Thp-1细胞膜蛋白Annexin A2在Ac-Gal-1诱导凋亡中的应用
技术领域
[0001] 本
发明属于生命科学技术领域，尤其是一种Thp-1细胞上的膜蛋白Annexin A2在广州管 圆
线虫(Angiostrongylus Cantonensis，Ac)蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用。
背景技术
[0002] 广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)是引起嗜酸性脑膜炎的重要病原体，可引 起中枢神经系统损伤，严重者导致死亡。Galectins在诱导细胞凋亡方面发挥重要作用，但尚 无广州管圆线虫Galectin-1具有诱导细胞凋亡功能的研究和应用，以及诱导细胞凋亡的膜蛋 白受体。
[0003] 通过检索，与本发明
专利申请相似的现有研究如下：
[0004] (1)人类Galectins蛋白具有诱导细胞凋亡的功能。
[0005] (2)广州管圆线虫Galectin-1是一种重要的免疫调节分子，具有免疫抑制作用。
[0006] 通过对比，本发明专利申请与上述相关的公开文献存在本质的不同。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于克服
现有技术的不足之处，补充对广州管圆线虫致病机制研究的不足， 提供一种Thp-1细胞上的膜蛋白Annexin A2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应 用，该应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡的应用，特别是Thp-1细胞上 的膜蛋白Annexin A2在细胞凋亡过程中可作为药物靶点的应用，为
治疗药物的研制提供新思 路，为广州管圆线虫病的治疗提供理论依据。
[0008] 本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
[0009] 一种Thp-1细胞上的膜蛋白Annexin A2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应 用。
[0010] 而且，所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1通过细胞膜蛋白Annexin A2诱导Thp-1 细胞凋亡的应用。
[0011] 而且，所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1在诱导细胞凋亡以及广州管圆线虫致病 机制中的应用。
[0012] 而且，所述应用为Thp-1细胞上的膜蛋白Annexin A2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱 导的细胞凋亡中作为治疗广州管圆线虫的药物靶点中的应用。
[0013] 而且，所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白Annexin A2诱导细胞凋亡的作用。
[0014] 而且，所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白Annexin A2诱导细胞凋亡的作用的验证方法，步骤如下：
[0015] ⑴广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——CCK-8实验
[0016] CCK-8实验分别检测不同作用时间：6h，12h，18h，24h，不同浓度0-100μMAc-Galectinl-1 蛋白对Thp-1细胞的抑制情况，所述Ac-Galectinl-1蛋白为广州管圆线虫蛋白Galectin-1；具 体操作步骤如下：
[0017] ①Thp-1细胞毒性实验：每孔加入100微升5000±10个细胞。按照实验需要，进行培养 并给予0，0.05，0.2，0.8，3.2，12.5，25，50，100μg/mLAc-Galectin-1刺激，作用6h、12h、 18h、24h；
[0018] ②每孔加入10微升CCK-8溶液，同时设置加入相应量细胞培养液、Ac-Galectin-1和 CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；
[0020] ④在450nm处测定吸光度；
[0021] ⑵广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——AnnexinⅤ-FITC流式方法检测细胞 凋亡
[0022] 为了验证广州管圆线虫Galectin-1诱导THP-1细胞凋亡，采用Annexin V-FITC/PI双
染色结 合流式细胞术检测THP-1细胞凋亡；
[0023] 根据CCK-8结果，选择500ng/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mLAc-Galectin-1蛋白作用浓 度，进行流式检测；同等浓度的
牛血清
白蛋白处理Thp-1细胞作为无关蛋白对照，地塞米松处 理Thp-1细胞作为细胞凋亡的阳性对照；与BSA对照组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞凋亡率 显著增高；具体操作步骤如下：
[0024] ①将0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mLAc-Galectin-1加入到Thp-1细胞，作用18h 后，37℃预温的PBS洗涤细胞一次，将Thp-1细胞用胰酶消化下来；
[0025] ②细胞消化下来后，加入细胞培养液转移到15mL离心管内，2000g离心5min，弃上清， 收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；
[0026] ③取1～5×105重悬的细胞，2000g离心5min，弃上清，加入500μL结合液，轻轻重悬细 胞；
[0027] ④加入5μL结合液，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶PI，轻轻混匀；
[0028] ⑤室温20～25℃避光孵育10min；
[0029] ⑥随即进行流式细胞仪检测，结合液为绿色
荧光，PI为红色荧光；
[0030] ⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——Western Blot检测凋亡蛋白的表达
[0031] 为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1凋亡，Western Blot检测促凋亡蛋白caspase-3、 Bax、caspase-9蛋白及抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量；分为正常细胞组、Ac-Galectin-1处理 组、同等浓度的牛血清白蛋白处理组作为无关蛋白对照；
[0032] 与正常细胞组和同等浓度的牛血清白蛋白处理组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞促凋亡 蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白表达量显著增高，抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量显著降 低；
[0033] 具体步骤如下：
[0034] ①样品制备
[0035] 100μg/mLAc-Galectin-1作用于Thp-1细胞，弃去培养液，加入PBS后用刮铲刮下贴7
壁细 胞细胞，2000rpm离心5min，收集细胞，PBS洗涤一次；每10个细胞加50μL细胞裂解液，
冰上裂解l0min后，13000rpm/min离心l0min，收集上清，取40μL，加入10μL的5×蛋白 上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；
[0037] ③转膜：依次按照
滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸
自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃 棒将气泡赶尽，
电压15V，转膜30min；
[0038] ④封闭：转膜结束后将PVDF膜用
质量浓度为5％的
脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST 洗涤3次，每次10mim；
[0039] ⑤孵育一抗：将一抗
抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育 2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；
[0040] ⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体 积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST洗涤5次，每次10min；
[0041] ⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果；
[0042] ⑷广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——caspase-3活性检测
[0043] Caspase-3是细胞凋亡的执行分子，其发生活化引起细胞凋亡；为了进一步验证 Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡，检测caspase-3的酶活性；
[0044] Ac-Galectin-1引起caspase-3酶活性增高，则引起Thp-1细胞发生凋亡；
[0045] 操作步骤如下：
[0046] ①测定pNA标准曲线：
