具有脂类动员性质的糖蛋白及其治疗用途
阅读：475发布：2021-08-07
专利汇可以提供具有脂类动员性质的糖蛋白及其治疗用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供通过单独或与额外药剂(如β肾上腺素能受体激动剂、β肾上腺素能受体拮抗剂和/或血糖控制药)组合施用Zn-α2-糖蛋白或其功能性 片段 的制剂和方法，用于改善与代谢紊乱(如恶病质、低血糖、 肥胖症 、糖尿病等)相关的症状。，下面是具有脂类动员性质的糖蛋白及其治疗用途专利的具体信息内容。
1.一种制剂，其包含锌-α2-糖蛋白(ZAG)、ZAG变体、修饰的ZAG或其功能性片段。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述ZAG是哺乳动物的。
3.根据权利要求2所述的制剂，其中所述ZAG是人的。
4.根据权利要求3所述的制剂，其中所述ZAG由SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求所述的制剂4，其中所述ZAG与非蛋白质聚合物缀合。
6.根据权利要求5所述的制剂，其中所述ZAG经唾液酸化、PEG化或修饰以增加溶解度或稳定性。
7.根据权利要求1所述的制剂，其中所述ZAG是重组或合成的。
8.根据权利要求1所述的制剂，其中所述修饰的ZAG由带有一个或多个选自缺失、添加或保守性置换的氨基酸序列突变的野生型ZAG氨基酸序列组成。
9.根据权利要求1所述的制剂，其中所述ZAG还包含一个或多个前导序列和尾随序列(trailing sequence)。
10.根据权利要求5所述的制剂，其中所述ZAG是糖基化的。
11.根据权利要求10所述的制剂，其中所述ZAG因翻译后修饰而糖基化。
12.根据权利要求1所述的制剂，其中通过蛋白水解化学降解作用或折叠结构域保留片段化产生所述功能性片段。
13.根据权利要求1所述的制剂，其中所述制剂包含至少5、10、25、50、100mg的ZAG。
14.根据权利要求1所述的制剂，还包含药学上可接受的载体。
15.根据权利要求1所述的制剂，还包含一种或多种选自β3激动剂和β-肾上腺素能受体(β-AR)拮抗剂的药剂。
16.根据权利要求15所述的制剂，其中所述β-AR拮抗剂选自β2-肾上腺素能受体(β2-AR)拮抗剂、β1-肾上腺素能受体(β1-AR)拮抗剂和β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂。
17.根据权利要求15所述的制剂，其中所述β3激动剂选自肾上腺素(肾上腺
素(adrenaline))、去甲肾上腺素(去甲肾上腺素(noradrenaline))、异丙肾上腺素(isoprotenerol)、异丙肾上腺素、普萘洛尔、阿普洛尔、阿罗洛尔、布新洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、克仑特罗、地诺帕明、非诺特罗、纳多洛尔、奥克巴胺、氧烯洛尔、吲哚洛尔、[(氰基)吲哚洛尔]、沙丁胺醇、沙美特罗、teratolol、tecradine、特美奎诺(trimetoquinolol)、3'- 碘特 美 奎诺(3'-iodotrimetoquinolol)、3',5'-碘 特 美奎诺(3',5'-iodotrimetoquinolol)、阿米贝隆、索拉贝隆、奈必洛尔、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413的SO3H的CONH2取代、BMS-181413的 消旋物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、(-)-RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001和ZM-215967。
18.根据权利要求16所述的制剂，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
19.根据权利要求15所述的制剂，其中所述β-AR拮抗剂选自普萘洛尔、(-)-普萘洛尔、(+)-普萘洛尔、普拉洛尔、(-)-普拉洛尔、(+)-普拉洛尔、CGP-20712A、ICI-118551、(-)-布拉洛尔、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、奈必洛尔、美托洛尔、醋丁洛尔、卡替洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。
20.根据权利要求1所述的制剂，还包含选自胰岛素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其类似物的降血糖药剂。
21.根据权利要求1所述的制剂，其中所述制剂处于液体剂、糊剂、粉剂、乳剂、混悬剂或固体剂形式。
22.根据权利要求1所述的制剂，其中所述制剂处于适合作为喷雾剂、片剂、冻干粉剂、半固体凝胶剂、舌下剂、速溶剂、颊含剂、液体剂、糖锭剂、薄膜剂、咀嚼剂、掩味剂或泡腾剂口服施用的形式。
23.根据权利要求1所述的制剂，其中所述制剂处于适合鼻内或肺部施用的形式，包括喷雾剂、液体剂、糊剂、乳剂、混悬剂、冻干粉剂或半固体凝胶剂形式。
24.根据权利要求1所述的制剂，其中所述制剂处于适合局部施用的形式，包括喷雾剂、液体剂、糊剂、乳剂、混悬剂、冻干粉剂、乳膏剂、油膏剂或半固体凝胶剂形式。
25.根据权利要求1所述的制剂，其中所述制剂适于通过自动注射器、泵装置、预填充注射器和无针技术注射。
26.根据权利要求1所述的制剂，其中所述制剂被挤出。
27.根据权利要求1所述的制剂，还包含膳食纤维源。
28.根据权利要求1所述的制剂，还包含蛋白质源。
29.根据权利要求1所述的制剂，还包含以下的一种或多种：微量营养素、膳食补充剂、养分、可食用化合物和调味剂。
30.根据权利要求1所述的制剂，还包含一种或多种选自磷酸盐、Tris、精氨酸、甘氨酸、Tween80、蔗糖、海藻糖、甘露醇、酪蛋白和其衍生物的赋形剂。
31.根据权利要求30所述的制剂，其中当存在时，磷酸盐、Tris、精氨酸和甘氨酸的浓度约15mM至300mM。
32.根据权利要求31所述的制剂，其中磷酸盐、Tris、精氨酸和甘氨酸的浓度独立地是
20mM、150mM或250mM。
33.根据权利要求1所述的制剂，其中当存在时，Tween80的浓度是约0.01%至0.1%。
34.根据权利要求33所述的制剂，其中Tween80的浓度是0.01%、0.05%或0.1%。
35.根据权利要求30所述的制剂，其中当存在时，蔗糖、海藻糖和甘露醇的浓度是约
0.1%至5%。
36.根据权利要求35所述的制剂，其中蔗糖、海藻糖和甘露醇的浓度独立地是0.1%、
1.0%或5.0%。
37.根据权利要求30所述的制剂，其中所述一种或多种赋形剂是酪蛋白。
38.根据权利要求30所述的制剂，其中所述膳食补充剂选自A1和A2β酪蛋白。
39.根据权利要求1所述的制剂，其中所述ZAG、ZAG变体、修饰的ZAG或其功能性片段作为聚合物存在。
40.食料添加剂或营养补充剂，其包含根据权利要求1所述的制剂。
41.食料或营养补充剂，其包含与根据权利要求1所述的制剂组合的可消耗载体。
42.根据权利要求40所述的食料添加剂或营养补充剂，其中所述可消耗载体是饼干、巧克力蛋糕、薄脆饼、早餐棒、能量棒、谷类食品或蛋糕。
43.根据权利要求40所述的食料添加剂或营养补充剂，其中所述可消耗载体是饮料。
44.根据权利要求40所述的食料添加剂或营养补充剂，其中所述可消耗载体是肉产品。
45.根据权利要求40所述的食料添加剂或营养补充剂，其中所述肉产品是培养肉。
46.一种用于将制剂递送至哺乳动物受试者的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用根据权利要求1-39或1-45中任一项所述的制剂。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者是人。
48.根据权利要求46所述的方法，其中将所述制剂按静脉内、经口、经颊、舌下、鼻内、透皮、皮下、肌内、局部方式或通过吸入施用。
49.根据权利要求46所述的方法，其中每天施用所述制剂至少10天。
50.根据权利要求46所述的方法，其中每天施用所述制剂至少21天。
51.根据权利要求46所述的方法，其中每天施用所述制剂长于一年。
52.根据权利要求51所述的方法，其中每天施用所述制剂长于两年。
53.根据权利要求46所述的方法，其中每天施用所述制剂二次。
54.根据权利要求46所述的方法，其中每三天施用所述制剂一次。
55.根据权利要求46所述的方法，其中每周施用所述制剂。
56.根据权利要求46所述的方法，其中每月施用所述制剂。
57.根据权利要求46所述的方法，其中将所述制剂与一种或多种选自β3激动剂和β-肾上腺素能受体(β-AR)拮抗剂的药剂组合施用。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述β-AR拮抗剂选自β2-肾上腺素能受体(β2-AR)拮抗剂、β1-肾上腺素能受体(β1-AR)拮抗剂和β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述β3激动剂选自肾上腺素(肾上腺
素(adrenaline))、去甲肾上腺素(去甲肾上腺素(noradrenaline))、异丙肾上腺素(isoprotenerol)、异丙肾上腺素、普萘洛尔、阿普洛尔、阿罗洛尔、布新洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、克仑特罗、地诺帕明、非诺特罗、纳多洛尔、奥克巴胺、氧烯洛尔、吲哚洛尔、[(氰基)吲哚洛尔]、沙丁胺醇、沙美特罗、teratolol、tecradine、特美奎诺(trimetoquinolol)、3'-碘特美奎诺、3',5'-碘特美奎诺、阿米贝隆、索拉贝隆、奈必洛尔、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413 的 SO3H 的 CONH2 取代、BMS-181413的消旋物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、(-)-RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001和ZM-215967。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
61.根据权利要求57所述的方法，其中所述β-AR拮抗剂选自普萘洛尔、(-)-普萘洛尔、(+)-普萘洛尔、普拉洛尔、(-)-普拉洛尔、(+)-普拉洛尔、CGP-20712A、ICI-118551、(-)-布拉洛尔、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、奈必洛尔、美托洛尔、醋丁洛尔、卡替洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。
62.根据权利要求58所述的方法，其中同时施用所述制剂和β3-AR激动剂。
63.根据权利要求58所述的方法，其中同时施用所述制剂和β3-AR拮抗剂。
64.根据权利要求57所述的方法，其中在施用β3激动剂之前或之后施用所述制剂。
65.根据权利要求58所述的方法，其中在施用β3-AR之前或之后施用所述制剂。
66.根据权利要求46所述的方法，其中将所述制剂与选自胰岛素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其类似物的降血糖药剂组合以任何顺序或同时施用。
67.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者具有与肌肉消耗、少肌症、糖尿病、恶病质、肌肉丢失、脂肪营养不良或肥胖相关的一种或多种症状。
68.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者具有与胰岛素抗性、低血糖、升高的游离脂肪酸(NEFA)、甘油三酯或葡萄糖的血浆水平相关的一种或多种症状。
69.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者的代谢被调节。
70.一种用于将锌-α2-糖蛋白(ZAG)递送至哺乳动物受试者的方法，所述方法包括通过口服施用将根据权利要求1-39或1-45中任一项所述的制剂递送至受试者。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述受试者是人。
72.根据权利要求70所述的方法，其中每天施用所述制剂至少10天。
73.根据权利要求70所述的方法，其中每天施用所述制剂至少21天。
74.根据权利要求70所述的方法，其中每天施用所述制剂长于一年。
75.根据权利要求74所述的方法，其中每天施用所述制剂长于两年。
76.根据权利要求70所述的方法，其中每天施用所述制剂二次。
77.根据权利要求70所述的方法，其中每三天施用所述制剂一次。
78.根据权利要求70所述的方法，其中每周施用所述制剂。
79.根据权利要求70所述的方法，其中每月施用所述制剂。
80.根据权利要求70所述的方法，其中将所述制剂与一种或多种选自β3激动剂和β-肾上腺素能受体(β-AR)拮抗剂的药剂组合施用。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述β-AR拮抗剂选自β2-肾上腺素能受体(β2-AR)拮抗剂、β1-肾上腺素能受体(β1-AR)拮抗剂和β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述β3激动剂选自肾上腺素(肾上腺
素(adrenaline))、去甲肾上腺素(去甲肾上腺素(noradrenaline))、异丙肾上腺素(isoprotenerol)、异丙肾上腺素、普萘洛尔、阿普洛尔、阿罗洛尔、布新洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、克仑特罗、地诺帕明、非诺特罗、纳多洛尔、奥克巴胺、氧烯洛尔、吲哚洛尔、[(氰基)吲哚洛尔]、沙丁胺醇、沙美特罗、teratolol、tecradine、特美奎诺(trimetoquinolol)、3'-碘特美奎诺、3',5'-碘特美奎诺、阿米贝隆、索拉贝隆、奈必洛尔、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413 的 SO3H 的 CONH2 取代、BMS-181413的消旋物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、(-)-RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001和ZM-215967。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
84.根据权利要求80所述的方法，其中所述β-AR拮抗剂选自普萘洛尔、(-)-普萘洛尔、(+)-普萘洛尔、普拉洛尔、(-)-普拉洛尔、(+)-普拉洛尔、CGP-20712A、ICI-118551、(-)-布拉洛尔、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、奈必洛尔、美托洛尔、醋丁洛尔、卡替洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。
85.根据权利要求81所述的方法，其中同时施用所述制剂和β3-AR激动剂。
86.根据权利要求81所述的方法，其中同时施用所述制剂和β3-AR拮抗剂。
87.根据权利要求80所述的方法，其中在施用β3激动剂之前或之后施用所述制剂。
88.根据权利要求81所述的方法，其中在施用β3-AR之前或之后施用所述制剂。
89.根据权利要求70所述的方法，其中将所述制剂与选自胰岛素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其类似物的降血糖药剂组合以任何顺序或同时施用。
90.根据权利要求70所述的方法，其中所述受试者具有与肌肉消耗、少肌症、糖尿病、恶病质、肌肉丢失、脂肪营养不良或肥胖相关的一种或多种症状。
91.根据权利要求70所述的方法，其中所述受试者具有与胰岛素抗性、低血糖、升高的游离脂肪酸(NEFA)、甘油三酯或葡萄糖的血浆水平相关的一种或多种症状。
92.根据权利要求70所述的方法，其中所述受试者的代谢被调节。
93.一种用于增加受试者的锌-α2-糖蛋白(ZAG)内源水平的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1-39或1-45中任一项所述的制剂。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述受试者是人。
95.根据权利要求93所述的方法，其中将所述制剂按静脉内、经口、经颊、舌下、鼻内、透皮、皮下、肌内、局部方式或通过吸入施用。
96.根据权利要求93所述的方法，其中每天施用所述制剂至少10天。
97.根据权利要求93所述的方法，其中每天施用所述制剂至少21天。
98.根据权利要求93所述的方法，其中每天施用所述制剂长于一年。
99.根据权利要求98所述的方法，其中每天施用所述制剂长于两年。
100.根据权利要求93所述的方法，其中每天施用所述制剂二次。
101.根据权利要求93所述的方法，其中每三天施用所述制剂一次。
102.根据权利要求93所述的方法，其中每周施用所述制剂。
103.根据权利要求93所述的方法，其中每月施用所述制剂。
104.根据权利要求93所述的方法，其中将所述制剂与一种或多种选自β3激动剂和β-肾上腺素能受体(β-AR)拮抗剂的药剂组合施用。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述β-AR拮抗剂选自β2-肾上腺素能受体(β2-AR)拮抗剂、β1-肾上腺素能受体(β1-AR)拮抗剂和β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂。
106.根据权利要求104所述的方法，其中所述β3激动剂选自肾上腺素(肾上
腺素(adrenaline))、去甲肾上腺素(去甲肾上腺素(noradrenaline))、异丙肾上腺素(isoprotenerol)、异丙肾上腺素、普萘洛尔、阿普洛尔、阿罗洛尔、布新洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、克仑特罗、地诺帕明、非诺特罗、纳多洛尔、奥克巴胺、氧烯洛尔、吲哚洛尔、[(氰基)吲哚洛尔]、沙丁胺醇、沙美特罗、teratolol、tecradine、特美奎诺(trimetoquinolol)、3'-碘特美奎诺、3',5'-碘特美奎诺、阿米贝隆、索拉贝隆、奈必洛尔、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413 的 SO3H 的 CONH2 取代、BMS-181413的消旋物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、(-)-RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001和ZM-215967。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
108.根据权利要求105所述的方法，其中所述β-AR拮抗剂选自普萘洛尔、(-)-普萘洛尔、(+)-普萘洛尔、普拉洛尔、(-)-普拉洛尔、(+)-普拉洛尔、CGP-20712A、ICI-118551、(-)-布拉洛尔、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、奈必洛尔、美托洛尔、醋丁洛尔、卡替洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。
109.根据权利要求104所述的方法，其中同时施用所述制剂和β3-AR激动剂。
110.根据权利要求105所述的方法，其中同时施用所述制剂和β3-AR拮抗剂。
111.根据权利要求104所述的方法，其中在施用β3激动剂之前或之后施用所述制剂。
112.根据权利要求105所述的方法，其中在施用β3-AR之前或之后施用所述制剂。
113.根据权利要求93所述的方法，其中将所述制剂与选自胰岛素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其类似物的降血糖药剂组合以任何顺序或同时施用。
114.根据权利要求93所述的方法，其中所述受试者具有与肌肉消耗、少肌症、糖尿病、恶病质、肌肉丢失、脂肪营养不良或肥胖相关的一种或多种症状。
115.根据权利要求93所述的方法，其中所述受试者具有与胰岛素抗性、低血糖、升高的游离脂肪酸(NEFA)、甘油三酯或葡萄糖的血浆水平相关的一种或多种症状。
116.根据权利要求93所述的方法，其中所述受试者的代谢被调节。
117.一种改善受试者中恶病质的症状的方法，包括向需要这样治疗的所述受试者施用治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO:1中所示序列的多肽的抑制剂，其中治疗之后与恶病质相关的症状改善。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述症状改善包括与治疗之前的体重减少相比，体重减少的下降或减轻。
119.根据权利要求117所述的方法，其中每天施用所述抑制剂。
120.根据权利要求117所述的方法，其中每天施用所述抑制剂二次。
121.根据权利要求117所述的方法，其中每周施用所述抑制剂。
122.根据权利要求117所述的方法，其中每月施用所述抑制剂。
123.根据权利要求117所述的方法，其中将所述抑制剂按静脉内、皮下、舌下、鼻内、经口、经颊方式或通过吸入施用。
124.根据权利要求117所述的方法，其中将所述抑制剂与一种或多种选自β3拮抗剂、β2拮抗剂、β1拮抗剂和β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂的药剂组合施用。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
126.根据权利要求117所述的方法，其中所述抗体是糖基化的。
127.根据权利要求117所述的方法，其中所述受试者患有癌症、AIDS、败血病、COPD、肾衰竭、关节炎、充血性心力衰竭、肌肉营养不良症、糖尿病或衰老的少肌症。
128.一种治疗受试者以引起体重减少降低的方法，包括向需要这样治疗的受试者施用治疗有效剂量的单独或与一种或多种药剂组合的多肽的抑制剂，所述多肽具有如SEQ ID NO:1中所示的序列，所述药剂选自β肾上腺素能受体(β-AR)拮抗剂和β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
130.根据权利要求128所述的方法，其中所述多肽是糖基化的。
131.一种改善哺乳动物受试者中糖尿病或肥胖症的症状的方法，包括向需要这样治疗的受试者以任何顺序或同时施用治疗有效剂量的根据权利要求1-39或1-45中任一项所述的制剂与降血糖药剂组合，所述降血糖药剂选自胰岛素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其类似物。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述受试者是人。
133.根据权利要求131所述的方法，其中将所述制剂按静脉内、经口、经颊、舌下、鼻内、透皮、皮下、肌内、局部方式或通过吸入施用。
134.根据权利要求131所述的方法，其中将所述制剂与一种或多种选自β3激动剂和β-肾上腺素能受体(β-AR)拮抗剂的药剂组合施用。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述β-AR拮抗剂选自β2-肾上腺素能受体(β2-AR)拮抗剂、β1-肾上腺素能受体(β1-AR)拮抗剂和β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂。
136.根据权利要求134所述的方法，其中所述β3激动剂选自肾上腺素(肾上
腺素(adrenaline))、去甲肾上腺素(去甲肾上腺素(noradrenaline))、异丙肾上腺素(isoprotenerol)、异丙肾上腺素、普萘洛尔、阿普洛尔、阿罗洛尔、布新洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、克仑特罗、地诺帕明、非诺特罗、纳多洛尔、奥克巴胺、氧烯洛尔、吲哚洛尔、[(氰基)吲哚洛尔]、沙丁胺醇、沙美特罗、teratolol、tecradine、特美奎诺(trimetoquinolol)、3'-碘特美奎诺、3',5'-碘特美奎诺、阿米贝隆、索拉贝隆、奈必洛尔、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413 的 SO3H 的 CONH2 取代、BMS-181413的消旋物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、(-)-RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001和ZM-215967。
137.根据权利要求135所述的方法，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
138.根据权利要求135所述的方法，其中所述β-AR拮抗剂选自普萘洛尔、(-)-普萘洛尔、(+)-普萘洛尔、普拉洛尔、(-)-普拉洛尔、(+)-普拉洛尔、CGP-20712A、ICI-118551、(-)-布拉洛尔、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、奈必洛尔、美托洛尔、醋丁洛尔、卡替洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。
139.根据权利要求134所述的方法，其中同时施用所述制剂和β3-AR激动剂。
140.根据权利要求135所述的方法，其中同时施用所述制剂和β3-AR拮抗剂。
141.根据权利要求134所述的方法，其中在施用β3激动剂之前或之后施用所述制剂。
142.根据权利要求135所述的方法，其中在施用β3-AR之前或之后施用所述制剂。
