技术领域
[0001] 本
发明涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种用于药物配伍筛选的集成化微流控芯片、制备方法及应用。
背景技术
[0002] 面临着21世纪科技发展中提出的众多挑战，分析仪器和分析科学也正经历着带有革命性的重要转折时期，其中一个日益明显的发展趋势就是化学分析设备的微型化、集成化与便携化。于是，为了适应时代发展的需要，微全分析系统（Micro Total Analytical System，µTAS）的概念诞生了，这种以芯片为操作平台，以分析化学为理论
基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征的多学科交叉技术-微流控芯片（Microfluidics）又称
芯片实验室（Lab-on-a-Chip，LOC）技术得到了迅猛的发展，它通过化学分析设备的微型化与集成化，可以把
生物和化学实验室的一系列功能，如样品制备、反应、混合、分离、分析和检测以及细胞和
微生物的培养、观测、分选等基本操作单元集成或基本集成在一
块几平方厘米的芯片上，目前，它已成为目前分析仪器发展的重要方向与前沿，并在各研究领域逐步发挥着越来越重要的作用。
[0003] 很长时间以来，成本过高、周期过长、成功率低下一直制约着现代药物的筛选和开发，如何迅速地从海量化合物库中筛选出先导化合物，快速地进行临床前毒理筛查，高效地检测临床
疾病标记物，从而缩短新药研发周期，降低开发成本，已成为国际制药界一个令人关注的课题。高通量高内涵药物筛选、体外毒理实验等技术因此应运而生并不断发展，各种以全自动和高通量为标签的大型仪器设备也不断面市，但实践表明，这些基于传统新药研发技术体系的局部技术改良或优化并未能实质性地降低新药研发的成本和周期。要解决新药研发的关键技术
瓶颈，实质性降低新药研发的周期和成本，需要向传统新药研发体系内引入新概念，从根本上对新药研发流程中的各个主要技术环节进行革新，实现对整个新药研发体系某种程度上的升级，而微流控芯片很可能就是这样一种能够“解决问题”的新兴科学技术。
[0004] 得益于现代化的微加工技术（MEMS）和微通道内精细的
流体控制技术，微流控芯片应用于药物筛选研究的技术也日趋成熟，并正在影响着整个新药研发的
进程。由于具有快速检测分析、
试剂消耗量少、灵活可控、信息量大、高通量等诸多优点，该技术可以克服传统药物筛选的限制，显著缩短整个药物筛选周期。
[0005] 微流控芯片在解决创新药物研发成本过高、周期过长等关键问题，革新传统创新药物研发体系等方面，显示了极大的发展潜
力。目前，微流控芯片技术用于药物研究方面已见诸报道，比如Andreas等制作了一种多参数具有微生理机能测试功能的芯片来检测人T98G脑瘤细胞的新陈代谢产物，该芯片包含有微型化学生物
传感器，并集成有
镀了铂和铱
氧化物
薄膜的微
电极，整套系统能保持长期的
稳定性，不仅可以对细胞进行长期培养，同时还能对细胞代谢产物的多种指标进行定量的检测；Wang等设计了多层次的24×24
橡胶阵列式微流控高通量筛选芯片，培养并用
荧光标记
哺乳动物细胞，然后利用3种不同细胞(BALB/3T3细胞、HeLa细胞、
牛内皮细胞)筛选了洋地黄皂苷、皂
角苷、丙烯
醛等毒性物质，在荧光
显微镜下观察药物与细胞相互作用，测试了毒性物质对细胞的形态和生存能力的影响，实验提供了一种高
密度平行的药物筛选方法。
[0006] 目前，关于大规模集成微
阀、通过操纵微阀进行药物筛选的微流控芯片的研究还并不多见，而这种能充分体现出集成化与灵活性优势的技术正是微流控芯片在细胞高通量药物筛选研究领域的一个十分热
门的发展趋势，但由于其加工制作的复杂性、操作的繁琐性及需要多学科知识的交叉融合，又使得许多研究者对此类集成有微阀的药物筛选芯片望而却步，导致了集成有微阀的药物筛选微流控芯片一直无法大规模应用于细胞
