此，发明人设计了包含5’同源臂、3’同源臂和狗源PD-1片段的重组载体，在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，如C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到基因狗源化纯合子小鼠。对获得的小鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例7、8一致。结果表明，利用ES细胞基因同源重组技术也可以制备得到PD-1基因狗源化小鼠。

[0245] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0246] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0247] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

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