[0047] 标准品稀释液的配制：按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制标准品稀 释液；
[0048] 将pNA 10mM用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100、200μM，每个浓度取100μL 用酶标仪进行检测，测定A405；每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计 算出实际的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线；
[0049] ②样品的收集
[0050] 吸取细胞培养液，用胰酶消化贴壁细胞，收集细胞加入到新的细胞培养液中，600×g 4℃ 离心5min收集细胞，小心吸去上清，PBS洗涤一次，再次吸尽上清后，按照每200万细胞加 入100μL裂解液的比例加入细胞裂解液，重悬细胞沉淀，放置冰上裂解15min；
[0051] ③样品测定
[0052] 如下设置反应体系：
[0053] 空白对照:检测缓冲液40μL、待测样品0μL、裂解液50μL、Ac-DEVD-pNA(2mM)10μL[0054] 样品：检测缓冲液40μL、待测样品50μL、裂解液0μL、Ac-DEVD-pNA(2mM)10μL[0055] 取出Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上备用；在比色杯中加入Ac-DEVD-pNA(2mM) 后混匀，在混匀时注意避免产生气泡，37℃孵育1-2h，样品的A405减去空白对照的A405， 即为样品中caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度；
[0056] ⑸Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——提取Thp-1细胞膜蛋白
[0057] ①通过4℃、700×g离心5min，收集细胞1±0.1g湿重，细胞个数为0.2-10×108，对于贴 壁细胞，刮下PBS中的细胞，然后700×g离心5min，沉淀细胞；
[0058] ②用3mL冰冷的PBS清洗细胞一次；
[0059] ③将细胞重新悬浮在2mLHomogenization Buffer中，在冰上用匀浆细胞30-50次；
[0060] ④将匀浆转移到1.5mL微量离心管中，在4℃条件下，700×g离心10min，收集上清液并 弃去沉淀；
[0061] ⑤将上清液转移至新的离心管中，并在4℃以10000×g离心30min；
[0062] ⑥弃上清，收集白色沉淀，白色沉淀是总细胞膜
蛋白质，其含有来自质膜和细胞器的蛋 白质膜；
[0063] ⑦纯化细胞膜蛋白质，获得质膜蛋白；
[0064] ⑹Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——IP实验
[0065] 为了探究与Ac-Galectin-1相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白，采用IP方法沉淀互 作蛋白；操作步骤如下：
[0066] ①贴壁细胞裂解液的制备
[0067] 弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，保持于冰上，再次加入PBS并用细胞刮铲刮 取细胞，收集细胞并转移至15mL离心管中；向收集好的细胞中加入1mL细胞裂解Buffer 于冰上孵肓10‐30min，中间晃动使裂解Buffer和细胞充分
接触；4℃，12000×g离心10min， 收集上清，并转移至新的离心管-20℃保存，备用；
[0068] ②取细胞裂解液350μL加入350μL 2×IP Buffer；
[0069] ③将样品加入到His标签蛋白
磁珠复合物中，室温孵育10min；
[0070] ④孵育完成后将离心管放入磁
力架1min，弃去上清；
[0071] ⑤用300μL 1×Binding/Wash Buffer清洗磁珠4次，加入1×Binding/Wash Buffer后混匀 放入磁力架1min后弃去上清，收集磁珠‐His标签-蛋白-未知蛋白复合物；
[0072] ⑥向上述磁珠中，加入100μLHis标签洗脱液室温孵育混悬5min；
[0073] ⑦将离心管放入磁力架，收集上清放入新的离心管，上清中的His标签蛋白和未知蛋白 复合物可用于后续分析；
[0074] ⑧取50μL收集的His标签蛋白和未知蛋白复合物，进行SDS‐PAGE电泳，考
马斯亮蓝 R250染色，观察电泳结果；
[0075] ⑨将His标签蛋白和未知蛋白复合物液体以及跑胶凝胶条送去蛋白质谱检测，采用QE 质谱鉴定；
[0076] ⑺Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——免疫荧光
[0077] 荧光共
定位初步验证IP及QE质谱结果，即Ac-Galectin-1与Annexin A2可能存在相互 作用：
[0078] ①将圆形细胞爬片加到24孔板；
[0079] ②将1mL含有PMA的THP-1细胞悬液滴加在爬片上，37℃培养48h，使细胞贴在爬片 上，伸出伪足诱导成为贴壁细胞；
[0080] ③吸去上清，用37℃
水浴锅预温的PBST洗涤1次，每孔加入1mL；
[0081] ④质量百分数为4％的多聚甲
醛37℃固定细胞15min；
[0082] ⑤用预温的PBS静置洗涤3次，用
注射器吸去；
[0083] ⑥质量百分数为10％的FBS 37℃封闭30min，吸去FBS；
[0084] ⑦一抗抗体用质量百分数10％FBS稀释，放在37℃培养箱里3h，或4℃过夜；
[0085] ⑧用预温的PBST洗5次；
[0086] ⑨加用质量百分数10％FBS稀释后的HRP山羊抗兔二抗，45min，从该步起均闭光；
[0087] ⑩每孔加400μLDAPI染细胞核4min，预温的PBST洗5次；质量百分数为50％的甘油 封片：在
载玻片上加一滴质量百分数为50％甘油，然后把载玻片
正面扣在甘油上，激光共聚 焦
显微镜镜下观察；
[0088] ⑻Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——IP实验
[0089] 按照步骤⑹的IP实验的操作步骤操作，进行IP实验即可；根据QE质谱鉴定及免疫荧光 实验验证Thp-1细胞膜上的Annexin A2可能是Ac-GaIectin-1结合作用到Thp-1细胞膜上的配 体，用Western Blot验证；
[0090] ⑼Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——Co-IP免疫共沉淀[0091] 为了进一步证明Annexin A2与Ac-Galectin-1相互结合，采用Co-IP免疫共沉淀方法进行 验证：
[0092] ①抗体固定化
[0093] 将偶联
树脂平衡至室温，用ddH2O稀释交联缓冲液至1×，轻轻摇晃偶联树脂使其重悬， 使用大枪头吸取50μL均一偶联树脂至离心柱中，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min， 弃流出液；用200μL 1×交联缓冲液洗涤树脂，1000g离心1min并弃流出液，用纸巾吸去离心 柱底部多余的液体，然后插入底塞；
[0094] 向离心柱中加入50μg抗体，用ddH2O和20×交联缓冲液将液体体积调整至200μL；在 通
风厨中，吸取3μL 5M氰基
硼氢化钠溶液加入到200μL反应体系中；离心柱在室温条件下 旋转孵育2h；离心并加入200μL 1×交联缓冲液洗一次；加入200μL淬灭缓冲液，1000g离 心1min，再在
通风橱中加入3μL氰基硼氢化钠溶液，盖上旋盖上下颠倒轻轻混匀，室温孵育
15min；卸下底塞，1000g离心1min并弃流出液，加入200μL 1×交联缓冲液，1000g离心1min 并弃流出液，重复上述操作一次；加入150μL洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重 复六次；
[0096] 胰酶消化贴壁细胞，2000rpm离心5min收集细胞沉淀，加入1mL杜氏PBS轻悬细胞， 2000rpm离心5min重复2次，获得细胞沉淀；将冰上预冷的IP裂解/洗涤缓冲液加入细胞沉 淀中，随后立即加入蛋白酶
抑制剂、
磷酸酶抑制剂，放置冰上孵育裂解10min并充分混匀； ～13000g，4℃离心10min以沉淀细胞碎片，离心后吸取上清转移到新EP管中，进行BCA法 蛋白定量；
[0097] ③对照琼脂糖预处理细胞裂解液
[0098] 加入100μL 1×交联缓冲液，1000g离心1min，弃流出液；轻轻重悬对照琼脂糖树脂使其 均匀，对于1mg细胞裂解液中加入80μL对照琼脂糖树脂到离心柱中；4℃
冰箱中旋转孵育 1h，1000g离心1min，保留流出液；
[0099] ④免疫共沉淀
[0100] 加入200μL IP裂解/洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液；重复该操作一次；用纸 巾吸去离心柱底部多余的液体，随后加入对照琼脂糖预处理过的细胞裂解液，4℃冰箱中旋转 孵育过夜；去掉底塞，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min并保留流出液做后续分析； 加入200μL IP裂解/洗涤缓冲液并离心，该步骤重复两次；加入100μL 1×条件缓冲液并离心， 保留流出液，BCA检测蛋白浓度；
[0101] ⑤洗脱
[0102] 将离心柱置于一个新的离心管中，加入10μL洗脱缓冲液，1000g离心1min，加入50μL 洗脱缓冲液，室温条件下静置5min，1000g离心1min，保留洗脱液并记作E1；可再次洗脱， 洗脱液分别记作E2、E3；
[0103] ⑥将免疫共沉淀的洗脱液取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制备样 品；进行Western Blot验证，操作步骤均按照上述步骤⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1 细胞凋亡——Western Blot检测凋亡蛋白的表达方法，采用的一抗二抗也均与步骤⑹的IP实 验时一致；