水平药物筛选。基于此现状，亟需开发一种加工难度相对较低、集成化、操作灵活且功能强大的药物配伍筛选微流控芯片，以解决该研究领域的一些关键和难点问题。
发明内容
[0007] 针对上述问题，本发明提供一种集成化多功能的微流控芯片、制备方法及应用，通过
气动微阀实现对细胞和微流体进行操控，并应用于高通量药物配伍关系研究。
[0008] 为实现本发明的上述目的，本发明提供一种用于药物配伍筛选的集成化微流控芯片，从上至下依次包括：微阀控制通道层、流体通道层及玻璃基底层；所述流体通道层与微阀控制通道层通过PDMS热键合构成流体通道单元，所述流体通道单元与玻璃基底层通过等离子键合成一体。
[0009] 所述流体通道单元包括两个功能区，分别为：药物混合生成区与阵列式细胞培养区。
[0010] 所述药物混合生成区包括：混合腔、与混合腔连通的连接通道、与混合腔连通的药液注入通道、及与混合腔连通的第一废液排出通道；所述药液注入通道设有若干组进样孔，分别作为培养液入口、对照药物入口、待测药物入口。
[0011] 所述阵列式细胞培养区包括：细胞注入主通道、若干并列排布的细胞培养单元、及第二废液排出通道；所述每一细胞培养单元通过支路微通道与细胞注入主通道相互并联连通，所述细胞培养单元由若干个细胞培养腔通过支路微通道相互
串联组成一列，所述支路微通道的末端为弯曲流道，所述每一弯曲流道均与第二废液排出通道相互连通；所述细胞注入主通道的末端设有细胞入口与废液排出口。
[0012] 所述药物混合生成区的药液注入通道与阵列式细胞培养区的细胞注入主通道相互连通。
[0013] 所述流体通道单元包括三组控制微阀，分别为：第一微阀组、第二微阀组、及第三微阀组；所述第一微阀组、第二微阀组、及第三微阀组均为气动控制微阀组；所述三组控制微阀的结构均是由微阀控制通道层的PDMS与流体通道层的PDMS薄膜构成密闭的空腔，并分别与压力施加装置相连。
[0014] 所述第一微阀组包括七个控制微阀，均为气动微阀；所述第二微阀组包括八个控制微阀，为五个气动微阀与由三个相邻的气动微阀组成的蠕动微阀组；所述第三微阀组包括九个控制微阀，均为气动微阀。
[0015] 所述药液注入通道的宽为200μm，混合腔由四个3×2.4mm的
倒角矩形组成，连接通道宽为200μm，第一废液排出通道宽为300μm；所述细胞培养腔为椭圆形，尺寸为1×1.2mm，所述弯曲流道为“S”型，宽度为150μm，所述细胞注入主通道、第二废液排出通道的宽均为300μm，所述支路微通道的宽为200μm。
[0016] 所述控制微阀的通道的宽窄不一致，在需要实现
开关作用处宽为400μm，在不需要控制作用处80μm，在其余连接处宽为200μm。
[0017] 所述芯片的压力施加装置为
注射器、微量注射
泵或本实验室自行研制的气动微阀
微泵控制装置。
[0018] 本发明还提供一种用于药物配伍筛选的集成化微流控芯片的制备方法，包括如下步骤。
[0019] 步骤一、单晶
硅片的清洗：将切割的单晶
硅片放入piranha溶液（浓H2SO4:H2O2=3:1，体积比）浸泡过夜，取出，分别用丙
酮、无水
乙醇和去离子水清洗后，放在加热板上150℃烘干20min。
[0020] 步骤二、AZ正胶硅片阳膜制作：取步骤1中清洗干净的硅片，放入匀胶机以3500rpm的速度在硅片上
旋涂牺牲层（SU-8胶:环戊酮=1:1，体积比），95℃加热30min前烘，然后置于
光刻机上曝光2min，冷却后，在牺牲层上以1000rpm的速度旋涂AZ-XT50
光刻胶，静置后置于烘胶台上，程序升温进行前烘，之后将硅片与掩膜
接触，移至
光刻机曝光
6min，再浸入显影液中显影15min，即得到带有流体层通道图案的光刻胶阳膜；最后将光刻胶阳膜放置在加热板上程序升温至190℃并保持4h，即得。
[0021] 步骤三、SU-8硅片阳模制作：取步骤1中清洗干净的硅片，置于匀胶机上以2800rpm的转速匀涂SU-8光刻胶40s，常温静置10min，然后置于烘胶台上加热至95℃，并在95℃下保持30min以进行前烘；缓慢降至室温后，将涂覆有光刻胶的硅片移至光刻机，与掩膜接触后曝光2min，曝光后的硅片95℃加热15min，对其进行