143.一种监测哺乳动物受试者中锌-α2-糖蛋白(ZAG)活性的方法，包括：
a)对受试者经口施用根据权利要求1-39或1-45中任一项所述的制剂；和
b)检测ZAG活性的水平；
从而监测受试者中的ZAG活性。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述受试者是人。
145.根据权利要求143所述的方法，其中通过测量一个或多个参数的变化或绝对值检测ZAG活性，所述参数选自体温、血液葡萄糖水平、尿葡萄糖水平和/或血浆ZAG水平或者ZAG活性的其他量值，包括甘油、脂类、甘油三酯的量值和/或其他血糖控制参数。
具有脂类动员性质的糖蛋白及其治疗用途
背景技术
发明领域
[0001] 本发明总体地涉及医学制剂和补充物，并且更具体地涉及用于改变受试者代谢以及改善病症诸如恶病质、肥胖症、糖尿病和胰岛素抗性的制剂和方法。
[0002] 背景信息
[0003] 成人、儿童和青少年中肥胖症的患病率已经在过去30年内在美国快速增加并且在全球继续上升。肥胖是经典地基于身体脂肪百分比或更新地基于身体质量指数(BMI)(也称作Quetlet指数)定义(National Task Force on the Prevention and Treatment of Obesity，Arch.Intern.Med.,160:898-904(2000)；Khaodhiar,L.等,Clin.Cornerstone,2:17-31(1999))。将BMI定义为重量(kg)除以高度(以米为单位)平方的比例。
[0004] 过重和肥胖症与美国所见到的许多老年慢性疾病形成风险增加相关。这类伴随疾病(co-morbidities)包括2型糖尿病、高血压、冠状动脉心脏病和血脂异常、胆结石和胆襄切除术、骨关节炎、癌症(乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌和胆囊癌)和睡眠呼吸暂停。据估计每年存在可归咎于肥胖症的约325,000例死亡。降低疾病严重性的关键是有效地减少重量。虽然约30%至40%要求尽力减少重量或维持减少的重量，但是目前的疗法似乎不起作用。除了膳食调节、药理学控制措施和在极端情况下手术之外，批准了治疗过重和肥胖患者的辅助疗法(Expert Panel,National Institute of Health,Heart,Lung,and Blood Institute，1-42(1998 年 6 月 )；Bray，G. A.,Contemporary Diagnosis and Management of Obesity，246-273(1998))。药物具有副作用，并且虽然有效，但手术是激烈措施并且保留用于病态肥胖症。
[0005] 恶病质是由疾病引起脂肪和骨骼肌质量的消耗。它在许多病况中出现并且是在缓解或控制失败时伴随许多癌症常见的。患有晚期癌症、AIDS和一些其他主要慢性进行性疾病的患者可以显现恶病质。恶病质可以在充分进食但不能吸收养分的人中出现。尽管恶病质可以由组织块中的肿瘤细胞和宿主细胞产生的某些细胞因子、尤其肿瘤坏死因子IL-1b和IL-6介导，但目前不存在广泛接受的恶病质疗法。
[0006] 糖尿病是发病率和死亡率的主要病因。逐渐升高的血糖导致衰竭性并发症：经常有必要透析或肾移植的肾病；周围神经病；致盲的视网膜病变；导致截肢的腿和足部溃疡；有时进展至肝硬化的脂肪肝病；和易患冠状动脉病和心肌梗死。
[0007] 存在两个主要类型的糖尿病。I型或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)归因于自身免疫破坏胰腺胰岛中产生胰岛素的β细胞。这种疾病的发作通常在儿童或青少年期。治疗主要由每天多次注射胰岛素组成，这与频繁检测血糖水平以指导胰岛素剂量的调节组合，因为过多的胰岛素可能造成低血糖症和随之而来的脑和其他功能损伤。渐增的注意力正在投向胰岛素抗性对这种类型糖尿病的起源、进展和治疗性控制措施的作用。
[0008] II型或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)一般在成人中形成。NIDDM与葡萄糖利用组织如脂肪组织、肌肉和肝脏对胰岛素作用的抵抗相关。最初，胰腺胰岛β细胞通过分泌过多的胰岛素代偿。最后的胰岛失效导致失代偿和慢性高血糖。相反，中度的胰岛功能不足可以在外周胰岛素抗性之前或与之同时出现。存在几种类型用于治疗NIDDM的药物：1)直接刺激胰岛素释放的胰岛素释放物，其存在低血糖症风险；2)膳食性胰岛素释放物，其启动葡萄糖诱导的胰岛素分泌并且必须每次就餐前服用；3)减弱肝脏糖原异生(这在糖尿病中相反地升高)的双胍类，包括二甲双胍；4)胰岛素敏化物，例如噻唑烷二酮衍生物罗格列酮和吡格列酮，其改善胰岛素的外周反应性，但是具有副作用如增重、水肿和偶发肝脏毒性；5)胰岛素注射剂，当胰岛于长期过度刺激下已经失效时，其经常在NIDDM晚期阶段是必需的。
[0009] 胰岛素抗性也可以在没有明显高血糖的情况下发生，并且通常与动脉粥样硬化、肥胖、高脂血症和原发性高血压相关。这类异常构成“代谢综合征”或“胰岛素抗性综合征”。胰岛素抗性也与脂肪肝相关，所述脂肪肝可以进展成慢性炎症(NASH；“非酒精性脂肪性肝炎”)、纤维化和肝硬化。累积地，胰岛素抗性综合征(包括但不限于糖尿病)是超过40岁的人发病和死亡的许多主要病因的基础。
[0010] 尽管存在这类药物，但糖尿病仍是一项主要和日益增长的公共卫生问题。糖尿病的晚期阶段并发症耗费巨大比例的国家卫生保健资源。需要新颖的口服有效治疗药，这些治疗药有效地解决胰岛素抗性和胰岛失效的主要缺陷，具有比现有药物更小或更温和的副作用。
[0011] 锌-α2-糖蛋白(ZAG)已被鉴定为脂类动员因子(LMF)，其具有引起癌症恶病质(cancer cacehxia)中脂肪丧失的潜能。显示ZAG在白色脂肪细胞中通过与β3-肾上腺素能受体相互作用而引起脂解作用，而在体内它增加解偶联蛋白-1(UCP-1)在棕色脂肪组织(BAT)中的表达，并引起身体脂肪的丧失。除了一些肿瘤，ZAG也由白脂肪组织(WAT)和BAT产生，其表达在恶病质中上调。相反，在肥胖人的脂肪组织中ZAG表达只是非肥胖受试者中存在的ZAG表达的30%。这提示WAT中ZAG表达的丧失能解释肥胖特征中的一些特征。当然，小鼠中ZAG等位基因的失活导致体重的增加，向动物饲喂高脂肪饮食时，这是更明显的。对各种药剂的脂肪分解反应在来自ZAG缺陷型动物的脂肪细胞中显著降低。
[0012] 迄今，关于ZAG的脂类动员作用的研究已经使用人和鼠ZAG在小鼠和大鼠中实施。研究表明ZAG是进化上保守的并且显示出物种交叉活性，例如，鼠ZAG在人类中显示基本上相同的活性并且反之亦然。
[0013] 仍缺少用于改变代谢性疾病(诸如肥胖症、糖尿病和恶病质)的代谢和治疗的有效和安全替代品。因此需要用于这类用途的新制剂。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明部分地基于以下研究结果：锌-α2-糖蛋白在成年肥胖高血糖(ob/ob)小鼠和成熟Wistar大鼠中对体重和胰岛素反应性具有影响，并且抗ZAG抗体防止恶病质情况下的体重减少。这种研究结果在改善调节体重、改善胰岛素反应性或缓解恶病质相关的症状或与肌肉消耗相关的疾病的方法中是有用的。
[0016] 在一个实施方案中，本发明提供一种制剂，其包含锌-α2-糖蛋白(ZAG)、ZAG变体、修饰的ZAG或其功能性片段。在一个方面，这种ZAG是哺乳动物的，例如，是人类的，并且可以包含SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列。ZAG肽可以与非蛋白质聚合物缀合。ZAG肽可以经唾液酸化、PEG化或修饰以增加溶解度或稳定性。ZAG肽可以是重组或合成的。在多个方面，ZAG肽可以是修饰的ZAG并且包含带有一个或多个选自缺失、添加或保守性置换的氨基酸序列突变的野生型ZAG氨基酸序列。在多个方面，ZAG肽可以包含一个或多个前导序列和尾随序列(trailing sequence)。ZAG肽也可以是糖基化的，例如，因翻译后修饰所致。此外，在多种实施方案中，制剂还可以包含药学上可接受的载体。制剂也可以包含一种或多种药剂，所述药剂包括β3激动剂和β-肾上腺素能受体(β-AR)拮抗剂，如β2-肾上腺素能受体(β2-AR)拮抗剂、β1-肾上腺素能受体(β1-AR)拮抗剂和β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂。在一些方面，权利要求1的制剂还可以包含胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其类似物。
[0017] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的本发明制剂的食料添加剂或营养补充剂。
[0018] 在另一个实施方案中，本发明提供一种用于将制剂递送至哺乳动物受试者的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用如本文所述的制剂。
[0019] 在另一个实施方案中，本发明提供一种用于将锌-α2-糖蛋白(ZAG)递送至哺乳动物受试者的方法，所述方法包括通过口服施用将如本文所述的制剂递送至受试者。
[0020] 在另一个实施方案中，本发明提供一种用于将锌-α2-糖蛋白(ZAG)以大剂量经口递送至哺乳动物受试者的方法，所述的大剂量与大剂量给药的口服胰岛素的大剂量相似，所述口服胰岛素需要如本文所述的所施用的ZAG的全身性吸收。
[0021] 在另一个实施方案中，本发明提供一种用于将锌-α2-糖蛋白(ZAG)以令人惊讶有效的低剂量和在下述制剂中经口递送至哺乳动物受试者的方法，所述的低剂量与静脉内施用ZAG的低剂量相似，所述制剂令人惊讶地不需要如本文所述的所施用的ZAG的全身性吸收。
[0022] 在另一个实施方案中，本发明提供一种用于增加受试者的锌-α2-糖蛋白(ZAG)内源水平的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的制剂。
[0023] 本发明还提供一种改善受试者中恶病质的症状的方法。这种方法包括向需要这样治疗的受试者施用治疗有效剂量的抑制剂，从而在治疗之后引起与恶病质相关的症状改善，其中所述抑制剂针对具有如SEQ ID NO:1中所示序列的多肽的生物学活性。在一个实施方案中，这种抑制剂是结合多肽的单克隆抗体，所述多肽包含与具有如SEQID NO:1中所示的序列的多肽同源至少80%的序列。在另一个实施方案中，治疗包括每天施用，持续10天。在另一个实施方案中，每天、每隔一天、每两天或每三天施用抑制剂，直至10天或更长时间。在另一个实施方案中，每天施用抗体两次。可以静脉内、皮下、舌下、鼻内、经口或通过吸入施用抗体。在另一个实施方案中，将抑制剂与一种或多种选自β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂的药剂组合施用。在一个实施方案中，β3-AR拮抗剂是SR59230A。在另一个实施方案中，抗体是糖基化的。在另一个实施方案中，抑制同源多肽的药剂是非抗体剂，例如但不限于适体。
[0024] 在另一个方面，本发明提供一种治疗受试者以引起体重减少的方法。这种方法包括向需要这样治疗的受试者施用治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO:1中所示序列的多肽的抑制剂，联合一种或多种选自β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂的药剂。在一个实施方案中，这种抑制剂是结合多肽的单克隆抗体，所述多肽包含与具有如SEQ IDNO:1中所示的序列的多肽同源至少80%的序列。在另一个实施方案中，β3-AR拮抗剂是SR59230A。在另一个实施方案中，抗体是糖基化的。在另一个实施方案中，抑制同源多肽的药剂是非抗体剂，例如但不限于适体。
[0025] 在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包含结合多肽的抗体或其功能性片段和选自β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂和β3拮抗剂的药剂，其中所述多肽具有如SEQ ID NO:1中所示的序列。在一个实施方案中，β3-AR拮抗剂是SR59230A。在另一个实施方案中，抗体是糖基化的。
[0026] 本公开提供用于补充人或动物膳食的材料和方法。在一个方面，本公开提供营养补充制剂。本发明的营养补充制剂可以包含锌-α2-糖蛋白(ZAG)或其功能性片段。本公开也提供材料，诸如包括一种或多种营养补充制剂(如包含ZAG或其功能性片段的营养补充制剂)的试剂盒。在另一个方面，本公开提供一种递送经口施用的治疗剂的方法，所述方法包括与经口施用的治疗剂组合施用β3激动剂。
[0027] 本文中的制剂、试剂盒和方法可以用于改善人健康和/或用来促进体重减少或与体重减少无关地改善胰岛素抗性和减少高血糖。这些制剂、试剂盒和方法可以因此用于治疗与肥胖症和/或高血糖症相关的疾病。
[0028] 在另一个方面，本发明提供一种食料，其包含与可消耗载体组合的本发明制剂。示例性可消耗载体包括但不限于饼干、巧克力蛋糕、薄脆饼、早餐棒、能量棒、禾谷植物、蛋糕、面包、饮料、肉产品和肉替代产品。
[0029] 在另一个方面，本发明提供一种补充人类膳食的方法。这种方法包括摄取包含锌-α2-糖蛋白(ZAG)或其功能性片段的制剂。在一个实施方案中，ZAG是哺乳动物的，如具有如SEQ ID NO:1中所示序列的人ZAG多肽或其片段。可以每天进行该方法，持续10天。在另一个实施方案中，每天、每隔一天、每两天或每三天摄取该制剂，直至10天或更长时间。在另一个实施方案中，每天摄取制剂两次。在另一个实施方案中，将制剂与一种或多种选自β3-肾上腺素能受体(β3-AR)激动剂和βAR激动剂及β3-AR拮抗剂的药剂组合摄取。在一个实施方案中，β3-AR拮抗剂是SR59230A。在另一个实施方案中，β3-AR激动剂是AMNI-BRL37344(BRL37344)。在另一个实施方案中，与一种或多种用来改善血糖控制的药剂组合摄取或递送这种制剂，无论以任何顺序依次或平行地进行。在一个实施方案中，血糖控制药剂是胰岛素或其任何衍生物或类似物。在另一个实施方案中，血糖控制药剂是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其任何衍生物或类似物。
[0030] 在另一个方面，本发明提供一种递送经口施用的治疗剂的方法，其中将所述治疗剂与β3激动剂组合递送。在另一个实施方案中，将β3激动剂和治疗剂同时递送。在又一个实施方案中，将β3激动剂在施用治疗剂之前或之后施用。在某些实施方案中，治疗剂是ZAG。在其他实施方案中，治疗剂包括心钠肽、脑钠肽、血小板聚集抑制剂、链激酶、肝素、尿激酶、肾素抑制剂、胰岛素、抗生素和睡眠诱导肽。
[0031] 在又一个方面，本发明提供治疗受试者以引起体重减少或肥胖减少的方法。该方法包括向需要这样治疗的受试者施用营养补充制剂，所述营养补充制剂包含治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO:1中所示序列的多肽或其片段。
[0032] 在另一个实施方案中，本发明提供一种监测哺乳动物受试者中锌-α2-糖蛋白(ZAG)活性的方法。这种方法包括：a)对受试者经口施用本发明的制剂；和b)检测ZAG活性的水平；从而监测受试者中的ZAG活性。
[0035] 图1B是显示蛋白质印迹结果的示意图，该蛋白质印迹显示培养基中ZAG的表达和纯化的ZAG。
[0036] 图1C是显示经历体重丧失的MAC16小鼠中脂肪组织和肝组织中ZAG mRNA水平的图解。P＜0.01。
[0037] 图1D是显示来自非肥胖(■)和ob/ob小鼠(□)的附睾脂肪细胞响应于异丙肾上腺素(Iso)和ZAG的脂解作用结果的图解。将与非肥胖小鼠的差异显示为*p＜0.05、**p＜0.01和***p＜0.001。
[0038] 图1E是显示来自肥胖(ob/ob)和非肥胖(non ob)小鼠附睾(ep)、皮下(s.c.)和内脏(vis)沉积物的脂肪细胞中脂解作用结果的图解，这些小鼠未经处理(■)、用异丙肾上腺素(10μM)(□)或ZAG(0.46μM)处理 将与附睾脂肪细胞的差异显示为**p＜0.01。
[0039] 图1F是显示与如方法中所描述的PBS(◆)相比，ZAG(■)对ob/ob小鼠体重的影响的图解。将与时间零点的重量和PBS对照的差异显示为***p＜0.001。
[0040] 图1G是显示与PBS对照(■)相比，ZAG(□)对小鼠体温影响的图解。将与对照的差异显示为***p＜0.001。
[0041] 图2A是显示用ZAG处理的ob/ob小鼠的葡萄糖耐量的图解。在i.v.施用葡萄糖(2g/kg)之后用ZAG(■)或PBS(◆)处理3天的饲养状态下ob/ob小鼠中的血浆葡萄糖水平。与PBS相比，p＜0.001。将血样在葡萄糖施用之后按间隔从尾静脉取出并且用于葡萄糖和胰岛素的测量。
[0042] 图2B是显示口服施用葡萄糖(1g/kg)之后用ZAG处理的ob/ob小鼠中血浆胰岛素水平的图解。与PBS相比，p＜0.001。
[0043] 图2C显示葡萄糖摄取进存在0(■)、1(□)或10nM胰岛素 下用ZAG处理5天的ob/ob小鼠的附睾(ep)、内脏(vis)和皮下(s.c)脂肪细胞的图解。将存在ZAG时的差异表示为***p＜0.001。
[0044] 图2D显示2-脱氧-D-葡萄糖摄取进存在或不存在胰岛素(100nM)下用ZAG或PBS处理5天的ob/ob小鼠的腓肠肌的图解。将存在胰岛素时的差异显示为*p＜0.05或**p＜0.01，而将存在ZAG时的差异显示为***p＜0.001。
[0045] 图2E是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中GLUT4葡萄糖转运蛋白表达的影响的示意图。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌取出并针对GLUT4的表达进行蛋白质印迹分析。
[0046] 图3A是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图解。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌取出并且用于测量蛋白质合成。将与PBS对照或非肥胖动物的差异显示为***p＜0.001。
[0047] 图3B是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图解。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌取出并且用于测量蛋白质降解。将与PBS对照或非肥胖动物的差异显示为***p＜0.001。
[0048] 图3C是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图解。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌取出并用于糜蛋白酶样酶活性的测量。将与PBS对照或非肥胖动物的差异显示为***p＜0.001。
[0049] 图3D是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的示意图。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌取出并针对20S蛋白酶体α-亚基的表达进行蛋白质印迹分析。
[0051] 图3F是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的示意图。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌取出并针对肌球蛋白的表达进行蛋白质印迹分析。
[0052] 图3G是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的示意图。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌取出并针对作为对照的肌动蛋白的表达进行蛋白质印迹分析。
[0053] 图4A是通过蛋白质印迹分析用PBS或ZAG处理5天之后ob/ob小鼠腓肠肌中的磷酸PKR显示ZAG对骨骼肌中分解代谢的信号转导途径影响的示意图。全部形式的蛋白质充当荷载对照。将与PBS对照的差异显示为***p＜0.001，而将与非肥胖小鼠的差异显示为#p＜0.001。
[0054] 图4B是通过蛋白质印迹分析用PBS或ZAG处理5天之后ob/ob小鼠腓肠肌中的磷酸eIF2α显示ZAG对骨骼肌中分解代谢的信号转导途径影响的示意图。全部形式的蛋白质充当荷载对照。将与PBS对照的差异显示为***p＜0.001，而将与非肥胖小鼠的差异显示为#p＜0.001。
[0055] 图4C是通过蛋白质印迹分析用PBS或ZAG处理5天之后ob/ob小鼠腓肠肌中的磷酸PLA2显示ZAG对骨骼肌中分解代谢的信号转导途径影响的示意图。全部形式的蛋白质充当荷载对照。将与PBS对照的差异显示为***p＜0.001，而将与非肥胖小鼠的差异显示为#p＜0.001。
[0056] 图4D是通过蛋白质印迹分析用PBS或ZAG处理5天之后ob/ob小鼠腓肠肌中的磷酸p38MAPK显示ZAG对骨骼肌中分解代谢的信号转导途径影响的示意图。全部形式的蛋白质充当荷载对照。将与PBS对照的差异显示为***p＜0.001，而将与非肥胖小鼠的差异显示为#p＜0.001。
[0057] 图4E是用PBS或ZAG处理5天之后ob/ob小鼠腓肠肌中的半胱天冬酶-3(■)和半胱天冬酶-8(□)活性显示ZAG对骨骼肌中分解代谢的信号转导途径影响的图解。
[0058] 图5A是显示响应于ZAG的HSL表达的示意图。蛋白质印迹显示在无处理(Con)、或单独用异丙肾上腺素(10μM)或ZAG(0.46μM)处理之后3h、或用ZAG处理5天之后在存在PD98059(25μM)时的非肥胖小鼠脂肪细胞中磷酸HSL的表达。
[0059] 图5B是通过用ZAG处理5天之后附睾(ep)脂肪细胞中的免疫印迹显示HSL表达的示意图。
[0060] 图5C是通过用ZAG处理5天之后皮下(sc)脂肪细胞中的免疫印迹显示HSL表达的示意图。
[0061] 图5D是通过用ZAG处理5天之后内脏(vis)脂肪细胞中的免疫印迹显示HSL表达的示意图。
[0062] 图5E是显示用ZAG处理5天之后附睾脂肪细胞中ATGL表达的示意图。
[0063] 图5F是显示用ZAG处理5天之后皮下脂肪细胞中ATGL表达的示意图。
[0064] 图5G是显示用ZAG处理5天之后内脏脂肪细胞中ATGL表达的示意图。
[0065] 图5H是显示用ZAG处理5天之后附睾脂肪细胞中pERK表达的示意图。
[0066] 图5I是显示用ZAG处理5天之后皮下脂肪细胞中pERK表达的示意图。
[0067] 图5J是显示用ZAG处理5天之后内脏脂肪细胞中pERK表达的示意图。
[0068] 图5K是显示来自用PBS或ZAG处理5天的ob/ob小鼠的附睾(ep)、皮下(sc)和内脏(vis)沉积物的脂肪细胞对BRL37344的脂肪分解作用反应的图解。将与PBS对照的差异表示为***p＜0.01，而将存在PD98059时的差异表示为#p＜0.001。
[0069] 图6A是显示用ZAG处理ob/ob小鼠5天对WAT中ZAG表达的影响的示意图。蛋白质印迹显示ZAG在ep、sc和vis脂肪细胞中的表达。第0天代表从小鼠除去脂肪细胞的那天。
[0070] 图6B是显示ZAG在如方法中所描述的悬浮于RMPI培养基中的附睾脂肪细胞中表达的示意图。然后将样品以每天的时间间隔取出并对ZAG表达进行蛋白质印迹分析。第0天代表从小鼠除去脂肪细胞的那天。
[0071] 图6C是显示HSL在如方法中所描述的悬浮于RMPI培养基中的附睾脂肪细胞中表达的示意图。然后将样品以每天的时间间隔取出并对HSL表达进行蛋白质印迹分析。第0天代表从小鼠除去脂肪细胞的那天。
[0072] 图6D是显示UCP1在从小鼠取出的BAT中表达的示意图。将与PBS处理的小鼠的差异显示为***p＜0.001。
[0073] 图6E是显示UCP3在从小鼠取出的BAT中表达的示意图。将与PBS处理的小鼠的差异显示为***p＜0.001。
[0074] 图6F是显示UCP3在从小鼠取出的腓肠肌中表达的示意图。将与PBS处理的小鼠的差异显示为***p＜0.001。
[0075] 图7A是显示21天研究期间ob/ob小鼠体重减少的图解。在第1、4、5、8、13、16、18和19天注射ZAG；在相同时间点注射PBS。
[0076] 图7B是显示用ZAG处理期间ob/ob小鼠(重量80-90g)体重变化(g)的图解。
[0077] 图7C是显示21天研究期间ob/ob小鼠体温升高的图解。在第1、4、5、8、13、16、18和19天注射ZAG；在相同时间点注射PBS。
[0078] 图8A是显示头5天处理期间尿葡萄糖排泄渐进性降低的图解。
[0079] 图8B是显示21天研究期间尿葡萄糖排泄渐进性降低的图解。
[0080] 图9是显示受异丙肾上腺素(iso)分离的脂肪细胞刺激的甘油释放的图解，所述脂肪细胞来自用和未用ZAG处理的ob小鼠，已经培养达5天。
[0081] 图10是显示人血浆Zn-α2-糖蛋白的完整氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的示 意 图，如T.Araki 等，(1988)“Complete amino acid sequence of human plasma Zn-α2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens.”所公布。
[0082] 图11是显示缺少或存在SR59230A(10μM)或抗ZAG抗体(1:1000)(IgG)时，与异丙肾上腺素(10μM)相比，人ZAG在分离的大鼠附睾脂肪细胞中的脂肪分解活性的图解。每个值是5个独立研究的平均值。将与对照的差异显示为b，p＜0.01或c，p＜0.001，而将与单独ZAG的差异表示为e，p＜0.01或f，p＜0.001。
[0083] 图12A是显示经10天的时间，每天i.v.施用在100μl PBS(■)或单独PBS(◆)中的ZAG(50μg/100g b.w.)对雄性Wistar大鼠体重的影响的图解。在方法部分中给出这个实验的方案。
[0084] 图12B是显示如图12A所描述的施用ZAG(■)或PBS(◆)的雄性Wistar大鼠的体温的图解。
