一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法
专利汇可以提供一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种油 水 井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法，具体包括以下步骤：(1)特异性引物合成；(2)标准品质粒的制备；(3) 荧光 定量PCR反应程序和反应体系的建立；(4)标准曲线的绘制；(5)方法的评价；(6)现场样品取样、菌体收集及DNA提取；(7)现场样品产甲烷古菌的定量检测，本发明具有灵敏度和准确性高、特异性强；操作简单，可重复性高；检测时间短，从样品DNA的提取到得到检测结果所需时间小于3h；可以同时实现对96个样品高通量检测的优点，可用于油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测。，下面是一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法专利的具体信息内容。
1.一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)特异性引物合成
特异性引物对序列为：
Mcr A-R：5`-CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT-3`
Mcr A-F：5`-GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3`
(2)标准品质粒的制备
标准品质粒具体制备方法如下：
①产甲烷古菌的培养
利用一株产甲烷古菌来构建甲基辅酶A还原酶基因片段的标准质粒，将培养基溶解后煮沸冷却至室温，然后加入半胱氨酸0.5‰，调pH为7.0，加入含氧指示剂刃天青后通氮气煮沸；溶液煮至无色后冷却至室温，在通氮气的条件下进行分装灭菌；接菌前向管中加入
4％Na2S 0.1mL、10％NaHCO30.05mL；最后用注射器向厌氧瓶中接种细菌，细菌的培养条件为60℃，共培养15天；
②甲基辅酶A还原酶基因片段的获取
从10mL达到对数生长期的细菌中提取总基因组DNA，通过紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测DNA的纯度和浓度，该DNA作为PCR扩增mcr A基因的模板；
2+
25μL普通PCR反应体系为：Mg 、dNTP、buffer和taq酶混合液MIX 12.5μL，引物
0.2μM，模板3μL，无菌水9.1μL；
扩增程序：①预变性98℃5min；②98℃15S、60℃30S、72℃30s，该步骤循环35次；
③72℃延伸10min；
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后用凝胶回收试剂盒纯化回 收目的基因条带；
③目的片段与载体连接构建重组质粒
将纯化后的目的基因片段和TaKaRa PMD T载体以5：1的比例混匀，在16℃下过夜连接；
反应体系为10μL，体系组成为：PMD 18T-1载体1μL,目的基因的DNA溶液5μL,连接缓冲液4μL；
④大肠杆菌转化、阳性克隆筛选及鉴定
实验前先用CaCl2法制备感受态大肠杆菌，然后制备含有氨苄，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和异丙基硫代半乳糖苷的琼脂糖蓝白斑筛选平板；将200μL感受态大肠杆菌加入10μL重组质粒，混合溶液在冰上放置10min后转移到42℃水浴中热击90s，最后置于冰上冷却3min；完成转化后向细菌液内加入1mL不含氨苄的LB液体培养基，混匀后
37℃震荡培养1h，细菌在该培养基中恢复正常生长状态，并表达质粒编码的氨苄抗性基因，
1h后将上述菌液摇匀后吸出500μL涂布于制备好的蓝白斑筛选平板上，37℃培养24h，培养好的平板放入4℃冰箱数小时，让蓝白斑充分显色后每个平板挑选3～4个白斑进行液体扩大培养，用于质粒提取；
利用质粒提取试剂盒提取质粒，提取的质粒通过PCR及测序进行验证；
⑤标准品质粒的定量
提取后的质粒溶液进行紫外分光光度检测，检测DNA溶液在260nm的吸光度(OD260)，根据相对分子质量和阿伏伽德罗常数计算出质粒的分子拷贝数，然后用灭菌水对质粒进行梯度稀释；
DNA浓度(mg/mL)＝OD260×(稀释倍数)×50μg/mL/1000
质粒DNA平均分子量MW＝碱基数×660道尔顿/碱基，单位：g/mol