热处理（中烘），冷却至室温后将其浸入配套显影液中显影8min，得到带有阀控层图案结构且厚度约为90μm的光刻胶阳膜，最后将阳膜在115℃环境下加热30min以完成坚膜，即得。
[0022] 步骤四、PDMS流体通道层制作：将PDMS预聚物与
固化剂按重量比15:1均匀混合，搅拌均匀后置于
真空干燥箱中脱气25min，然后浇注到流体层通道AZ阳模板上，以1000rpm旋涂，90℃固化15min，得到贴附于AZ阳模板上的PDMS流体通道层。
[0023] 步骤五、PDMS微阀控制通道层制作：将PDMS预聚物与固化剂按重量比8:1均匀混合，搅拌均匀后置于真空干燥箱中脱气25min，然后浇注到微阀控制通道层SU-8阳模板上，90℃固化15min，冷却后将其从模板上缓慢揭下，并经切割打孔得到PDMS微阀控制通道芯
片层。
[0024] 步骤六、微流控芯片的键合：将从模板上剥离并切割打孔的PDMS微阀控制通道层在显微镜下与贴附于AZ阳模板上的PDMS流体通道层对准贴合在一起，置于90℃加热台上加热1h，完成两层PDMS的键合，并从AZ阳模板上将键合成整体的芯片剥离；之后将双层PDMS与清洗干净的玻璃片一起放入等离子清洗机中进行氧等离子处理，以完成芯片的键合，即得本发明微流控芯片。
[0025] 本发明还提供一种用于药物配伍筛选的集成化微流控芯片的应用，包括如下步骤。
[0026] 步骤1、通过第一微阀组控制药物混合生成区与阵列式细胞培养区之间处于阻隔状态，开启其余所有微阀，使用微流体驱动装置，将细胞悬液通过细胞入口导入阵列式细胞培养区的细胞注入主通道中，待细胞均匀注满各细胞培养腔后，移走微流体驱动装置，使芯片中溶液处于静置状态，并将芯片置于细胞
培养箱中放置培养。
[0027] 步骤2、待细胞贴壁后，使用微流体驱动装置经由细胞注入主通道的实时通入培养液，并将芯片置于细胞培养箱中放置培养。
[0028] 步骤3、将各待测药物从药物注入通道的进样孔导入药物混合生成区，启动第二微阀组，对注入的不同药物进行混合，以生成需要的药物配比。
[0029] 步骤4、通过第一微阀组控制药物混合生成区与阵列式细胞培养区之间处于连通状态，通过控制第三微阀组的组合开关，使得特定支路微通道开启，其余支路微通道闭合，-1将微流体驱动装置连接于各待测药物注入通道，以1μL•min 的流速对药液施加驱动力，使药物进入到特定细胞培养单元中。
[0030] 步骤5、重复步骤3、4，直至每列细胞培养单元均注入不同配伍关系的待测药物。
[0031] 步骤6、通过第一微阀组控制药物混合生成区与阵列式细胞培养区之间处于阻隔状态，从阵列式细胞培养区的细胞入口加入PBS洗涤溶液，使用微流体驱动装置，以-10.2μL•min 的流速对细胞进行洗涤。
[0032] 步骤7、在阵列式细胞培养区的细胞入口加入
染色溶液，使用微流体驱动装置，以-10.2μL•min 的流速对细胞进行染色。
[0033] 步骤8、将芯片置于荧光显微镜下，进行细胞凋亡
坏死检测。
[0035] 本发明提供的用于药物配伍筛选的集成化微流控芯片、制备方法及应用，采用SU-8负性光刻胶工艺、AZ-XT50正性光刻胶工艺、多层PDMS热键合技术及等离子键合技术，制备了集药物自动化混合生成，细胞培养、受激、不同药物配伍结果并行分析、实时观察及结果检测于一体的微流控芯片。另外，本发明提供的微流控芯片还大规模的集成了气动微阀，通过响应快速、操作方便的气动微阀来实现对细胞和微流体的操控。本发明把通常在常规条件下进行的各待测药物混合的步骤集成在芯片中，有效降低试剂的消耗，大大简化了实验步骤，节省了时间，此外一次运行还可获得多个实验参数，充分发挥了微流控芯片集成化、自动化、高通量、多功能、灵活高效的特点，为高通量药物配伍筛选和细胞-药物研究提供了一个全新的技术平台和方法。
附图说明
[0036] 图1为本发明用于药物配伍筛选的集成化微流控芯片的总体结构示意图。