[0104] ⑽Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷
酸化信号通路的探究——MAPK通路磷酸化蛋白 芯片
[0105] 预实验确定通路磷酸化的时间点，用100μg/mLAc-Galectin-1分别作用于Thp-1细胞0h， 0.5h，1h，2h；收集细胞沉淀，RIPA裂解，加入磷酸酶抑制剂NaVO3，取RIPA裂解液40μL， 加入10μL5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；进行Western Blot验证，孵育一抗 Anti-phosphotyrisine rabbit pAb过夜，4℃，室温孵育抗兔二抗1h后进行曝光，成像仪成像， 观察结果；
[0106] 筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白；
[0107] ①将2.0mL洗膜缓冲液TBST加入要使用的4孔多碟的每个孔中，将膜片单张放置在4 孔多碟的一个孔中，摇动平台摇床上孵育1h；
[0108] ②当膜被封闭好后，准备样品，即未处理组Thp-1细胞裂解液和Ac-Galectin-1处理组细 胞裂解液，每个样品取400μL加入样品分离管，使用缓冲液调节至1.5mL的最终体积；
[0109] ③向每个制备的样品中加入20μL检测抗体混合物，在室温下孵育混合1h；
[0110] ④从4孔多碟的孔中吸去TBST缓冲液并添加制备的样品/抗体混合物，盖上4孔多碟， 在摇床摇床上2-8℃孵育过夜；
[0111] ⑤在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；
[0112] ⑥吸取2mL 1×链霉亲和素-HRP到4孔多碟的每个孔中，在室温下摇动平台摇床上孵育 30min，在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；
[0113] ⑦小心地从洗涤容器中取出每个膜，每个
薄膜上带有标识数字的面朝上放置，将1mL制 备的Chemi
试剂均匀地吸移到每个膜上；
[0114] ⑧成像仪曝光膜1-10min；
[0115] ⑾Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——Western Blot检测凋亡信 号通路相关蛋白的表达
[0116] ①样品制备
[0117] 在对Thp-1细胞处理之前，先去掉含有胎牛血清的培养液，用不含胎牛血清的1640培养 液使细胞饥饿12h后，特异性c-JUN抑制剂作用于细胞20min，即可达到抑制JNK磷酸化 的效果，再加入100μg/mlAc-Galectin-1细胞作用1h，同时10ng/ml EGFR刺激Thp-1细胞， 激活通路，作为阳性对照；弃去培养液，用刮铲刮下细胞，1500rpm离心l0min，收集细胞， PBS洗涤一次；每加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，2000rpm/min离心l0min，收集 上清，取40μL，加入l0μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；
[0118] 分组：空白对照组、10μM SP600125处理组、10μM SP600125+100μMAc-Galectin-1处理 组、100μMAc-Galectin-1处理组、10μM EGFR处理组；
[0119] ②SDS—PAGE电泳；
[0120] ③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃 棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；
[0121] ④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST 洗涤3次，每次10mim；
[0122] ⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育 2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；
[0123] ⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体 积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST涤5次，每次10min；
[0124] ⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果。
[0125] 而且，所述步骤⑴CCK-8结果显示，在0-2μg/mL作用浓度下细胞活性抑制率成指数增 长，趋势尤为显著，因此步骤⑵中采用广州管圆线虫Galectin-1的诱导浓度为500ng/mL、 1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL。
[0126] 而且，所述步骤⑴中采用碧
云天试剂公司的CCK-8检测
试剂盒；
[0127] 或者，所述步骤⑵中采用南京建成试剂公司的AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测 细胞凋亡；或者，所述步骤⑵中采用Gibco胰酶，用于消化细胞；
[0128] 所述步骤⑵中细胞培养液为1640细胞培养液，所述结合液为AnnexinV-FITC结合液；
[0129] 而且，所述步⑶⑾中采用CST单克隆一抗及二抗检测GAPDH、caspase-3、caspase-9、 Bax、Bcl-2、JNK、ERK、Akt、EGFR、Annexin A2蛋白表达及磷酸化水平；
[0130] 或者，所述步骤⑷中采用碧云天碧云天试剂公司的caspase-3活性检测试剂盒；
[0131] 或者，所述步骤⑸采用Biovision细胞膜蛋白提取试剂盒。
[0132] 或者，所述步骤⑹⑻中采用Sino Biological Inc His-IP试剂盒。
[0133] 而且，所述步骤⑼中采用Pierce免疫共沉淀Co-IP试剂盒；或者，所述步骤⑼①中偶联 树脂为加强型Amino-Link偶联树脂；
[0134] 或者，所述步骤⑽中筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白采用人MAPK通路磷酸化蛋 白芯片试剂盒；或者，所述步骤⑽①中TBST配方为：8g NaCl、20mL 1MTris-HCl PH＝8.0， 加入去离子水定容至1L再加入500μL吐温；
[0135] 或者，所述步骤⑾①中特异性c-JUN抑制剂采用Selleck特异性JNK磷酸化抑制剂 SP600125。
[0136] 本发明取得的优点和积极效果是：
[0137] 1、本发明为广州管圆线虫蛋白Galectin-1以及与其相互作用的细胞膜蛋白Annexin A2 的应用，该应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有使细胞发生凋亡的作用的应用，特别是 一种Thp-1细胞上的膜蛋白Annexin A2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用， 该应用为研究广州管圆线虫致病机制以及防治的应用，为广州管圆线虫病的治疗提供理论依 据，为治疗药物的研制提供潜在作用靶点；同时为广州管圆线虫病治疗药物的研发奠定
基础， 为广州管圆线虫的个性化治疗提供靶标，具相当的市场前景和应用性。
[0138] 2、本发明中广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有诱导Thp-1细胞凋亡作用的验证方法简单、 操作方便，分析了广州管圆线虫Galectin-1蛋白对Thp-1细胞有凋亡作用，筛选出于Galectin-1 相互作用并引发细胞凋亡的细胞膜受体Annexin A2蛋白，并进一步通过验证，从不同方面分 析了广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡的信号通路相关蛋白，为更好地理解广州 管圆线虫的致病机制提供依据，为广州管圆线虫病的免疫治疗奠定理论基础。
附图说明
[0139] 图1-A-E为本发明中CCK-8检测分别检测不同时间：6h，12h，18h，24h，不同浓度 (0-100μg/ml)Ac-Galectinl-1蛋白对Thp-1细胞的抑制情况图；
[0140] 图2为本发明中流式细胞术检测不同Ac-Galectin-1蛋白浓度下Thp-1细胞的凋亡结果图； 其中，图2-A为不同Ac-Galectin-1蛋白浓度下Thp-1细胞的凋亡流式结果图；图2-B为统计学结 果图；
[0141] 图3为本发明中Western Blot检测凋亡蛋白表达水平结果图；其中，图3-A为Western Blot 结果图；图3-B为统计学结果图；
[0142] 图4为本发明中caspase-3酶活测定结果图；
[0143] 图5为本发明中提取细胞膜蛋白及IP结果图；
[0144] 图6为本发明中Ac-Galectin-1与Annexin A2免疫荧光共定位结果图；其中上图为 Ac-Galectin-1与细胞膜蛋白Annexin A2共定位；下图为添加乳糖后，乳糖封闭Ac-Galectin-1， 未能与Annexin A2结合；
[0145] 图7为本发明中Ac-Galectin-1与Annexin A2发生相互作用IP结果图；
[0146] 图8为本发明中Ac-Galectin-1与Annexin A2发生相互作用Co-IP结果图；
[0147] 图9为本发明中磷酸化MAPK蛋白芯片结果结果图，标黄为磷酸化水平有显著性差异的蛋 白；
[0148] 图10-A为本发明中Western Blot检测通路关键蛋白磷酸化水平情况及抑制剂SP6001259 (主要针对JNK)对抑制细胞JNK磷酸化的作用；其中，图10-B、图10-C为蛋白相对灰度值 柱状统计图；
[0149] 图11-A为本发明中Western Blot检测通路凋亡和自噬相关蛋白表达水平情况及抑制剂 SP6001259(主要针对JNK)对抑制细胞凋亡的作用；其中，图11-B为蛋白相对灰度值柱状统 计图。
