干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA,包含其的载体及其应用
阅读：831发布：2023-03-01
专利汇可以提供干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA,包含其的载体及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因表达的方法，具体地Atrogin-1基因和MuRF1基因的干扰RNA及其DNA序列，包含其的载体和由所述载体转录的干扰RNA，以及将所述干扰RNA序列，包含其的载体和由所述载体转录的干扰RNA用于制备 预防 和 治疗 肌肉萎缩 疾病 的药物中的应用。在细胞 水 平和实验动物上，本发明的干扰RNA序列将Atrogin-1基因和MuRF1基因的表达分别比对照降低60％和30％左右，肌肉细胞分化水平分别比对照升高70％和30％左右。在实验动物上表现出明显的肌肉萎缩治疗效果，有效提高疾病发生时的肌肉 质量 。，下面是干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA,包含其的载体及其应用专利的具体信息内容。
一种用于预防和治疗肌肉萎缩的载体转录的干扰RNA。
2. 权利要求l的干扰RNA，其靶向肌特异E3泛素蛋白连接酶基因。
3. 权利要求1的干扰RNA，所述肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因为Atrogin-l基因 (SEQ ID NO :7)或MuRF 1 (SEQ ID NO :8)基因。
4. 权利要求1的干扰RNA，其靶向所述Atrogin-l的3'端、5'端或中间区域序列和/ 或所述MuRF 1基因的3'端、5'端或中间区域序列。
5. 权利要求l的干扰RNA，其中所述载体是病毒载体或质粒载体。
6. —种干扰RNA，其编码DNA序列与权利要求1_5任一项的干扰RNA的编码DNA序列 相同。
7. —种载体，其包含编码权利要求1-6任一项的干扰RNA的DNA序列。
8. 权利要求7的载体，其包含分别干扰Atrogin-l和MuRF 1基因的干扰RNA的DNA编码序列。
9. 权利要求7或8的载体，其中所述载体是腺病毒载体或小环DNA质粒载体。
10. 权利要求1-6中任一项的干扰RNA和/或权利要求7-9任一项的载体在制备预防 和治疗肌肉萎縮的药物中的应用。
11. 一种预防和治疗肌肉萎縮的药物，其包含上述权利要求1-6中任一项的干扰RNA和 /或权利要求7-9任一项的载体作为活性成分。
12. —种干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的方法，所述方法包括下列步骤：a) 将干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA编码的DNA与载体连接；b) 用所述载体转染包含肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的细胞。
干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA，包含其
的载体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及针对肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因，具 体地Atrogin-l和MuRF 1的干扰RNA，包含所述干扰RNA的载体，由所述载体转录的干扰 RNA及其在制备用于预防或治疗肌肉萎縮的药物中的应用。
背景技术
[0002]"肌肉萎縮"系指骨骼肌肉体积縮小，肌纤维减少或变细甚至消失。多种因素均可 导致肌肉萎縮的发生，严重的疾病如乙肝、糖尿病、艾滋病、肾衰竭等。肌肉萎縮的主要表现 之一是骨骼肌蛋白分解丢失，其降解通过3类蛋白酶途径：溶酶体蛋白酶、钙依赖蛋白酶和 泛素-蛋白酶，后者最为重要。Atrogin-l和MuRF 1都属于肌肉特异性E3泛素连接蛋白 酶，发生肌肉萎縮时Atrogin-l和MuRF 1的表达都升高(Claved et al. 2006) 。 Atrogin — 1基因含有一个F-box功能结构域，此酶在骨骼肌中特异性地高表达。多种疾病导致的营 养不良和骨骼肌萎縮都伴有Atrogin-l基因表达上调（Gomes et al. ，2005)。最新的研究 显示Atrogin-l的表达量在肌肉萎縮临床症状出现以前就有所提高，说明导致肌肉萎縮， 首先产生Atrogin-l基因表达量升高，并使肌肉细胞中蛋白质非正常降解（Glass, 2005)。 Atrogin-l蛋白降解途径可以与细胞自噬途径协同作用，导致更多蛋白的降解。 [0003] 为了探讨小RNA在肌肉萎縮中应用的途径，刘长梅等研究了用化学合成的针对 Foxo-l基因的干扰RNA经进一步研究有抑制鼠肌肉萎縮的作用（Liu et al. ，2007)。刘 长梅等还研究了化学合成的针对Myostatin反义RNA对小鼠肌肉萎縮有抑制作用（Liu et al. 2008)。通过大剂量的直接注射经过修饰的耙向GDF-8、F0X0-1基因的有效干扰片段，可 以明显的观察到小鼠的肌肉质量的改善。由于化学合成的干扰RNA除价格昂贵外，其靶向 性差，特异性较低以及作用持续时间短等因素，导致干扰效果欠佳。为了探索应用性更佳的 药物施入方式，刘长梅等应用逆转录病毒系统转录的干扰RNA使GDF-8基因沉默，其治疗肌 肉萎縮病的效果更好（Yang etal.2008)。
[0004] 本发明的申请人针对上述问题，设计了针对肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因，具 体地Atrogin-l基因和MuRF 1基因的干扰RNA序列，并将其编码DNA序列构建到腺病毒载 体或小环DNA载体中，申请人的实验结果证明，本发明设计的干扰RNA序列以及包含其的 载体可以有效地抑制肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因Atrogin-l基因和MuRF 1基因的 表达，提高疾病发生时的肌肉质量，同时所构建的腺病毒载体转录的干扰RNA相比于化学 合成的干扰RNA靶向性更好，特异性更强，具有更好的稳定性，能够克服化学合成干扰RNA 的不稳定，药物作用持续时间短，吸收量少的特点，相比于逆转录病毒载体具有更好的安全 性，作用效果稳定，而小环DNA系统在此基础上相比于传统的腺病毒载体和逆转录病毒载 体还具有更好的安全性，药物作用持续时间长，可以多次免疫的优点。 [0005] 参考文献