23
拷贝数计算公式为：[6.02×10 ×(浓度，g/mL)]/(MW，g/mol)＝copy/mL
(3)荧光定量PCR反应程序和反应体系的建立
荧光定量PCR反应程序：预变性95℃3min；95℃10s，58℃30s，72℃30s，收集荧光，扩增40个循环；溶解曲线分析，55℃逐步升温到95℃，每隔0.5℃收集一次荧光；
荧光定量PCR反应体系为20μL,体系组成为：Sso fast EvaGreen supermix10μL，引物的浓度为0.2μM，模板1μL，无菌水8.6μL；
(4)标准曲线的绘制
标准曲线绘制的具体步骤为：取上述制备的标准品质粒，以10倍的倍比关系进行梯度
10 1
稀释(1×10 copy/μL到1×10copy/μL)，从中选取5个浓度梯度作为荧光定量PCR反应的模板进行扩增，以质粒拷贝数的对数值和相应的阈值循环数作图，并进行线性拟合得到标准曲线；
(5)方法的评价
6 4
方法的灵敏性评价，其具体步骤为：考察拷贝数为1×10copy/μL、1×10copy/μL、
2 1
1×10copy/μL、1×10copy/μL的标准质粒在步骤(3)优化的条件和体系下进行荧光定量PCR反应的效率，通过该反应考察检测下限，对该方法的灵敏性进行评价；
方法的重复性评价，其具体步骤为：同一个拷贝浓度在不同时间进行两次独立实验，每次实验设置3个平行，通过不同批次实验的Ct值(Ct值是指PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数)的变异系数来评价该方法的重复性；
方法的特异性评价，其具体步骤为：将大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)及竹节状甲烷鬃菌(methanosaeta harundinacea)的DNA分别作为荧光定量PCR的模板，从检测结果可以考察该方法的检测特异性；
准确性以及mcr A功能基因拷贝数与产甲烷菌数相关性评价，其具体步骤为： 利用该方法检测4～5个已知梯度菌浓产甲烷细菌的DNA样品，将检测到的mcr A基因拷贝数结果和实际菌量进行统计学分析，确定该方法的准确性和相关性；
(6)对现场样品取样、菌体收集及DNA提取
(7)现场样品中产甲烷古菌的定量检测。
2.根据权利要求1所述的一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法，其特征在于，所述产甲烷古菌，其培养基配方为：NH4Cl 1g/L、K2HPO40.3g/L、KH2PO40.3g/L、KCl
1g、CaCl20.1g/L、MgCl20.2g/L、NaCl 5g/L、MgSO40.2g/L、酵母粉2.5g/L、蛋白胨0.5g/L、微量元素10g/L、复合元素10g/L、NaAc 0.8g/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法，其特征在于，所述现场样品取样的具体步骤为：采用带胶塞和螺旋盖的玻璃瓶，用去离子水清洗干净，用高纯氮气置换瓶内空气，用胶塞和盖子密封后，高压蒸汽121℃灭菌20min；打开井口取样口阀门，用废液桶接取液体，使液体畅流15L～20L；打开采样容器，连接取样口，待注入水充满采样容器，拧盖密封；在采样容器上贴上标签，置于4℃条件下在4h内送回实验室进行分析。
4.根据权利要求1或2所述的一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法，其特征在于，所述菌体收集及DNA提取的具体步骤为：将现场取到的油水井产出液进行预处理，加入1/5体积的石油醚萃取其中的原油污染，然后将下层溶液进行离心12000rpm，
15min，弃掉上清，收集底部菌体沉淀，每个样品收集6L液体中的菌体，收集的菌体利用基因组提取试剂盒进行基因组提取，最终的样品DNA溶解在100μL的缓冲液中，作为后面产甲烷菌功能基因定量检测的模板。
5.根据权利要求1或2所述的一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法，其特征在于，所述现场样品中产甲烷古菌的定量检测的具体步骤为：将提取到的现场样品DNA溶液和4个梯度稀释的标准质粒溶液各1μL作为模板， 同时进行荧光定量PCR反应；
根据标准质粒反应后构建的标准曲线来定量现场样品中产甲烷细菌的含量；荧光定量PCR反应程序为：预变性95℃3min；95℃10s，58℃30s，72℃30s，收集荧光，扩增40个循环；
溶解曲线分析，55℃逐步升温到95℃，每隔0.5℃收集一次荧光；荧光定量PCR反应体系为
