嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白
阅读：2发布：2020-06-27
专利汇可以提供嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且嵌合体 抗原 受体胞内段的基因及其编码蛋白，它涉及嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白。嵌合体抗原受体胞内段基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1，3，5，7，9，11所示，该基因的编码蛋白的 氨 基酸序列如SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12所示。本 发明 的嵌合体抗原受体胞内段的基因编码的氨基酸序列，作为一种通用的结构可用于制造各种以抗癌细胞免疫 治疗 为目的的嵌合体抗原受体。Ncar可显著提高 转染 后T细胞分泌的细胞因子量，增强转染后T细胞的细胞毒性，因而极大地提高了T细胞对癌细胞的杀伤能 力 。，下面是嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白专利的具体信息内容。
1.嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白，其特征在于嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白，其特征在于嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白，其特征在于嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
4.嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白，其特征在于嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：7所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
5.嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白，其特征在于嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
6.嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白，其特征在于嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：11所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：
12所示。
嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白
技术领域
背景技术
[0002] 嵌合体抗原受体（CAR）是通过基因工程方法构建的一种重组的细胞膜受体。嵌合体抗原受体基因可以修饰杀伤性T细胞，在T细胞表面表达该受体，使T细胞能够特异识别癌细胞并发挥对癌细胞的杀伤作用。
[0003] CAR的结构包括三部分，即细胞外区，跨细胞膜区和细胞内区。其中胞外区即抗体区，由单链抗体可变区构成；跨细胞膜结构区由白细胞分化抗原簇（CD:cluster of differentiation）分子的跨膜区构成；细胞内区由CD分子的细胞内结构区构成。
[0004] CAR的作用机制：嵌合体抗原受体基因转染杀伤性T细胞后，在T细胞表面表达该受体，该受体能够特异性的识别癌细胞表面的肿瘤相关抗原并与该抗原结合，介导其携带的T细胞直接发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0005] 现有的CAR的胞内结构主要为CD3构成，也可由CD3-CD28构成。
[0006] 有此结构的CAR在转染T细胞后介导的细胞因子的分泌量，细胞毒性方面的效率不高，直接影响了转染后T细胞的抗癌活性，因此新型的胞内结构成为当前该领域的研发热点。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供嵌合体抗原受体胞内段的基因及其编码蛋白。
[0008] 本发明的嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009] 本发明的嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0010] 本发明的嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0011] 本发明的嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：7所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
[0012] 本发明的嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
[0013] 本发明的嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：11所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
[0014] 本发明的嵌合体抗原受体胞内段的基因编码蛋白的氨基酸序列在此简称为：“CIN”；CIN作为一种通用的结构可用于制造各种以抗癌细胞免疫治疗为目的的嵌合体抗原受体。包含CIN的CAR（嵌合体抗原受体）在此简称为：“Ncar”；Ncar可显著提高转染后T细胞分泌的细胞因子量，增强转染后T细胞的细胞毒性，因而极大地提高了T细胞对癌细胞的杀伤能力，与现有嵌合体抗原受体相比较：（1）Ncar可以提高转染后T细胞的细胞因子的分泌量，以T细胞干扰素（IFN-γ）分泌量的变化为例，Ncar与只包含CD3结构的CAR相比较可提高640%，与包含CD28-CD3结构的CAR相比较可提高213%。（2）Ncar可以提高转
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染后T细胞的细胞毒性，T细胞的细胞毒性是通过 铬释放试验来测定的。Ncar与只包含CD3结构的CAR相比较可提高310%，与包含CD28-CD3结构的CAR相比较可提高186%。
附图说明
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染后T细胞的细胞毒性，T细胞的细胞毒性是通过 铬释放试验来测定的。Ncar与只包含CD3结构的CAR相比较可提高310%，与包含CD28-CD3结构的CAR相比较可提高186%。
附图说明
[0015] 图1为本发明中Ncar提高转染后T细胞的细胞因子的分泌量的柱状图；
[0016] 图2为本发明中Ncar提高转染后T细胞的细胞毒性的柱状图。
具体实施方式
[0017] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0018] 具体实施方式一：本实施方式嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0019] 本实施方式中嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列或者该基因的编码蛋白的氨基酸序列，由CD3分子、CD28分子和CD137分子的核苷酸序列或者氨基酸序列以CD28-CD137-CD3的顺序组合而成；
[0020] 其中，CD3的核苷酸序列如SEQ ID No：13所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：14所示；
[0021] CD28的核苷酸序列如SEQ ID No：15所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：16所示；