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[0013] 本发明提供下列：
[0014] 第一方面，提供一种用于预防和治疗肌肉萎縮的载体转录的干扰RNA。在一个实施 方案中，所述干扰RNA，其靶向肌特异E3泛素蛋白连接酶基因。在一个实施方案中，所述肌 肉特异E3泛素蛋白连接酶基因为Atrogin-l基因（SEQ ID NO :7)或MuRF 1 (SEQ ID NO: 8)基因。在一个实施方案中，所述干扰RNA耙向所述Atrogin-l的3'端、5'端或中间区域 序列和/或所述MuRF l基因的3'端、5'端或中间区域序列。在一个实施方案中，所述干 扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO :1， SEQ ID NO :2， SEQ IDNO :3， SEQ ID NO :4， SEQ ID N0:5，或SEQ ID NO :6。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体或质粒载体。在一个实施 方案中，所述载体是腺病毒载体或小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述腺病毒载体 是PDC312载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是P2 4 C31载体。 [0015] 第二方面，提供一种干扰RNA，其编码DNA序列与上述第一方面的干扰RNA的编码 DNA序列相同。
[0016] 第三方面，提供一种载体，其包含编码上述第一方面或第二方面的干扰RNA的DNA 序列。在一个实施方案中，所述干扰RNA，其靶向肌特异E3泛素蛋白连接酶基因。在一个 实施方案中，所述肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因为Atrogin-l基因（SEQ ID NO :7)或 MuRF l(SEQ ID NO :8)基因。在一个实施方案中，所述干扰RNA靶向所述Atrogin-l的3'端、5'端或中间区域序列和/或所述MuRF l基因的3'端、5'端或中间区域序列。在一个实 施方案中，所述干扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO :1， SEQID NO :2， SEQ ID NO :3， SEQ ID NO :4， SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体或质粒 载体。在一个实施方案中，所述载体是腺病毒载体或小环DNA质粒载体。在一个实施方案 中，所述腺病毒载体是PDC312载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是P2 4 C31 载体。
[0017] 第四方面，提供一种载体，其是一种双价载体，包含分别干扰Atrogin-l和MuRF 1 的干扰RNA的DNA编码序列。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体或质粒载体。在一 个实施方案中，所述载体是腺病毒载体或小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述腺病 毒载体是PDC312载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是P2 4C31载体。在一 个实施方案中，干扰Atrogin-l的干扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO:l，MuRF 1的干扰 RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO :4。
[0018] 第五方面，提供上述第一或第二方面的干扰RNA和/或第三或第四方面的载体在 制备预防和治疗肌肉萎縮的药物中的应用。
[0019] 第六方面，提供一种预防和治疗肌肉萎縮的药物，其包含第一或第二方面的干扰 RNA和/或第三或第四方面的载体作为活性成分。
[0020] 第七方面，提供一种干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的方法，所述方法包括 下列步骤：
[0021] a)将干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA编码的DNA与载体连接； [0022] b)用所述载体转染包含肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的细胞。在一个实施方 案中，所述干扰RNA，其靶向肌特异E3泛素蛋白连接酶基因。在一个实施方案中，所述肌肉 特异E3泛素蛋白连接酶基因为Atrogin-l基因（SEQ ID NO :7)或MuRF 1 (SEQ ID NO :8) 基因。在一个实施方案中，所述干扰RNA靶向所述Atrogin-l的3'端、5'端或中间区域序 列和/或所述MuRF l基因的3'端、5'端或中间区域序列。在一个实施方案中，所述干扰 RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO:l， SEQ ID NO :2， SEQ ID NO :3， SEQ ID NO :4， SEQ ID N0:5，或SEQ ID NO :6。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体或质粒载体。在一个实施 方案中，所述载体是腺病毒载体或小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述腺病毒载体 是PDC312载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是P2 4 C31载体。 [0023] 申请人分别根据肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因Atrogin-l基因和MuRF 1基因 的5'端，3'端或中间区域序列设计了干扰RNA序列，并将其构建到腺病毒载体和小环DNA载 体中，对细胞的转染实验结果显示，其可明显抑制Atrogin-l基因和MuRF 1基因的表达水 平，提高Mygod， myosin, myogenin的表达量，对动物水平的药效学检测显示动物的腿部肌 肉质量增加，对Atrogin-1基因和MuRF 1基因的表达被抑制，肌肉分化的负调控因子GDF-8 表达量下降，小鼠的肌纤维大小增加，肌肉质量得到改善。