20μL,体系组成为：Sso fast EvaGreen supermix10μL，引物的浓度为0.2μM，模板1μL，无菌水8.6μL。
6.根据权利要求3所述的一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法，其特征在于，所述现场样品中产甲烷古菌的定量检测的具体步骤为：将提取到的现场样品DNA溶液和4个梯度稀释的标准质粒溶液各1μL作为模板，同时进行荧光定量PCR反应；根据标准质粒反应后构建的标准曲线来定量现场样品中产甲烷细菌的含量；荧光定量PCR反应程序为：预变性95℃3min；95℃10s，58℃30s，72℃30s，收集荧光，扩增40个循环；溶解曲线分析，55℃逐步升温到95℃，每隔0.5℃收集一次荧光；荧光定量PCR反应体系为20μL,体系组成为：Sso fast EvaGreen supermix10μL，引物的浓度为0.2μM，模板1μL，无菌水
8.6μL。
7.根据权利要求4所述的一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法，其特征在于，所述现场样品中产甲烷古菌的定量检测的具体步骤为：将提取到的现场样品DNA溶液和4个梯度稀释的标准质粒溶液各1μL作为模板，同时进行荧光定量PCR反应；根据标准质粒反应后构建的标准曲线来定量现场样品中产甲烷细菌的含量；荧光定量PCR反应程序为：预变性95℃3min；95℃10s，58℃30s，72℃30s，收集荧光，扩增40个循环；溶解曲线分析，55℃逐步升温到95℃，每隔0.5℃收集一次荧光；荧光定量PCR反应体系为20μL,体系组成为：Sso fast EvaGreen supermix10μL，引物的浓度为0.2μM，模板1μL，无菌水
8.6μL。
一种油水井产出液中产甲烷古菌的快速定量检测方法
技术领域
背景技术
发明内容
梯度稀释(1×10 copy/μL—1×10copy/μL)，从中选取5个浓度梯度作为荧光定量PCR反应的模板进行扩增，以质粒拷贝数的对数值和相应的阈值循环数(Ct)作图，并进行线性拟合得到标准曲线。
μL、1×10copy/μL、1×10copy/μL的标准质粒在步骤(3)优化的条件和体系下进行荧光定量PCR反应的效率，通过该反应考察检测下限，对该方法的灵敏性进行评价。
为：1×10copy/μL、1×10copy/μL、1×10copy/μL、1×10copy/μL及阴性对照；
最后用注射器向厌氧瓶中接种细菌，细菌的培养条件为60℃，共培养15天。
质粒进行梯度稀释，通过计算，该质粒的浓度为5.68×10 (copy/μL)。
1×10copy/μL)，从中选取10 、10、10、10 和10 作为荧光定量PCR反应的模板进行扩增，以质粒拷贝数的对数值和相应的阈值循环数(Ct)作图，并进行线性拟合得到标准曲线
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(附图1)，反应效率E＝106.9％，线性拟合度达到R ＝0.995。
1×10copy/μL的标准质粒在步骤3优化的条件和体系下进行荧光定量PCR反应的效率,
1
实验结果(附图2)证实，1×10copy/μL的模板量通过该方法也能检测到明显的荧光值，Ct＝32，说明该方法具有很高的灵敏性。
用该方法检测4个已知菌量分别为3×10、1.5×10、6×10、1.5×10 产甲烷细菌的DNA样品，检测结果见表1，从表1可以看出该检测方法准确性>90％，同时利用spss评价实际菌量和荧光定量PCR检测到的mcr A基因总拷贝数的相关性见表2，从表2可以看出P＝
0.003<0.01，该结果证实细菌浓度和定量检测得到的基因拷贝数间存在极显著的正相关关系。
μL、1×10copy/μL、1×10copy/μL标准质粒溶液各1μL作为模板，同时进行荧光定量PCR反应，反应体系和反应程序与步骤3一致，结果见附图5。
标准质粒-1 10.03 1×108
标准质粒-2 16.68 1×106
标准质粒-3 24.27 1×104
标准质粒-4 31.99 1×102
水井 18.04 5.54×105
油井-1 26.95 1.66×103
2
油井-2 27.65 9.80×10
油井-3 27.29 1.21×103
油井-4 29.92 2.05×102
油井-5 28.29 6.13×102
阴性对照 N/A 0
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