[0085] 图12C是显示缺少或存在胰岛素(60μU/ml)时，如图12A所示用ZAG(空心柱)或PBS(实心柱)处理10天之后，2-脱氧-D-葡萄糖进入雄性Wistar大鼠附睾脂肪细胞的摄取量的图解。
[0086] 图12D是显示缺少或存在胰岛素(60μU/ml)时，用ZAG或PBS处理10天之后，葡萄糖进入雄性Wistar大鼠腓肠肌和BAT中的摄取量的图解。将ZAG和PBS处理的动物之间的差异显示为a，p＜0.05，b，p＜0.01或c，p＜0.001，而将存在胰岛素时的差异显示为f，p＜0.001。
[0087] 图12E是显示施用ZAG的ob/ob小鼠中组织Rg的图解。与PBS相比，c，p＜0.001。
[0088] 图13A-13C是蛋白质印迹的示意图，其显示GLUT4在如图12所示用PBS或ZAG处理10天的雄性Wistar大鼠的BAT(图13A)和WAT(图13B)和腓肠肌(图13C)中表达。将ZAG和PBS处理的动物之间的差异显示为c，p＜0.001。
[0089] 图14A和14B是蛋白质印迹的示意图，其显示UCP1和UCP3在如图12所示用PBS或ZAG处理10天的雄性Wistar大鼠的BAT(图14A)和WAT(图14B)中表达。将ZAG和PBS处理的动物之间的差异显示为c，p＜0.001。
[0090] 图15A和15B是蛋白质印迹的示意图，其显示ATGL(图15A)和HSL(图15B)在如图12所示用PBS或ZAG处理10天的雄性Wistar大鼠的附睾脂肪组织中表达。将ZAG和PBS处理的动物之间的差异显示为c，p＜0.001。
[0091] 图16A-16C是显示ZAG在腓肠肌(图16A)、WAT(图16B)和BAT(图16C)中表达的蛋白质印迹的示意图。从如图12所示用PBS或ZAG处理10天的雄性Wistar大鼠切除组织。将ZAG和PBS处理的动物之间的差异显示为c，p＜0.001。
[0092] 图17A和17B是蛋白质印迹的示意图，其显示pPKR(图17A)和peIF2α(图17B)的磷酸化形式和全体形式在如图12所示用PBS或ZAG处理10天的雄性Wistar大鼠的腓肠肌中表达。密度分析是磷酸化形式对全体形式的比，表达为用PBS处理的大鼠的值的百分比。
[0093] 图18A和18B是显示在各种浓度的葡萄糖存在下，用和未用ZAG处理4h的C2C12肌管中苯丙氨酸释放(图18A)和蛋白质合成(图18B)的图解。与对照相比统计学上显著的c，P＜0.001，与单独葡萄糖相比f，P＜0.001。
[0094] 图19是显示在各种浓度的葡萄糖存在下，用和未用ZAG处理，以及用和未用SR59230A处理的C2C12肌管中苯丙氨酸释放的图解。与对照相比统计学上显著的b，P＜0.01和c，P＜0.001；与单独葡萄糖相比e，P＜0.05和f，P＜0.001。
[0095] 图20是显示在各种浓度的葡萄糖存在下，用和未用ZAG处理，以及用和未用SR59230A处理的C2C12肌管中蛋白质合成的图解。与对照相比统计学上显著的b，P＜0.01和c，P＜0.001；与单独葡萄糖相比e，P＜0.05和f，P＜0.001；与葡萄糖+SR相比I，P<0.001。
[0096] 图21是显示在用有和没有ZAG的各种浓度的葡萄糖处理的C2C12肌管中ROS活性的图解。与对照相比统计学上显著的c，P＜0.001，与单独葡萄糖相比f，P＜0.001。
[0097] 图22A是显示在用有和没有ZAG的葡萄糖处理的C2C12肌管中pPKR的蛋白质印迹的示意图。与对照相比统计学上显著的c，P＜0.001，与单独葡萄糖相比f，P＜0.001。
[0098] 图22B是显示在用有和没有ZAG的葡萄糖处理的C2C12肌管中peIF2α的蛋白质印迹的示意图。与对照相比统计学上显著的c，P＜0.001，与单独葡萄糖相比f，P＜0.001。
[0099] 图23A和23B是显示用和未用ZAG处理的ob/ob小鼠中胰岛素耐受性试验的结果的图解。与用ZAG相比统计学上显著的b，P＜0.05和c，P＜0.001。
[0100] 图24是显示ob/ob小鼠中D-[U-14C葡萄糖]氧化成14CO2的图解。
[0101] 图25是显示ob/ob小鼠中由[14C羧基]三油酸甘油酯产生14CO2的图解。
[0102] 图26是显示与施用BRL37344的小鼠(恶病质模型)相比，显示施用抗ZAG的小鼠中体重减少降低的图解。
[0103] 图27是显示在缺少和存在抗ZAG抗体时用β3激动剂BRL37344处理的ob/ob小鼠中葡萄糖耐量的图解。
[0104] 图28是显示附睾鼠脂肪细胞中响应于异丙肾上腺素(Iso)、ZAG和抗ZAG抗体的脂解作用结果的图解。
[0105] 图29是显示在缺少或存在抗ZAG时用BRL处理的ob/ob小鼠的重量变化的图解，其中在抗ZAG之前24h或同时添加BRL。
[0107] 图31是显示用和未用ZAG处理的ob/ob小鼠中重量变化的图解。
[0108] 图32是显示用和未用ZAG处理的ob/ob小鼠中体温的图解。
[0109] 图33是显示用和未用ZAG处理的ob/ob小鼠中尿葡萄糖水平的图解。
[0110] 图34是显示口服施用后的ob/ob小鼠中ZAG的蛋白质印迹的示意图。用口服施用的rhZAG处理导致血浆中内源表达的鼠ZAG增加。
[0111] 图35是蛋白质印迹的示意图，其显示来自用和不用人ZAG(p.o.)处理的ob/ob小鼠的WAT中的ZAG表达。用口服施用的rhZAG处理导致WAT中内源表达的鼠ZAG增加。
[0112] 图36是显示在缺少或存在普萘洛尔(一种通用β-AR拮抗剂)时，用和未用ZAG处理(p.o.)的ob/ob小鼠中重量变化的图解。普萘洛尔第3日从20mg/kg增加至40mg/kg，此后体重减少的变化从ZAG处理动物的负斜率变成未处理动物的正斜率。
[0113] 图37是显示在缺少或存在普萘洛尔时，用和未用ZAG处理(p.o.)的ob/ob小鼠中体温变化的图解。普萘洛尔第3日从20mg/kg增加至40mg/kg，此后ZAG+Prop动物的体温与未处理动物的体温处于同一队列。
[0114] 图38是使用抗小鼠ZAG显示小鼠血清中的ZAG的蛋白质印迹的示意图，所述小鼠血清来自缺少或存在普萘洛尔时用和未用ZAG处理的小鼠。内源性鼠ZAG随口服施用rhZAG的处理增加，并且这种增加被普萘洛尔阻断。
[0115] 图39是使用抗人ZAG针对小鼠血清显示ZAG的蛋白质印迹的示意图，所述小鼠血清来自缺少或存在普萘洛尔时用和未用ZAG处理的小鼠。未在含有或没有普萘洛尔的小鼠血清中检测到人ZAG。
[0116] 图40是显示在ob/ob小鼠中葡萄糖耐量试验期间葡萄糖水平的图解，其中所述小鼠在缺少或存在普萘洛尔时用和未用ZAG(p.o.)处理。
[0117] 图41是显示口服施用后的ob/ob小鼠中ZAG的蛋白质印迹的示意图。用口服施用的rhZAG处理导致血浆中内源表达的鼠ZAG增加。
[0118] 图42是蛋白质印迹的示意图，其显示来自用人和不用人ZAG(p.o)处理的ob/ob小鼠的WAT中的ZAG表达。
[0119] 图43是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的示意图。
[0120] 图44是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中信号传导途径的影响的示意图。
[0121] 图45是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的示意图。
[0122] 图46是14C ZAG放射自显影的示意图，其显示来自p.o.处理的ob/ob小鼠的ZAG的胃水平和血浆水平，样品在处理后24小时取得。
[0123] 图47是显示用和未用50ug ZAG(p.o./管饲)处理的ob/ob小鼠中重量变化的图解。
[0124] 图48是显示用和未用50ug ZAG(p.o./管饲)处理的ob/ob小鼠中尿葡萄糖水平的图解。
[0125] 图49是蛋白质印迹的示意图。抗ZAG削弱由BRL37344在体内造成的影响：ob/ob小鼠的BAT中UCP3的蛋白质印迹，所述小鼠在缺少或存在抗ZAG时用和未用BRL处理。用BRL37344处理ob/ob小鼠引起BAT中UCP3的增加，一种通过施用抗ZAG抗体被阻断的作用。
[0126] 图50是蛋白质印迹的示意图。对ob/ob小鼠口服施用的ZAG引起血浆中和WAT中内源性鼠ZAG的上调。在rhZAG p.o.给药的血浆样品(顶部)和WAT样品(底部)中的小鼠ZAG的蛋白质印迹。
[0127] 图51是蛋白质印迹的示意图。普萘洛尔阻断因用rhZAG p.o.处理所致的鼠血清ZAG增加，但是没有在血浆中找到施用的人ZAG。使用小鼠血清中的抗小鼠ZAG的ZAG的蛋白质印迹(顶部)，所述小鼠血清来自缺少或存在普萘洛尔时用和未用ZAG处理的小鼠。未在小鼠血清中检测到人ZAG。使用小鼠血清中的抗人ZAG的ZAG的蛋白质印迹(底部)，所述小鼠血清来自缺少或存在普萘洛尔时用和未用ZAG处理的小鼠。
[0128] 图52A是显示ZAG浓度对CHO细胞中环状AMP生产的影响的图解，所述CHO细胞用β1-AR(■)、β2-AR(□)和β3-AR(加斜线)转染。图52B是显示异丙肾上腺素(10μM)对缺少或存在SR59230A(10μM)时β1-(■)、β2-(□)和β3-AR(加斜线)转染的CHO细胞中环状AMP生产的影响的图解。将与环状AMP基础水平的差异显示为a，p<0.05或c，p<0.001。
[0129] 图52C是显示mRNA水平的图解。与相同样品中GAPDH的表达相比(空心框)，β1-、β2-和β3-AR在用相应人类基因转染的CHO-K1细胞中的表达，由RT-实时PCR测量为β-AR mRNA分子绝对数/μg总RNA(实心框)。图52D是相对于基础水平(空心框)显示用人β1-、β2-和β3-AR转染的CHO-K1细胞中响应于毛喉素(20μM)(实心框)的环状AMP生产的图解。
[0130] 图52E、52F和52G是显示ZAG与CHO-K1细胞的特异性结合的图解，其中所述CHO-K1细胞在缺少(■)或存在(▲)100uM未标记的ZAG时用人β1-(图52E)、β2-(图52F)和β3-AR(图52G)转染。还指示了相似浓度的冷冻和融化(X)的ZAG的结合作用。
[0131] 图52H是显示与异丙肾上腺素(Iso；10μM)(实心)相比，在鼠附睾脂肪细胞中新鲜(空心)或冷冻与融化一次(虚线)的ZAG(0.58μM)的脂肪分解活性的图解。将与对照的差异显示为c，p<0.001，而将新鲜ZAG和冷冻ZAG之间和存在SR59230A时的差异显示为f，p<0.001。
[0132] 图53A-53C是显示普萘洛尔对用ZAG处理的ob/ob小鼠中体重(53A)、体温(53B)和尿葡萄糖排泄(53C)的影响的图解。将动物分成4组(每组n=5)以接受每天ZAG施用-1(50mg，i v)(■)、ZAG+普萘洛尔(40mgkg ，po)(▲)，同时对照接受PBS(◆)或PBS和普萘洛尔(X)。将与PBS的差异显示为c，p<0.001，而将与单独ZAG的差异表示为f，p<0.001。
[0133] 图53D是在60天后比较对照处理和ZAG处理的实例切片时肝脏组织学的示意图。
[0134] 图54A是显示与PBS(□)相比，在启用ZAG(■)后3天的葡萄糖耐量试验期间任意单位的葡萄糖曲线下总面积(AUC)和血浆葡萄糖水平的图解。图54B是显示在(图54A)中描述的葡萄糖耐量试验期间血浆胰岛素水平的图解。
[0135] 图54C是显示在缺少或存在胰岛素(100nM)时进入分离的ob/ob小鼠腓肠肌中的葡萄糖摄取量的图解。在切下肌肉之前，ob/ob小鼠在存在或不存在普萘洛尔的情况下用ZAG处理7天。
[0136] 图54D是显示在缺少或存在胰岛素(10nM)时进入ob/ob小鼠附睾脂肪细胞中的葡萄糖摄取量的图解。动物在切下WAT之前接收所示的处理7天。
[0137] 图54E和54F是显示在存在或不存在普萘洛尔的情况下用PBS或ZAG处理7天的ob/ob小鼠中TG(图54E)和NEFA(图54F)的水平的图解。
[0138] 图54G和54H是蛋白质印迹的示意图，其显示在ZAG或胰岛素或二者均存在的情况下在来自ob/ob小鼠的腓肠肌(54G)和WAT(54H)中的Glut4表达。将与对照的差异显示为b，p＜0.01或c，p＜0.001，而将与单独ZAG的差异表示为d，p<0.05或f，p<0.001。图55A是蛋白质印迹的示意图。
[0139] 图55A、55B和55C是显示用ZAG(35μg；i.v.天-1)处理ob/ob小鼠5天后β3-AR的表达的示意图。蛋白质印迹显示β3-AR在用PBS或ZAG处理的ob/ob小鼠的腓肠肌(54A)、BAT(54B)和WAT(54C)中表达。密度分析是3个独立蛋白质印迹物的平均值。将与控制的差异显示为c，p<0.001。
[0140] 图56A、56B和56C是显示用ZAG(35μg；每天i.v.)处理ob/ob小鼠5天后β1-和β2-AR在腓肠肌(56A)、WAT(56B)和心脏(56C)中表达的示意图。将与PBS处理的动物的差异显示为a，p<0.05。图57A、57B、57C和57D是ZAG对解偶联蛋白表达的影响的示意图。在用PBS或ZAG(35μg；每天i.v.)处理5天后的ob/ob小鼠中，显示UCP1表达的蛋白质印迹显示UCP1在BAT(57A)和WAT(57B)中表达，和UCP3在WAT(57C)中以及AMPK在腓肠肌(57D)中表达。密度分析是3个独立印迹物的平均值。将与PBS处理的动物的差异显示为c，p<0.001。
[0141] 本发明的具体实施方式
[0142] 本发明基于抗人锌-α2-糖蛋白(ZAG)抗体在恶病质模型中降低体重减少的观察结果。就这一点而论，本发明提供用于防止受试者中恶病质状况下体重减少的方法。还提供在患有恶病质的受试者中引起体重减少降低的联合疗法。
[0143] 本文中提供了用于治疗哺乳动物和/或补充人或动物膳食的制剂和方法。所示方法可以包括持续某些时间和/或以某个顺序摄取一种或多种所述制剂。也提供包含一种或多种制剂的试剂盒。就这一点而论，本发明基于观察结果—重组人锌-α2-糖蛋白(ZAG)在受试者中降低体重和增加胰岛素反应性，对食物摄入没有影响。
[0144] 在描述本发明的组合物和方法之前，将要理解的是该发明不限于描述的特定的组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可变化。还将要理解的是本文使用的术语只是用于描述特定的实施方案的目的，而不是意欲受限制，因为本发明的范围将只由所附的权利要求书限定。
[0145] 如本说明书和所附的权利要求书所用，除非上下文清楚地指出，单数形式“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”包括复数的指代物。因此，例如，对“所述方法”的称谓包括本文中所述类型的一种或多种方法和/或步骤，在阅读该公开等之后，它们将对本领域的技术人员变得显而易见。
[0146] 除非另外限定，本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在实践或测试本发明中能使用与本文描述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。
[0147] ZAG的完全氨基酸序列已在T.Araki等的名称为“Complete amino acid sequence of human plasma Zinc-α2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens”(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,85,679-683的论文中 被报道，其中 糖蛋白被显示为由276个氨基酸残基的单个多肽链组成，其具有三个不同的域结构(A、B和C)并包括两个二硫键连同三个糖基化位点处的N联聚糖。在附图的图10中展示多肽组分的氨基酸序列。尽管一些随后的出版物已指出当从不同的体液或组织中分离出时，人ZAG的组成可能多少改变，但是这种物质的所有制备物具有基本上相同的免疫学特性。如H.Ueyama等(1991)“Cloning and nucleotide sequence of a human Zinc-α2-glycoprotein cDNA and chromosomal assignment of its gene”,Biochem.Biophys.Res.Commun.177,696-703所报道，ZAG的cDNA已从人肝和前列腺文库中分离出来，并且如Ueyama等,(1993)““Molecular cloning and chromosomal assignment of the gene for human Zinc-α2-glycoprotein”,Biochemistry32,12968-12976所报道，基因也已经分离出来。H.Ueyama等也已经在J.Biochem.(1994)116，677-681中描述了对来自大鼠和小鼠肝脏的ZAG cDNA的研究，其与相应的mRNA表达的糖蛋白一起已经测序并与人类物质比较。尽管如所期望，找到来自不同物种的细节差别，但是发现高度的氨基酸序列同源性与人对应物(糖蛋白的B结构域内超过70%的同源性)具有超过50%的同源性。再次地，已经观察到人、大鼠和小鼠ZAG之间共同的免疫学性质。
[0148] 基本上根据Ohkubo等(Ohkubo等(1988)“Purification and characterisation of human plasma Zn-α2-glycoprotein”Prep.Biochem.,18,413-430)所述的方法，从新鲜的人血浆中制备上面讨论的纯化的ZAG。应当理解，在一些情况下，可以在不丧失活性的情况下产生分离的脂类动员因子的片段、ZAG的片段或抗ZAG抗体片段的片段，并且可进行各种添加、缺失和置换，其也将基本上不影响这种活性。就这一点而论，本发明的方法还包括使用抗ZAG抗体的功能片段。用于这些治疗应用中的抗体或其片段还可以通过重组DNA技术产生，重组DNA技术是本领域所熟知的，其可能基于Zn-α2-糖蛋白的已知cDNA序列，该序列已被公开例如在H.Ueyama等(1994)“Structure and Expression of Rat and Mouse mRNAs for Zn-α2-glycoprotein”J.Biochem.,116,677-681中。此外，这用于这些治疗应用中的抗体或其片段可进一步包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其它修饰，天然存在和非天然存在的修饰。
[0149] 如本文所用，ZAG多肽或蛋白质包括野生型蛋白质的变体，所述变体保留其生物学功能。就这一点而论，可以改变ZAG蛋白的一个或多个残基以产生变体或截短蛋白，只要变体保留其天然生物学活性。保守性氨基酸置换包括例如作为酸性氨基酸的天冬氨酸-谷氨酸；作为碱性氨基酸的赖氨酸/精氨酸/组氨酸；作为疏水性氨基酸的亮氨酸/异亮氨酸、甲硫氨酸/缬氨酸、丙氨酸/缬氨酸；作为亲水性氨基酸的丝氨酸/甘氨酸/苏氨酸。保守性氨基酸置换也包括基于侧链的分组。例如，具有脂族侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，合理的是希望用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸或用结构上相关的氨基酸相似地替换氨基酸将对所得到的变体多肽的性能不产生重大影响。
[0150] 通常，通过选择其对以下方面的影响方面没有明显差异的置换，完成属于本发明范围内的氨基酸置换：维持(a)肽主链在置换区域内的结构、(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性或(c)侧链体积。然而，本发明也构思具有非保守性置换的变体。
[0151] 除非另外区分，否则术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中互换地用来指任意长度的氨基酸聚合物。这些术语也包括通过包括糖基化、乙酰化和磷酸化的反应经翻译后修饰的蛋白质。
[0152] 如上文讨论，本发明包括ZAG多肽或蛋白的功能片段的用途。将功能性片段部分地表征为具有或影响与体重减少、降低血糖水平、增加体温、改善葡萄糖组织摄入量、增加β3受体表达、增加ZAG的表达、增加Glut4表达和/或增加UCP1和UCP3表达相关的活性。因此，在本文所用时，术语“功能性片段”指保留ZAG的一种或多种生物学功能的多肽。用于鉴定ZAG多肽的这种功能性片段的方法通常是本领域已知的。
[0153] 如本文所用，术语“抗体”包括对以免疫方式反与特定抗原应性的免疫球蛋白分子的称谓，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体。该术语也包括基因修饰形成，如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)和异质缀合抗体(例如，双特异性抗体)。术语“抗体”还包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段(例如，Fab'、F(ab')2、Fab、Fv和rIgG。还见，Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)。也见例如，Kuby，J.,Immunology3.sup.rd Ed.,W. H.Freeman&Co.,New York(1998)。该术语也指重组单链Fv片段(scFv)。术语“抗体”也包括双价或双特异性分子、双体抗体、三体抗体和四体抗体。双价和双特异性分子在以下中描述例如，Kostelny等.(1992)JImmunol148:1547,Pack和Pluckthun(1992)Biochemistry31:1579,Hollinger等,1993,上文,Gruber等.(1994)J Immunol:5368,Zhu等.(1997)Protein Sci6:781,Hu等.(1996)Cancer Res.56:3055,Adams 等 .(1993)Cancer Res.53:4026 和 McCartney 等 .(1995)Protein Eng.8:301。
[0154] 以免疫方式与特定抗原反应性的抗体可以通过重组方法如选择噬菌体或相似载体中的重组抗体文库(见，例如，Huse等,Science 246:1275-1281(1989)；Ward等,Nature341:544-546(1989)；和Vaughan等,Nature Biotech.14:309-314(1996))或通过其中所述抗原或用编码所述抗原的DNA免疫动物来产生。
[0155] 一般而言，免疫球蛋白具有重链和轻链。每条重链和轻链含有恒定区和可变区(这些区域也称作“结构域”)。轻链和重链可变区含有4个被3个高变区间隔(也称作“互补性决定区”或“CDR”)的“框架区”。已经限定框架区和CDR的范围。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内部是相对保守的。作为组成性轻链和重链的组合框架区的抗体框架区起到在三维空间中定位和对齐CDR的作用。
[0156] CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR一般称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始依次编号，并且一般也由其中存在特定CDR的链确定。因此，VHCDR3位于找到它的抗体的重链可变域内，而VLCDR1是来自找到它的抗体的轻链可变域中的CDR1。
[0157] 对“VH”或“VH”的称谓指抗体的免疫球蛋白重链(包括Fv、scFv或Fab的重链)的可变区。对“VL”或“VL”的称谓指免疫球蛋白轻链(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链)的可变区。
[0158] 具有与天然存在的IgG类抗体的恒定区基本上相同的恒定区的抗体指这样的抗体，其中存在的任何恒定区与天然存在的IgG类抗体的恒定区的氨基酸序列基本上相同，即，与之至少约85-90%并且优选地至少95%相同。
[0159] 如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指抗体，其源自单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)并且不源自产生它的方法。可以用本领域已知的多种技术(包括使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或其组合)制备用于本发明的单克隆抗体。例如，可以使用杂交瘤技术，包括本领域已知和例如在Harlow和Lane,“Antibodies:A Laboratory Manual,”Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1988)；Hammerling 等 ,“Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,”Elsevier,N.Y.(1981),第563-681页(所述两份参考文献均通过引用的方式完整并入)中教导的那些技术，产生单克隆抗体。
[0160] 因此，在一些实施方案中，本发明的抗体可以是嵌合抗体、灵长类化抗体、人源化抗体或人抗体。
[0161] “嵌合抗体”是免疫球蛋白分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点(可变区)与不同或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或向嵌合抗体赋予新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。见，例如，Morrison,Science229:1202-1207(1985)；Oi 等 ,BioTechniques4:214-221(1986)；Gillies 等 ,J.Immunol.Methods125:191-202(1989)；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