[0024] 实验结果表明，本发明的载体，由载体转录的干扰RNA在降低Atrogin-1基因和 MuRF l基因表达的同时，显著提高肌肉分化因子的表达，降低分化抑制因子的表达，迅速而 且高效的诱导细胞分化，抑制I型肌纤维向II型肌纤维的转化，显著提高肌肉质量，说明本 发明的载体转录的干扰RNA以及包含其的载体可在肌肉萎縮的治疗和预防中起到至关重 要的作用。并且本文构建的载体转录的干扰RNA明显地具有靶向性好，特异性强，更加稳定，并且药物作用效果时间长的优点。同时，观察到由分别干扰Atrogin-l和干扰MuRF 1 基因构建的双价载体对预防和治疗肌肉萎縮有增强作用。附图说明
[0025] 图1.抑制Atrogin-1基因表达的干扰RNA的序列设计及表达载体的构建 [0026] 图1A.转录载体的构建
[0028] 图1C. A-3' -IsiRNA重组腺病毒的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测。
[0029] 图2.腺病毒载体转录的siRNA在细胞水平和动物水平对Atrogin-1表达的抑制
[0030] 图2A. A-3' -IsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对Atrogin-1基因转录成的mRNA的影响，siRNA有明显的抑制作用，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。Control为空
载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
[0031] 图2B. A-3' -IsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对Atrogin-1基因表达的影 响，siRNA有明显的抑制作用，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。Control为空载体重组 腺病毒、Mock为空白对照。
[0032] 图2C. A-3' -IsiRNA和无关干扰RNA SiHBC对Atrogin-1基因表达成为蛋白的影 响，siRNA有明显的抑制作用，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。P-actin为内参照。为 了检测A-3' -1 siRNA有无脱靶现象，检测了 NF k -P65 ， C-F0S转录因子的表达水平。Contro 1 为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
[0033] 图2D.饥饿小鼠模型中siRNA对Atrogin-1基因表达成为蛋白的影响，siRNA 有明显的抑制作用。P-actin为内参照。为了检测A-3'-IsiRNA有无脱靶现象，检测了 NFk -P65，C-F0S转录因子的表达水平，证明无脱靶现象。Mock为空白对照，saline为生理 盐水，Control为空载体腺病毒。
[0034] 图2E. A-3'-lsiRNA对饥饿小鼠模型骨骼肌中Atrogin-1表达的影响，siRNA有明 显的抑制作用。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。 [0035] 图2F.Northen blotting检测A_3' -IsiRNA在饥饿小鼠模型骨骼肌中的表达。 Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
[0036] 图2G. Northen blotting检测A-3'-lsiRNA在c2c 12细胞中的表达。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
[0037] 图3. siRNA对实验动物肌肉重量和肌纤维质量的影响
[0038] 图3A. siRNA实验组，生理盐水，空载体对照组饥饿小鼠及正常饲养对照组的小鼠 体重变化。实验证明，siRNA实验组较生理盐水，空载体对照组饥饿小鼠体重有所增加，饥饿 小鼠体重一直处于上升的趋势，而饥饿小鼠的体重无明显变化。Mock为空白对照，saline 为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
[0039] 图3B. siRNA对饥饿小鼠腿部肌肉重量的影响。结果显示，siRNA实验组饥饿小鼠 的腿部肌肉重量与饥饿对照组小鼠相比有明显增加。Mock为正常饲养的空白对照，saline 为生理盐水，Control为空载体腺病毒。0040] 图3C. siRNA实验组饥饿小鼠，Mock正常饲养的空白对照，saline生理盐水注射饥饿对照组小鼠，Control空载体腺病毒注射饥饿对照组小鼠腿部骨骼肌病理切片的H&E染 色。
[0041] 图3D.根据肌肉病理切片计算的小鼠模型腿部骨骼肌肌纤维横截面积的变化。注 射siRNA的饥饿实验组小鼠与saline生理盐水，Control空载体腺病毒处理的饥饿小鼠对 照组相比，肌纤维的面积显著增加。Mock为正常饲养的空白对照。
[0042] 图3E. siRNA处理饥饿小鼠及saline生理盐水，Control空载体腺病毒对照组饥饿小鼠腿部骨骼肌病理切片的ATPase染色，Mock为正常饲养的空白对照。
[0043] 图3F.小鼠腿部骨骼肌I型肌纤维横截面积的变化。siRNA实验组饥饿小鼠与saline生理盐水，Control空载体腺病毒处理的饥饿小鼠对照组相比，I型肌纤维的面积显
著增加，且II型肌纤维的数目较少。Mock为正常饲养的空白对照。