[0037] 图2为本发明用于药物配伍筛选的集成化微流控芯片的结构分解示意图。
[0038] 图3为Hoechst33342和碘化丙啶PI双染后荧光显微镜下的HepG2细胞凋亡形态图。
[0039] 图4为各组分配伍组对肝
肿瘤细胞HepG2的凋亡坏死影响柱状图。
具体实施方式
[0040] 下面结合具体
实施例进一步详细说明本发明。
[0041] 请参阅图1、图2，本实施例提供一种用于药物配伍筛选的集成化微流控芯片，包括：流体通道层1、微阀控制通道层2及玻璃基底层3；所述流体通道层1与微阀控制通道层2通过PDMS热键合构成流体通道单元4，所述流体通道单元4与玻璃基底层3通过等离子键合成一体。
[0042] 所述流体通道单元4包括两个功能区，分别为：药物混合生成区6与阵列式细胞培养区7。
[0043] 所述药物混合生成区6用于待测药物的注入、混合、生成，包括：混合腔8、与混合腔8连通的连接通道9、与混合腔8连通的药液注入通道10、及与混合腔8连通的第一废液排出通道11；所述药液注入通道10设有三组进样孔12，分别作为培养液入口13、对照药物入口14、待测药物入口15。所述药液注入通道10的宽为200μm，混合腔8由四个3×2.4mm的倒角矩形组成，连接通道9宽为200μm，第一废液排出通道11宽为300μm。
[0044] 所述阵列式细胞培养区7用于待测细胞的培养、受激、结果的检测，包括：细胞注入主通道16、若干并列排布的细胞培养单元17、及第二废液排出通道18；所述每一细胞培养单元17通过支路微通道19与细胞注入主通道16相互并联连通，所述细胞培养单元17由若干个细胞培养腔20通过支路微通道19相互串联组成一列，所述支路微通道19的末端为弯曲流道21，所述每一弯曲流道21均与第二废液排出通道18相互连通；所述细胞注入主通道16的末端设有细胞入口22与废液排出口23。所述细胞培养腔20为椭圆形，尺寸为1×1.2mm，所述弯曲流道21为“S”型，宽度为150μm，所述细胞注入主通道16、第二废液排出通道18的宽均为300μm，所述支路微通道19的宽为200μm。
[0045] 所述药物混合生成区6的药液注入通道10与阵列式细胞培养区7的细胞注入主通道16相互连通，进而实现药物混合生成区6与阵列式细胞培养区7的连通。
[0046] 所述流体通道单元4包括三组控制微阀，分别为：第一微阀组24、第二微阀组25、及第三微阀组26；所述三组控制微阀的结构均是由微阀控制通道层2的PDMS与流体通道层1的PDMS薄膜构成密闭的空腔，并分别与压力施加装置相连，当对阀空间施加压力时，PDMS薄膜发生形变，阻挡流体通道层1的液体流动，从而实现相应阀组
对流体通道层1的封闭；当压力移除后，PDMS薄膜恢复原形，从而恢复流体层通道1的液体流通。
[0047] 所述第一微阀组24包括七个控制微阀，均为气动微阀；其中靠左侧的六个气动微阀，通过控制药液注入通道10的启闭来实现不同待测药物的注入，最右侧一个气动微阀对药物混合生成区6及阵列式细胞培养区7之间的连通状态进行控制。
[0048] 所述第二微阀组25包括八个控制微阀，为五个气动微阀与三个蠕动微阀；其中五个气动微阀控制与混合腔8连通的药液注入通道10、及第一废液排出通道11的启闭，三个蠕动微阀控制连接通道9的状态，实现药物的混合、生成功能。所述三个蠕动微阀依靠蠕动阀循环开关在连接通道9上产生的驱动作用，促使流体在混合腔8中周而复始的循环流动，达到充分混合的目的。
[0049] 所述第三微阀组26包括九个控制微阀，均为气动微阀；其中一个气动微阀控制细胞注入主通道16的启闭，当需要注入细胞时，切断药物混合生成区6及阵列式细胞培养区7之间的连通状态，开启位于细胞入口22上的微阀26，压紧位于废液排出口23上的微阀26，自细胞入口22引入细胞。当细胞贴壁，需要排出培养液等液体时，切断药物混合生成区6及阵列式细胞培养区7之间的连通状态，压紧位于细胞入口22上的微阀26，开启位于废液排出口23上的微阀26，自废液排出口23排出废液。七个气动微阀通过各自不同开关状态的配合控制细胞培养阵列中每一支路微通道的启闭，实现细胞培养、受激、结果检测功能。