具体实施方式
[0150] 为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，兹例举以下
实施例，并配合附图详细说明 如下。需要说明的是，本实施例是描述性的，不是限定性的，不能由此限定本发明的保护范 围。
[0151] 本发明中所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域的常规试剂；本发明中所使用的方 法，如无特殊规定，均为本领域的常规方法。
[0152] 一种Thp-1细胞上的膜蛋白Annexin A2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应 用。
[0153] 进一步地，所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1通过细胞膜蛋白Annexin A2诱导 Thp-1细胞凋亡的应用。
[0154] 进一步地，所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1在诱导细胞凋亡以及广州管圆线虫 致病机制中的应用。
[0155] 进一步地，所述应用为Thp-1细胞上的膜蛋白Annexin A2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1 诱导的细胞凋亡中作为治疗广州管圆线虫的药物靶点中的应用。
[0156] 进一步地，所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白 Annexin A2诱导细胞凋亡的作用。
[0157] 进一步地，所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白 Annexin A2诱导细胞凋亡的作用的验证方法，步骤如下：
[0158] ⑴广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——CCK-8实验
[0159] CCK-8实验分别检测不同作用时间：6h，12h，18h，24h，不同浓度0-100μMAc-Galectinl-1 蛋白对Thp-1细胞的抑制情况，所述Ac-Galectinl-1蛋白为广州管圆线虫蛋白Galectin-1；具 体操作步骤如下：
[0160] ①Thp-1细胞毒性实验：每孔加入100微升5000±10个细胞。按照实验需要，进行培养 并给予0，0.05，0.2，0.8，3.2，12.5，25，50，100μg/mLAc-Galectin-1刺激，作用6h、12h、 18h、24h；
[0161] ②每孔加入10微升CCK-8溶液，同时设置加入相应量细胞培养液、Ac-Galectin-1和 CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；
[0162] ③在细胞培养箱内继续孵育2h；
[0163] ④在450nm处测定吸光度；
[0164] ⑵广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——AnnexinⅤ-FITC流式方法检测细胞 凋亡
[0165] 为了验证广州管圆线虫Galectin-1诱导THP-1细胞凋亡，采用Annexin V-FITC/PI双染色结 合流式细胞术检测THP-1细胞凋亡；
[0166] 根据CCK-8结果，选择500ng/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mLAc-Galectin-1蛋白作用浓 度，进行流式检测；同等浓度的牛血清白蛋白处理Thp-1细胞作为无关蛋白对照，地塞米松处 理Thp-1细胞作为细胞凋亡的阳性对照；与BSA对照组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞凋亡率 显著增高；具体操作步骤如下：
[0167] ①将0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mLAc-Galectin-1加入到Thp-1细胞，作用18h 后，37℃预温的PBS洗涤细胞一次，将Thp-1细胞用胰酶消化下来；
[0168] ②细胞消化下来后，加入细胞培养液转移到15mL离心管内，2000g离心5min，弃上清， 收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；
[0169] ③取1～5×105重悬的细胞，2000g离心5min，弃上清，加入500μL结合液，轻轻重悬细 胞；
[0170] ④加入5μL结合液，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶PI，轻轻混匀；
[0171] ⑤室温20～25℃避光孵育10min；
[0172] ⑥随即进行流式细胞仪检测，结合液为绿色荧光，PI为红色荧光；
[0173] ⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——Western Blot检测凋亡蛋白的表达
[0174] 为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1凋亡，Western Blot检测促凋亡蛋白caspase-3、 Bax、caspase-9蛋白及抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量；分为正常细胞组、Ac-Galectin-1处理 组、同等浓度的牛血清白蛋白处理组作为无关蛋白对照；
[0175] 与正常细胞组和同等浓度的牛血清白蛋白处理组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞促凋亡 蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白表达量显著增高，抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量显著降 低；
[0176] 具体步骤如下：
[0177] ①样品制备
[0178] 100μg/mLAc-Galectin-1作用于Thp-1细胞，弃去培养液，加入PBS后用刮铲刮下贴壁细 胞细胞，2000rpm离心5min，收集细胞，PBS洗涤一次；每107个细胞加50μL细胞裂解液， 冰上裂解l0min后，13000rpm/min离心l0min，收集上清，取40μL，加入10μL的5×蛋白 上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；
[0179] ②SDS—PAGE电泳；
[0180] ③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃 棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；
[0181] ④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST 洗涤3次，每次10mim；
[0182] ⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育 2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；
[0183] ⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体 积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST洗涤5次，每次10min；
[0184] ⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果；
[0185] ⑷广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——caspase-3活性检测
[0186] Caspase-3是细胞凋亡的执行分子，其发生活化引起细胞凋亡；为了进一步验证 Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡，检测caspase-3的酶活性；
[0187] Ac-Galectin-1引起caspase-3酶活性增高，则引起Thp-1细胞发生凋亡；
[0188] 操作步骤如下：
[0189] ①测定pNA标准曲线：
[0190] 标准品稀释液的配制：按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制标准品稀 释液；
[0191] 将pNA 10mM用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100、200μM，每个浓度取100μL 用酶标仪进行检测，测定A405；每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计 算出实际的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线；
[0192] ②样品的收集
[0193] 吸取细胞培养液，用胰酶消化贴壁细胞，收集细胞加入到新的细胞培养液中，600×g 4℃ 离心5min收集细胞，小心吸去上清，PBS洗涤一次，再次吸尽上清后，按照每200万细胞加 入100μL裂解液的比例加入细胞裂解液，重悬细胞沉淀，放置冰上裂解15min；
[0194] ③样品测定
[0195] 如下设置反应体系：
[0196] 空白对照:检测缓冲液40μL、待测样品0μL、裂解液50μL、Ac-DEVD-pNA(2mM)10μL[0197] 样品：检测缓冲液40μL、待测样品50μL、裂解液0μL、Ac-DEVD-pNA(2mM)10μL[0198] 取出Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上备用；在比色杯中加入Ac-DEVD-pNA(2mM) 后混匀，在混匀时注意避免产生气泡，37℃孵育1-2h，样品的A405减去空白对照的A405， 即为样品中caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度；