著增加，且II型肌纤维的数目较少。Mock为正常饲养的空白对照。
[0045] 图4A. A-3' -lsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对细胞分化标志物，myosin，myogenin， a -actin表达的影响。siRNA會g够明显的提高myosin,myogenin， a -actin的表
达量，从而说明siRNA能够显著的提高c2cl2细胞的分化，而无关干扰RNA SiHBC， Control
空载体重组腺病毒均无明显作用。P-actin为内参照。
达量，从而说明siRNA能够显著的提高c2cl2细胞的分化，而无关干扰RNA SiHBC， Control
空载体重组腺病毒均无明显作用。P-actin为内参照。
[0046] 图4B.A-3'-lsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对细胞分化标志物myosin表达影响的定量计算。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
[0047] 图4C. A-3'-lsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对细胞分化标志物a -actin表达影响的定量计算。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
[0048] 图4D. A-3'-lsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对细胞分化标志物myogenin表达影响的定量计算。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
[0049] 图4E. A-3' -IsiRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞分化水平的影响。siRNA够明显的提高小鼠骨骼肌肌细胞中myosin和a -actin的表达量，从而说明siRNA能够显
著的提高小鼠骨骼肌肌细胞的分化，Mock空白对照，生理盐水，Control组均无明显作用。
P-tublin为内参照。
著的提高小鼠骨骼肌肌细胞的分化，Mock空白对照，生理盐水，Control组均无明显作用。
P-tublin为内参照。
[0050] 图4F. A-3' -IsiRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞中myosin表达影响的定量计算。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
[0051] 图4G. A-3'-lsiRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞中a -actin表达影响的定量计算。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
[0052] 图5. c2cl2细胞和肌萎縮小鼠模型中抑制Atrogin-1的表达对Myod和GDF-8基因表达的影响
[0053] 图5A. A-3'-lsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对GDF-8基因转录成的mRNA 的影响，siRNA有明显的抑制作用，而无关干扰RNASiHBC无明显作用。Control为空载体重 组腺病毒、Mock为空白对照。
[0054] 图5B. A-3'-lsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对Myod基因转录成的mRNA的 影响，siRNA可以显著的提高Myod基因的转录，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。Contro1 为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
[0055] 图5C. A-3'-lsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对GDF-8和Myod基因表达的 影响。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。7[0056] 图5D. A-3'-lsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对GDF-8基因表达影响的定量 计算。siRNA可以显著的降低GDF-8基因表达，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。Control 为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
[0057] 图5E. A-3'-lsiRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对Myod基因表达影响的定量 计算。siRNA可以显著的升高Myod基因表达，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。Control 为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
[0058] 图5F. A-3'-lsiRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞中GDF-8和Myod基因表达的影响。siRNA够明显的降低小鼠骨骼肌肌细胞中GDF-8，同时提高Myod的表达量。Mock空白
对照，Saline为生理盐水，Control为空载体重组腺病毒。P -tublin为内参照。
对照，Saline为生理盐水，Control为空载体重组腺病毒。P -tublin为内参照。
[0059] 图5G. A-3' -lsiRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞中GDF-8基因表达影响的定量计算。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