[0162] 术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”指免疫球蛋白，其包含人框架、来自非人抗体的至少一个和优选地全部互补性决定区(CDR)并且其中存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即，至少约85-90%并且优选地至少95%相同。因此，人源化免疫球蛋白的可能除CDR之外的全部部分与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的相应部份基本上相同。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上小于完整人可变结构域的区域已经被来自非人物种的相应序列置换。经常地，人框架区中的框架残基将用来自CDR供体抗体的相应残基置换以改变、优选地改善抗原结合。这些框架置换由本领域熟知的方法鉴定，例如，通过将CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基并且进行序列比较以鉴定特定位置处的不寻常框架残基。见，例如，美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370(所述每个专利通过引用的方式完整地并入)。抗体可以使用本领域已知的多种技术人源化，所述多种技术包括例如CDR-接枝(EP239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)、镶饰或表面重塑(EP592,106；EP519,596；
Padlan,Mol.Immunol.,28:489-498(1991)；Studnicka 等 ,Prot.Eng.7:805-814(1994)；
Roguska等,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973(1994)和链改组(美国专利号5,565,332)，所述全部文献因而通过引用的方式完整并入。
Padlan,Mol.Immunol.,28:489-498(1991)；Studnicka 等 ,Prot.Eng.7:805-814(1994)；
Roguska等,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973(1994)和链改组(美国专利号5,565,332)，所述全部文献因而通过引用的方式完整并入。
[0163] 在某些实施方案中，完全“人的”抗体可以对于治疗性治疗人患者是合乎需要的。可以通过本领域已知的多种方法产生人抗体，所述方法包括上文所述的使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示法。见美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO98/46645；WO98/50433；WO98/24893；WO98/16654；WO96/34096；WO96/33735和WO91/10741，所述的每篇文献通过引用方式完整地并入本文。也可以使用转基因小鼠产生人抗体，其中所述转基因小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白，但是可以表达免疫球蛋白基因。对用于产生人抗体的这项技术的综述，见Lonberg和Huszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。对用于产生人抗体和人单克隆抗体的这项技术及用于产生此类抗体的操作方案的详细讨论，见，例如，PCT公开WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；
WO96/33735；欧洲专利号0 598 877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；
5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，所述文献通过引用的方式完整并入本文。此外，诸多公司如Abgenix,Inc.(Fremont,Calif.)和Medarex(Princeton,N.J.)可以签约以使用与上述相似的技术提供针对所选择抗原的人抗体。
WO96/33735；欧洲专利号0 598 877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；
5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，所述文献通过引用的方式完整并入本文。此外，诸多公司如Abgenix,Inc.(Fremont,Calif.)和Medarex(Princeton,N.J.)可以签约以使用与上述相似的技术提供针对所选择抗原的人抗体。
[0164] 可以使用称作“导向选择”的技术产生识别所选择表位的完全人类的抗体。在这种方法中，选择的非人单克隆抗体(例如，小鼠抗体)用来指导识别相同表位的完全人类的抗体的选择(Jespers等,Biotechnology12:899-903(1988)。
[0165] 术语“灵长类化抗体”指包含猴可变区和人恒定区的抗体。用于产生灵长类化抗体的方法是本领域已知的。见例如美国专利号5,658,570、5,681,722和5,693,780，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
[0166] 如本文所用，“表位”或“抗原决定簇”指抗原上与抗体结合的位点。表位可以从连续氨基酸或因蛋白质的立体折叠而靠近的非连续氨基酸中形成。从连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时保留，而因立体折叠形成的表位通一般在用变性溶剂处理时丧失。表位一般地包含至少3个和更多个、通常至少5个或8-10个处于独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X射线结晶学和二维核磁共振法。见，例如，Methods in Molecular Biology，第66卷,Glenn E.Morris编著(1996)中的Epitope Mapping Protocols。
[0167] “IgG类”的抗体指抗体IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链和轻链中氨基酸残基的编号按照EU index(Kabat等,“Sequences ofProteins of Immunological Interest”,第5版,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；在此使用EU编号方案进行)。
[0168] 制备多克隆抗体的方法是技术人员已知的。多克隆抗体可以在哺乳动物中产生，例如，通过一次或多次注射免疫剂和(如果需要)佐剂。一般地，将通过多次皮下或腹腔内在哺乳动物中注射免疫剂和/或佐剂。免疫剂可包括蛋白质，如由核酸或其功能性片段编码的SEQ IDNO:1中所示的多肽。可能有用的是将免疫剂与蛋白质缀合，其中已知所述蛋白质在正在免疫的哺乳动物中具有免疫原性。这类免疫原性蛋白质的实例包括但不限于匙孔槭血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酸酯类脂A，合成性海藻糖dicorynomycolate)。可以由本领域技术人员选择免疫操作方案，无需过多实验。
[0169] 抗体可以可选地是单克隆抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤方法(如Kohler和Milstein,Nature256:495(1975)描述的那些方法)制备。在杂交瘤方法中，将小鼠、仓鼠或其他适宜的宿主动物用免疫剂免疫以激发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，其中所述的抗体将与免疫剂特异性结合。备选地，淋巴细胞可以体外免疫。免疫剂一般将包括如SEQ ID NO:1中所示的多肽或其功能性片段。
[0170] 可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体，所述技术包括噬菌体展示文 库 法 (Hoogenboom 和 Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks 等 ,J.Mol.Biol.222:581(1991))。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体 (Cole 等 ,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy， 第 77 页 (1985) 和Boemer等,J.Immunol.147(1):86-95(1991))。类 似地，可以 通过将人免 疫球蛋白基因座导入转基因动物(例如，其中已经部分或完全地使内源免疫球蛋白基因失活的小鼠)中产生人抗体。当攻击时，观察到人抗体产生，这与人类中在全部方面所见到的情况十分相似，包括基因重排、装配和抗体库。这种方法例如在美国专 利 号 5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016 中并 且在 以 下 科 学 出版 物：Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature368:856-859(1994)；Morrison,Nature368:812-13(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnology14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology14:826(1996)；
Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)中描述。
Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)中描述。
[0171] 在一些实施方案中，抗体是单链Fv(scFv)。scFv抗体的VH和VL区包含单链，所述单链经折叠以产生与双链抗体中存在的抗原结合位点相似的抗原结合位点。一旦折叠，非共价的相互作用使单链抗体稳定。尽管一些抗体实施方案的VH和VL区域可以直接连接在一起，然而技术人员将理解这些区域可以通过由一个或多个氨基酸组成的肽接头分隔。肽接头和它们的用途是本领域熟知的。见，例如，Huston等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA8:5879(1988)；Bird 等 ,Science242:4236(1988)；Glockshuber等,Biochemistry29:1362(1990)；美国专利号4,946,778、美国专利号5,132,405和Stemmer等,Biotechniques 14:256-265(1993)。通常，除连接所述区域或保持VH和VL之间的一些最小距离或其他空间关系之外，肽接头将具有非特异性生物学活性。然而，可以选择肽接头的组成氨基酸以影响分子的一些性能如折叠、净电荷或疏水性。单链Fv(scFv)抗体任选地包括不多于50个氨基酸、通常不多于40个氨基酸、优选地不多于30个氨基酸和更优选地不多于20个氨基酸长度的肽接头。在一些实施方案中，肽接头是序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:7)的连环体，优选地2、3、4、5或6个这类序列。然而，将理解的是可以在接头内部进行一些氨基酸置换。例如，可以将缬氨酸置换为甘氨酸。
[0172] 已经描述了制造scFv抗体的方法。见Huse等,上文；Ward等,上文；和Vaughan等,上文。简言之，从来自免疫动物的B细胞中分离mRNA并且制备cDNA。使用对免疫球蛋白重链和轻链可变区特异的引物扩增cDNA。纯化PCR产物并且连接核酸序列。如果需要接头肽，将编码这种肽的核酸序列在重链和轻链核酸序列之间插入。将编码scFv的核酸插入载体中并且在适宜的宿主细胞中表达。一般通过淘洗噬菌体展示文库找到与所需抗原特异性结合的scFv。可以通过几种方法中的任一种进行淘洗。可以使用在表面上表达所需抗原的细胞或使用以所需抗原包被的固体表面便利地进行淘洗。便利地，所述表面可以是磁珠。从固体表面上洗下未结合的噬菌体并且洗脱结合的噬菌体。
[0173] ZAG和/或其片段先前已经显示在哺乳动物中引起体重减少和肥胖减少，如美国专利号6,890,899和7,550,429中和美国公开号2010/0173829中公开，每篇文献的完整内容通过引用方式并入本文。在一个实施方案中，本发明显示抗ZAG抗体和/或其功能性片段在恶病质模型中降低体重减少。因此考虑本发明的方法对与恶病质相关的症状和/或与肌肉消耗性疾病相关的疾病提供可检测的作用。
[0174] 因此，在一个方面，本发明提供一种改善受试者中恶病质症状的方法。这种方法包括向需要这样治疗的受试者施用治疗有效剂量的抑制剂，其中所述抑制剂针对具有如SEQ ID NO:1中所示序列的多肽的生物学活性。在一个实施方案中，该治疗方案可持续数月(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)、或数年。在另一个实施方案中，施用多肽持续达21天或更长时间。在另一个实施方案中，症状的改善在开始治疗的数天(例如，1、2、3、4、5、6或7天)、数周(例如1、2、3或4周)、或数月(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或
12个月)内检测到。在另一个实施方案中，治疗方案是约10天，其中治疗之后存在与恶病质相关的症状的改善。在另一个实施方案中，治疗方案是约21天，其中治疗之后存在与恶病质相关的症状的改善。
12个月)内检测到。在另一个实施方案中，治疗方案是约10天，其中治疗之后存在与恶病质相关的症状的改善。在另一个实施方案中，治疗方案是约21天，其中治疗之后存在与恶病质相关的症状的改善。
[0175] 此外，已观察到具有ZAG和/或其片段的相似特性的脂类动员药剂也已用于在哺乳动物中引起体重减少和肥胖减少，如美国公开的申请号2006/0160723中所公开，其通过引用以其全部被并入本文。最后，已经显示ZAG和/或其功能片段增加脂肪细胞和骨骼肌的胰岛素反应性，并通过蛋白质合成的增加加上蛋白质降解的减少而引起肌肉质量的增加，不论在治疗期间是否观察到体重减少或肥胖减少(见美国系列号12/614,289，所述文献通过引用方式并入本文)。
[0176] 另外，β3激动剂是在啮齿类中据报道有效的胰岛素致敏剂，并且它们在人类中降低血糖水平的潜力已经成为研究的主题。β3激动剂肾上腺素能受体的活化刺激脂肪氧化，从而降低调节胰岛素信号传导的代谢物(包括脂肪酰基CoA和二酰甘油)的胞内浓度。另外，本文中考虑，鉴于这些药剂可获得的一个类别的β3受体位于消化系统中并且尤其位于口、咽、食道和胃中，从而导致所述激动剂对这些受体暴露最小(如果有的话)，因而某些β3受体激动剂可能在临床试验中未取得成功。这种理论受到以下观察结果支持：发现几种β3激动剂治疗药是有效的，但是在血浆空间具有有限的生物利用率。
[0177] 本文中提供众多的制剂。制剂可以处于任何形式，例如，液体剂、固体剂、凝胶剂、乳剂、粉剂、片剂、胶囊剂或凝胶胶囊剂(例如，软质或硬质凝胶胶囊剂)。制剂一般将包含已经被纯化、分离或提取(例如，从植物中)或合成的一种或多种组合物，用来补充膳食中的食物时，将所述组合物组合以提供益处(例如，除营养性益处之外的健康益处)。
[0178] 在某些实施方案中，可以在本文中描述制剂的或制剂中所提供成分的每天或每客推荐量。在某些情况下，如本领域普通技术人员将认识到，可以变动制剂的形式，例如，通过用粉剂替换胶囊剂、用片剂替换胶囊剂、用凝胶胶囊剂替换片剂、用凝胶胶囊剂替换胶囊剂、用粉剂替换凝胶胶囊剂或任何这类组合，以便提供制剂的每天或每客这类推荐量。
[0179] 可以由本领域普通技术人员使用熟知的方法制备制剂的任一种，例如，通过以恰当的量混合所述成分。包含于制剂的成分通常是可商业获得的。
[0180] 因此，在一个方面，本发明提供了包含ZAG或其功能性片段的制剂。例如，这种ZAG可以是哺乳动物ZAG(如SEQ ID NO:1中所示的人ZAG)或其片段。然而，应当理解ZAG可以源自任何来源，前提是这种ZAG保留野生型ZAG的活性。在一个实施方案中，还包含药学上可接受的载体，所述载体构成一种或多种辅助成分。
[0181] 如本文所用的术语“受试者”指对其进行主题方法的任何个体或患者。一般地，受试者是人，尽管如本领域的技术人员所将理解的，受试者可以是动物。因此，在受试者的定义内包括其它的动物，包括哺乳动物诸如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子、家畜(包括奶牛、马、山羊、绵羊、猪等)和灵长类(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。
[0182] 恶病质常见地与众多疾病状态相关，所述疾病状态包括与危重疾病相关的急性炎症过程和慢性炎性疾病、癌症、AIDS、败血病、COPD、肾衰竭、关节炎、充血性心力衰竭、肌肉营养不良症、糖尿病、老年人少肌症(sarcopenia of aging)、严重创伤(例如，肢体的矫形固定)、代谢性酸中毒、去神经性萎缩和失重。
[0183] 术语“治疗有效量”或“有效量”意指化合物或药物组合物的量，其将激发研究人员、兽医、医生或其它的临床医生正在寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应。
[0184] 在一些实施方案中，本发明的制剂意在每天口服施用。然而，同等地构思其他的施用形式。如本文所用，将术语“施用(administration)”或“施用(administering)”定义为包括提供给需要治疗的受试者本发明的化合物或药物组合物的行为。短语“胃肠外施用(parenteral administration)”和“经胃肠外施用(administered parenterally)”如本文所用指除肠内和局部施用外的施用方式，通常是口服或通过注射，包括但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内的和胸骨内的注射和输注。短语“全身施用(systemic administration)”、“经全身施用(administered systemically)”、“外周施用(peripheral administration)”和“经外周施用(administered peripherally)”如本文所用指除直接进入到中枢神经系统外的化合物、药物或其它物质的施用，这样它进入受试者的全身，并因此易遭受新陈代谢和其它相似的过程，例如皮下施用。就这一点而论，在一个实施方案中，将本发明的抗ZAG抗体，其片段和/或制剂通过吸入、鼻内、经颊、舌下、静脉内、肌内和/或口服施用给受试者。在另一个实施方案中，将抗体或其组合物配制于速溶组合物、延长释放组合物等中。
[0185] 如本文所用，术语“改善”或“治疗”指与恶病质相关的临床体征和/或症状由所进行的行为而减少。待监测的体征或症状将是恶病质特征性的并且对于熟练临床医生将是熟知的，并且对于具有并对本领域的技术人员来说，用于监测所述体征和状况的方法也是熟知的。除脂肪/肌肉质量丢失之外还，与正常受试者或未患有恶病质的受试者相比，与恶病质相关的示例性症状还包括但不限于发热、头痛、慢性疼痛、身体不适、昏厥、发作伴随发热、休克、心悸、心脏杂音、坏疽、鼻衄、咯血、咳嗽、呼吸困难、哮鸣、换气过度和换气不足、口呼吸、呃逆和胸痛、腹痛、恶心或呕吐、胃灼热、口臭和肠胃胀气。就这一点而论，综合征与恶病质相关的症状的改善包括但不限于降低或减小受试者中的体重减少并且逆转一个或多个上文所列的症状。
[0186] 如本文所用，术语“减低”和“抑制”在一起使用，因为认识到在一些情况下，降低可以是减小低于特定测定法的检测水平。就这一点而论，表达水平或活性是否“减小”低于测定法的检测水平或或完全“抑制”可能并不总是清楚的。尽管如此，将明显可确定的是，根据本方法的治疗之后，受试者中体重减少的量至少从治疗之前的水平被减低。
[0187] 已经认为ZAG具有许多生物学作用，但是其作为脂肪因子调节脂类动员和利用的作用是在调节身体组成方面最重要的。先前的研究提示蛋白质合成的增加是由于通过与β-肾上腺素能受体的相互作用引起的环AMP的增加，而蛋白质降解的降低是由于降低的泛素-蛋白酶体蛋白水解途径的活性。db/db小鼠中的研究显示胰岛素抗性通过增加的泛素-蛋白酶体途径的活性引起肌萎缩。增加的PKR和eIF2α的磷酸化将通过阻断翻译起始而降低蛋白质合成，而PKR的活化将通过活化核因子-κB(NF-κB)、增加蛋白酶体亚基的表达而增加蛋白质降解。在存在高的细胞外葡萄糖时使用肌管的体外研究显示PKR的活化引起p38MAPK的活化和活性氧种类(ROS)的形成。p38MAPK可以在Ser-505处磷酸化并活化cPLA2，引起花生四烯酸—ROS来源—的释放。在饮食诱发的肥胖模型中已观察到骨骼肌中p38MAPK的超活化。此外已显示半胱天冬酶-3活性在糖尿病动物的骨骼肌中增加，这可以是信号级联放大的一部分，因为它可以切割PKR，导致活化。不受理论束缚，ZAG减弱这些信号传导途径的能力提供关于它增加肌肉质量的能力的解释。就这一点而论，抗ZAG抗体显示恶病质状况下降低肌肉质量损失。
[0188] 因此，在另一个方面，本发明提供一种补充人类或动物膳食的方法。该方法包括向受试者施用ZAG多肽或其片段。在另一个实施方案中，该方法包括摄取包含ZAG多肽(如SEQ ID NO:1中所述的人ZAG多肽)的制剂。可以将制剂单独摄取或以任何顺序和持续不同的相对时间长度，与任何其他已知的制剂组合摄取。在某些实施方案中，在其他制剂之前使用某些制剂，而同时摄取其他制剂。
[0189] 因此，将ZAG鉴定为能够在小鼠白色脂肪细胞中以GTP依赖性过程诱导脂解作用的脂类动员因子，类似于脂肪分解激素诱导的脂类动员因子。本文呈现的数据通过显示ZAG在大鼠脂肪细胞中具有相似的脂肪分解作用，而且，在成熟的雄性大鼠中引起身体重量和尸体脂肪降低而支持这些研究结果，尽管大鼠和人ZAG之间的序列同源性仅为59.4%。
[0190] ZAG还抵消包括血浆胰岛素水平降低和改善的葡萄糖耐量试验反应在内的糖尿病状态的代谢特征中的一些特征。因此，在另一个方面，本发明提供降低受试者中血浆胰岛素水平的方法。该方法包括对受试者施用治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO:1中所示序列的多肽或其片段。在一个实施方案中，血浆胰岛素降低在开始治疗的3天内发生。在另一个实施方案中，将治疗方案施用10天或更长时间。在另一个实施方案中，将治疗方案施用21天或更长时间。
[0191] 此外，ZAG已显示在成年雄性小鼠中增加葡萄糖氧化和增加组织葡萄糖代谢速率。这种增加的葡萄糖的利用将解释在施用ZAG的ob/ob小鼠中血液葡萄糖和胰岛素水平的下降。甘油三酯利用在施用ZAG的小鼠中也增加，这将解释血浆非酯化脂肪酸(NEFA)和甘油三酯(TG)的下降，尽管血浆甘油增加，指示脂解作用增加。将从BAT中UCP1和UCP3及骨骼肌中UCP3的增加的表达预期增加的脂类利用，导致体温增加。因此，将ZAG鉴定为能够在小鼠白色脂肪细胞中以GTP依赖性过程诱导脂解作用的脂类动员因子，类似于脂肪分解激素诱导的脂类动员因子。就这一点而论，在一个实施方案中，与高血糖相关的症状的改善还包括治疗期间体温增加约0.5°C至约1°C。在一个实施方案中，体温增加在开始治疗的4天内发生。在另一个实施方案中，与高血糖相关的症状的改善还包括与治疗之前胰腺胰岛素水平相比，胰腺胰岛素的增加，因为作为ZAG存在的结果，需要较少的胰岛素来控制血液葡萄糖。
[0192] ZAG还显示抵消糖尿病状态的代谢特征中的一些，包括血浆胰岛素水平降低和改善的葡萄糖耐量试验反应。此外，ZAG增加附睾脂肪细胞对β3-肾上腺素能刺激物的脂肪分解的反应性。ZAG还增加附睾脂肪组织中HSL和ATGL的表达，已发现这种表达在肥胖的胰岛素抗性状态下降低。调节HSL和ATGL表达的因子是未知的。然而，特异性ERK抑制剂(PD98059)响应于ZAG而下调HSL表达，提示MAPK在该过程中的作用。缺少MAPK磷酸酶-1的小鼠在WAT中具有增加的ERK和p38MAPK活性，并且因增强的能量支出而抵抗膳食诱导的肥胖症。先前的研究已提示MAPK在骨骼肌中ZAG诱导的UCP3表达中的作用。ERK活化可通过HSL的丝氨酸残基，诸如Ser-600-由蛋白激酶A磷酸化的位点之一-的磷酸化而在脂肪细胞中调节脂解作用。
[0193] 本文呈现的结果显示，对大鼠施用ZAG还增加大鼠中ATGL和HSL的表达。ATGL可能在肥胖症中在过度脂肪储存方面是重要的，因为ATGL敲除小鼠具有响应于异丙肾上腺素的大量脂肪沉积和来自WAT的NEFA释放降低，尽管它们确实显示正常的胰岛素敏感性。相反，以正常饮食喂养时，无HSL小鼠具有与野生型动物相似的体重。然而，与胰岛素敏感状态相比，肥胖的胰岛素抗性状态中ATGL和HSL的表达在人WAT中减少，重量减少也降低mRNA和蛋白水平。
[0194] 单独脂解作用的刺激不会耗尽身体脂肪贮存，因为没有能量池，释放的NEFA在脂肪细胞中将被再合成甘油三酯。为了减少身体脂肪，ZAG不但增加脂解作用，如通过血浆甘油的增加所显示的，而且还增加脂类利用，如通过甘油三酯和NEFA的血浆水平的降低所显示。该能量形成(channel into)热，如用ZAG处理的大鼠中体温上升0.4°C所证明。增加的能量利用最可能来自增加的UCP1表达，其已经在施用ZAG之后BAT和WAT中显示。增加的UCP1表达将期望降低NEFA的血浆水平，因为在BAT中它们是产热的主要底物。BAT还具有高的葡萄糖利用能力，这将部分地解释血液葡萄糖的降低。此外在骨骼肌和WAT中具有增加的GLUT4表达，这有助于介导存在胰岛素时葡萄糖摄入量的增加。在用ZAG处理的14 14
小鼠中存在脑、心、BAT和腓肠肌的增加的葡萄糖利用/氧化，和 CO2从D-[U- C]葡萄糖
14
以及[ C羧基]三油酸甘油酯中的产生增加(图24)。ZAG施用之后还存在ob/ob小鼠的BAT氧摄取三倍的增加。
小鼠中存在脑、心、BAT和腓肠肌的增加的葡萄糖利用/氧化，和 CO2从D-[U- C]葡萄糖
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以及[ C羧基]三油酸甘油酯中的产生增加(图24)。ZAG施用之后还存在ob/ob小鼠的BAT氧摄取三倍的增加。