[0199] ⑸Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——提取Thp-1细胞膜蛋白
[0200] ①通过4℃、700×g离心5min，收集细胞1±0.1g湿重，细胞个数为0.2-10×108，对于贴 壁细胞，刮下PBS中的细胞，然后700×g离心5min，沉淀细胞；
[0201] ②用3mL冰冷的PBS清洗细胞一次；
[0202] ③将细胞重新悬浮在2mLHomogenization Buffer中，在冰上用匀浆细胞30-50次；
[0203] ④将匀浆转移到1.5mL微量离心管中，在4℃条件下，700×g离心10min，收集上清液并 弃去沉淀；
[0204] ⑤将上清液转移至新的离心管中，并在4℃以10000×g离心30min；
[0205] ⑥弃上清，收集白色沉淀，白色沉淀是总细胞膜蛋白质，其含有来自质膜和细胞器的蛋 白质膜；
[0206] ⑦纯化细胞膜蛋白质，获得质膜蛋白；
[0207] ⑹Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——IP实验
[0208] 为了探究与Ac-Galectin-1相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白，采用IP方法沉淀互 作蛋白；操作步骤如下：
[0209] ①贴壁细胞裂解液的制备
[0210] 弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，保持于冰上，再次加入PBS并用细胞刮铲刮 取细胞，收集细胞并转移至15mL离心管中；向收集好的细胞中加入1mL细胞裂解Buffer 于冰上孵肓10‐30min，中间晃动使裂解Buffer和细胞充分接触；4℃，12000×g离心10min， 收集上清，并转移至新的离心管-20℃保存，备用；
[0211] ②取细胞裂解液350μL加入350μL 2×IP Buffer；
[0212] ③将样品加入到His标签蛋白磁珠复合物中，室温孵育10min；
[0213] ④孵育完成后将离心管放入磁力架1min，弃去上清；
[0214] ⑤用300μL 1×Binding/Wash Buffer清洗磁珠4次，加入1×Binding/Wash Buffer后混匀 放入磁力架1min后弃去上清，收集磁珠‐His标签-蛋白-未知蛋白复合物；
[0215] ⑥向上述磁珠中，加入100μLHis标签洗脱液室温孵育混悬5min；
[0216] ⑦将离心管放入磁力架，收集上清放入新的离心管，上清中的His标签蛋白和未知蛋白 复合物可用于后续分析；
[0217] ⑧取50μL收集的His标签蛋白和未知蛋白复合物，进行SDS‐PAGE电泳，考马斯亮蓝 R250染色，观察电泳结果；
[0218] ⑨将His标签蛋白和未知蛋白复合物液体以及跑胶凝胶条送去蛋白质谱检测，采用QE 质谱鉴定；
[0219] ⑺Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——免疫荧光
[0220] 荧光共定位初步验证IP及QE质谱结果，即Ac-Galectin-1与Annexin A2可能存在相互 作用：
[0221] ①将圆形细胞爬片加到24孔板；
[0222] ②将1mL含有PMA的THP-1细胞悬液滴加在爬片上，37℃培养48h，使细胞贴在爬片 上，伸出伪足诱导成为贴壁细胞；
[0223] ③吸去上清，用37℃水浴锅预温的PBST洗涤1次，每孔加入1mL；
[0224] ④质量百分数为4％的多聚甲醛37℃固定细胞15min；
[0225] ⑤用预温的PBS静置洗涤3次，用注射器吸去；
[0226] ⑥质量百分数为10％的FBS 37℃封闭30min，吸去FBS；
[0227] ⑦一抗抗体用质量百分数10％FBS稀释，放在37℃培养箱里3h，或4℃过夜；
[0228] ⑧用预温的PBST洗5次；
[0229] ⑨加用质量百分数10％FBS稀释后的HRP山羊抗兔二抗，45min，从该步起均闭光；
[0230] ⑩每孔加400μLDAPI染细胞核4min，预温的PBST洗5次；质量百分数为50％的甘油 封片：在载玻片上加一滴质量百分数为50％甘油，然后把载玻片正面扣在甘油上，激光共聚 焦显微镜镜下观察；
[0231] ⑻Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——IP实验
[0232] 按照步骤⑹的IP实验的操作步骤操作，进行IP实验即可；根据QE质谱鉴定及免疫荧光 实验验证Thp-1细胞膜上的Annexin A2可能是Ac-GaIectin-1结合作用到Thp-1细胞膜上的配 体，用Western Blot验证；
[0233] ⑼Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——Co-IP免疫共沉淀[0234] 为了进一步证明Annexin A2与Ac-Galectin-1相互结合，采用Co-IP免疫共沉淀方法进行 验证：
[0235] ①抗体固定化
[0236] 将偶联树脂平衡至室温，用ddH2O稀释交联缓冲液至1×，轻轻摇晃偶联树脂使其重悬， 使用大枪头吸取50μL均一偶联树脂至离心柱中，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min， 弃流出液；用200μL 1×交联缓冲液洗涤树脂，1000g离心1min并弃流出液，用纸巾吸去离心 柱底部多余的液体，然后插入底塞；
[0237] 向离心柱中加入50μg抗体，用ddH2O和20×交联缓冲液将液体体积调整至200μL；在 通风厨中，吸取3μL 5M氰基硼氢化钠溶液加入到200μL反应体系中；离心柱在室温条件下 旋转孵育2h；离心并加入200μL 1×交联缓冲液洗一次；加入200μL淬灭缓冲液，1000g离 心1min，再在通风橱中加入3μL氰基硼氢化钠溶液，盖上旋盖上下颠倒轻轻混匀，室温孵育
15min；卸下底塞，1000g离心1min并弃流出液，加入200μL 1×交联缓冲液，1000g离心1min 并弃流出液，重复上述操作一次；加入150μL洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重 复六次；
[0238] ②哺乳动物细胞裂解
[0239] 胰酶消化贴壁细胞，2000rpm离心5min收集细胞沉淀，加入1mL杜氏PBS轻悬细胞， 2000rpm离心5min重复2次，获得细胞沉淀；将冰上预冷的IP裂解/洗涤缓冲液加入细胞沉 淀中，随后立即加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，放置冰上孵育裂解10min并充分混匀； ～13000g，4℃离心10min以沉淀细胞碎片，离心后吸取上清转移到新EP管中，进行BCA法 蛋白定量；
[0240] ③对照琼脂糖预处理细胞裂解液
[0241] 加入100μL 1×交联缓冲液，1000g离心1min，弃流出液；轻轻重悬对照琼脂糖树脂使其 均匀，对于1mg细胞裂解液中加入80μL对照琼脂糖树脂到离心柱中；4℃冰箱中旋转孵育 1h，1000g离心1min，保留流出液；
[0242] ④免疫共沉淀
[0243] 加入200μL IP裂解/洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液；重复该操作一次；用纸 巾吸去离心柱底部多余的液体，随后加入对照琼脂糖预处理过的细胞裂解液，4℃冰箱中旋转 孵育过夜；去掉底塞，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min并保留流出液做后续分析； 加入200μL IP裂解/洗涤缓冲液并离心，该步骤重复两次；加入100μL 1×条件缓冲液并离心， 保留流出液，BCA检测蛋白浓度；
[0244] ⑤洗脱
[0245] 将离心柱置于一个新的离心管中，加入10μL洗脱缓冲液，1000g离心1min，加入50μL 洗脱缓冲液，室温条件下静置5min，1000g离心1min，保留洗脱液并记作E1；可再次洗脱， 洗脱液分别记作E2、E3；
[0246] ⑥将免疫共沉淀的洗脱液取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制备样 品；进行Western Blot验证，操作步骤均按照上述步骤⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1 细胞凋亡——Western Blot检测凋亡蛋白的表达方法，采用的一抗二抗也均与步骤⑹的IP实 验时一致；
[0247] ⑽Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——MAPK通路磷酸化蛋白 芯片
[0248] 预实验确定通路磷酸化的时间点，用100μg/mLAc-Galectin-1分别作用于Thp-1细胞0h， 0.5h，1h，2h；收集细胞沉淀，RIPA裂解，加入磷酸酶抑制剂NaVO3，取RIPA裂解液40μL， 加入10μL5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；进行Western Blot验证，孵育一抗 Anti-phosphotyrisine rabbit pAb过夜，4℃，室温孵育抗兔二抗1h后进行曝光，成像仪成像， 观察结果；
[0249] 筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白；
[0250] ①将2.0mL洗膜缓冲液TBST加入要使用的4孔多碟的每个孔中，将膜片单张放置在4 孔多碟的一个孔中，摇动平台摇床上孵育1h；
[0251] ②当膜被封闭好后，准备样品，即未处理组Thp-1细胞裂解液和Ac-Galectin-1处理组细 胞裂解液，每个样品取400μL加入样品分离管，使用缓冲液调节至1.5mL的最终体积；