[0022] CD137的核苷酸序列如SEQ ID No：17所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：18所示。
[0023] 具体实施方式二：本实施方式嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0024] 本实施方式中嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列或者该基因的编码蛋白的氨基酸序列，由CD3分子、CD28分子和CD137分子的核苷酸序列或者氨基酸序列以CD28-CD3-CD137的顺序组合而成。
[0025] 具体实施方式三：本实施方式嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0026] 本实施方式中嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列或者该基因的编码蛋白的氨基酸序列，由CD3分子、CD28分子和CD137分子的核苷酸序列或者氨基酸序列以CD137-CD3-CD28的顺序组合而成。
[0027] 具体实施方式四：本实施方式嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：7所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
[0028] 本实施方式中嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列或者该基因的编码蛋白的氨基酸序列，由CD3分子、CD28分子和CD137分子的核苷酸序列或者氨基酸序列以CD137-CD28-CD3的顺序组合而成。
[0029] 具体实施方式五：本实施方式嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
[0030] 本实施方式中嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列或者该基因的编码蛋白的氨基酸序列，由CD3分子、CD28分子和CD137分子的核苷酸序列或者氨基酸序列以CD3-CD137-CD28的顺序组合而成。
[0031] 具体实施方式六：本实施方式嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：11所示，该基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
[0032] 本实施方式中嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列或者该基因的编码蛋白的氨基酸序列，由CD3分子、CD28分子和CD137分子的核苷酸序列或者氨基酸序列以CD3-CD28-CD137的顺序组合而成。
[0033] 嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列通过PCR反应获得，
[0034] 1、PCR反应体系如下：PCR扩增的反应体系为15μL的反应体系，由下列成分组成：
[0035]
[0036]
[0038] 2、具体PCR操作程序如下：
[0039] 一、通过PCR获得CD28的核苷酸序列，如SEQ ID No：15所示，简称a。
[0040] DNA模板：cDNA of CD28（Gene bank ID:NM_006139.2）
[0041] PCR引物1:AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTG
[0042] PCR引物2:
[0043] AGGAGTTTCTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGCG
[0044] 二、通过PCR获得CD137的核苷酸序列，如SEQ ID No：17所示，简称b。
[0045] DNA模板：cDNA of CD137（Gene bank ID:NM_001561.4）
[0046] PCR引物3:
[0047] CGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTG
[0048] PCR引物4:
[0049] TGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC
[0050] 三、通过PCR获得CD3的核苷酸序列，如SEQ ID No：13所示，简称c。
[0051] DNA模板：cDNA of CD3（Gene bank ID:NM_000734.3）
[0052] PCR引物5:
[0053] GAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCA
[0054] PCR引物6:GCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTG
[0055] 四、通过PCR获得核苷酸序列ab。
[0056] DNA模板：a（来自步骤一）和b（来自步骤二），各0.25μl。
[0057] PCR引物1:AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTG
[0058] PCR引物4:
[0059] TGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC
[0060] 五、通过PCR获得嵌合体抗原受体胞内段的基因的核苷酸序列，如SEQ ID No：1所示，简称d。
[0061] DNA模板：ab（来自步骤四）和c（来自步骤三），各0.25ul。
[0062] PCR引物1:AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTG
[0063] PCR引物6:GCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTG
[0064] 3、核苷酸序列SEQ ID No：3，SEQ ID No：5，SEQ ID No：7，SEQ ID No：9，SEQ ID No：11的获得，依次分别简称为e,f,g,h,i。
[0065] 采用与上述获得序列d同样的PCR方式，即重复从步骤一到步骤五，并采用与之相应的引物即可完成。
[0066] 其中：
[0068] CD28分子分布于外周血淋巴细胞，与抗原提呈细胞(APC)上的配体(B7)结合后为T细胞活化提供必需的协同刺激信号,促进T细胞活化的分子。
[0069] CD137作为一种共刺激分子广泛存在于免疫细胞、组织细胞和肿瘤细胞表面，通过多种途径调节CD8+T细胞、CD4+T细胞的增殖、分化与细胞因子的分泌，调节NK细胞的增殖与效应，进而促进机体的抗肿瘤免疫应答。
[0070] 通过PCR反应所获得的嵌合体抗原受体胞内段的基因，其氨基酸序列在此简称为：“CIN”；包含CIN的CAR（嵌合体抗原受体）在此简称为：“Ncar”；CIN作为一种通用的结构可用于制造各种以抗癌细胞免疫治疗为目的的嵌合体抗原受体。
[0071] 与现有嵌合体抗原受体相比较：
[0072] 1、Ncar可以提高转染后T细胞的细胞因子的分泌量
[0073] 以T细胞干扰素（IFN-γ）分泌量的变化为例，Ncar与只包含CD3结构的CAR相比较可提高640%，与包含CD28-CD3结构的CAR相比较可提高213%，如表1和图1所示。
[0074] 注解：Ncar在本实验中是指：scFvcd20-CIN，即以CD20为靶点的包含CIN结构的CAR。
[0075] 表1
[0076]
[0077] 2、Ncar可以提高转染后T细胞的细胞毒性
[0078] T细胞的细胞毒性是通过51铬释放试验来测定的。Ncar与只包含CD3结构的CAR相比较可提高310%，与包含CD28-CD3结构的CAR相比较可提高186%，如表2和图2所示。
[0079] 表2
[0080]
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