[0060] 图5H. A-3'-lsiRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞中Myod基因表达影响的定量计算。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
[0061] 图6pSUPER-Hl载体的图谱。
[0062] 图7p2 4C31载体的图谱。具体实施方式：
[0064] 下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法（分子克隆实验指南第二版， 1999年，J.萨姆布鲁克，E.F弗里奇，科学出版社。）
[0065] 实施例一、靶向Atrogin-l基因的干扰RNA序列的设计，载体构建及细胞和动物水 平药效学柃测l。
[0066] 一、抑制Atrogin-l基因表达的干扰RNA的序列设计及表达载体的构建 [0067] 1、干扰RNA序列的设计
[0068] (1)、靶向Atrogin-l基因3'端的干扰RNA序列的设计
[0069] 应用干扰序列设计软件(siRNA design)设计耙向为Atrogin-l基因（SEQ ID NO : 7)3'端的干扰RNA序列：所设计的与干扰RNA对应的DNA序列如图1B，干扰序列均为人鼠 同源，转录后自身能够形成小发夹结构，以便能成功的被dicer酶识别并剪切，并导致mRNA 的降解，。以
[0070] Atrogin-3' _1的序列为例，其DNA序列为： [0071] A_3， _1 :3， （SEQ ID NO :1)
[0073] 以下叙述中A-3' -IsiRNA在实施例1中简称为siRNA。 [0074] (2)、靶向Atrogin-l基因5'端干扰RNA序列的设计
[0075] 应用干扰序列设计软件（siRNA design)设计耙向Atrogin-l基因5'端的干扰序 列，设计原则同上。以A-5' -1为例，其DNA序列为： [0076] A-5' -13， （SEQ ID NO :2)
[0078] (3)、靶向Atrogin-1某闵中间区域序列的干扰RNA的设计
[0079] 设计原则同上。应用干扰序列设计软件（siRNA design)设计耙向Atrogin-l基 因中间区域的干扰序列，设计原则同上。其DNA序列为： [0080] A-M-l :3' (SEQ ID NO :3) (4)为了检测所设计的靶向Atrogin-1的干扰序列的特异性，设计了靶向 乙肝病毒核心抗原的干扰序列siHBC，与其干扰RNA对应的DNA序列为：SiHBC :5'GATCAAAA AGCCTCCAAGCTGTGCCTTGTTCAAGAGACAAGGCACAGCTTGGAGG TTTTT 3' (SEQ ID NO :9) [0082] 2、干扰RNA载体的构建 [0083] (1)、腺病毒载体的构建
[0084] 将上述与干扰序列siRNA， siHBC相对应的DNA片段95。C加热10分钟后37。C退 火半小时。然后根据分子克隆实验指南（第二版，1999年，J.萨姆布鲁克，E.F弗里奇，科 学出版社)和（Baer M et al， 1990)，在pSUPER-Hl (购自Oligoengine)载体（图6)上 后面反向插入一个U6启动子获得pSUPER-Hl+U6载体，将上述退火的与干扰序列siRNA相 对应的DNA片段（其带有Sail和Xbal酶切位点）与所述pSUPER-Hl+U6载体上的相应位 点连接，得到pSUPER-Hl+siRNA+U6载体，用Kpnl和EcoRI切下含有Hl+U6双启动子的表 达盒（Hl+siRNA+U6)连接PUC18载体（购自科宁公司），得到PUC18+Hl+siRNA+U6重组质 粒。再由重组后的PUC18+Hl+siRNA+U6载体中将Hl+siRNA+U6切下并将其和PDC312载 体（购自本元正阳）连接，从而将所述表达盒重组到腺病毒载体PDC312上（图1A)得到 PDC312+Hl+siRNA+U6。 PDC312+Hl+siHBC+U6的构建方法同上。PCR扩增目的片段，测定序 列（奥科测序）证实其可靠性。测序检测，所合成的与干扰序列相对应的DNA片段准确插 入PDC312载体的适当位点，腺病毒载体构建成功。
[0085] 10% DMEM液（100 ii g/ml潮霉素，1 y g/ml嘌呤霉素）培养M293 (购自本元正阳） 细胞，转染前一天，分细胞到六孔板，37°C ， 5% C02培养细胞18小时，待细胞80%联会后， 用fugen转染试剂（罗氏公司），分别按质粒（重量）/转染试剂（微升）2/4的比例将腺 病毒骨架质粒与所构建的PDC312+Hl+siRNA+U6， PDC312+Hl+siHBC+U6， PDC312+H1+U6共转 染M293细胞系（转染方法：200微升opti-MEM(购自GIBC0)加入2微克重组质粒，O. 2微 克骨架质粒，充分混匀后，加入8微升fugen转染试剂，震荡后，室温放置15分钟，缓慢加入 六孔板中），转染一天后换液，继续培养，至病毒噬斑出现，待50%细胞漂浮，吹下细胞，将 含细胞的培养液冻融3次，800G离心，取上清用PCR扩增目的片段（图1C)，并测序，上清 置-7(TC保存。应用225cm2培养瓶培养M293细胞，按每瓶接种lml的剂量接种重组病毒， 每种病毒接种6瓶。培养3天后，50%细胞悬浮，吹下细胞，应用腺病毒纯化试剂盒（购自 吉美公司）纯化重组腺病毒，浓縮病毒至lml， _701:保存。 [0086] 3、小环DNA载体的构建
[0087] 将合成的相对应的干扰序列siRNA的DNA片段95t:加热10分钟后，37。C退火半小 时。根据分子克隆实验指南（第二版，1999年，J.萨姆布鲁克，E.F弗里奇，科学出版社） 和（Baer M et al， 1990)，在pSUPER-Hl (购自oligoengine)载体上后面反向插入一个U6启动子获得pSUPER-Hl+U6载体，所述重组载体经Sail和Xbal双酶切后，与上述退火的所 述合成的相对应的干扰序列siRNA的DNA片段相连接构建成pSUPER-Hl+siRNA+U6重组质 粒，从所述pSUPER-Hl+U6载体上用Kpnl和Sacl切下含有H1+干扰序列+U6双启动子的表 达盒与Kpnl和Sacl双酶切的小环DNA载体（P2 4 C31载体）（人内皮抑素小环载体的构建 及其在真核细胞的表达，中山大学学报，2006，6)(图7)(获自武汉大学分子病毒与免疫实 验室）使用Kpnl和Sacl连接，产生重组质粒。并测定序列。经测序检测，所合成的与干扰 序列相对应的DNA片段准确插入小环DNA载体的适当位点，小环DNA载体构建成功。 [0088] 二、 siRNA重组腺病毒在细胞水平和动物水平对Atrogin-1表汰的抑制 [0089] 1、 siRNA重组腺病毒在细胞水平对Atrogin-1表汰的抑制