[0050] 为了解决“微阀贯穿多条流体通道时，阀控通道的形变除了会关闭特定流道外，也会对其余不需要关闭的流道产生影响，阻碍流体通过，从而对实验产生不良影响”这一问题，本实施例微流控芯片所选用的微阀全部为气阀通道宽窄不一致的气动微阀，在需要实现开关作用流道上较宽（400μm），弹性形变的幅度较大，从而保证对下
层流路的充分闭合，在不需要控制作用处较窄（80μm），不产生或产生小幅度的形变，保证不会妨碍下层流体通过，在其余连接处宽为200μm。
[0051] 本实施例还提供一种用于药物配伍筛选的集成化微流控芯片的制备方法，采用SU-8负性光刻胶工艺、AZ-XT50正性光刻胶工艺、多层PDMS热键合技术及等离子键合技术，并采用具有良好透光透气性和
生物相容性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）以及常规玻璃基片作为材料，制作了具有多层结构的集成化微流控芯片，具体步骤如下。
[0052] 步骤一、
单晶硅片的清洗：将切割成合适大小的单晶硅片放入piranha溶液（浓H2SO4:H2O2=3:1体积比）浸泡过夜，取出，分别用丙酮、无水乙醇和去离子水清洗后，放在加热板上150℃烘干20min，使硅片脱水完全。
[0053] 步骤二、AZ正胶硅片阳膜制作：取步骤1中清洗干净的硅片，放入匀胶机以3500rpm的速度在硅片上旋涂牺牲层（SU-8胶:环戊酮=1:1体积比），95℃加热30min前烘，然后置于光刻机上曝光2min，冷却后，在牺牲层上以1000rpm的速度旋涂AZ-XT50光刻胶，静置后置于烘胶台上，程序升温进行前烘，之后将硅片与掩膜接触，移至光刻机曝光6min，再浸入显影液中显影15min，即得到带有流体层通道图案的光刻胶阳膜；最后将光刻胶阳膜放置在加热板上程序升温至190℃并保持4h，对其加热回流从而能使微流体通道的横截面由矩形变为弧形，利于气动微阀的闭合完全。
[0054] 步骤三、SU-8硅片阳模制作：取步骤1中清洗干净的硅片，置于匀胶机上以2800rpm的转速匀涂SU-8光刻胶40s，常温静置10min，然后置于烘胶台上加热至95℃，并在95℃下保持30min以进行前烘；缓慢降至室温后，将涂覆有光刻胶的硅片移至光刻机，与掩膜接触后曝光2min，曝光后的硅片95℃加热15min，对其进行热处理（中烘），冷却至室温后将其浸入配套显影液中显影8min，得到带有阀控层图案结构且厚度约为90μm的光刻胶阳膜，最后将阳膜在115℃环境下加热30min以完成坚膜，即得。
[0055] 步骤四、PDMS流体通道层制作：将PDMS预聚物与固化剂按重量比15:1均匀混合，搅拌均匀后置于真空干燥箱中脱气25min，然后浇注到流体层通道AZ阳模板上，以1000rpm旋涂，90℃固化15min，得到贴附于AZ阳模板上的PDMS流体通道层。
[0056] 步骤五、PDMS微阀控制通道层制作：将PDMS预聚物与固化剂按重量比8:1均匀混合，搅拌均匀后置于真空干燥箱中脱气25min，然后浇注到微阀控制通道层SU-8阳模板上，90℃固化15min，冷却后将其从模板上缓慢揭下，并经切割打孔得到PDMS微阀控制通道层。
[0057] 步骤六、微流控芯片的键合：将从模板上剥离并切割打孔的PDMS微阀控制通道层在显微镜下与贴附于AZ阳模板上的PDMS流体通道层对准贴合在一起，置于90℃加热台上加热1h，利用两层PDMS界面不同比例成分的热扩散和内部反应来完成两层PDMS的键合，并从AZ阳模板上将键合成整体的芯片剥离；之后将双层PDMS与清洗干净的玻璃片一起放入等离子清洗机中进行氧等离子处理，以完成芯片的键合，即得本发明微流控芯片。
[0058] 为进一步验证本发明的有益效果，本发明提供以下应用试验案例。
[0059] 1、基于微流控芯片技术的SWGT各有效组分配伍组对肝癌细胞HepG2凋亡坏死的影响。