[0195] 虽然ZAG增加附睾脂肪细胞中HSL的表达，但是在皮下或内脏脂肪细胞中没有增加。对于脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)表达，观察到相似的情形。HSL和ATGL的表达与ERK的活性(磷酸)形式的表达相关。附睾脂肪细胞中HSL和ATGL的表达与响应于β3激动剂BRL37344的增加的脂肪分解相关。该结果提示，ZAG可以协同地与β3激动剂起作用，并且提示抗ZAG抗体可以协同地与β3拮抗剂起作用。
[0196] 如本文所用，术语“激动剂”指能引起完全或部分药理学反应的药剂或类似物。例如，激动剂可有成果地与受体结合并在那里模拟生理反应。如本文所用，术语“拮抗剂”指与受体结合时不诱发生物学反应本身，但是阻断或减缓激动剂介导的反应的药剂或类似物。本发明的方法和制剂可以包括与β3拮抗剂(如但不限于BRL37344)或β3激动剂组合施用抗ZAG抗体或其功能性片段。
[0197] 可以在本发明中使用的β3激动剂的实例包括但不限于肾上腺素(肾上腺素(adrenaline))、去甲肾上腺素(去甲肾上腺素(noradrenaline))、异丙肾上腺素(isoprotenerol)、异丙肾上腺素、普萘洛尔、阿普洛尔、阿罗洛尔、布新洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、克仑特罗、地诺帕明、非诺特罗、纳多洛尔、奥克巴胺、氧烯洛尔、吲哚洛尔、[(氰基)吲哚洛尔]、沙丁胺醇、沙美特罗、teratolol、tecradine、特美奎诺(trimetoquinolol)、3'-碘特美奎诺、3',5'-碘特美奎诺、阿米贝隆、索拉贝隆、奈必洛尔、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413 的 SO3H 的 CONH2 取代、BMS-181413的消旋物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、(-)-RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001和ZM-215967。
[0198] 可以在本发明中使用的β-AR拮抗剂的实例包括但不限于：普萘洛尔、(-)-普萘洛尔、(+)-普萘洛尔、普拉洛尔、(-)-普拉洛尔、(+)-普拉洛尔、CGP-20712A、ICI-118551、(-)-布拉洛尔、醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、奈必洛尔、美托洛尔、醋丁洛尔、卡替洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔、纳多洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。
[0199] 提示ZAG诱导的大鼠脂肪细胞中的脂解作用是通过β3-AR介导的，ZAG对脂肪组织和瘦体重的作用还可由于它刺激β3-AR的能力。已经显示通过与β3-AR的相互作用介导ZAG诱导UCP1表达。WAT中增加的UCP1表达还可以是通过重塑棕色脂肪细胞前体的β3-AR效应，如采用β3-AR激动剂CL316,243时发生那样。使用敲除小鼠，β3-AR刺激的抗肥胖作用通过从WAT释放的NEFA的UCP1依赖性降解已主要归因于BAT中的UCP1，较少地归因于UCP2和UCP3。葡萄糖摄取进动物的外周组织受寒冷暴露—也是通过β3-AR介导的效应—刺激。然而，靶向β3-AR在人类中较啮齿动物中更难，因为β3-AR在控制人皮下腹部脂肪组织中的脂解作用和营养性血流量中较β1和β2-AR亚型起到较不显著的作用。然而，尽管这样，β3-AR激动剂CL316,243已在健康的年轻男性志愿者中显示增加脂肪氧化。这可能是由于β-肾上腺素能激动剂增加来自BAT的质膜中β3-AR数目的能力。
[0200] 因此，在另一个方面，本发明提供治疗受试者以引起体重减少降低的方法，其中所述体重减少归因于恶病质或与肌肉消耗相关的疾病。该方法包括向需要这样治疗的受试者施用治疗有效剂量的β3拮抗剂，联合与多肽结合的抗体或其片段，其中所述多肽具有如SEQ IDNO:1中所显示的序列。在另一个实施方案中，该方法包括向需要这样治疗的受试者施用治疗有效剂量的β3-AR拮抗剂，联合与多肽结合的抗体或其片段，其中所述多肽具有如SEQ ID NO:1中所显示的序列。
[0201] 最近的结果显示，通过以旁分泌方式起作用，脂肪组织中的ZAG表达可能在局部比循环型ZAG更重要。因此在人类中，虽然内脏和皮下脂肪中ZAG的mRNA水平与BMI、脂肪质量和胰岛素抗性负相关，但是通过ELISA测定的血清水平与肥胖参数(BMI和腰围)和胰岛素抗性正相关。因此ZAG诱导其自身在腓肠肌、WAT和BAT中表达的能力对它增加脂解作用和能量利用的能力可以是关键的。
[0202] 在本发明的多种实施方案中，组合ZAG、β-3AR激动剂和β-AR拮抗剂目的取决于治疗目的和受试者的状态而变动。
[0203] 在一个实施方案中，涉及治疗肥胖症或糖尿病，其中需要激活β-3AR机制以实现所需的脂解作用、葡萄糖消耗、胰岛素敏化、蛋白质合成、增加的能量支出等。在这种环境下对于一些受试者，可以观察到，施用的ZAG或更有可能的是β-3AR激动剂将在一个或多个β-1AR或β-2AR处显示一些不希望的活性，引起副作用或所需功效的削弱。这种环境将随后要求额外施用β-AR拮抗剂(有时称作“经典β阻滞剂”)，从而在β-1AR或β-2AR处防止不希望的活性。将优选地但不必然地选择这些β-AR拮抗剂来阻断与副作用或减轻功效相关的受体亚型(β-1AR、β-2AR之一)。
[0204] 在另一个实施方案中，涉及治疗恶病质。在由不同疾病引起的恶病质中和在患有给定疾病的受试者群体内部，观察到不同程度的恶病质并伴有不同比例的肌肉丢失和脂肪丢失。
[0205] 在另一个方面，恶病质受试者可能正患有肌肉质量丢失，但是没有脂肪丢失或某种程度的脂肪丢失。因为肌肉丢失一般地是临床上更不想要的结局，所以可能需要使用ZAG以在ZAG处理的恶病质动物中引起一些肌肉积累，同时还引起某种程度的脂肪丢失。因此用ZAG、β-3AR激动剂和任选地如上文所述的β-AR拮抗剂治疗这类受试者可以增加肌肉质量。
[0206] 在另一个方面，恶病质受试者可能正患有脂肪质量丢失，没有肌肉质量丢失或伴有某种程度的肌肉质量丢失。在这种情况下，从临床观点看可以需要阻断脂肪丢失，并且因而将使用对ZAG特异性的抗体施用，以便阻断由ZAG引起的作用并且因此减少β-3AR的下游作用。
[0207] 在另一个实施方案中，涉及治疗脂肪营养不良，其中脂肪质量与受试者内部的正常分布不成比例和其中脂肪质量的丢失是所需。在这种情况下，将需要施用ZAG、β-3AR激动剂和β-AR拮抗剂中的一种或多种，原因类似于第一种情况。
[0208] 所有的方法可以进一步包括将活性成分(或多个)与药学上可接受的载体结合的步骤，所述载体构成一种或多种辅助成分。就这一点而论，本发明还提供用于治疗具有与恶病质相关的症状的受试者的药物组合物。在一个实施方案中，该组合物包括治疗有效剂量的如上文讨论的抗ZAG抗体或其功能性片段作为活性成分，连同药学上可接受的载体、赋形剂的稀释剂。
[0209] 对配制适用于对受试者施用的组合物的药学上可接受的载体是本领域熟知的，并且包括例如水溶液诸如水或生理缓冲盐水或其它溶剂或媒介物诸如二醇类、甘油、油类诸如橄榄油或可注射用有机酯。药学上可接受的载体可含有生理学上可接受的化合物，该化合物起到，例如稳定或增加结合物的吸收的作用。这类生理学上可接受的化合物包括，例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。此外，这类生理可接受的化合物还可以为盐形式(即，用反离子诸如Ca2+、Mg2+、Na+、NH4+等平衡)，前提是载体与所需的施用途径(例如，静脉内、皮下、口服等)相容。本领域的技术人员将知道包括生理学上可接受的化合物在内的药学上可接受的载体的选择依赖，例如治疗剂的物理化学特性和组合物施用途径，施用途径可以是，例如，口服或胃肠外地诸如静脉内地，和通过注射、插管或本领域已知的其它这样的方法。药物组合物还能含有第二(或更多)化合物(或多种)诸如诊断试剂、额外的营养物质、毒素或治疗剂，例如癌症化疗药和/或维生素(或多种)。
[0210] 发明的制剂也可以包含一种或多种赋形剂。可以在制剂中包含的药学上可接受的赋形剂是缓冲剂诸如柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和重碳酸盐缓冲剂、氨基酸、脲、醇类、抗坏血酸、磷脂；蛋白质，诸如血清白蛋白、胶原蛋白和明胶；盐诸如EDTA或EGTA和氯化钠；脂质体；聚乙烯吡咯烷酮；糖诸如葡聚糖、甘露醇、山梨醇和甘油；丙二醇和聚乙二醇(例如，PEG-4000、PEG-6000)；甘油；和甘氨酸或其他氨基酸。随制剂使用的缓冲剂体系包括柠檬酸盐、乙酸盐、重碳酸盐和磷酸盐缓冲剂。
[0211] 适于口服施用的本发明的制剂可作为不连续的单位诸如胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂而存在，每个单位含有以粉末或颗粒形式的预定量的活性化合物；或作为水成液或非水成液中的活性化合物的悬浮液而存在，诸如顿服的糖浆、酏剂、乳剂。
[0212] 营养补充制剂可以进一步包含任何数目的已知促进健康和/或重量减轻的额外成分。示例性的额外成分包括但不限于降血糖成分如碳水化合物源、蛋白质源和膳食纤维源。这类降血糖成分已经显示抑制食欲并且引起每天热量摄入量降低。
[0213] 营养补充剂的重要大分子养分是碳水化合物，因为它对饱满感和后续体重减少具有最大影响。如本文所用，饱满感指在一餐和下一餐之间的胀满感并且满足指在就餐过程期间形成并且有助于就餐终止的胀满感。具有低血糖指数的食物激发较小的血糖和胰岛素升高和较高的胰高血糖素浓度，这促进饱满感和比具有较高血糖指数的那些含碳水化合物的食物更好地防止增重，因为它们比具有高血糖指数的碳水化合物耗费更长时间来消化和吸收。
[0214] “血糖指数”是预测摄取含碳水化合物的食物后血糖随后升高的系统(Anderson,J.S.等,Modern Nutrition in Health and Disease,第70章:1259-86(1994)；
Wolever,T.M.S. 等 ,Am.J.Clin.Nutr.,54:846-54(1991)；Wolever,T.M.S. 等 ,Diab.Care,12:126-32(1990))。血糖指数表征餐后碳水化合物吸收的速率。将它定义为在消费来自试验食物的50g碳水化合物后2小时时间期间血糖反应曲线下面积除以标准物的曲线下面积，所述标准物是白面包或葡萄糖。血糖指数碳水化合物在摄取食物后2小时时间内具有最高峰值循环型葡萄糖。相反，低血糖指数碳水化合物引起较低的峰值葡萄糖和较小的曲线下面积。
Wolever,T.M.S. 等 ,Am.J.Clin.Nutr.,54:846-54(1991)；Wolever,T.M.S. 等 ,Diab.Care,12:126-32(1990))。血糖指数表征餐后碳水化合物吸收的速率。将它定义为在消费来自试验食物的50g碳水化合物后2小时时间期间血糖反应曲线下面积除以标准物的曲线下面积，所述标准物是白面包或葡萄糖。血糖指数碳水化合物在摄取食物后2小时时间内具有最高峰值循环型葡萄糖。相反，低血糖指数碳水化合物引起较低的峰值葡萄糖和较小的曲线下面积。
[0215] 许多因素决定食物的血糖指数。这些包括碳水化合物类型、纤维、蛋白质和脂肪含量和制备方法(过度烹调的食物激发较高的反应)。通常，高血糖指数碳水化合物是高度地精制的，并且与乳糖、蔗糖或果糖相比，具有相对高的葡萄糖或淀粉量。另外，它们在可溶性纤维方面低。包含纤维是重要的，原因在于纤维通过在胃中与食物一起形成凝胶促进体重减少。这种胶凝作用降低胃排空速率并且降低消化速率，这促进饱满感。影响饱满感的其他因素是碳水化合物的量、碳水化合物的复杂性和随碳水化合物同时食入的其他食物(例如，纤维、蛋白质、脂肪)(Ludwig,D.S.,J Nutr.,130:280S-3S(2000)；Wolever,T.M.S 等 ,Am.J.Clin.Nutr.,54:846-54(1991)；Wolever,T.M.S 等 ,Diab.Care,12:126-32(1990))。面包和马铃薯比菜豆更升高血糖。与碳水化合物同时摄取的不含或无可消化碳水化合物的其他食物(例如，脂肪、纤维和蛋白质)减少餐后血糖和胰岛素水平(Wolever,T.M.S.等,Am.J.Clin.Nutr.,54:846-54(1991))。
[0216] 低血糖指数碳水化合物源可以由单种碳水化合物或组合提供。碳水化合物源可以进一步由纤维源提供并且可以是天然甜味剂、果糖、大麦、魔芋甘露聚糖、欧车前(psyllium)及其组合。蛋白质源具有高生物学价值并且选自以下的至少一种：乳清蛋浓缩物、酪蛋白、大豆、牛奶、蛋和这些的组合。额外地，营养补充剂可以含有微量营养素、维生素、矿物质、膳食补充剂(例如，草药)、养分、乳化剂、调味剂和可食用化合物。
[0217] 在一个实施方案中，营养补充制剂还可以包括用于营养补充剂增甜的碳水化合物。用于营养补充剂增甜的示例性碳水化合物包括但不限于果糖、蒸发的甘蔗汁、菊糖、龙舌兰蜜(agave)、蜂蜜、槭糖浆、糙米糖浆、麦芽糖浆、椰枣糖、果汁浓缩物和混合的果汁浓缩物。
[0218] 可以适用于本发明中的膳食纤维包括但不限于纤维素、种子、半纤维素(例如，麸糠、全谷物)、多聚果糖(例如，菊糖和寡果聚糖)、多糖胶(例如，落叶松胶、阿拉伯半乳聚糖)、燕麦片、大麦、果胶、木质素、抗酶解淀粉。合适的纤维源的实例包括但不限于麦麸、纤维素、燕麦麸、玉米麸、瓜尔豆、果胶和欧车前。
[0219] 蛋白质源可以是营养制剂中使用的任何适合的蛋白质并且可以包括乳清蛋、乳清蛋白浓缩物、乳清粉、蛋、大豆蛋白、大豆蛋白分离物、酪蛋白酸盐(例如，酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钠钙、酪蛋白酸钙和酪蛋白酸钾)、动物和植物蛋白及其混合物。当选择蛋白质源时，应当首先蛋白质的生物学价值，其中最高的生物学价值存在于酪蛋白酸盐、乳清、乳白蛋白、大豆、脱乳糖乳固形物、卵白蛋白和全卵蛋白。这些蛋白质具有高生物学价值，即它们具有高比例的必需氨基酸。
[0220] 营养补充剂也可以含有其他成分，如其他维生素、矿物质、抗氧化剂、纤维(例如，银杏(ginkgo biloba)、人参(ginseng))和其他营养补充剂之一或组合。选择这些成分中的一种或几种是制剂设计、顾客和终端用户偏好的问题。添加至本发明营养补充剂的这些成分的量是技术人员轻易已知，并且可以由儿童和成人的RDA和DRI(膳食参考摄入量)量提供这类量的指导。可以添加的维生素和矿物质包括但不限于磷酸或乙酸三钙；磷酸二钾；硫酸镁或氧化镁；盐(氯化钠)；氯化钾或乙酸钾；抗坏血酸；正磷酸铁；烟酰胺；硫酸锌或氧化锌；泛酸钙；葡糖酸铜；核黄素；β-胡萝卜素；盐酸吡多醇；单硝酸硫胺素；叶酸；生物素；氯化铬或吡啶甲酸铬；碘化钾；硒；硒酸钠；钼酸钠；叶绿醌；维生素D3；氰钴胺；亚硒酸钠；硫酸铜；维生素A；维生素E；维生素B6及其盐酸盐；维生素C；肌醇；维生素B12；碘化钾。
[0221] 其他成分的每单位份的量是设计问题并且将取决于每天对患者施用的营养补充剂的每单位份的总数。其他成分的总量还将部分地取决于患者的状况。其他成分的量将优选地是RDA或DRI的部分或倍数。例如，营养补充剂每单位剂量将包含50%RDI(参考每天摄入量)的维生素和矿物质，并且患者每天将消费两个单位。
[0222] 可以将香料、着色剂、香辛料、坚果等掺入产品中。调味剂形式可以为调香(flavored)提取物、挥发油、巧克力调味剂(例如，无咖啡因的可可或巧克力或巧克力代用品，如角豆)、花生酱调味剂、饼干屑、锅巴、香草兰或任何市售调味剂。可以用混合的生育酚保护调味剂。有用的调味剂的实例包括但不限于纯八角提取物、仿香蕉提取物、仿樱桃提取物、巧克力提取物、纯的柠檬提取物、纯的橙提取物、纯薄荷提取物、仿菠萝提取物、仿朗姆(rum)提取物、仿草莓提取物或纯香草兰提取物；或挥发油，如蜜蜂花油、月桂油、香柠檬油、柏木油、樱桃油、胡桃油、桂皮油、丁香油或薄荷油；花生酱、巧克力调味剂、香草兰饼干屑、牛油糖(butterscotch)或太妃糖。在一个优选实施方案中，营养补充剂含有浆果或其他水果香料。如果作为棒施用，则食品组合物还可以例如用酸奶涂层涂覆。
[0223] 为了成品的稳定性，可以添加乳化剂。合适的乳化剂的实例包括但不限于卵磷脂(例如，来自蛋或大豆)和/或单甘油酯和二甘油酯。其他乳化剂是技术人员轻易显而易见的，并且选择合适的乳化剂将部分地取决于制剂和成品。
[0225] 除上文描述的碳水化合物之外，营养补充剂可以含有人工甜味剂，例如，糖、甜蜜素、阿司帕坦(aspartamine)、阿斯巴甜、乙酰磺胺酸钾和/或山梨醇。如果营养补充剂意图针对超重或肥胖个体或易患高血糖的II型糖尿病个体，则这类人工甜味剂可以是合乎需要的。
[0226] 本发明的营养补充剂可以使用任何药学上可接受形式的上文讨论的维生素、矿物质和其他养分(包括它们的盐)配制。可以将它们配制成胶囊剂、片剂、粉剂、混悬剂、凝胶剂或液体剂，其任选地包含生理可接受的载体，如但不限于水、乳、果汁、苏打、淀粉、植物油、盐溶液、羟甲基纤维素、碳水化合物。在一个实施方案中，可以将营养补充剂配制为粉末，例如，用于与可消耗液体(如乳、果汁、苏打、水)或用于混入其他营养性液体或食物的可消耗凝胶剂或糖浆剂混合。粉末形式具有特定的顾客吸引力，易于施用和并入顾客的每天食谱(regimen)，因此增加患者依从性的机会。本发明的营养补充剂可以用其他食物或液体配制以提供预计量的补充性食物，例如单客早餐棒、能量棒、面包、饼干、巧克力蛋糕、薄脆饼、谷物食品、蛋糕或饮料。
[0227] 因此，营养补充制剂可以作为膳食补充剂或作为可消耗载体如食料的添加剂施用。可以将组合物掺入稍后烹煮或焙烘的食料中。组合物的组分是结构上稳定的，以保持非氧化，并且在焙烘或烹煮所要求的温度是热稳定的。
[0228] 为制造这种饮料，将成分干燥并且使之轻易地可溶于水或如上文所述的其他可消耗液体中。饮料是优选的营养补充剂形式，原因在于如果在就餐之前至少一个半小时消费，其有助于饱满感的能力。
[0229] 为制造这种食物棒，将干成分随液体成分一起添加于混合器中并且混合直至达到面团阶段；将面团置于挤出机中并挤出；将挤出的面团切成适宜的长度；并且将产品冷却。
[0230] 为制造其他食品或饮料，可以将包含本发明营养补充剂的成分添加至常规制剂或它们可以用来替换常规成分。出于考虑本发明的目的，食品配制领域的技术人员将能够设计适宜的食品/饮料。
[0231] 营养补充剂可以按多种形式制成，如布丁、糖食(即，糖果)、营养性饮料、冰淇淋、冷冻的糖食和新奇食品或焙烘或非焙烘、膨化食品如棒。在一个实施方案中，营养补充剂处于饮料用粉末或非焙烘膨化营养棒的形式。
[0232] 在一个实施方案中，可消耗载体是肉产品，如天然或培养肉。体外肉，也称作培养肉，是从未成为完整的活动物的一部分的动物肉。形成体外肉的方法包括取得肌肉细胞和施加帮助细胞生长成大部分肉的蛋白质。一旦已经获得初始细胞，将不需要额外的动物-类似于酸奶培养物的产生。在一个实施方案中，产生体外肉：疏松的肌肉细胞和结构化的肌肉，后者比前者富有更大的挑战性。肌肉由肌肉纤维(具有多核的修长细胞)组成。这类细胞不通过自身增殖，而是在前体细胞融合时形成。前体细胞可以是胚胎干细胞或卫星细胞(肌肉组织中的特化干细胞)。理论上，在生物反应器中培养它们并且随后使其融合是相对地简单的。然而，为长出真实肌肉，细胞应当“现场”生长，这需要灌注系统，其类似于靠近正在生长的细胞输送养分和氧以及移去废物的血液供应。此外，其他细胞类型(如脂肪细胞)需要培育，并且化学信使应当提供向正在生长的组织关于结构的提示。最后，肌肉组织需要物理地拉伸或“锻炼以恰当地发育(见，例如，美国专利号6,835,390和公布的国际申请号WO99/31222，二者均通过引用方式并入本文)。在又一个实施方案中，本发明包括经工程化以按足够的量表达ZAG的培养肉，从而不需要添加重组ZAG。
[0233] 成分可以按单一制剂形式施用或它们可以是分别施用。例如，可以合乎需要的是将味道较苦的成分以掩蔽其味道的形式(例如，胶囊剂或丸剂形式)施用而非将其并入营养组合物本身(例如，粉末或棒)。因此，本发明也提供了包含一个或多个容器药学的包装或试剂盒，所述容器填充有本发明营养组合物的一种或多种成分。任选地，由管理药物产品或膳食补充剂产品制造、使用或销售的政府机构规定的公告可以与这类容器结合，所述公告反映该机构批准制造、使用销售物用于人类施用。包装或试剂盒可以标明关于施用模式、施用顺序(例如，单独、依次或同时)等的信息。包装或试剂盒也可以包括用于提醒患者服用治疗剂的手段。包装或试剂盒可以是联合疗法的单个单位剂量或它可以是多个单位剂量。具体而言，在制剂或片剂中时，药剂可以是分离的，以任何组合混合在一起。优选在泡罩包装中组装的药剂或其他分配手段。
[0234] 在一个实施方案中，制剂包含约1.0mg至1000mg ZAG。在另一个实施方案中，制剂包含约1.0mg至约500mg ZAG。在另一个实施方案中，制剂包含约1.0mg至约100mg ZAG。在另一个实施方案中，制剂包含约1.0mg至约50mg ZAG。在另一个实施方案中，制剂包含约
1.0mg至约10mg ZAG。在另一个实施方案中，制剂包含约5.0mg ZAG。
1.0mg至约10mg ZAG。在另一个实施方案中，制剂包含约5.0mg ZAG。
[0235] 因此，在另一个方面，本发明提供如本文所定义的抗ZAG抗体或其功能性片段在制备药物中的用途，所述药物在人类医学中用于治疗与恶病质相关的症状和/或病况或与肌肉消耗病症相关的疾病。
[0236] 在一个实施方案中，口服施用本发明的制剂。在这类实施方案中，制剂是与任何其他施用途径至少70、75、80、85、90、95或100%同样有效的。
[0237] 在实践本发明的方法中将要施用的制剂的总量能作为单一剂量或作为大丸剂或在相对短的时期里通过摄取而施用受试者，或能使用分次治疗方案施用，其中在延长的时期里施用多剂量(例如，每天一次、每天两次等)。本领域的技术人员将知道制剂的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和一般健康以及施用途径和将要施用的治疗的数目。考虑到这些因素，必要时熟练的技术人员将调整特定的剂量。一般而言，使用I期和II期临床试验最初确定药物组合物的制剂和施用途径和频率。
[0238] 因此，在某些实施方案中，本发明的方法包括间隔的治疗方案。观察到在ob/ob小鼠中长期每天施用ZAG导致连续的体重减轻。就这一点而论，在一个实施方案中，每隔一日施用单独与一种或多种β-拮抗剂或β3-AR激动剂组合的ZAG或抗ZAG抗体治疗。在另一个实施方案中，每两天施用治疗。在另一个实施方案中，每三天施用治疗。在另一个实施方案中，每四天施用治疗。
[0239] 提供以下实施例以进一步说明本发明的优点和特点，但是这些实施例不意在限制本发明的范围。尽管这些实施例是可能使用的那些常见实施例，可以备选地使用本领域技术人员已知的其他方法、方法学或技术。
[0240] 实施例1
[0241] 锌-α2-糖蛋白减弱高血糖
[0242] 为了评价锌-α2-糖蛋白(ZAG)减弱肥胖和高血糖的能力，给ob/ob小鼠施用诱导体重减轻和体温升高—提示增加的能力消耗-的ZAG。棕色脂肪组织中解偶联蛋白-1和-3的表达增加，尽管甘油增加，而葡萄糖、甘油三酯和非酯化脂肪酸的血清水平降低，指示增加的脂解作用。存在血浆胰岛素降低、对静脉内葡萄糖的改善的反应加上增加的葡萄糖摄取进脂肪细胞和骨骼肌。附睾脂肪细胞中激素敏感性脂肪酶的表达增加。存在骨骼肌质量的增加，这是由于蛋白质合成的增加和降解的减少。这提示ZAG在高血糖的治疗中可以是有效的。
[0243] Dulbeccos’Modified Eagle’s(DMEM) 和 Freestyle 培 养 基 购 自14
Invitrogen(Paisley，UK)，而胎牛血清购自Biosera(Sussex，UK)。2-[1- C]脱氧-D-葡萄-1 3 -1
糖(sp.act.1.85GBq mmol )和L-[2,6-H]苯丙氨酸(sp.act.37Bq mmol )来自American Radiolabeled Chemicals(Cardiff，UK)。对磷酸(Thr-202)和总ERK1、总p38MAPK、磷酸HSL(Ser-552)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、脂肪甘油三酯脂肪酶、激素敏感性脂肪酶、和磷酸PLA2(Ser-505)和对人ATGL的兔多克隆抗体购自Abcam(Cambridge，UK)。对全长人ZAG的小鼠单克隆抗体来自Santa Cruz(California，USA)，对肌球蛋白重链II型的小鼠单克隆抗体来自Novacastra(via Leica Biosystems，Newcastle，UK)。对20S蛋白酶体α-亚基和p42的小鼠单克隆抗体来自Affiniti Research Products(Exeter，UK)。对磷酸(Thr-180/Tyr-182)p38MAPK的小鼠单克隆抗体和对总和磷酸(Thr-451)PKR、磷酸(Ser-162)eIF2α和对总eIF2α的兔多克隆抗血清来自New England Biosciences(Herts，UK)。
TM
对UCP1、UCP3和总PKR的多克隆兔抗体和PHOSPHOSAFE 提取试剂来自Calbiochem(via Merk Chemicals，Nottingham，UK)。过氧化物酶偶联的山羊抗兔和兔抗小鼠抗体购自Dako(Cambridge，UK)。对小鼠β-肌动蛋白的多克隆兔抗体和甘油三酯测定试剂盒购自Sigma Aldrich(Dorset，UK)。Hybond A硝酸纤维素膜和增强化学发光(ECL)显影试剂盒来自Amersham Pharmacia Biotech(Bucks，UK)。针对NEFA的WAKO比色测定试剂盒购自Alpha Laboratories(Hampshire，UK)，小鼠胰岛素ELISA试剂盒购自DRG(Marburg，Germany)。使用Boots(Nottingham，UK)血浆葡萄糖试剂盒进行葡萄糖测量。
Invitrogen(Paisley，UK)，而胎牛血清购自Biosera(Sussex，UK)。2-[1- C]脱氧-D-葡萄-1 3 -1