[0090] 应用腺病毒滴度检测试剂盒（购自本元正阳）检测重组腺病毒滴度。用含15% FBS (胎牛血清)的DMEM液(100 y g/ml潮霉素，1 y g/ml嘌呤霉素)培养c2cl2 (购自协和 医学院）细胞。在转染前24小时，100微升2.5%胰酶消化所述细胞并按每孔104个细胞的 数量接种于六孔板中。按细胞数/病毒数=1 : 100的比例将siRNA，siHBC，Mock (空载体 腺病毒）重组腺病毒感染c2cl2细胞，感染后12小时后，将培养基换为含2%马血清的DMEM 液，剌激所述细胞分化24小时后，吸掉上清，将其冰浴用PBS轻轻洗涤3次，其中一板每孔 各加0. 5mL的RTIZOL试剂(invitrogin)，并提取细胞总RNA，用DEPC(焦碳酸二乙脂)水 充分溶解后，通过1X琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用分光光度计测量RNA浓度。采用 TAKARA公司的逆转录试剂盒，将RNA逆转录为cDNA。应用SYBgreen方法，将其在ABI7000 型REAL-TME PCR仪上进行检测，通过Ct值计算RNA水平Atrogin-1的表达。 [0091] 此外，在剌激所述c2cl2细胞分化24小时后，吸掉上清，冰浴用PBS轻轻洗涤 3次，加入150微升细胞裂解液，待至细胞裂解完全后，吸入1. 5ml离心管中，12000转/ 分，4。C离心10分钟。将上清转移到离心管中，应用Biorad公司的AXB液测量蛋白浓度， 12% SDS-PAGE，80V电泳2小时，将所述蛋白通过半干转的方法转移至PVDF膜（Amersham) 上（27mA、45min)，考马斯亮蓝染色确定转膜效率，脱色后TBST(Tris-HCI缓冲液（0. 5M pH7. 6) 100ml NaCl 8. 5〜9g(0. 15mol/L) ， lml/L的triton-20)洗涤3次，5%脱脂奶粉封 闭过夜，TBST洗涤3次后，加入Atrogin-l抗体（1%脱脂奶粉，抗体1/1000稀释），37。C孵 育1小时，TBST洗涤3次（每次10分钟）后，加入辣根过氧化酶标记的二抗（购买自中衫 金桥）（1%脱脂奶粉，抗体1/3000稀释），37t:孵育45分钟，TBST洗涤3次后（每次10分 钟），再用超敏发光液显色，压片，洗片。
[0092] 荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，siRNA对c2cl2细胞中Atrogin-l基因 RNA水平的抑制效率达到了60X (图2A)，与蛋白表达水平的检测结果一致（图2B)同时分 析了转录因子NF k -P65， C-FOS的表达量变化，证明无脱靶现象（图2C)。 [0093] 2、 siRNA重组腺病毒在动物水平对Atrogin-1表达的抑制
[0094] 本实验所采用的肌萎縮动物模型为饥饿处理的BALB/C小鼠（购自军事医学科学 院）。4周龄的BALB/C雌性小鼠饲养一周（按照中国科学院实验动物管理办法）后，饥饿 l天。
[0095] 将饥饿处理的BALB/C雌性小鼠分为A、 B、 C、 D四组，每组5只。A组按109/只的 剂量注射siRNA重组腺病毒，B组按107只的剂量注射Pdc312重组腺病毒，C组注射生理 盐水，D组注射生理盐水。A、B、C三组按5g/只的进食量饲养，D组正常饲养，注射后饲养一10周，处死小鼠。
[0096] 取一定量的小鼠肌肉组织（小鼠骨骼肌），加RIPA(全组织）裂解液（BI0MED)，加 入全蛋白酶抑制剂（罗氏公司），于冰上匀浆，至细胞完全裂解，离心，取上清，稀释后测量 蛋白浓度，即刻上样分析（方法同细胞水平一致）。动物水平的实验结果显示，在肌萎縮小 鼠模型中，siRNA重组腺病毒对Atrogin-1的抑制效率达到了 60%以上（图2E)，为检测有 无脱靶现象，检测了 c-Fos和nfkB-P65的表达情况，结果显示该转录因子的表达量并没有 明显变化图（2C)。
[0097] Northen blotting检测所构建的重组腺病毒在细胞（图2F)和动物肌肉组织中 (图2G)的表达情况，结果显示，在c2cl2细胞和动物肌肉组织中，siRNA都有较高的表达
[0098] 综上所述，细胞水平和动物水平检测指标显示，siRNA能够有效的降低Atrogin-l 基因的表达。
[0099] 3、小环DNA干扰系统在细胞水平和动物水平对Atrogin-l的抑制 [0100] 将构建的含有干扰序列表达盒siRNA的小环重组质粒转化DH5a大肠杆菌，挑取单 克隆，接于3ml LB液体培养基中，37。C，200RPM培养过夜，按1 : 100接于200ml LB液体 培养基中，培养12小时，用质粒大提试剂盒（威格拉斯）提取质粒，测浓度，应用fugen转 染试剂（罗氏公司），按质粒（重量）/转染试剂（微升）2/4的比例转染c2cl2细胞，转染 6小时后，将培养基由15% FBS的DMEM液中更换为含2%马血清的DMEM液中，剌激分化24 小时后，进行western blot分析（方法同上）。实验结果显示，在c2cl2细胞系中，转染重 组小环DNA后（包含siRNA)，有效的抑制了 Atrogin-l基因的表达，其抑制效率达60%以 上。
[0101] 将所提质粒按2〜0. 5微克/只的剂量注射饥饿处理1天的BALB/C小鼠，每天定时称量小鼠体重，l周后检测肌肉重量。结果显示，在肌萎縮小鼠模型中，siRNA重组小环
DNA载体对Atrogin-l的抑制效率达到了 50%以上。
DNA载体对Atrogin-l的抑制效率达到了 50%以上。
[0102] 三、siRNA对实验动物肌肉重暈和肌纤维质暈的影响
[0103] 1、 siRNA重组腺病毒对实验动物肌肉重暈和肌纤维质暈的影响
[0104] 将饥饿处理的BALB/C雌性小鼠分为A、 B、 C、 D四组，每组5只。A组按109/只的剂量注射siRNA重组腺病毒，B组按107只的剂量注射Pdc312重组腺病毒，C组注射生理