[0060] （1）芯片预处理：将芯片先用无菌水润洗，之后通入75%乙醇清洗3遍，每遍5min，-1然后用无菌水冲洗数遍，烘干，紫外照射20min灭菌，之后通入0.1mg•mL 的多聚L-赖
氨酸（PLL），于37℃下孵育1h，以对芯片的细胞培养腔进行包被处理，提高细胞的贴壁率，最后用无菌水将剩余PLL冲掉，烘干备用。
[0061] （2）芯片细胞培养：通过第一微阀组控制药物混合生成区与阵列式细胞培养区之间处于阻隔状态，将对数生长期的人肝癌HepG2细胞用含10%灭活
小牛血清的DMEM培养液5 2
配制成密度为5×10个/cm 的细胞悬液，利用
微量注射器将细胞悬液通过细胞入口注入芯片中，待细胞均匀注满各细胞培养腔后，移走微量注射器，之后将芯片放入细胞培养箱中静-1
置，培养3-3.5h细胞贴壁后，使用精密
注射泵以0.2μL•min 的流速从细胞入口经由细胞注入主通道实时通入培养液，进行灌流培养。
[0062] （3）待测药物配制：根据均匀设计方案，以四味肝泰复方中水红花子、花蕊石、薏苡仁、白茅根4种药材的抗肝癌有效组分为考察因素，参照2010年版《中国药典》中规定的用量范围并结合临床实际，同时为了排除量效关系对药效的干扰，将各组生药量调节至相同，最终得到9个药物配伍组，按照调整后的配伍药量表，分别准备各待测组分溶液，并选择浓-1度为2.5μg•mL 的
顺铂为阳性药物组，并设立空白对照组。
[0063] （4）药物作用：将各有效组分溶液按照配伍顺序进行编号分组，得9个配伍组，每个配伍组包括4种不同浓度的有效组分溶液，加上阳性药物组和空白对照组，即共有11个实验组。首先将第一配伍组的各有效组分溶液从药物混合生成区的4个待测药物入口注入芯片，同时通过控制第一微阀组与第二微阀组，使药物注入到混合腔中，之后启动第二微阀组中的混合蠕动微阀，将3个蠕动微阀的蠕动
频率设定为10Hz，通过蠕动微阀的驱动，使4个有效组分溶液在混合腔内循环流动，进行药物混合。待混合均匀后，开启细胞培养单元，通过第一微阀组控制药物混合生成区与阵列式细胞培养区之间处于连通状态，同时控制第三微阀区的组合开关，使得阵列式细胞培养区的第一列支路微通道开启，其余列支路微通道关闭，使药物注入到第一列细胞培养单元中，对细胞进行刺激。其余8个配伍组也依此法注入芯片，完成混合后通过微阀的控制分别注入相应列的细胞培养单元中，实现对特定细胞培养腔中细胞的刺激，空白培养液及阳性药物无需混合，直接注入到所对应的细胞培养单元中，使不同列的细胞培养单元中注入不同的待测溶液。每过6h将各实验组重复注入一遍，以实现溶液的更新。
[0064] （5）结果检测：药物刺激24h后，控制第一微阀组使药物混合生成区与阵列式细胞培养区之间处于阻隔状态，吸取一定量的PBS缓慢匀速的注入到芯片细胞培养腔，对细胞清洗3遍后，向芯片中通入凋亡坏死
试剂盒中现配的Hoechst 33342和PI染液（V/V=1:1）对细胞进行双染，4℃避光孵育12min，然后用PBS清洗剩余的染料，最后使用OLympus荧光显微镜CellSens成像
软件对芯片进行拍照，并结合IPP软件计算出待测药物对HepG2细胞的凋亡坏死率。
[0065] 2、结果。经Hoechst33342和碘化丙啶（PI）双染法得到的各配伍组对HepG2细胞凋亡坏死影响的荧光图如图3所示，可以看到，各配伍组对应的荧光图中均呈现出了亮斑点，表明各配伍组均有凋亡和坏死的细胞产生，但各图中的凋亡坏死细胞数具有明显差异，说明各配伍组对HepG2细胞的抑制作用是不同的。我们通过IPP软件对所得荧光图像做进一步分析，计算出各实验组HepG2细胞的凋亡坏死率，绘制了各实验组对HepG2细胞的凋亡坏死影响的柱状图，如图4所示。数据分析结果显示，各配伍组细胞的凋亡坏死率与空白对照组相比均有显著性差异，说明各配伍组对HepG2细胞均有一定的促凋亡作用，然而各配伍组的凋亡坏死率却不尽相同，说明复方中各有效组分按不同比例配伍时对人肝肿瘤HepG2细胞的抑制作用是有差异的。