糖(sp.act.1.85GBq mmol )和L-[2,6-H]苯丙氨酸(sp.act.37Bq mmol )来自American Radiolabeled Chemicals(Cardiff，UK)。对磷酸(Thr-202)和总ERK1、总p38MAPK、磷酸HSL(Ser-552)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、脂肪甘油三酯脂肪酶、激素敏感性脂肪酶、和磷酸PLA2(Ser-505)和对人ATGL的兔多克隆抗体购自Abcam(Cambridge，UK)。对全长人ZAG的小鼠单克隆抗体来自Santa Cruz(California，USA)，对肌球蛋白重链II型的小鼠单克隆抗体来自Novacastra(via Leica Biosystems，Newcastle，UK)。对20S蛋白酶体α-亚基和p42的小鼠单克隆抗体来自Affiniti Research Products(Exeter，UK)。对磷酸(Thr-180/Tyr-182)p38MAPK的小鼠单克隆抗体和对总和磷酸(Thr-451)PKR、磷酸(Ser-162)eIF2α和对总eIF2α的兔多克隆抗血清来自New England Biosciences(Herts，UK)。
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对UCP1、UCP3和总PKR的多克隆兔抗体和PHOSPHOSAFE 提取试剂来自Calbiochem(via Merk Chemicals，Nottingham，UK)。过氧化物酶偶联的山羊抗兔和兔抗小鼠抗体购自Dako(Cambridge，UK)。对小鼠β-肌动蛋白的多克隆兔抗体和甘油三酯测定试剂盒购自Sigma Aldrich(Dorset，UK)。Hybond A硝酸纤维素膜和增强化学发光(ECL)显影试剂盒来自Amersham Pharmacia Biotech(Bucks，UK)。针对NEFA的WAKO比色测定试剂盒购自Alpha Laboratories(Hampshire，UK)，小鼠胰岛素ELISA试剂盒购自DRG(Marburg，Germany)。使用Boots(Nottingham，UK)血浆葡萄糖试剂盒进行葡萄糖测量。
[0244] 重组ZAG的产生-将HEK293F细胞用表达载体pcDNA3.1中的全长人ZAG cDNA转染并且在37°C于空气中5%CO2的气氛下于FreeStyle培养基中维持。ZAG被分泌到培养-1基中，将其收集，并且在14天培养之后获得最高蛋白质水平(16μgml )。为了纯化ZAG，使用具有10kDa截断的Amicon Ultra-15离心滤器，将培养基(200ml)以700g离心15min以去除细胞，并且浓缩到1ml体积的无菌PBS。将浓缩物(约2mg蛋白质)加入到悬浮于
20ml10mM Tris，pH8.8中的2g DEAE纤维素中，并于4°C搅拌2h。DEAE纤维素结合ZAG并通过离心(1500g持续15min)沉淀，ZAG通过与含有0.3M NaCl的20ml10mM Tris，pH8.8于4°C搅拌30min而洗脱。洗涤洗脱液并使用Amicon离心滤器将其在无菌PBS中浓缩到体积1ml。如用LAL Pyrogent单个测试试剂盒(Lonza，Bucks，UK)所测定，纯化的ZAG无内毒素。
20ml10mM Tris，pH8.8中的2g DEAE纤维素中，并于4°C搅拌2h。DEAE纤维素结合ZAG并通过离心(1500g持续15min)沉淀，ZAG通过与含有0.3M NaCl的20ml10mM Tris，pH8.8于4°C搅拌30min而洗脱。洗涤洗脱液并使用Amicon离心滤器将其在无菌PBS中浓缩到体积1ml。如用LAL Pyrogent单个测试试剂盒(Lonza，Bucks，UK)所测定，纯化的ZAG无内毒素。
[0245] 细胞培养和ZAG的纯化。通过在含有1.5mgml-1胶原酶和4%牛血清白蛋白的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中在如先前所描述的95%氧:5%CO2的气氛下于37°C温育2h而从切碎的脂肪沉积中制备白色脂肪细胞的单细胞悬液。为了时程研究，将脂肪细胞以
5 -1
10 个细胞ml 的浓度悬浮在含有10%胎牛血清的DMEM中，并且于37°C保持在空气中
5 -1
10%CO2的气氛下。将用含有人ZAG的质粒转染的人293细胞以10 个细胞ml 的浓度接种到FreeStyle培养基中并且在37°C于空气在5%CO2的气氛下维持。14天的培养之后获得-1
最高蛋白质水平(16μgml )。随后使用具有10kDa截断的Amicon Ultra-15离心滤器，将培养基(200ml)以700g离心15min以去除细胞，并且浓缩到1ml体积的无菌PBS。测量样品(约2mg)的蛋白质浓度之后，将其加入到悬浮于20ml的10mM Tris，pH8.8的2g DEAE纤维素中，于4°C搅拌2h。带有负电荷的ZAG结合到DEAE纤维素，将其通过离心(1500g持续15min)沉淀，并通过与含有0.3M NaCl的20ml10mM Tris，pH8.8于4°C搅拌30min而洗脱。洗涤洗脱液并使用Amicon离心滤器将其在无菌PBS中浓缩到1ml的体积。
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10 个细胞ml 的浓度悬浮在含有10%胎牛血清的DMEM中，并且于37°C保持在空气中
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10%CO2的气氛下。将用含有人ZAG的质粒转染的人293细胞以10 个细胞ml 的浓度接种到FreeStyle培养基中并且在37°C于空气在5%CO2的气氛下维持。14天的培养之后获得-1
最高蛋白质水平(16μgml )。随后使用具有10kDa截断的Amicon Ultra-15离心滤器，将培养基(200ml)以700g离心15min以去除细胞，并且浓缩到1ml体积的无菌PBS。测量样品(约2mg)的蛋白质浓度之后，将其加入到悬浮于20ml的10mM Tris，pH8.8的2g DEAE纤维素中，于4°C搅拌2h。带有负电荷的ZAG结合到DEAE纤维素，将其通过离心(1500g持续15min)沉淀，并通过与含有0.3M NaCl的20ml10mM Tris，pH8.8于4°C搅拌30min而洗脱。洗涤洗脱液并使用Amicon离心滤器将其在无菌PBS中浓缩到1ml的体积。
[0246] 动物-小鼠。在本研究中使用来自在阿斯顿大学(Aston University)保持的群体的纯合的肥胖(ob/ob)小鼠。先前已描述了Aston ob/ob小鼠的出身和特性。将雄性小鼠(20-21周龄，重量90-100g)分组成每笼三只，处于22±2°C有空调的房间，具有12h-光照:12h-黑暗循环，并且饲喂大鼠和小鼠繁育饮食(Special Diet Services，Witham，UK)和随意饮用自来水。通过i.v.施用动物PBS(100μl)中的ZAG(35μg)，b.d.，并且每天监测体重、食物和水摄入量。对照小鼠只接受PBS。通过使用直肠温度计(RS Components，Northants，UK)每天测量体温。所有的动物实验都依据U.K.Animals(Scientific Procedures)Act1986进行。施用ZAG之后未观察到不良作用。
[0247] 动物-大鼠。将重540±82.5g、成熟的雄性Wistar大鼠(一岁大，来自我们自己的群体)单个居住并用PBS(100μl)中的ZAG(50μg/100g体重)或用PBS(100μl)作为对照每天i.v处理一次。每天测量食物和水的摄入和体重。让动物自由饮食(Special Diet Services，Essex，UK)和随意饮水。动物实验在British Home Office强加的福利条件下进行。10天处理之后，终止动物并测定身体组成。将动物加热到80-90°C持续7天直到达到恒定的重量。然后根据湿重和干重的差异测定含水量。如Lundholm等(14)所描述的，使用氯仿:甲醇(1:1)、乙醇/丙酮(1:1)和二乙醚(每次120ml)的顺序从干的动物尸体提取脂类。将溶剂蒸发并且将脂肪称重。将无脂肪的尸体质量计算为尸体的最初重量与水和脂肪的重量之间的差异。
[0248] 脂肪分解测定。将待测定样品与105至2×105个脂肪细胞在1ml pH7.2的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中温育2h。用Wieland的方法(Wieland,O.Glycerol UV method.引自Methods of Enzymatic Analysis(Bergmeyer,H.U.编 著)(Academic Press,London,UK,第1404-1409,1974年))酶法测定释放的甘油的浓度。分析只含有脂肪5
细胞的对照样品以测定自然的甘油释放。将活性表示为μmol释放的甘油/10 个脂肪细胞/2h。
细胞的对照样品以测定自然的甘油释放。将活性表示为μmol释放的甘油/10 个脂肪细胞/2h。
[0249] 血清代谢物测定。使用Wako-ASC-ACOD试剂盒(Wako Chemical GmbH，Neuss，Germany)测定非酯化的脂肪酸(NEFA)。使用甘油三酯试剂盒(Sigma ChemicalCo.,Poole,United Kingdom)测定甘油三酯，并且通过定量酶测定试剂盒(Sigma)测定
3-羟基丁酸盐。使用葡萄糖分析仪(Beckman，Irvine，Calif.)测量葡萄糖，并且使用如Academic Press，London(1974)出版的“Methods of Enzymatic Analysis”(Bergmeyer,H.U.编著)第3卷,第1404-1409页中描述的Wieland方法，以酶方式测定甘油。
3-羟基丁酸盐。使用葡萄糖分析仪(Beckman，Irvine，Calif.)测量葡萄糖，并且使用如Academic Press，London(1974)出版的“Methods of Enzymatic Analysis”(Bergmeyer,H.U.编著)第3卷,第1404-1409页中描述的Wieland方法，以酶方式测定甘油。
[0250] 小鼠脂肪细胞质膜的分离。在典型的操作中，除了在250mM蔗糖、2mM乙二醇双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'(EGTA)、10mM Tris-HCl(pH7.4)中洗涤细胞之外，如上文所参考，从小鼠附睾脂肪垫分离白色脂肪细胞。将脂肪细胞再悬浮在20ml上述缓冲液中并通过用Swinny滤器抽吸至少10次而匀化。然后将细胞匀浆以300g离心5min，从表面去除脂肪饼并将剩余的沉淀物和下层漂浮物转移至干净的管中。将它们在4°C以30,000g离心TM1h，并且将形成的膜沉淀物再悬浮于蔗糖缓冲液(200至400μl)中。将质膜在PERCOLL胶态二氧化硅颗粒的自形成梯度上与其它的细胞器膜分离。组分是250mM蔗糖、2mMEGTA、TM
10mM Tris-HCl，pH7.4；PERCOLL ；和2M蔗糖、8mMEGTA、80mM Tris-HCl，pH7.4，与膜悬液以32:7:1的比混合在一起(总体积8ml)。将该混合物于4°C以10,000g离心30min。将梯度分成0.75ml的部分，测定每部分琥珀酸脱氢酶、NADH-细胞色素c还原酶、乳酸脱氢酶和5′-核苷酸酶的存在以定位质膜部分。将膜部分再悬浮于150mM NaCl、1mM EGTA、10mM Tris-HCl，pH7.4中并于4°C以10,000g离心2min。将该过程重复两次。然后将洗过的质膜在10mM Tris-HCl，pH7.4、250mM蔗糖、2mM EGTA和4μM苯甲基磺酰氟(PMSF)中以
1-2mg/ml稀释，在液氮中速冻并储存在-70°C直到使用。
10mM Tris-HCl，pH7.4；PERCOLL ；和2M蔗糖、8mMEGTA、80mM Tris-HCl，pH7.4，与膜悬液以32:7:1的比混合在一起(总体积8ml)。将该混合物于4°C以10,000g离心30min。将梯度分成0.75ml的部分，测定每部分琥珀酸脱氢酶、NADH-细胞色素c还原酶、乳酸脱氢酶和5′-核苷酸酶的存在以定位质膜部分。将膜部分再悬浮于150mM NaCl、1mM EGTA、10mM Tris-HCl，pH7.4中并于4°C以10,000g离心2min。将该过程重复两次。然后将洗过的质膜在10mM Tris-HCl，pH7.4、250mM蔗糖、2mM EGTA和4μM苯甲基磺酰氟(PMSF)中以
1-2mg/ml稀释，在液氮中速冻并储存在-70°C直到使用。
[0251] 大鼠脂肪细胞中的脂肪分解活性-如(Beck SA等,Production of lipolytic and proteolytic factors by a murine tumor-producing cachexia in the host.Cancer Res47：5919-5923,1987)所描述，使用胶原酶消化从雄性Wistar大鼠(400g)精细切碎的附睾脂肪组织制备白色脂肪细胞。通过在1ml pH7.2的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中温5 5
育10-2×10 脂肪细胞2h测定脂肪分解活性，通过测量释放的甘油来测定脂解作用的程度(Wieland,O.Glycerol UV method.引自Methods of Enzymatic Analysis(Bergmeyer,HU编著)(Academic Press,London,UK,第1404-1409页,1974))。通过单独温育脂肪细胞测
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量自然的甘油释放。将脂肪分解活性表示为μmol释放的甘油/10 脂肪细胞/2h。
育10-2×10 脂肪细胞2h测定脂肪分解活性，通过测量释放的甘油来测定脂解作用的程度(Wieland,O.Glycerol UV method.引自Methods of Enzymatic Analysis(Bergmeyer,HU编著)(Academic Press,London,UK,第1404-1409页,1974))。通过单独温育脂肪细胞测
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量自然的甘油释放。将脂肪分解活性表示为μmol释放的甘油/10 脂肪细胞/2h。
[0252] 凝胶电泳。根据Laemmli的方法制备凝胶，该凝胶通常由5%浓缩胶和15%SDS-PAGE分离胶(变性或还原条件)或10%SDS-PAGE分离胶(非变性或非还原条件)组成。将样品以1-5μg/泳道加样。通过用考马斯亮蓝R-250或银染色使带可视化。通过在0.0625M Tris-HCl，pH6.8、10%甘油、1%SDS、0.01%溴酚蓝和5%2-巯基乙醇中于100°C加热5min制备用于还原条件的样品。
[0253] 葡萄糖摄取进脂肪细胞。将分离的脂肪细胞(5x104)在1ml pH7.2的14
Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(KRBS)中洗涤两次，并进一步在含有18.5MBq2-[1- C]脱氧-D-葡萄糖和非放射的2-脱氧-D-葡萄糖的0.5ml KRBS中在室温温育10min至0.1mM的终浓度。通过加入1ml冰冷的无葡萄糖的KRBS终止摄取，将细胞用1ml KRBS洗三次，通过加入0.5ml1M NaOH而裂解，在用液体闪烁计数测定放射性之前将其放置于室温至少1h。
Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(KRBS)中洗涤两次，并进一步在含有18.5MBq2-[1- C]脱氧-D-葡萄糖和非放射的2-脱氧-D-葡萄糖的0.5ml KRBS中在室温温育10min至0.1mM的终浓度。通过加入1ml冰冷的无葡萄糖的KRBS终止摄取，将细胞用1ml KRBS洗三次，通过加入0.5ml1M NaOH而裂解，在用液体闪烁计数测定放射性之前将其放置于室温至少1h。
[0254] 葡萄糖摄取进腓肠肌-将腓肠肌在Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液中于37°C14
温育45min，然后在含有185M Bq2-[1- C]脱氧-D-葡萄糖和非放射的2-脱氧-D-葡萄糖的5ml Krebs-Henseleit缓冲液中再温育10min至0.1mM的终浓度。然后将肌肉取出并在
0.9%NaCl中洗5min，之后在0.5ml1M NaOH中溶解并用液体闪烁计数测定放射性。
温育45min，然后在含有185M Bq2-[1- C]脱氧-D-葡萄糖和非放射的2-脱氧-D-葡萄糖的5ml Krebs-Henseleit缓冲液中再温育10min至0.1mM的终浓度。然后将肌肉取出并在
0.9%NaCl中洗5min，之后在0.5ml1M NaOH中溶解并用液体闪烁计数测定放射性。
[0255] 葡萄糖摄取进比目鱼肌。将比目鱼肌在Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液中于14
37°C温育45min，然后在含有185M Bq2-[1- C]脱氧-D-葡萄糖和非放射的2-脱氧-D-葡萄糖的5ml Krebs-Henseleit缓冲液中再温育10min至0.1mM的终浓度。然后将肌肉取出并在0.9%NaCl中洗5min，之后在0.5ml1M NaOH中溶解并用液体闪烁计数法测定放射性。
37°C温育45min，然后在含有185M Bq2-[1- C]脱氧-D-葡萄糖和非放射的2-脱氧-D-葡萄糖的5ml Krebs-Henseleit缓冲液中再温育10min至0.1mM的终浓度。然后将肌肉取出并在0.9%NaCl中洗5min，之后在0.5ml1M NaOH中溶解并用液体闪烁计数法测定放射性。
[0256] 肌肉中蛋白质合成和降解。先前已描述了测定肌肉中蛋白质合成和降解 的 方 法 (Smith，K.L. 和 Tisdale,M.J.Increased protein degradation and decreased protein synthesis in skeletal muscle during cancer cachexia.Br.J.Cancer67,680-685(1993))。使用结扎线切除腓肠肌并将其在缺少酚红的RPMI1640培养基中于37°C温育30min，并用O2:CO2(19:1)饱和，并且然后用PBS洗涤。用2h时间
3
通过将L-[2,6-H]苯丙氨酸(640MBq)掺入酸不溶性物质中测量蛋白质合成，在所述时间中将肌肉在没有酚红的RPMI/640培养基中于37°C温育并且用O2:CO2(19:1)饱和。将肌肉然后在非放射性培养基中漂洗、吸干并且在2%高氯酸中均化。通过用酸溶解的放射性的量除以蛋白质结合的放射性的量来计算蛋白质合成速度。蛋白质降解通过2h时间内在3ml pH7.4、含有5mM葡萄糖和0.5mM放线酮的氧合Krebs-Henseleit缓冲液中从腓肠肌释放酪氨酸而测定。
3
通过将L-[2,6-H]苯丙氨酸(640MBq)掺入酸不溶性物质中测量蛋白质合成，在所述时间中将肌肉在没有酚红的RPMI/640培养基中于37°C温育并且用O2:CO2(19:1)饱和。将肌肉然后在非放射性培养基中漂洗、吸干并且在2%高氯酸中均化。通过用酸溶解的放射性的量除以蛋白质结合的放射性的量来计算蛋白质合成速度。蛋白质降解通过2h时间内在3ml pH7.4、含有5mM葡萄糖和0.5mM放线酮的氧合Krebs-Henseleit缓冲液中从腓肠肌释放酪氨酸而测定。
[0257] 蛋白酶体和半胱天冬酶活性的测量。如先前针对肌管所描述，通过测量7-酰氨基-4-甲基香豆素(AMC)在360nm的激发波长和460nm的发射波长从荧光底物N-琥珀酰Lys Lys Val Tyr.AMC(SEQ ID NO:2)的释放而经荧光测量方法测定蛋白酶体的‘糜蛋白酶样’活性(Whitehouse,A.S.和Tisdale,M.J。泛素-蛋白酶体途径在鼠肌管中通过蛋白水解诱导因子(PIF)表达的增加与转录因子NF-κB的活化有关。Br.J.Cancer89,1116-1122(2003))。将腓肠肌在20mM Tris，pH7.5，2mMATP、5mM MgCl2和
50mM DTT于4°C匀化、超声处理并于4°C以18,000g离心10min以沉淀不溶解的物质，将所得的上清液用于在存在或缺少蛋白酶体抑制剂乳胞素(10μM)时测量‘糜蛋白酶样’酶活性。只有乳胞素可抑制的活性被认为是真正的蛋白酶体活性。存在或缺少半胱天冬酶-3(AcAspGluValAsp-CHO)(SEQ ID NO:5)或半胱天冬酶-8(Ile Glu Phe Thr Asp-CHO)(SEQ ID NO:6)抑制剂(100μM)的情况下，使用来自上面的上清液(50μg蛋白质)和半胱天冬酶-3或半胱天冬酶-8底物(10μM)于37°C持续1h，通过AMC从AcAsp.Gly.Val.Asp.AMC(SEQ ID NO:3)的释放测定半胱天冬酶-3的活性，通过7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)从特异性底物Z-Ile Glu Phe Thr Asp-AFC(SEQ ID NO:4)的释放测定半胱天冬酶-8的活性。如上测定由于AFC的荧光的增加，而用400nm的激发波长和505nm的发射波长测量由于AFC的荧光的增加。缺少或存在半胱天冬酶抑制剂时值的差异是活性的量度。
50mM DTT于4°C匀化、超声处理并于4°C以18,000g离心10min以沉淀不溶解的物质，将所得的上清液用于在存在或缺少蛋白酶体抑制剂乳胞素(10μM)时测量‘糜蛋白酶样’酶活性。只有乳胞素可抑制的活性被认为是真正的蛋白酶体活性。存在或缺少半胱天冬酶-3(AcAspGluValAsp-CHO)(SEQ ID NO:5)或半胱天冬酶-8(Ile Glu Phe Thr Asp-CHO)(SEQ ID NO:6)抑制剂(100μM)的情况下，使用来自上面的上清液(50μg蛋白质)和半胱天冬酶-3或半胱天冬酶-8底物(10μM)于37°C持续1h，通过AMC从AcAsp.Gly.Val.Asp.AMC(SEQ ID NO:3)的释放测定半胱天冬酶-3的活性，通过7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)从特异性底物Z-Ile Glu Phe Thr Asp-AFC(SEQ ID NO:4)的释放测定半胱天冬酶-8的活性。如上测定由于AFC的荧光的增加，而用400nm的激发波长和505nm的发射波长测量由于AFC的荧光的增加。缺少或存在半胱天冬酶抑制剂时值的差异是活性的量度。
[0258] 蛋白质印迹分析。将新切除的腓肠肌在PBS中洗涤并在PHOSPHOSAFETM提取剂中于室温裂解5min，之后于4°C声处理。通过在4°C以18,000g离心5min使裂解液澄清，并且将胞质蛋白(5μg)的样品在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上于180V解析大约1h。之后是转移至0.45μM硝酸纤维素膜，后者然后用pH7.5、Tris-缓冲盐水中的5%Marvel于4°C封闭过夜。第一抗体和第二抗体均以1:1000的稀释度使用，除了抗肌球蛋白(1:250)之外。在室温温育1h，并且通过ECL显影。用密度计扫描印迹以定量差别。
[0259] 将从用ZAG或PBS处理5天的大鼠上切除的附睾WAT、BAT和腓肠肌的样品在0.25M蔗糖、1mM HEPES，pH7.0和0.2M EDTA中匀化，并且然后以4,500rpm离心10min。将胞质蛋白(10μg)的样品在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上解析，然后将其转移至0.45μM硝酸纤维素膜，将该膜用pH7.5、Tris-缓冲盐水中的5%Marvel于4°C封闭过夜，以后的四个15min用PBS中0.1%Tween洗涤，与第二抗体在室温温育1h。通过ECL显影。
[0260] 统计分析。将结果显示为至少三次重复实验的均数值±SEM。通过单向方差分析(ANOVA)，随后通过Tukey-Kramer多重比较检验确定组间均数的差异。小于0.05的P值认为是显著的。
[0261] 结果-小鼠。ZAG的纯化导致大于95%纯的产物(图1A)，通过免疫印迹法证实为ZAG(图1B)。ZAG在附睾脂肪细胞中刺激脂解作用(图1D)但是在来自皮下和内脏沉积物的脂肪细胞中脂肪分解作用降低很多，尽管它超过基础水平显著地升高(图1E)。任何脂肪细胞组中，在异丙肾上腺素和ZAG之间，没有显著的脂解作用刺激程度差异，尽管在摩尔基础上ZAG较异丙肾上腺素更有效地诱导脂解作用。在1F图中显示ZAG对5天时间范围内ob/ob小鼠体重的影响。虽然对照动物保持重量稳定，但是用ZAG处理的动物显示渐进性体重减轻，从而在5天之后，组之间存在3.5g重量差异，尽管实验过程中食物(PBS32±3.1g；ZAG30±2.5g)和水(PBS140±8.2ml；ZAG135±3.2ml)摄入相等。ZAG施用4天之后有
0.4°C的显著体温上升(图1G)，表示基础代谢率的增加。血浆代谢水平的测量提示ZAG处理的动物中代谢底物利用增加(表1)。因此在ZAG处理的动物中血浆葡萄糖、甘油三酯(TG)和非酯化脂肪酸(NEFA)显著降低，尽管存在表示增加的脂解作用的增加的甘油浓度。
存在血浆胰岛素水平36%的降低，提示ZAG在减少糖尿病状态方面是有效的。图1C中显示各种组织中的ZAGmRNA水平。
0.4°C的显著体温上升(图1G)，表示基础代谢率的增加。血浆代谢水平的测量提示ZAG处理的动物中代谢底物利用增加(表1)。因此在ZAG处理的动物中血浆葡萄糖、甘油三酯(TG)和非酯化脂肪酸(NEFA)显著降低，尽管存在表示增加的脂解作用的增加的甘油浓度。
存在血浆胰岛素水平36%的降低，提示ZAG在减少糖尿病状态方面是有效的。图1C中显示各种组织中的ZAGmRNA水平。
[0262] 表1-用ZAG处理120h的ob/ob小鼠中的血浆代谢物和胰岛素水平
[0263]
[0264] 为了研究这一点，在ZAG施用3天之后，对饲养的动物进行葡萄糖耐量试验(图2A)。虽然PBS对照中血液葡萄糖水平显著地升高，但是在ZAG处理的动物中只有小的升高，在整个研究过程中其保持显著地低于对照组。此外在研究开始时ZAG处理的动物中血浆胰岛素水平显著地较低，并在60min的观察期间保持这样(图2B)。缺少胰岛素时ZAG施用增加葡萄糖摄取进附睾、内脏和皮下的脂肪细胞，并且存在低(1nM)胰岛素时也增加葡萄糖摄取进附睾和内脏脂肪细胞(图2C)。在ZAG处理的动物中，缺少或存在胰岛素(100nM)时葡萄糖摄取进腓肠肌也显著地增强(图2D)。ZAG处理的小鼠的腓肠肌中的葡萄糖摄取大于未治疗的动物中对胰岛素的反应。