[0252] ③向每个制备的样品中加入20μL检测抗体混合物，在室温下孵育混合1h；
[0253] ④从4孔多碟的孔中吸去TBST缓冲液并添加制备的样品/抗体混合物，盖上4孔多碟， 在摇床摇床上2-8℃孵育过夜；
[0254] ⑤在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；
[0255] ⑥吸取2mL 1×链霉亲和素-HRP到4孔多碟的每个孔中，在室温下摇动平台摇床上孵育 30min，在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；
[0256] ⑦小心地从洗涤容器中取出每个膜，每个薄膜上带有标识数字的面朝上放置，将1mL制 备的Chemi试剂均匀地吸移到每个膜上；
[0257] ⑧成像仪曝光膜1-10min；
[0258] ⑾Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——Western Blot检测凋亡信 号通路相关蛋白的表达
[0259] ①样品制备
[0260] 在对Thp-1细胞处理之前，先去掉含有胎牛血清的培养液，用不含胎牛血清的1640培养 液使细胞饥饿12h后，特异性c-JUN抑制剂作用于细胞20min，即可达到抑制JNK磷酸化 的效果，再加入100μg/mlAc-Galectin-1细胞作用1h，同时10ng/ml EGFR刺激Thp-1细胞， 激活通路，作为阳性对照；弃去培养液，用刮铲刮下细胞，1500rpm离心l0min，收集细胞， PBS洗涤一次；每加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，2000rpm/min离心l0min，收集 上清，取40μL，加入l0μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；
[0261] 分组：空白对照组、10μM SP600125处理组、10μM SP600125+100μMAc-Galectin-1处理 组、100μMAc-Galectin-1处理组、10μM EGFR处理组；
[0262] ②SDS—PAGE电泳；
[0263] ③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃 棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；
[0264] ④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST 洗涤3次，每次10mim；
[0265] ⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育 2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；
[0266] ⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体 积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST涤5次，每次10min；
[0267] ⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果。
[0268] 进一步地，所述步骤⑴CCK-8结果显示，在0-2μg/mL作用浓度下细胞活性抑制率成指 数增长，趋势尤为显著，因此步骤⑵中采用广州管圆线虫Galectin-1的诱导浓度为500ng/mL、 1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL。
[0269] 进一步地，所述步骤⑴中采用碧云天试剂公司的CCK-8检测试剂盒；
[0270] 或者，所述步骤⑵中采用南京建成试剂公司的AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测 细胞凋亡；或者，所述步骤⑵中采用Gibco胰酶，用于消化细胞；
[0271] 所述步骤⑵中细胞培养液为1640细胞培养液，所述结合液为AnnexinV-FITC结合液；
[0272] 进一步地，所述步⑶⑾中采用CST单克隆一抗及二抗检测GAPDH、caspase-3、caspase-9、 Bax、Bcl-2、JNK、ERK、Akt、EGFR、Annexin A2蛋白表达及磷酸化水平；
[0273] 或者，所述步骤⑷中采用碧云天碧云天试剂公司的caspase-3活性检测试剂盒；
[0274] 或者，所述步骤⑸采用Biovision细胞膜蛋白提取试剂盒。
[0275] 或者，所述步骤⑹⑻中采用Sino Biological Inc His-IP试剂盒。
[0276] 进一步地，所述步骤⑼中采用Pierce免疫共沉淀Co-IP试剂盒；或者，所述步骤⑼①中 偶联树脂为加强型Amino-Link偶联树脂；
[0277] 或者，所述步骤⑽中筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白采用人MAPK通路磷酸化蛋 白芯片试剂盒；或者，所述步骤⑽①中TBST配方为：8g NaCl、20mL 1MTris-HCl PH＝8.0， 加入去离子水定容至1L再加入500μL吐温；
[0278] 或者，所述步骤⑾①中特异性c-JUN抑制剂采用Selleck特异性JNK磷酸化抑制剂SP600125。
[0279] 更具体地，所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白 Annexin A2诱导细胞凋亡的作用的验证方法，步骤如下：
[0280] ⑴广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——CCK-8实验
[0281] CCK-8实验分别检测不同作用时间：6h，12h，18h，24h，不同浓度0-100μMAc-Galectinl-1 蛋白对Thp-1细胞的抑制情况，所述Ac-Galectinl-1蛋白为广州管圆线虫蛋白Galectin-1；具 体操作步骤如下：
[0282] ①Thp-1细胞毒性实验：每孔加入100微升5000±10个细胞。按照实验需要，进行培养 并给予0，0.05，0.2，0.8，3.2，12.5，25，50，100μg/mLAc-Galectin-1刺激，作用6h、12h、 18h、24h；
[0283] ②每孔加入10微升CCK-8溶液，同时设置加入相应量细胞培养液、Ac-Galectin-1和 CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；
[0284] ③在细胞培养箱内继续孵育2h；
[0285] ④在450nm处测定吸光度；
[0286] ⑵广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——AnnexinⅤ-FITC流式方法检测细胞 凋亡
[0287] 为了验证广州管圆线虫Galectin-1诱导THP-1细胞凋亡，采用Annexin V-FITC/PI双染色结 合流式细胞术检测THP-1细胞凋亡；
[0288] 根据CCK-8结果，选择500ng/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mLAc-Galectin-1蛋白作用浓 度，进行流式检测；同等浓度的牛血清白蛋白(BSA)处理Thp-1细胞作为无关蛋白对照，地 塞米松处理Thp-1细胞作为细胞凋亡的阳性对照；与BSA对照组相比，Ac-Galectin-1处理组细 胞凋亡率显著增高；具体操作步骤如下：
[0289] ①将0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mLAc-Galectin-1加入到Thp-1细胞，作用18h 后，37℃预温的PBS洗涤细胞一次，将Thp-1细胞用胰酶消化下来；
[0290] ②细胞消化下来后，加入1640细胞培养液转移到15mL离心管内，2000g离心5min，弃 上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；
[0291] ③取1～5×105重悬的细胞，2000g离心5min，弃上清，加入500μLAnnexinV-FITC结合 液，轻轻重悬细胞；
[0292] ④加入5μLAnnexinV-FITC结合液，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶PI，轻轻混匀；
[0293] ⑤室温20～25℃避光孵育10min。可以使用
铝箔进行避光；
[0294] ⑥随即进行流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC结合液为绿色荧光，PI为红色荧光；
[0295] ⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——Western Blot检测凋亡蛋白的表达
[0296] 为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1凋亡，Western Blot检测促凋亡蛋白caspase-3、 Bax、caspase-9蛋白及抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量；分为正常细胞组、Ac-Galectin-1处理 组、同等浓度的牛血清白蛋白(BSA)处理组作为无关蛋白对照；
[0297] 与正常细胞组和同等浓度的牛血清白蛋白(BSA)处理组相比，Ac-Galectin-1处理组细 胞促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白表达量显著增高，抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达 量显著降低；
[0298] 具体步骤如下：
[0299] ①样品制备