盐水，D组注射生理盐水。A、B、C三组按5g/只的进食量饲养，D组正常饲养，观察小鼠体重
变化（图3A)。注射后饲养一周，处死小鼠，并取其前肢、后肢大腿和小腿。
盐水，D组注射生理盐水。A、B、C三组按5g/只的进食量饲养，D组正常饲养，观察小鼠体重
变化（图3A)。注射后饲养一周，处死小鼠，并取其前肢、后肢大腿和小腿。
[0105] 处死小鼠后，称量其前大腿，和小腿，后大腿，和小腿重量。比较实验组与对照组小鼠腿部肌肉重量变化。实验结果显示，与对照组相比，注射siRNA重组腺病毒的小鼠前肢大
腿，后肢大腿腿部肌肉重量与对照组相比增加20-30% (图3B)。
腿，后肢大腿腿部肌肉重量与对照组相比增加20-30% (图3B)。
[0106] 取小鼠后肢大腿，于液氮冷却的异戊烷中迅速冷冻，并储存于液氮中，制作石蜡切 片，并用苏木精和伊红（H&E)染色在光学显微镜下观察并拍照（图3C)。纤维计数和横截面 积计量运用ImagePro5. 0. 1软件（MediaCybe潔tics， Silver Spring, MD， USA)进行分析， 纤维的大小为测量的肌纤维横截面积的平均值，每个肌肉组织样品测量了大约500-700个 肌纤维。结果显示，注射siRNA重组腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纤维横截面积比注射生 理盐水和Mock的对照组增加约25% (图3D)，从而说明在降低Atrogin-1基因表达的情况下，促进肌纤维的生肌分化的同时，能够增加肌纤维的大小，提高肌肉质量。 [0107] 新鲜获取的肌肉样品（小鼠腿部骨骼肌）在液氮冷却的异戊烷中冷冻，保存于液 氮中。将样品在恒冷切片机中切片，随后进行三磷酸腺苷酶（ATPase)染色：切片首先孵育 (37°C )在酸性预培养液中(95mM CH3C00Na， 99mM KC1， pH 4. 2)，然后孵育在ATP培养液中 (2.8mM ATP，47. 5mMNa0H，65mM NaCl，52.75mM glycine, 37. 8mM CaCl2，pH 9.4)。肌纤维类 型通过着色深浅来区分（typel > type II)，分析平均纤维面积和纤维类型（图3E)。纤维 横截面积计量运用ImagePro 5.0. 1软件（MediaCybe潔tics， SilverSpring， MD， USA)进 行分析，纤维的大小为测量的肌纤维横截面积的平均值，每个肌肉组织样品测量了大约500 个肌纤维。结果显示， 一型肌纤维的横截面积没有显著差异，二型肌纤维的横截面积与对照 组相比明显增大（图3F)。
[0108] 上述实验结果说明含有siRNA干扰序列的重组腺病毒能够精确的靶向Atrogin-l基因，在降低Atrogin-l基因的表达的同时，抑制I型肌纤维向II型肌纤维的转化，增加肌
纤维的大小，显著提高肌纤维的质量，从而提高肌肉的重量。
纤维的大小，显著提高肌纤维的质量，从而提高肌肉的重量。
[0109] 2、 siRNA小环DNA载体系统对实验动物肌肉重量和肌纤维质量的影响
[0110] 将所提质粒按2〜0. 5微克/只的剂量注射饥饿处理1天的BALB/C小鼠，每天定时称量小鼠体重，1周后检测肌肉重量，检测指标同前，结果显示，注射siRNA小环DNA载体
的小鼠前肢大腿，后肢大腿腿部肌肉重量增加20-25 % 。，注射siRNA重组腺病毒的小鼠大
腿腿部肌肉肌纤维横截面积比注射生理盐水和Mock的对照组增加约20%，一型肌纤维的
横截面积没有显著差异，二型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大。
[0川]四、抑制Atrogin-l对c2cl2细胞和肌萎縮小鼠生肌分化的影响
的小鼠前肢大腿，后肢大腿腿部肌肉重量增加20-25 % 。，注射siRNA重组腺病毒的小鼠大
腿腿部肌肉肌纤维横截面积比注射生理盐水和Mock的对照组增加约20%，一型肌纤维的
横截面积没有显著差异，二型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大。
[0川]四、抑制Atrogin-l对c2cl2细胞和肌萎縮小鼠生肌分化的影响
[0112] 在有效抑制Atrogin-l基因的表达量的同时，western blotting检测了肌细胞分化标志物a -actin、 myosin、 myogenin的表达量变化（图4A)。结果显示，细胞分化标
志物a -actin的表达量提高近10倍（图4B) ， myosin的表达量提高了近10倍（图4C)，
myogenin的表达量提高7倍以上（图4D)，从而证明在降低Atrogin-1基因的表达后，能够
迅速而且高效的诱导细胞生肌分化。
志物a -actin的表达量提高近10倍（图4B) ， myosin的表达量提高了近10倍（图4C)，
myogenin的表达量提高7倍以上（图4D)，从而证明在降低Atrogin-1基因的表达后，能够
迅速而且高效的诱导细胞生肌分化。
[0113] 在小鼠饥饿肌萎縮模型中，western blotting检测了肌细胞分化标志物 a -actin、 myosin的表达量变化（图4E)，检测到Atrogin-l基因的表达量下降的同时，细胞分化因子a-actin的表达量提高近30% (图4F) ， myosin的表达量提高了近30% (图
4G)。
4G)。
[0114] 五，c2cl2细胞和肌萎縮小鼠模型中抑制Atrogin-l的表达对Myod和GDF-8基因 表汰的影响
[0115] 实验结果显示，在c2cl2细胞系和小鼠模型中，siRNA能够有效降低GDF-8基因和 提高Myod基因的表达。在c2c 12细胞中，siRNA使GDF-8基因转录的mRNA水平降低了 20% (图5A)，同时使Myod基因mRNA水平升高了 30% (图5B)。在蛋白表达水平（图5C)， siRNA使细胞的生肌负调控因子GDF-8表达量下降了 30% (图5D)，生肌正调控因子Myod 的表达量提高了 40% (图5E)。在小鼠饥饿肌萎縮模型中，检测了 GDF-8和Myod基因表达 量的变化（图5F)。注射siRNA重组腺病毒的实验组同对照组相比myod的表达量提高20% 以上（图5G)，肌肉分化的负调控因子GDF-8表达量下降了 20% (图5H)。 [0116] 实施例二、靶向MuRF 1基因干扰序列的设计，载体构建及细胞和动物水平药效学[0117] 一、抑制MuRF 1某因表汰的干扰RNA某因表汰载体的构建