[0265] ZAG施用还减弱高血糖对骨骼肌萎缩的影响。因此用ZAG处理的ob/ob小鼠显示腓肠肌和比目鱼肌湿重的显著增加(表1)。这与足底肌肉中蛋白质合成增加超过两倍(图3A)和蛋白质降解减少60%(图3B)相关。来自用ZAG处理的小鼠的腓肠肌显示降低的蛋白酶体‘糜蛋白酶样’酶活性(图3C)—这与非肥胖小鼠中存在的情况并无显著差异—和降低的20S蛋白酶体α-亚基(图3D)和p42(19S调节子的ATP酶亚基)(图3E)表达，这提示降低的泛素-蛋白酶体途径活性。ZAG处理的小鼠中肌球蛋白水平增加(图3F)，而肌动蛋白水平不改变(图3G)。此外，存在dsRNA-依赖性蛋白激酶(PKR)(图4A)和真核起始因子2α(eIF2α)(图4B)的磷酸化形式的水平降低，这已经显示引起由肿瘤分解代谢因子诱导的肌肉萎缩，和高水平的细胞外葡萄糖。该途径中的其它的酶，包括磷脂酶A2(PLA2)(图
4C)、p38促分裂原活化蛋白激酶(图4D)和半胱天冬酶-3和-8(图4E)，也在用ZAG处理的ob/ob小鼠的腓肠肌中减弱。这些改变与响应于ZAG的肌肉中分解代谢信号传导降低相当。
4C)、p38促分裂原活化蛋白激酶(图4D)和半胱天冬酶-3和-8(图4E)，也在用ZAG处理的ob/ob小鼠的腓肠肌中减弱。这些改变与响应于ZAG的肌肉中分解代谢信号传导降低相当。
[0266] ZAG而不是异丙肾上腺素，增加脂肪细胞中磷酸HSL的表达，这被细胞外信号调节14
激酶(ERK)抑制剂PD98059 完全地减弱。虽然ZAG增加附睾脂肪细胞中HSL的表达，但是不存在皮下或内脏脂肪细胞中的增加(图5B-5D)。在脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)的表达中观查到相似的情形(图5E-5G)。HSL和ATGL的表达与ERK的活性(磷酸)形式的表达相关(图5H-5J)。附睾脂肪细胞中HSL和ATGL的表达与响应于β3激动剂，BRL37344的增加的脂肪分解相关(图5K)。该结果提示，ZAG可以协同地与β3激动剂起作用。
激酶(ERK)抑制剂PD98059 完全地减弱。虽然ZAG增加附睾脂肪细胞中HSL的表达，但是不存在皮下或内脏脂肪细胞中的增加(图5B-5D)。在脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)的表达中观查到相似的情形(图5E-5G)。HSL和ATGL的表达与ERK的活性(磷酸)形式的表达相关(图5H-5J)。附睾脂肪细胞中HSL和ATGL的表达与响应于β3激动剂，BRL37344的增加的脂肪分解相关(图5K)。该结果提示，ZAG可以协同地与β3激动剂起作用。
[0267] 如先前所报道，ZAG施用增加其在脂肪组织中的表达(图6A)。ZAG表达保持升高，在缺少ZAG时在组织培养中持续另外3天(图6B)。缺少ZAG时在组织培养中脂肪细胞中的HSL表达也升高，持续3天(图6C)。ZAG的施用增加BAT(图6D)中的UCP1(图6D)和UCP3(图6E)以及骨骼肌(图6F)中UCP3的表达。增加的解偶联蛋白表达将期望如所观察的引导代谢底物形成热(图1G)。
[0268] 21天之后，观察ob/ob小鼠中血浆代谢水平(表2)，监测的参数示于表3中。观察到血液葡萄糖进一步下降(从2.03至15.2mM)和甘油升高，这似乎较大，因为对照较以前较低。与第5天相比，在第21天没有观察NEFA、TG或胰岛素改变(表1)。注意的是，显示血浆胰岛素下降的ZAG处理的动物的胰腺中有多很多的胰岛素，这不是由于较低的胰岛素产生(例如，对胰腺β细胞的毒素将发生)，而更是由于在ZAG处理的动物中需要较少的胰岛素来控制血液葡萄糖的事实。
[0269] 表2-在第21天用ZAG处理的ob/ob小鼠中的血浆代谢物和胰岛素水平
[0270]
[0271] 表3-在第21天用ZAG处理的ob/ob小鼠中监测的参数
[0272]参数 PBS ZAG p
开始重量 92.5±3.1 93.1±1.9
结束重量 89.9±1.3 83.95±2.2
食物(g) 135±6 145±4
水(ml) 268±15 259±20
BAT(g) 0.36±0.21 0.41±0.35
腓肠肌(g) 0.26±0.15 0.39±0.12 0.01
比目鱼肌(g) 0.15±0.06 0.18±0.07
开始重量 92.5±3.1 93.1±1.9
结束重量 89.9±1.3 83.95±2.2
食物(g) 135±6 145±4
水(ml) 268±15 259±20
BAT(g) 0.36±0.21 0.41±0.35
腓肠肌(g) 0.26±0.15 0.39±0.12 0.01
比目鱼肌(g) 0.15±0.06 0.18±0.07
[0273] 此外，四天内ob/ob小鼠的体温增加0.5°C至1°C(图1G)并刚好在它们丧失重量的最大值之前达到峰值38.1°C(图7)。这将与棕色脂肪组织的重量相关，该重量从对照中的0.33±0.12g增加到ZAG处理的动物中的0.52±0.08g(图7)。腓肠肌的重量也从0.2±0.05g增加到0.7±0.1g，而存在尿葡萄糖排泄的渐进降低(图8A和8B)。
[0274] 结果-大鼠。在图11中显示与异丙肾上腺素比较，人ZAG对大鼠附睾脂肪细胞的脂肪分解作用。ZAG在233和700nM之间的浓度产生甘油释放的剂量相关的增加，这种增加被抗-ZAG单克隆抗体减弱，从而显示作用的特异性。大鼠脂肪细胞中脂解作用的程度与先前在小鼠中报道的相似。如在小鼠中那样，ZAG的脂肪分解作用完全被β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂SR59230A减弱，提示ZAG的作用是通过β3-AR介导的。这些结果提示ZAG可以有效诱导大鼠脂肪减少。
[0275] 图12A中显示每天单次i.v.注射ZAG(50μg/100g b.w)对成熟雄性Wistar大鼠(540±83g)体重的影响。与施用相同体积的溶剂(PBS)的对照大鼠相比，施用ZAG的大鼠显示渐进性体重降低，这样10天之后，用PBS处理的大鼠显示体重增加13g，同时用ZAG处理的动物显示体重下降5g(表4)。研究过程期间，在两组之间不存在食物(ZAG：102±32g；PBS：98±25g)或水(ZAG：135±35ml；PBS：125±25ml)摄入量的差异，但是ZAG处理的动物显示一致的0.4°C体温升高，这在第一次施用ZAG的24h内是显著的(图12B)，表示提高的能量消耗。身体组成分析(表4)显示ZAG诱导的体重减轻是由于尸体脂肪的减少，这被瘦体重的显著增加部分地抵消。用ZAG处理的大鼠的血浆甘油浓度增加50%(表5)，表示增加的脂解作用，但非酯化脂肪酸(NEFA)的血浆水平降低55%，提示增加的利用。葡萄糖和甘油三酯的血浆水平也降低36-37%(表5)，也提示增加的利用。2-脱氧葡萄糖摄取进用ZAG处理10天的大鼠的附睾脂肪细胞中显著增加，这在存在胰岛素时增加(图12C)。然而，存在胰岛素时葡萄糖摄取进来自ZAG或PBS处理的动物的脂肪细胞中无显著差异(图
12C)。与PBS对照相比，葡萄糖摄取进用ZAG处理的大鼠的腓肠肌和BAT中有小的、非显著的增加，但是存在胰岛素时有摄取的显著增加(图12D)。这些结果提示血液葡萄糖的降低是由于BAT、WAT和骨骼肌的增加的利用，这得到所有三种组织中(图13)增加的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达的支持。
12C)。与PBS对照相比，葡萄糖摄取进用ZAG处理的大鼠的腓肠肌和BAT中有小的、非显著的增加，但是存在胰岛素时有摄取的显著增加(图12D)。这些结果提示血液葡萄糖的降低是由于BAT、WAT和骨骼肌的增加的利用，这得到所有三种组织中(图13)增加的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达的支持。
[0276] 表4-用PBS或ZAG处理之后雄性大鼠的身体组成
[0277]
[0278] 将与用PBS处理的动物的差异显示为a，p＜0.05或b，p＜0.01
[0279] 表5-用PBS或ZAG处理10天的大鼠中的血浆代谢物和胰岛素水平
[0280]代谢物 PBS ZAG
葡萄糖(mmol/l) 25.5±2.3 16.2±2.1c
甘油三酯(mmol/l) 1.75±0.01 1.1±0.09a
甘油(umol/l) 300±52 450±51c
NEFA(mEq/l) 0.58±0.008 0.26±0.06b
葡萄糖(mmol/l) 25.5±2.3 16.2±2.1c
甘油三酯(mmol/l) 1.75±0.01 1.1±0.09a
甘油(umol/l) 300±52 450±51c
NEFA(mEq/l) 0.58±0.008 0.26±0.06b
[0281] 将与用PBS处理的动物的差异显示为a，p＜0.05；b，p＜0.01或c，p＜0.001[0282] ZAG施用增加BAT和WAT中解偶联蛋白(UCP)-1和-3的表达几乎两倍(图13A和13B)，这将有助于增加的底物利用。在用ZAG处理的大鼠中，附睾脂肪组织中(图15)还有脂肪分解酶脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感性脂肪酶(HSL)的增加的表达，又是两倍的增加。ATGL主要引起三酰甘油分子中第一酯键的水解，形成二酰甘油，而由HSL将其转变成单酰甘油。ZAG表达在用ZAG处理10天的大鼠的骨骼肌(图16A)、WAT(图16B)和BAT(图16C)中也显著增加，显示外源性ZAG促进其自身在外周组织中产生。
[0283] 施用ZAG的大鼠腓肠肌中的α-亚基上有dsRNA-依赖性蛋白激酶(PKR)和真核起始因子2(eIF2)的磷酸化形式表达的显著降低，而总量不变(图17A和17B)。在施用ZAG的ob/ob小鼠中已观察到相似的变化(未公布的结果)，并与骨骼肌中蛋白质降解的降低和蛋白质合成的增加一致。
[0284] 实施例2
[0285] 锌-α2-糖蛋白的间隔施用
[0286] 观察到在ob/ob小鼠中长期每天施用ZAG导致体重减少的停止。就这一点而论，确定中断3-4天随后再输注ZAG导致连续的体重减轻和改善与高血糖相关的症状。
[0287] 尽管不想受理论束缚，但可以是受试者正接受太多的ZAG或如在TNF所看到的存在受体脱敏。每组中用2只小鼠进行试点研究以确定ZAG递送的最佳安排。在约3周中观察到从90g小鼠的8-10g体重减轻。
[0288] ZAG5天之后将脂肪细胞从小鼠中除去，在缺少ZAG的培养之后测量对异丙肾上腺素(iso)的反应性(图9)。在ZAG处理的小鼠中对iso的反应性较高，这持续另外4天(这是当ZAG和HSL的表达增加时)，然后在第5天下降(当表达不增加时)到PBS对照的值。
[0289] 实施例3
[0290] 锌-α2-糖蛋白减弱ob/ob小鼠中的肌肉萎缩
[0291] 该实施例显示这样的机制，通过该机制ZAG利用新研发的体外模型在ob/ob小鼠中减弱肌肉萎缩(Russell等,Exp.CellRes.315,16-25,2009)。这利用经历高浓度葡萄糖(10或25mM)的鼠肌管。如图18所示，高葡萄糖刺激蛋白质降解的增加(图18A)和蛋白质合成的降低(图18B)，这些作用都被ZAG(25μg/ml)完全地减弱。因此使用拮抗剂SR59230A确定ZAG的作用是否通过β3-AR介导。然而，SR化合物(即SR59230A)也可以充当β-激动剂，这似乎是它在这些实验中所做的。因此10和25mM葡萄糖诱导的蛋白质降解被ZAG和SR化合物减弱，这种组合是加合性而不是拮抗性的(图19)。对于蛋白质合成(图20)，SR化合物似乎与ZAG相似，没有相反的证据，而具有10mM葡萄糖，SR化合物引起蛋白质合成降低的增加。
[0292] 实施例4
[0293] 锌-α2-糖蛋白减少ROS形成
[0294] 已显示活性氧种类(ROS)的形成在高葡萄糖负荷诱导的蛋白质降解中是重要的。图21中的数据显示ZAG完全减弱葡萄糖产生的ROS的增加，与蛋白质降解的减少一致(图
18A)。高葡萄糖还诱导PKR的活化(磷酸化)(图22A)以及随后eIF2α的磷酸化(图
22B)，如ob/ob小鼠的骨骼肌中所见，这也可被ZAG减弱。这些结果提示，这种体外模型将适用于研究ZAG如何在分子水平影响肌肉质量。
18A)。高葡萄糖还诱导PKR的活化(磷酸化)(图22A)以及随后eIF2α的磷酸化(图
22B)，如ob/ob小鼠的骨骼肌中所见，这也可被ZAG减弱。这些结果提示，这种体外模型将适用于研究ZAG如何在分子水平影响肌肉质量。
[0295] 实施例5
[0296] 锌-α2-糖蛋白增加胰岛素耐受性
[0297] 胰岛素耐受性试验也在施用ZAG持续3天的ob/ob小鼠中进行(图23)。通过i.p.注射对动物施用两种剂量的胰岛素(10和20U/kg)，在下一个60min内测量血液葡萄糖。如可以见到(图23A)，用ZAG处理的动物比给予PBS的动物显示增加的胰岛素敏感性(10U/kg)。在较高的胰岛素浓度(20U/kg)，这种差异消失(图23B)。针对20U/kg+PBS的葡萄糖消失曲线与10U/kg+ZAG几乎相同，所以在该剂量水平ZAG减少对胰岛素的需要量50%，但是这能通过给予更多的胰岛素而克服。
[0298] 实施例6
[0299] 抗锌-α2-糖蛋白抗体减弱体重减少
[0300] 图26-29中所示的数据来自其中单独和基于每天与每天50μg的抗ZAG抗体组合时施用β3激动剂BRL37344的研究。在施用24小时内，与施用BRL37344的小鼠相比，施用抗体的小鼠显示显著的体重减少减弱。
[0301] 实施例7
[0302] 锌-α2-糖蛋白的5天施用
[0303] 进行一项5天研究，其中基于每天i.v.每天35μg施用ZAG持续5天。在实验结束时取出组织并且印迹，或用分离的脂肪细胞进行功能试验。如可以在图6A中见到，ZAG施用增加其在附睾(ep)、皮下(sc)和内脏(vis)脂肪中的表达约两倍。当制备ep脂肪细胞并将其保持在组织培养(RPMI1640+10%FCS)中时，ZAG表达维持另外3天，即使没将ZAG添加至培养基(图6B)。此外来自ZAG处理的小鼠的脂肪细胞显示对异丙肾上腺素(10μM)增加的反应，这也在缺少ZAG时在组织培养中保持4天(图9)。对异丙肾上腺素的增加的反应是由于ZAG引起的HSL的增加的表达，这也在缺少ZAG时在组织培养中保持4天(图6C)。这些结果显示当撤回ZAG时，ZAG的作用保持另外3天，因此不需要基于每天施用。实际上，如文讨论，过多ZAG更可能导致抵抗而不是反应增加。
[0304] 5天ZAG之后在ep脂肪细胞中只看到增加的HSL的表达(图5B-5D)，ATGL也如此(图5E-5G)。只在ep脂肪组织中有增加的pERK表达(图5H-5J)，pERK的抑制剂(PD9805910μM)减弱与ZAG温育3h的ep脂肪细胞中HSL表达的增加(图5A)。ZAG增加BAT(图6D和6E)和肌肉(图6F)中UCP1和UCP3的表达，这将解释体温增加和血清中TG和NEFA的降低，尽管脂解作用增加。
[0305] 实施例8
[0306] β-肾上腺素能受体在锌-α2-糖蛋白的抗肥胖症和抗糖尿病效果中的作用[0307] 本研究的目的是确定β-肾上腺素能受体(β-AR)是否在锌-α2-糖蛋白(ZAG)的抗肥胖症和抗糖尿病效果中发挥作用。这已经在用人β1-、β2-、β3-AR转染的CHO-K1细胞中和ob/ob小鼠中研究过。在用β3-AR转染的CHO-K1细胞中，刺激环状AMP产生的ZAG最低浓度是350nM，而对于用β2-AR转染的细胞，需要更高的浓度(580nM)，并且在用β1-AR转染的细胞中不存在环状AMP的增加。这与结合于β3-AR(46±4nM)和β2-AR(71±2nM)的Kd值相关，同时不存在与β1-AR的结合。摧毁其生物学活性的冻融ZAG消除与β2-和β3-AR的结合。用ZAG处理ob/ob小鼠增加β3-AR在腓肠肌中和在白色及棕色脂肪组织中的蛋白质表达，但是不影响β1-和β2-AR的表达。ZAG在降低体重及尿葡萄糖排泄、增加体温、在口服葡萄糖耐量试验中降低最大血浆葡萄糖及胰岛素水平和刺激葡萄糖转运入骨骼肌及脂肪组织方面的作用完全被非特异性β-AR拮抗剂普萘洛尔减弱。这些结果证明ZAG对ob/ob小鼠中体重和胰岛素敏感性的影响借助β-3AR或可能借助β2-AR展示出来。
[0308] 当被认为在癌症恶病质中造成脂肪组织丢失的脂类动员因子(LMF)的胰酶片段在氨基酸序列方面显示与ZAG相同时，首先认识到锌-α2-糖蛋白(ZAG)在脂类代谢中发挥作用。ZAG和LMF均显示是免疫学相同的，并且二者均在鼠脂肪细胞中以相同的浓度在GTP依赖性过程中通过活化腺苷酰环化酶刺激脂解作用达相同的量。初步研究提出ZAG源自肿瘤，因为启动恶病质的肿瘤显示高水平表达，而不引起恶病质的其他肿瘤显示无表达。稍后的研究显示ZAG也在正常组织中产生，包括肝脏、棕色脂肪组织(BAT)和白色脂肪组织(WAT)，从而可以将ZAG划归为脂肪因子。另外，在恶病质的小鼠和人中，发现ZAG mRNA在WAT中的表达分别增加10倍和2.7倍。在恶病质癌症患者中，ZAG mRNA显示与身体质量指数(BMI)负相关，但是与体重减少和血清甘油水平正相关。相反，WAT中的ZAG mRNA水平已经显示在肥胖症中下调并且与脂肪质量、BMI、血浆胰岛素和瘦蛋白负相关。用ZAG处理ob/ob小鼠减少体重和脂肪质量并且改善胰岛素抗性参数，包括降低葡萄糖、胰岛素和非酯化脂肪酸(NEFA)的血浆水平、改善胰岛素敏感性并且增加肌肉质量。已经发现血清ZAG水平在饲喂高脂肪膳食的小鼠中比饲喂正常膳食的那些小鼠以及肥胖的人和小鼠中显著更低。尽管ZAG在小鼠中过量表达降低体重和附睾脂肪重量，但是ZAG敲除动物显示增加的体重，尤其在饲喂高脂肪膳食时。这些结果表明，ZAG象瘦蛋白那样与脂肪质量密切相关。
然而，尽管瘦蛋白与脂肪质量正相关，但ZAG是负相关的。
然而，尽管瘦蛋白与脂肪质量正相关，但ZAG是负相关的。
[0309] ZAG的脂肪分解作用显示由β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂SR59230A减弱，而LMF已经显示通过高亲和力结合位点(Kd78±4.5nM)与β3-AR结合。这些结果表明，由ZAG介导的脂解作用借助β3-AR表现出来。这项研究检验了β3-AR在ZAG作用中的角色，以及确定与β1-和β2-AR结合和β-AR在ZAG的抗肥胖和抗糖尿病效果中的作用。
[0310] FCS(胎 牛 血 清)来 自Biosera(Sussex,UK)，而 DMEM(Dulbecco’smodified Eagle培养基)来自PAA(Somerset,UK)并且Freestyle培养基和Superscript II逆14
转录酶购自Invitrogen(Paisley，UK)。2-[1- C]脱氧-D-葡萄糖(sp.act.1.85GBq -1 125
mmol )购 自American Radiolabeled Chemicals(Cardiff，UK)。Na[ I](比 放 射 性-1
活度>17Ci mg )购自Perkin Elmer Limited。针对β3-AR的鸡多克隆抗体和针
对β1-AR和β2-AR的兔多克隆抗体购自Abcam(Cambridge,UK)，并且过氧化物酶偶联的山羊抗鸡抗体来自Santa Cruz(USA)。针对UCP1和UCP3的多克隆兔抗体来自Calbiochem(via Merck Chemicals,Nottingham,UK)。过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体来自Dako(Cambridge,UK)。针对小鼠β-肌动蛋白的多克隆兔抗体、Tri-Reagent和普萘洛尔来自SigmaAldrich(Dorset，UK)。Hybond A硝酸纤维素膜来自GE Healthcare(Bucks,UK)。
参数环状AMP分析试剂盒购自New England Biolabs(Hitchin,UK)。碘珠和增强型化学发光(ECL)显影试剂盒购自Thermo Scientific(Northumberland,UK)。小鼠胰岛素ELISA试剂盒购自DRG(Marburg,Germany)并且使用Boots(Nottingham,UK)血浆葡萄糖试剂盒进行葡萄糖测量。用于逆转录和Easy-A单管RT.PCR系统的引物来自Agilent Technologies(Cheshire,UK)。
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[0311] 动物。繁育具有71g平均重量的肥胖(ob/ob)高血糖小鼠。这些动物的背景先前已经描述(Bailey CJ等Influence of genetic background and age on the expression of the obese hyperglycaemic syndrome in Aston ob/ob mice.Int J Obes6:11-21,1982)，并且它们比C57BL/6Job/ob小鼠显示更严重形式的糖尿病。将雄性小鼠(约20周龄)分组成每笼三只，并且在22±2°C在有空调的房间饲养，随意采食大鼠和小鼠繁育膳食(Special Diet Services，Witham，UK)和自来水。在伴有或不伴有普萘-1洛尔(40mgkg ，po，每天)的情况下，每天对小鼠施用ZAG(50μg，i.v.在100μl PBS中)或PBS，并且测定体重和食物及水摄入量以及尿葡萄糖排泄量及体温，通过使用直肠温度计(RSComponents,Northants,UK)测定。在第3日进行葡萄糖耐量试验。将葡萄糖(100μl-1
体积中的1gkg )口服地施用于已经禁食12h的动物。将血样在葡萄糖施用之后15、30、60和120min从尾静脉取出并且用于葡萄糖和胰岛素的测量。在实验结束时，通过颈椎脱臼法处死动物，取出组织并且在液氮中快速冷冻并且维持在-80°C。
体积中的1gkg )口服地施用于已经禁食12h的动物。将血样在葡萄糖施用之后15、30、60和120min从尾静脉取出并且用于葡萄糖和胰岛素的测量。在实验结束时，通过颈椎脱臼法处死动物，取出组织并且在液氮中快速冷冻并且维持在-80°C。
[0312] 重组人ZAG的产生。将已经用含有人ZAG的pcDNA3.1转染的人HEK293F细胞在-1空气中在5%CO2的气氛下于含有新霉素(50μgml )的Freestyle培养基中维持。在2周生长后，通过离心除去细胞(700g持续15min)，并且使用具有M.W.截断10kDa的Amicon Ultra-15离心滤器，将培养基浓缩成1ml体积的无菌PBS。由于ZAG具有高电负性，所以通过与DEAE纤维素结合，将ZAG如所描述那样纯化(Russell ST和Tisdale MJ,Antidiabetic properties of zinc-α2-glycoprotein in ob/ob mice.Endocrinol151:948-957,2010)并且用0.3MNaCl洗脱。由这种方法产生的ZAG是大于95%纯的并且不含内毒素，如用LAL Pyrogent单个测试试剂盒(Lonza)所测定。纯化的ZAG在PBS中贮存在4°C。
[0313] ZAG的[125I]标记。将已经洗涤和干燥的一粒碘珠与Na[125I](每100μg蛋白质1mCi)在PBS中温育5min，随后添加ZAG(100μg蛋白质)并且停留另外15min。通过取出
125
碘珠终止反应，同时使用以0.1MNaI洗脱的Sephadex G25柱除去游离的Na[ I]。使用具
125 125
有Mr10,000滤器截断的Microcon微量浓缩器，将[ I]ZAG针对PBS浓缩。[ I]ZAG的比
1
活度是8Cimg蛋白质 。
125
碘珠终止反应，同时使用以0.1MNaI洗脱的Sephadex G25柱除去游离的Na[ I]。使用具
125 125
有Mr10,000滤器截断的Microcon微量浓缩器，将[ I]ZAG针对PBS浓缩。[ I]ZAG的比
1
活度是8Cimg蛋白质 。
[0314] 结合研究和环状AMP测定。用人β1-和β2-AR转染的CHO-K1细胞从英国诺丁汉姆大学获得，而用β3-AR转染的CHOK1细胞从Astra Zeneca,Macclesfield,Cheshire,UK获得。基因表达处于潮霉素控制下，与β-gal报道分子构建一起，针对G418抗性进行选-1 -1择。将它们在补充有2mM谷氨酰胺、潮霉素B(50mgml )、G418(200mgml )和10%FCS的DMEM中于空气中在10%CO2的气氛下维持。为测定激动剂对环状AMP产生的影响，在含有1ml营养培养基的24孔平板中培育细胞。将ZAG或异丙肾上腺素以图51中所示的浓度添加至细胞并且温育继续30min。将培养基移去并替换为0.5ml的20mM HEPES，pH7.5，5mM EDTA和0.1mM异丁基甲基黄嘌呤，并且将平板在沸水浴上加热5min并且在冰上冷却10min。用ELISA测定环状AMP的浓度。
[0315] 为进行结合研究，在含有0.5M MgCl2的2mM Tris HCl,pH7.5中声处理细胞，并且通过在4°C离心(13,000g；15min)使粗制总膜沉淀。在37°C通过将膜(500μg蛋白125
质)在含有0.5mM MgCl2的0.4ml50mM Tris HCl,pH7.5中伴有多种浓度的[ I]ZAG(3,000至15,000cpm)，在缺少或存在100μM未标记的ZAG时温育60min，实施结合研究。随后通过13000g离心20min使膜沉淀，移去上清液并且使用Packard Corbra型号5005Auto-γ
125
计数器定量与沉淀结合的[ I]。使用非线性回归分析分析结合作用(GraphPad Prism,版本5.04)。将特异性结合视为由非放射性ZAG替换的标记ZAG的量。
质)在含有0.5mM MgCl2的0.4ml50mM Tris HCl,pH7.5中伴有多种浓度的[ I]ZAG(3,000至15,000cpm)，在缺少或存在100μM未标记的ZAG时温育60min，实施结合研究。随后通过13000g离心20min使膜沉淀，移去上清液并且使用Packard Corbra型号5005Auto-γ
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计数器定量与沉淀结合的[ I]。使用非线性回归分析分析结合作用(GraphPad Prism,版本5.04)。将特异性结合视为由非放射性ZAG替换的标记ZAG的量。