[0300] 100μg/mLAc-Galectin-1作用于Thp-1细胞，弃去培养液，加入PBS后用刮铲刮下贴壁细 胞细胞，2000rpm离心5min，收集细胞，PBS洗涤一次；每107个细胞加50μL细胞裂解液， 冰上裂解l0min后，13000rpm/min离心l0min，收集上清，取40μL，加入10μL的5×蛋白 上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；
[0301] ②SDS—PAGE电泳；
[0302] ③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃 棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；
[0303] ④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST 洗涤3次，每次10mim；
[0304] ⑤孵育一抗：将CST公司的一抗抗体：GAPDH(内参)、caspase-3、caspase-9、Bcl-2、 Bax，均用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育2h；然后用TBST洗 涤3次，每次10min；
[0305] ⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体 积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST洗涤5次，每次10min；
[0306] ⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果；
[0307] ⑷广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——caspase-3活性检测
[0308] Caspase-3是细胞凋亡的执行分子，其发生活化引起细胞凋亡；为了进一步验证 Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡，检测caspase-3的酶活性；
[0309] Ac-Galectin-1引起caspase-3酶活性增高，则引起Thp-1细胞发生凋亡；
[0310] 操作步骤如下：
[0311] ①测定pNA标准曲线：
[0312] 标准品稀释液的配制：按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制标准品稀 释液；
[0313] 将pNA 10mM用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100、200μM，每个浓度取100μL 用酶标仪进行检测，测定A405；每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计 算出实际的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线；
[0314] ②样品的收集
[0315] 吸取细胞培养液，用胰酶消化贴壁细胞，收集细胞加入到新的细胞培养液中，600×g 4℃ 离心5min收集细胞，小心吸去上清，PBS洗涤一次，再次吸尽上清后，按照每200万细胞加 入100μL裂解液的比例加入细胞裂解液，重悬细胞沉淀，放置冰上裂解15min；
[0316] ③样品测定
[0317] 如下设置反应体系：
[0318] 空白对照:检测缓冲液40μL、待测样品0μL、裂解液50μL、Ac-DEVD-pNA(2mM)10μL[0319] 样品：检测缓冲液40μL、待测样品50μL、裂解液0μL、Ac-DEVD-pNA(2mM)10μL[0320] 取出Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上备用；在比色杯中加入Ac-DEVD-pNA(2mM) 后混匀，在混匀时注意避免产生气泡，37℃孵育1-2h，样品的A405减去空白对照的A405， 即为样品中caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度；
[0321] ⑸Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——提取Thp-1细胞膜蛋白
[0322] ①通过4℃、700×g离心5min，收集细胞1±0.1g湿重，细胞个数为0.2-10×108，对于贴 壁细胞，刮下PBS中的细胞，然后700×g离心5min，沉淀细胞；
[0323] ②用3mL冰冷的PBS清洗细胞一次；
[0324] ③将细胞重新悬浮在2mLHomogenization Buffer(NP40)中，在冰上用匀浆器(Dounce) 匀浆细胞30-50次；
[0325] ④将匀浆转移到1.5mL微量离心管中，在4℃条件下，700×g离心10min，收集上清液并 弃去沉淀；
[0326] ⑤将上清液转移至新的离心管中，并在4℃以10000×g离心30min；
[0327] ⑥弃上清，收集白色沉淀，白色沉淀是总细胞膜蛋白质，其含有来自质膜和细胞器的蛋 白质膜；
[0328] ⑦纯化细胞膜蛋白质，获得质膜蛋白；
[0329] ⑹Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——IP实验
[0330] 为了探究与Ac-Galectin-1相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白，采用IP方法沉淀互 作蛋白；操作步骤如下：
[0331] ①贴壁细胞裂解液的制备
[0332] 弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，保持于冰上，再次加入PBS并用细胞刮铲刮 取细胞，收集细胞并转移至15mL离心管中；向收集好的细胞中加入1mLNP40细胞裂解Buffer 于冰上孵肓10‐30min，中间晃动使裂解Buffer和细胞充分接触；4℃，12000×g离心10min， 收集上清，并转移至新的离心管-20℃保存，备用；
[0333] ②取细胞裂解液350μL加入350μL 2×IP Buffer；
[0334] ③将样品加入到His标签蛋白磁珠复合物中，室温孵育10min；
[0335] ④孵育完成后将离心管放入磁力架1min，弃去上清；
[0336] ⑤用300μL 1×Binding/Wash Buffer清洗磁珠4次，加入1×Binding/Wash Buffer后混匀 放入磁力架1min后弃去上清，收集磁珠‐His标签-蛋白-未知蛋白复合物；
[0337] ⑥向上述磁珠中，加入100μLHis标签洗脱液室温孵育混悬5min；
[0338] ⑦将离心管放入磁力架，收集上清放入新的离心管，上清中的His标签蛋白和未知蛋白 复合物可用于后续分析；
[0339] ⑧取50μL收集的His标签蛋白和未知蛋白复合物，进行SDS‐PAGE电泳，考马斯亮蓝 R250染色，观察电泳结果；
[0340] ⑨将His标签蛋白和未知蛋白复合物液体以及跑胶凝胶条送去蛋白质谱检测，采用QE 质谱鉴定；
[0341] ⑺Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——免疫荧光
[0342] 荧光共定位初步验证IP及QE质谱结果，即Ac-Galectin-1与Annexin A2可能存在相互 作用：
[0343] ①将圆形细胞爬片加到24孔板；
[0344] ②将1mL含有PMA的THP-1细胞悬液滴加在爬片上，37℃培养48h，使细胞贴在爬片 上，伸出伪足诱导成为贴壁细胞；
[0345] ③吸去上清，用37℃水浴锅预温的PBST洗涤1次，每孔加入1mL；
[0346] ④质量百分数为4％的多聚甲醛37℃固定细胞15min；
[0347] ⑤用预温的PBST(1mL)静置洗涤3次，用注射器吸去；
[0348] ⑥质量百分数为10％的FBS 37℃封闭30min(400μL)，吸去FBS；
[0349] ⑦一抗抗体用质量百分数10％FBS稀释，放在37℃培养箱里3h，或4℃过夜；
[0350] ⑧用预温的PBST洗5次；
[0351] ⑨加用质量百分数10％FBS稀释后的HRP山羊抗兔二抗，45min，从该步起均闭光；
[0352] ⑩每孔加400μLDAPI染细胞核4min，预温的PBST洗5次；质量百分数为50％的甘油 封片：在载玻片上加一滴质量百分数为50％甘油，然后把载玻片正面扣在甘油上，激光共聚 焦显微镜镜下观察；
[0353] ⑻Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——IP实验
[0354] 按照步骤⑹的IP实验的操作步骤操作，进行IP实验即可；根据QE质谱鉴定及免疫荧光 实验验证Thp-1细胞膜上的Annexin A2可能是Ac-GaIectin-1结合作用到Thp-1细胞膜上的配 体，用Western Blot验证；
[0355] ⑼Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上Annexin A2相互作用——Co-IP免疫共沉淀[0356] 为了进一步证明Annexin A2与Ac-Galectin-1相互结合，采用Co-IP免疫共沉淀方法进行 验证：
[0357] ①抗体固定化
[0358] 将加强型Amino-Link偶联树脂平衡至室温，用ddH2O稀释交联缓冲液至1×，轻轻摇晃 加强型Amino-Link偶联树脂(保存于液体中)使其重悬，使用大枪头吸取50μL均一加强型 Amino-Link偶联树脂至Pierce离心柱中，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min，弃流出 液；用200μL 1×交联缓冲液洗涤树脂，1000g离心1min并弃流出液，用纸巾吸去离心柱底部 多余的液体，然后插入底塞；
[0359] 向离心柱中加入50μg抗体，用ddH2O和20×交联缓冲液将液体体积调整至200μL；在 通风厨中，吸取3μL 5M氰基硼氢化钠溶液加入到200μL反应体系中；离心柱在室温条件下 旋转孵育2h；离心并加入200μL 1×交联缓冲液洗一次；加入200μL淬灭缓冲液，1000g离 心1min，再在通风橱中加入3μL氰基硼氢化钠溶液，盖上旋盖上下颠倒轻轻混匀，室温孵育
15min；卸下底塞，1000g离心1min并弃流出液，加入200μL 1×交联缓冲液，1000g离心1min 并弃流出液，重复上述操作一次；加入150μL洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重 复六次；
[0360] ②哺乳动物细胞裂解
[0361] 胰酶消化贴壁细胞，2000rpm离心5min收集细胞沉淀，加入1mL杜氏PBS轻悬细胞， 2000rpm离心5min重复2次，获得细胞沉淀；将冰上预冷的IP裂解/洗涤缓冲液加入细胞沉 淀中，随后立即加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，放置冰上孵育裂解10min并充分混匀； ～13000g，4℃离心10min以沉淀细胞碎片，离心后吸取上清转移到新EP管中，进行BCA法 蛋白定量；
[0362] ③对照琼脂糖预处理细胞裂解液
[0363] 加入100μL 1×交联缓冲液，1000g离心1min，弃流出液；轻轻重悬对照琼脂糖树脂使其 均匀，对于1mg细胞裂解液中加入80μL对照琼脂糖树脂到离心柱中；4℃冰箱中旋转孵育 1h，1000g离心1min，保留流出液；
[0364] ④免疫共沉淀
[0365] 加入200μL IP裂解/洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液；重复该操作一次；用纸 巾吸去离心柱底部多余的液体，随后加入对照琼脂糖预处理过的细胞裂解液，4℃冰箱中旋转 孵育过夜；去掉底塞，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min并保留流出液做后续分析； 加入200μL IP裂解/洗涤缓冲液并离心，该步骤重复两次；加入100μL 1×条件缓冲液并离心， 保留流出液，BCA检测蛋白浓度；
[0366] ⑤洗脱
[0367] 将离心柱置于一个新的离心管中，加入10μL洗脱缓冲液，1000g离心1min，加入50μL 洗脱缓冲液，室温条件下静置5min，1000g离心1min，保留洗脱液并记作E1；可再次洗脱， 洗脱液分别记作E2、E3；
[0368] ⑥将免疫共沉淀的洗脱液取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制备样 品；进行Western Blot验证，操作步骤均按照上述步骤⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1 细胞凋亡——Western Blot检测凋亡蛋白的表达方法，采用的一抗二抗也均与步骤⑹的IP实 验时一致；
[0369] ⑽Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——MAPK通路磷酸化蛋白 芯片
[0370] 预实验确定通路磷酸化的时间点，用100μg/mLAc-Galectin-1分别作用于Thp-1细胞0h， 0.5h，1h，2h；收集细胞沉淀，RIPA裂解，加入磷酸酶抑制剂NaVO3，取RIPA裂解液40μL， 加入10μL5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；进行Western Blot验证，孵育一抗 Anti-phosphotyrisine rabbit pAb过夜，4℃，室温孵育抗兔二抗1h后进行曝光，成像仪成像， 观察结果；
[0371] 筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白；
[0372] ①将2.0mL洗膜缓冲液TBST加入要使用的4孔多碟的每个孔中，将膜片单张放置在4 孔多碟的一个孔中，摇动平台摇床上孵育1h；
[0373] ②当膜被封闭好后，准备样品，即未处理组Thp-1细胞裂解液和Ac-Galectin-1处理组细 胞裂解液，每个样品取400μL加入样品分离管，使用缓冲液调节至1.5mL的最终体积；
[0374] ③向每个制备的样品中加入20μL检测抗体混合物，在室温下孵育混合1h；
[0375] ④从4孔多碟的孔中吸去TBST缓冲液并添加制备的样品/抗体混合物，盖上4孔多碟， 在摇床摇床上2-8℃孵育过夜；注意：如果不需要最佳灵敏度，则可以使用较短的孵育时间；
[0376] ⑤在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；
[0377] ⑥吸取2mL 1×链霉亲和素-HRP到4孔多碟的每个孔中，在室温下摇动平台摇床上孵育 30min，在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；
[0378] ⑦小心地从洗涤容器中取出每个膜，每个薄膜上带有标识数字的面朝上放置，将1mL制 备的Chemi试剂均匀地吸移到每个膜上；
[0379] ⑧成像仪曝光膜1-10min；
[0380] ⑾Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——Western Blot检测凋亡信 号通路相关蛋白的表达
[0381] ①样品制备
[0382] 在对Thp-1细胞处理之前，先去掉含有胎牛血清的培养液，用不含胎牛血清的1640培养 液使细胞饥饿12h后，特异性c-JUN抑制剂作用于细胞20min，即可达到抑制JNK磷酸化 的效果，再加入100μg/mlAc-Galectin-1细胞作用1h，同时10ng/ml EGFR刺激Thp-1细胞， 激活通路，作为阳性对照；弃去培养液，用刮铲刮下细胞，1500rpm离心l0min，收集细胞， PBS洗涤一次；每加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，2000rpm/min离心l0min，收集 上清，取40μL，加入l0μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；
[0383] 分组：空白对照组、10μM SP600125处理组、10μM SP600125+100μMAc-Galectin-1处理 组、100μMAc-Galectin-1处理组、10μM EGFR处理组；
[0384] ②SDS—PAGE电泳；
[0385] ③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃 棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；
[0386] ④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST 洗涤3次，每次10mim；
[0387] ⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育 2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；
[0388] ⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体 积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST涤5次，每次10min；
[0389] ⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果。
[0390] 本发明中广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有免疫抑制作用的验证方法的原理如下：
[0391] 通过CCK-8、流式细胞术方法检测广州管圆线虫Galectin-1蛋白对Thp-1细胞的作用， 评估细胞凋亡情况。
[0392] 凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2检测，评估细胞凋亡情况。
[0393] 免疫共沉淀、免疫荧光以及质谱筛选与验证与Galectin-1蛋白相互结合的THP-1细胞膜 表面受体蛋白，研究细胞凋亡的具体机制。
[0394] MAPK磷酸化抗体芯片及Western Blot进一步验证Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡的信号 通路及相关蛋白。
[0395] 本发明方法的相关检测结果及讨论：
[0396] CCK-8及流式细胞术检测结果显示，Galectin-1蛋白能够诱导Thp-1细胞发生凋亡， Galectin-1蛋白浓度增高，Thp-1细胞凋亡率也随之增高；
[0397] Western Blot结果显示，Galectin-1蛋白抑制Bcl-2蛋白表达，促进Bax、caspase-9和 caspase-3蛋白表达，促进caspase-3活化；
[0398] 免疫共沉淀、免疫荧光及质谱检测结果表明，与Galectin-1蛋白相互结合的THP-1细胞 膜表面受体蛋白——Annexin A2；
[0399] 磷酸化抗体芯片及Western Blot验证广州管圆线虫Galectin-1引起Thp-1细胞凋亡的主要 信号通路相关蛋白，促进jnk蛋白磷酸化。
[0400] 本发明从不同方面研究了广州管圆线虫Galectin-1蛋白具有诱导Thp-1细胞凋亡的作用， 初步证实Annexin A2蛋白是由Galectin-1引起的细胞凋亡、并与Galectin-1蛋白相互结合的 THP-1细胞膜表面受体蛋白，且主要是通过EGFR/MERK途径诱导细胞发生凋亡。
[0401] 讨论：
[0402] 本发明在不同方面说明广州管圆线虫Galectin-1蛋白具有诱导Thp-1细胞凋亡的作用， 并且发现一种Thp-1细胞上的膜蛋白Annexin A2在广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用。广州管圆线虫病是一种急性感染性
疾病， 广州管圆线虫Galectin-1蛋白能够通过细胞膜蛋白Annexin A2诱导细胞凋亡，在一定程度上 能够损伤宿主免疫细胞，膜蛋白Annexin A2可以作为治疗广州管圆线虫病的潜在药物作用靶 点。