[0316] RNA分离和RT-PCR。对3种CHO-K1细胞中β1-、β2-和β3-AR的mRNA转录物的定量基于已经描述的方法学(Moniotte S等,Real-time RT-PCR for the detection of beta-adrenoceptor messanger RNAs in small human endomyocardial biopsies.J Mol Cell Cardiol33:2121-2133,2001)。总RNA用Tri试剂提取并且通过分光光度法定量，连同2000pmol随机六聚物作为引物，使用Superscript II逆转录酶在43℃，将800±34ng总RNA逆转录50min。选择探针序列以获得低于配对引物对大约10°C的TmS。使用Easy-A单管RT.PCR系统，根据制造商的说明书实施PCR。PCR条件包括变性95°C10min，退火步骤42-65°C和延伸步骤68°C2min以及终末延伸68°C10min。存在40个循环扩增。使用Stratagenes MxPro,QPCR软件v3.00，通过Δ-CT法测定β-ARmRNA的表达。
[0317] 蛋白质印迹分析。WAT、BAT、心脏和腓肠肌融化、在PBS中洗涤并在PhosphsafeTM提取试剂中于室温裂解5min，之后于4°C声处理。将通过在4°C以18,000g离心5min所形成的上清液用于蛋白质印迹。将胞质蛋白(5μg用于UCP，并且20μg用于β-AR)的样品在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上通过在180V电泳解析约1小时，然后将其转移到0.45μM硝酸纤维素膜上，所述硝酸纤维素膜已经用pH7.5、Tris-缓冲盐水中的5%(w/v)脱脂乳(Marvel)于4°C封闭过夜。在添加第一抗体之前，将膜在0.1%Tween20-缓冲盐水中洗涤15min。第一抗体和第二抗体均以1:1000的稀释度使用。在室温温育1h，并且通过ECL显影。用密度计扫描印迹以定量差别。
[0318] 葡萄糖进入脂肪组织和骨骼肌的摄入量。如先前所述那样测定2-[1-14C]脱氧-D-葡萄糖(2-DG)进入新鲜分离的附睾脂肪细胞和腓肠肌的摄入量(Russell ST和Tisdale MJ,Antidiabetic properties of zinc-α2-glycoprotein in ob/ob mice.Endocrinol151:948-957,2010)。
[0319] 统计分析。将结果显示为至少三次重复实验的均数值±SEM。通过单向方差分析(ANOVA)，随后通过Tukey-Kramer多重比较检验确定组间均数的差异。小于0.05的p值认为是显著的。
[0320] 图51中显示人ZAG对CHO细胞中环状AMP生产的影响，所述CHO细胞用人β1、β2和β3-AR转染。在低浓度(直至460nM)，仅在用β3-AR转染的细胞中存在环状AMP产生的特异性刺激(图51A)。然而，在580nM，用β2-AR转染的CHO细胞中也存在环状AMP水平的显著增加，虽然变化的幅度小于用β3-AR转染的细胞中的幅度。在ZAG的任何浓度，用β1-AR转染的CHO细胞中不存在环状AMP的增加(图51A)。相反，异丙肾上腺素(10μM)显示环状AMP水平在用β1-、β2-和β3-AR转染的CHO细胞中显著增加，从而显示缺少针对β-AR的3种同工型的特异性(图51B)。环状AMP通过异丙肾上腺素借助β1-、β2-和β3-AR的增加被SR59230A减弱，显示这种药剂缺少对β3-AR的特异性。
[0321] 为确定β-AR表达是否在这3个细胞系中相同，通过RT-PCR如所述那样测定β1-AR、β2-AR和β3-AR 的mRNA水 平(Moniotte S等 ,Real-time RT-PCR for the detection of beta-adrenoceptor messanger RNAs in small human endomyocardial biopsies.J Mol Cell Cardiol33:2121-2133,2001)。图51C中的数据显示相对于持家基因GAPDH，每种β-AR表达水平是相同的。另外，如在毛喉素存在的情况下通过环状AMP产生所测定，腺苷酸环化酶的水平在这3个细胞系中也是相似的(图51D)。这些结果表明，在这3个细胞系中β-AR之间的比较是有效的。
[0322] 使用125I标记的ZAG和来自CHO-K1、β1、β2和β3细胞的粗制膜，测定ZAG与3种β-AR结合的亲和力(图51E、F和G)。使用非线性回归分析评估数据并且显示Kd值和Bmax值。结合数据反映环状AMP产生受ZAG刺激，如图51A中所示。因此，ZAG优势地与β3-AR结合(高Bmax和最低Kd)，优势较少地与β2-AR结合(Bmax是β3-AR的20%并且Kd两倍于β3-AR)，并且根本不与β1-AR结合(无Bmax和高Kd)。通过在100μM未标记125
的ZAG存在时[ I]ZAG的结合作用测定非特异性结合，并且从总结合作用扣减这些值以产生特异性结合值。ZAG的脂肪分解活性显示因单次冷冻和融化循环而摧毁(图51H)，这可能归因于这种蛋白质的构象变化。为确定这是否损害与β-AR的结合，进行两个实验：(i)
125
将冻融的[ I]ZAG用结合研究于中，这完全减弱与β2-和β3-AR的结合(图51F和G)，
125
(ii)将冷冻/融化的未标记的ZAG与[ I]ZAG一起用于竞争测定法中，如上文测定非特异性结合作用中那样。相反，采用新鲜的未标记的ZAG时，这不影响与β2-AR或β3-AR结合的Kd或Bmax。这些结果表明冻/融ZAG通过防止与β-AR结合而摧毁生物学活性。
的ZAG存在时[ I]ZAG的结合作用测定非特异性结合，并且从总结合作用扣减这些值以产生特异性结合值。ZAG的脂肪分解活性显示因单次冷冻和融化循环而摧毁(图51H)，这可能归因于这种蛋白质的构象变化。为确定这是否损害与β-AR的结合，进行两个实验：(i)
125
将冻融的[ I]ZAG用结合研究于中，这完全减弱与β2-和β3-AR的结合(图51F和G)，
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(ii)将冷冻/融化的未标记的ZAG与[ I]ZAG一起用于竞争测定法中，如上文测定非特异性结合作用中那样。相反，采用新鲜的未标记的ZAG时，这不影响与β2-AR或β3-AR结合的Kd或Bmax。这些结果表明冻/融ZAG通过防止与β-AR结合而摧毁生物学活性。
[0323] 为确定ZAG对体重和胰岛素敏感性的作用是否归因于与β-AR的相互作用，如先-1前所报道那样，在非特异性β-AR拮抗剂普萘洛尔(40mg kg ，po，每天)缺少和存在时，将ob/ob小鼠用ZAG(50μg，iv，每天)处理(Russell ST和Tisdale MJ,Antidiabetic properties of zinc-α2-glycoprotein in ob/ob mice.Endocrinol151:948-957,2010)。
由于需要更高的水平来抵消β3-AR激动剂的作用，所以这个剂量水平高于β2-AR激动剂常用的水平(Liu YL和Stock MJ,Acute effects of the beta3-adrenoreceptoragonist,BRL35135,on tissue glucose utilisation.Br J Pharmacol.114:888-894,1995)。普萘洛尔完全减弱由ZAG引起的体重下降(图52A)，虽然用普萘洛尔单独处理的动物未显示如PBS对照那样大的增重。如先前所报道那样(Russell ST和Tisdale MJ,Antidiabetic properties of zinc-α2-glycoprotein in ob/ob mice.Endocrinol151:948-957,2010)，用ZAG处理的小鼠显示增加的体温(图52B)，并且这被普萘洛尔完全减弱，尿葡萄糖分泌量降低也被其完全减弱(图52C)。单独的ZAG不影响肝脏脂类，虽然存在糖原的某种增加(图52D)。普萘洛尔还阻断口服葡萄糖耐量试验中由ZAG引起的峰值血浆葡萄糖水平和葡萄糖曲线下面积(AUC)下降(图53A)，以及峰值血浆胰岛素水平的相应下降(图53B)。用ZAG处理的动物显示在胰岛素(10nM)存在的情况下葡萄糖进入腓肠肌的摄入量增加(图
53C)，并且在来自接受普萘洛尔的小鼠的腓肠肌中，这被完全减弱。来自用ZAG处理的小鼠的附睾脂肪细胞在胰岛素缺少和存在时也显示增强的葡萄糖摄入(图53D)，并且在用普萘洛尔处理的动物中，这也被完全减弱。因ZAG引起的甘油三酯(TG)和非酯化脂肪酸(NEFA)的血清水平下降也被普萘洛尔减弱(图53E和F)。这些结果表明，ZAG的生物学效由β-AR介导。为确定是否ZAG可以增加胰岛素信号传导，测定对Glut4表达的影响。胰岛素和ZAG均增加Glut4在腓肠肌(图53G)和WAT(图53H)中的表达，但是这种组合引起的增加没有超过单独胰岛素所致的增加。这些结果表明，ZAG影响与胰岛素相同的信号传导途径，但是不增加胰岛素信号传导。
由于需要更高的水平来抵消β3-AR激动剂的作用，所以这个剂量水平高于β2-AR激动剂常用的水平(Liu YL和Stock MJ,Acute effects of the beta3-adrenoreceptoragonist,BRL35135,on tissue glucose utilisation.Br J Pharmacol.114:888-894,1995)。普萘洛尔完全减弱由ZAG引起的体重下降(图52A)，虽然用普萘洛尔单独处理的动物未显示如PBS对照那样大的增重。如先前所报道那样(Russell ST和Tisdale MJ,Antidiabetic properties of zinc-α2-glycoprotein in ob/ob mice.Endocrinol151:948-957,2010)，用ZAG处理的小鼠显示增加的体温(图52B)，并且这被普萘洛尔完全减弱，尿葡萄糖分泌量降低也被其完全减弱(图52C)。单独的ZAG不影响肝脏脂类，虽然存在糖原的某种增加(图52D)。普萘洛尔还阻断口服葡萄糖耐量试验中由ZAG引起的峰值血浆葡萄糖水平和葡萄糖曲线下面积(AUC)下降(图53A)，以及峰值血浆胰岛素水平的相应下降(图53B)。用ZAG处理的动物显示在胰岛素(10nM)存在的情况下葡萄糖进入腓肠肌的摄入量增加(图
53C)，并且在来自接受普萘洛尔的小鼠的腓肠肌中，这被完全减弱。来自用ZAG处理的小鼠的附睾脂肪细胞在胰岛素缺少和存在时也显示增强的葡萄糖摄入(图53D)，并且在用普萘洛尔处理的动物中，这也被完全减弱。因ZAG引起的甘油三酯(TG)和非酯化脂肪酸(NEFA)的血清水平下降也被普萘洛尔减弱(图53E和F)。这些结果表明，ZAG的生物学效由β-AR介导。为确定是否ZAG可以增加胰岛素信号传导，测定对Glut4表达的影响。胰岛素和ZAG均增加Glut4在腓肠肌(图53G)和WAT(图53H)中的表达，但是这种组合引起的增加没有超过单独胰岛素所致的增加。这些结果表明，ZAG影响与胰岛素相同的信号传导途径，但是不增加胰岛素信号传导。
[0324] 已知众多β3-激动剂增加β3-AR的表达。为确定ZAG是否具有相同的作用，用ZAG处理ob/ob小鼠5天后，通过蛋白质印迹法对组织β3-AR表达进行定量。图54中的结果显示β3-AR的表达在腓肠肌中增加两倍(图54A)，在BAT中增加89%(图54B)和在WAT中增加85%(图54C)。相反，β1-AR或β2-AR的表达在腓肠肌(图55A)或WAT(图55B)中不存在变化，并且β1-AR在心脏中的表达不存在变化(图55C)，但是β2-AR的表达小幅增加，刚达到显著性(图55C)。
[0325] BAT和WAT中增加的β3-AR表达(图54)将预期导致增加的UCP1表达，在ZAG施用后在BAT(图56A)和WAT(图56B)中均观察到这一点。体外实验已经显示，促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)抑制剂PD98059减弱ZAG对UCP3表达的诱导，表明MAPK参与这个过程。先前的研究已经显示在ZAG处理的小鼠的WAT中ERK的表达增加。这将预期导致UCP3在WAT中的表达增加，如所观察到那样(图56C)。先前还报道，施用ZAG后的ob/ob小鼠骨骼肌中UCP3增加。增加的UCP表达将为自脂肪组织释放的NEFA提供阱(sink)，从如先前报道那样产生热。
[0326] 此外，用ZAG处理引起AMPK在骨骼肌中的表达增加(图56D)，这将导致长链脂肪酸氧化增加，降低用于甘油三酯合成的可用性，以及通过增加GLUT4表达刺激葡萄糖摄入。
[0327] 这项研究已经发现ZAG优势地与β3-AR结合，中度地与β2-AR结合，并且不与β1-AR结合。人β3-AR在氨基酸序列方面51%同源于β1-AR并且46%同源于β2-AR。ZAG与β3-AR结合的Bmax约3倍于β2-AR的Bmax，而Kd是其约二分之一。ZAG与β3-AR结合的Kd比CGP12177(一种部分激动剂)低约100倍，同时Bmax仅略微较低。这些结果
125
使用可能对天然ZAG具有不等同结合活性的[ I]ZAG获得，这可能导致对Kd的过高或不足估计。尽管采用ZAG的大部分研究已经在啮齿类中实施，但是在人和啮齿类β3-AR之间存在差异。因此BRL37344在通过人β3-AR刺激腺苷酰环化酶方面比啮齿类β3-AR更低效，而CGP12177是有效的人β3-AR激动剂，但是大鼠β3-AR的不良的部分激动剂。不知道ZAG怎样与β3-AR和β2-AR结合而同时不与β1-AR结合，但是该蛋白质的构象是十分重要的，因为结合作用因单次冷/融循环被损毁，ZAG刺激鼠脂肪细胞中脂解作用的能力也同样如此。Kd值处于预期范围内，二者均来自有关ZAG刺激脂解作用和环状AMP产生的研究。然而，它们低于使用ELISA(600nM)所报道的人血浆浓度超过10倍，但是与使用质谱法所报道的人血浆浓度(85nM)可比较。如果前一个值是真实的，则ZAG将以正常血浆浓度最大限度地刺激β2-和β3-AR，这显然不是正确的。必需小心解读使用ELISA时ZAG的血浆浓度，因为可能存在与抗ZAG抗体结合的其他组分，从而产生明显更高的浓度。因此，ZAG已经显示与单克隆抗人红细胞生成素抗体非特异性结合，在含有增加量的尿ZAG的样品中产生明显更高的值。
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使用可能对天然ZAG具有不等同结合活性的[ I]ZAG获得，这可能导致对Kd的过高或不足估计。尽管采用ZAG的大部分研究已经在啮齿类中实施，但是在人和啮齿类β3-AR之间存在差异。因此BRL37344在通过人β3-AR刺激腺苷酰环化酶方面比啮齿类β3-AR更低效，而CGP12177是有效的人β3-AR激动剂，但是大鼠β3-AR的不良的部分激动剂。不知道ZAG怎样与β3-AR和β2-AR结合而同时不与β1-AR结合，但是该蛋白质的构象是十分重要的，因为结合作用因单次冷/融循环被损毁，ZAG刺激鼠脂肪细胞中脂解作用的能力也同样如此。Kd值处于预期范围内，二者均来自有关ZAG刺激脂解作用和环状AMP产生的研究。然而，它们低于使用ELISA(600nM)所报道的人血浆浓度超过10倍，但是与使用质谱法所报道的人血浆浓度(85nM)可比较。如果前一个值是真实的，则ZAG将以正常血浆浓度最大限度地刺激β2-和β3-AR，这显然不是正确的。必需小心解读使用ELISA时ZAG的血浆浓度，因为可能存在与抗ZAG抗体结合的其他组分，从而产生明显更高的浓度。因此，ZAG已经显示与单克隆抗人红细胞生成素抗体非特异性结合，在含有增加量的尿ZAG的样品中产生明显更高的值。
[0328] ZAG对ob/ob小鼠模型中肥胖症和糖尿病的作用可以归因于其与β3-AR结合的能力。因此，β3-AR激动剂在啮齿类模型中显示与ZAG相似的抗肥胖症作用，这引起甘油三酯从WAT贮库中的动员增加、脂肪氧化增加和BAT介导介导的产热增加，导致身体脂肪的选择性降低和无脂肪质量的保留。与ZAG一样，β3-AR激动剂的抗糖尿病作用与抗肥胖症作用无关，并且在不引起体重减少的剂量水平出现。用β3-AR激动剂BRL35135处理ob/ob小鼠使血浆葡萄糖水平正常化并且显著地降低血浆胰岛素水平和非酯化脂肪酸(NEFA)水平。与ZAG一样，BRL35135刺激葡萄糖摄入3类骨骼肌(BAT、WAT、心脏和膈)中，这不依赖胰岛素的作用。作为单一剂量施用时，另一种β3-激动剂L-796568在肥胖人中增加脂解作用和能量支出。然而，持续28天的处理没有明显的脂肪分解或产热作用，虽它降低三酰甘油浓度。这可以归因于人类中β3-AR应答性组织的不充分复原或长期给药时β3-AR的下调。在人腹部皮下脂肪组织中的研究显示β3-AR在控制脂解作用方面发挥了比啮齿类中更弱的作用，并且脂类的动员主要通过β1和β2-AR亚型进行。因此，ZAG可以在人类中通过β2-AR而非β3-AR发挥其作用。
[0329] 这项研究已经显示以高剂量水平施用时，普萘洛尔(一种非特异性β-AR拮抗剂)减弱ZAG在降低体重及尿葡萄糖排泄量、增加体温、改善口服葡萄糖耐量试验中葡萄糖反应性和增加葡萄糖摄入ob/ob小鼠的骨骼肌及WAT中的作用。此外，冻融，其摧毁ZAG在WAT中诱导脂解作用和在衰老肥胖小鼠中减少身体脂肪的能力，也完全减弱其与人β2-和β3-AR结合的能力。这些结果证实，ZAG的抗肥胖症和抗糖尿病作用由β-AR介导。
[0330] 这项研究也已经显示，对ob/ob小鼠施用ZAG增加β3-AR蛋白在BAT、WAT和骨骼肌中的表达。也随其他β3-AR激动剂见到这种作用。因此，用β3-AR激动剂BRL35135长期处理ob/ob小鼠导致β3-AR mRNA在BAT中增加两倍。在Zucker fa/fa大鼠中和成人脂肪细胞中报道伴随另一种β3-AR激动剂CL316,243的相似作用。因此，ZAG诱导β3-AR表达的能力将增强其对肥胖症和糖尿病的作用。在肥胖受试者中见到的降低的β-AR介导的脂解作用和脂肪氧化可以归因于低水平的ZAG，并且施用ZAG可能改善敏感性。当然，对ob/ob小鼠施用ZAG增加附睾脂肪细胞对β3-AR激动剂BRL37344的脂肪分解作用的灵敏度。ZAG诱导β3-AR表达的能力将解释来自ZAG‘敲除小鼠’的脂肪组织对β3-AR激动剂CL316243的脂肪分解作用缺少应答。
[0331] 使用敲除小鼠，已经显示β3-AR刺激的抗肥胖作用因从WAT释放的脂肪酸的UCP-1依赖性降解作用所致。直至最近，仍将BAT视为限于啮齿类和新生人类。然而，3项独立研究令人信服地在成人中鉴定到BAT，主要在下颈部和锁骨的肌肉后面以及沿着胸部和腹部的脊骨鉴定到。已经显示β3-AR激动剂刺激WAT重塑成BAT，这以组织学方式或通过UCP1的出现确定。UCP1在WAT中应答于ZAG的出现表明它启动相似的过程。先前的研究已经提示β3-AR在ZAG诱导UCP1中的作用。已经显示β3-AR激动剂通过刺激环状AMP/蛋白激酶A下游的p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)诱导BAT中的UCP1上调，从而导致过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)γ辅激活物1(PCG-1α)以及ATF-2的激活(磷酸化)，引起UCP1增强子的CRE和PPAR元件被占据。
[0332] ZAG是具有针对β3-AR的选择性激动剂活性的天然存在配体。很少的蛋白质显示这种活性，虽然降血压肽肾上腺髓质素也可以激活β3-AR，导致回肠肌肉松弛。由于ZAG比正常的儿茶酚胺激动剂大得多，因此激活通过变构调节作用发生是可能的。然而，使用LMF的先前研究已经显示结合将被普萘洛尔完全减弱，从而显示与β3-AR的直接相互作用。由于证据表明脂肪分解因子的胰酶消化片段(Mr约5kDa)仍有生物活性，仅需要ZAG分子的一部分用于结合是可能的。可能的是，氨基酸(如丝氨酸羟基)中的某些基团可能模拟儿茶酚胺和β3-AR之间所见到的氢键相互作用。分子建模研究可以提供关于所涉及相互作用的进一步信息。已经显示β3-AR激动剂(如BRL37344)增加脂肪细胞中的ZAG表达，并且也已经提出ZAG借助β3-AR诱导ZAG表达。因此，β3-AR在ZAG的产生和生物学效应方面均是重要，并且ZAG是β2-和β3-AR的天然激动剂。
[0333] 实施例9
[0334] 锌-α2-糖蛋白在用于治疗恶病质的骨骼肌合成中的用途
[0335] 本研究的目的是探索用ZAG处理时ob/ob小鼠中净蛋白质获得的机制。在一些ZAG处理实验中，观察到ob/ob小鼠丢失明显的身体脂肪，但是同时获得某个(补偿)量的作为蛋白质的肌肉质量。
[0336] 通过在37°C无酚红时温育2小时并且用O2CO2(95:5)饱和的情况下将L-[2,6-3H]苯丙氨掺入酸不溶解物质中，测量蛋白质合成。通过用酸溶解的放射性的量除以蛋白质结合的放射性的量来计算蛋白质合成速度。
[0337] 蛋白质降解通过2h内在含有5mM葡萄糖和0.5mM放线酮的氧合Krebs-Henselit缓冲液中从腓肠肌释放酪氨酸(21)而测定。
[0338] 图30中所示的结果表明，骨骼肌中的净蛋白质获得是蛋白质降解减缓和蛋白质合成增加的结果。
[0339] 实施例10
[0340] 口服施用锌-α2-糖蛋白用于体重减少和降低葡萄糖
[0341] 本研究的目的是在延长的时间段范围内和借助口服施用ZAG探索ZAG通过脂肪丢失导致体重减少和降低血浆葡萄糖水平和尿葡萄糖水平的能力。令人惊讶地，口服施用的重组人ZAG能够产生与静脉内施用重组人ZAG相同的反应集合，并且能够在不从身体的消化空间进入血浆空间的情况下做到这一点。一种新作用机制发挥作用以转导消化空间中存在的重组人ZAG信号，引起内源鼠ZAG在血浆空间和WAT和其他组织中产生，如图34和35中所见。
[0342] 对Aston ob/ob小鼠每天p.o.施用50ug的rhZAG。通过假定5mL/日水消耗量并且基于这种假设添加ZAG以实现50ug每天剂量实现口服给药。不试图校正在给定天的消耗量变化。
[0343] ZAG的p.o施用总体上重复通过i.v施用所获得的结果。这种类型广泛的作用包括明显的体重减少(图31、36、41、47)、标志能量支出增加的体温略增(图32、37、43)、尿葡萄糖和血浆葡萄糖降低(图33、42)和响应于口服葡萄糖耐量试验的明显改善(图40、48)。
[0344] 这种作用机制反映静脉内注射的作用机制，伴随重大差异。这些机制是相似的，在于在WAT、BAT、血浆、肝和骨骼肌中存在相同的类型广泛的反应集合。重大差异在于，口服施用的rhZAG从未进入被血液和身体器官占据的空间。相反，施用的rhZAG留在消化系统空间内，在胃中持续24小时或更长时间。机制方面令人惊讶和重大的差异在于，动物通过产生其自身的内源ZAG响应于rhZAG口服给药，所述内源ZAG介导上面提到的后续反应集合。
[0345] 下文详细描述3个实验。
[0346] 实验一(8天口服ZAG研究)：每天在饮用水中p.o.施用50ug的ZAG。观察到出现体重减少、体温增加和尿葡萄糖降低。鼠ZAG在血清和WAT中的增加，但是rhZAG在血清中的不存在表明口服施用的rhZAG上调小鼠ZAG的表达。
[0347] 实验二(8天口服ZAG外加普萘洛尔研究)：每天p.o.施用50ug的ZAG，同时施用和不施用普萘洛尔。普萘洛尔阻断ZAG的全部作用，包括耐量试验中体重和血糖的下降，还阻断体温上升和血浆小鼠ZAG上升，从而证明这种作用借助β肾上腺素能受体出现。普萘洛尔总体上通过ZAG减弱体重减少以及体温的增加。它似乎通过阻止口服施用rhZAG后血清中小鼠ZAG上升做到这一点。第二印迹物显示，在血清中不存在rhZAG，如rhZAG被阻隔于GI道内而没有转移至血流时所预期那样。
[0348] 因此，口服的ZAG通过与GI道β肾上腺素能受体结合起作用，导致血清ZAG上升和随后对体重和血糖的影响。图38显示，普萘洛尔阻断因rhZAG p.o.处理所致的鼠血清ZAG增加。另外，图39显示未在小鼠血清中检测到人ZAG。
[0349] 实验三(口服研究)：在延长的时间框范围内每天p.o.施用ZAG，同时在30日开始从处理组分出一个恢复组(数据未显示)。
[0350] 体重减少、体温和尿葡萄糖下降反映和扩大通过静脉内注射所实现的结果。动物在在整个研究期间的一半处丢失多达13.5%的体重。在研究的一半处理时间后，处理的动物显示以下情况。在尿葡萄糖方面，在相对于对照，50%恢复出现之前12天过去，并且相对于尿葡萄糖对照水平，完全恢复截止研究持续期结束时出现(数据未显示)。体重减少达到13.5%，并且在研究结束日，动物仅相对于对照重量恢复46%(数据未显示)。类似于静脉内施用时ZAG的作用，口服施用的ZAG引起体重减少但是不引起活动性(未显示)、食物消耗量(数据未显示)或水消耗量(数据未显示)的变化。
[0351] 实施例11
[0352] 锌-α2-糖蛋白的施用实现身体脂肪丢失和同时骨骼肌中的肌肉质量增加[0353] 在在一些实验中，已经观察到ob/ob小鼠将丢失明显的身体脂肪，但是同时获得某个(补偿)量的作为蛋白质的肌肉质量。已经探索这一点并且净蛋白质获得归因于蛋白质降解减缓和同时蛋白质合成增加(图30)。
[0354] 实施例12
[0355] 与I.V.施用比较的口服施用锌-α2-糖蛋白
[0356] 本研究的目的比较通过多种施用途径的ZAG的功效。对小鼠口服施用50μg ZAG或PBS(对照)。在图31、32、33(8天口服ZAG研究)；36、37、40(8天口服ZAG外加普萘洛尔研究)；和图47、48(口服ZAG管饲研究)中显示结果。如这些重复的研究中所示，显示ZAG在通过在小鼠的饮用水中简单混入低剂量的ZAG，无需全身吸收所施用的ZAG而口服施用时，出乎意料地有效引起重量变。蛋白质(如胰岛素)的常见口服给药可能需要直到10倍(或大量给药)的静脉内剂量以实现相同的功效水平，并且这种有限的功效需要这类蛋白质的全身性吸收。
[0357] 产生额外的数据(表6)，其显示ZAG的口服给药令人惊讶地实现完全相同剂量的静脉内施用的多达75%的减重功效。另外，在给药5天后，降低尿葡萄糖的功效与口服或i.v.给药时同样良好。
[0358] 用rhZAG口服给药引起动物对应地产生内源性ZAG，如图34、35和38中所示。普萘洛尔阻断因rhZAG p.o.处理所致的鼠血清ZAG增加(图38)，但是没有在血浆中找到施用的人ZAG(图39)。
[0359] 图38是使用小鼠血清中的抗小鼠ZAG的ZAG的蛋白质印迹，所述小鼠血清来自缺少或存在普萘洛尔时用和未用ZAG处理的小鼠。未在小鼠血清中检测到人ZAG。图39是使用小鼠血清中的抗人ZAG的ZAG的蛋白质印迹，所述小鼠血清来自缺少或存在普萘洛尔时用和未用ZAG处理的小鼠(图39)。
[0360] 表6-通过ROA持续8天或20天在70g ob/ob小鼠中因每天以50ug/天施用ZAG所致的体重减少(和相同时间范围内的i.v.丢失%):
[0361]
[0362] (1)实际在饮用水中
[0363] (2)管饲将ZAG剂量直接置入胃中，绕过胃之前的消化系统途径(口、咽、食道)[0364] (3)在饮用水中包含酪蛋白连同ZAG。
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