[0118] 1、干扰RNA序列的设i十
[0119] (1)、靶向MuRF 1某闵3'端的干扰RNA序列的设计
[0120] 应用干扰序列设计软件设计靶向MuRF 1基因（SEQ ID NO :8) 3'端的RNA干扰序 列，其DNA的序列如下：
[0121] M-3' -1 5' TCGAAAAAAGGACAGATGAGGAGGAGGATCAACAG
[0122] TCCTCCTCCTCATCTGTCCTTTTT 3， （SEQ ID NO :4)
[0123] 以下叙述中M-3' -IsiRNA在实施例2中简称为siRNA
[0124] (2)、靶向MuRF 1某因5'端干扰RNA序列的设计
[0125] 方法同实施例l。
[0126] M_5， _1 :3， （SEQ ID NO :5)
[0128] (3)、靶向MuRF 1某闵中间区域的干扰RNA序列的设计
[0129] 方法同实施例l。
[0130] M-M-l :3， （SEQ ID NO :6)
[0132] 2、干扰RNA载体的构建
[0133] (1)、腺病毒载体的构建
[0134] 构建方法同上。
[0135] 3、小环DNA载体的构建
[0136] 构建方法同上。
[0137] 二、 siRNA重组腺病毒在细胞水平和动物水平对MuRF 1表达的抑制 [0138] 1、 siRNA重组腺病毒在细胞水平对MuRF 1表达的抑制
[0139] 检测方法同上，荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，siRNA对c2cl2细胞中 MuRF 1基因RNA水平的抑制效率达到了 30%，与蛋白表达水平的检测结果一致同时分析了 转录因子NF k B-P65, c-Fos的表达量变化，证明无脱靶现象。 [0140] 2、 siRNA重组腺病毒在动物水平对MuRF 1表达的抑制
[0141] 所用小鼠模型及检测指标同上。动物水平的实验结果显示，在肌萎縮小鼠模型中， siRNA重组腺病毒对MuRF 1的抑制效率达到了 30%以上，为检测有无脱耙现象，检测了 c-Fos和nF k B-P65的表达情况，结果显示该转录因子的表达量并没有明显变化。 [0142] 综上所述，细胞水平和动物水平检测显示，靶向MuRF 1基因的siRNA能够有效的 降低MuRF 1基因的表达。
[0143] 3、小环DNA干扰系统在细胞水平和动物水平对MuRF 1的抑制 [0144] 含有耙向MuRF l基因的siRNA重组小环质粒转染c2cl2细胞，检测方法同上，实 验结果显示，在c2cl2细胞系中，转染siRNA重组小环DNA后，有效的抑制了 MuRF 1基因的 表达，其抑制效率达60%以上。[0145] 将所提质粒按2〜0. 5微克/只的剂量注射饥饿处理1天的BALB/C小鼠，每天定时称量小鼠体重，l周后检测肌肉重量。结果显示，在肌萎縮小鼠模型中，siRNA重组小环
DNA载体对MuRF 1的抑制效率达到了 50%以上。
DNA载体对MuRF 1的抑制效率达到了 50%以上。
[0146] H、 siRNA X寸輔云M纖歸慰口朋纖歸白條卩向
[0147] 1、 siRNA翻鹏動寸輔云M纖歸慰口朋纖歸白條口向
[0148] 将饥饿处理的BALB/C雌性小鼠分为A、 B、 C、 D四组，每组5只。A组按101QIU/只的剂量注射siRNA重组腺病毒，B组按101QIU/只的剂量注射Pdc312空载体重组腺病毒，C
组注射生理盐水，D组注射生理盐水。A、B、C三组按5g/只的进食量饲养，D组正常饲养，观
察小鼠体重变化。注射后饲养一周，处死小鼠，并取其前肢、后肢大腿和小腿。
组注射生理盐水，D组注射生理盐水。A、B、C三组按5g/只的进食量饲养，D组正常饲养，观
察小鼠体重变化。注射后饲养一周，处死小鼠，并取其前肢、后肢大腿和小腿。
[0149] 处死小鼠后，称量其前大腿，和小腿，后大腿，和小腿重量。比较实验组与对照组小鼠腿部肌肉重量变化。实验结果显示，与对照组相比，注射siRNA重组腺病毒的小鼠前肢大
腿，后肢大腿腿部肌肉重量与对照组相比增加10-15%。
腿，后肢大腿腿部肌肉重量与对照组相比增加10-15%。
[0150] 伊红（H&E)染色和三磷酸腺苷酶（ATPase)染色操作同上。试验结果显示，注射 siRNA重组腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纤维横截面积比注射生理盐水和Mock的对照组 增加约10X，从而说明在降低MuRF l基因表达的情况下，促进肌纤维的生肌分化的同时， 能够增加肌纤维的大小，提高肌肉质量。同时发现一型肌纤维的横截面积没有显著差异，二 型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大。
[0151] 上述实验结果说明含有siRNA干扰序列的重组腺病毒能够精确的靶向MuRF 1基 因，在降低MuRF 1基因的表达的同时，抑制I型肌纤维向II型肌纤维的转化，增加肌纤维 的大小，显著提高肌纤维的质量，从而提高肌肉的重量。
[0152] 2、 siRNA小环DNA载体系统对实验动物肌肉重暈和肌纤维质暈的影响
[0153] 试验操作及检测指标同前，结果显示，注射siRNA小环DNA载体的小鼠前肢大腿，后肢大腿腿部肌肉重量增加10-15%。，注射siRNA重组腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纤维
横截面积比注射生理盐水和Mock的对照组增加约10%，一型肌纤维的横截面积没有显著
差异，二型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大。
横截面积比注射生理盐水和Mock的对照组增加约10%，一型肌纤维的横截面积没有显著
差异，二型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大。
[0154] 四、抑制MuRF 1对c2cl2细胞和肌萎縮小鼠生肌分化的影响
[0155] 在有效抑制MuRF 1基因的表达量的同时，western blotting检测到了细胞分化标志物a-actin的表达量提高近5倍，myosin的表达量提高了近5倍，myogenin的表达量
提高6倍以上，从而证明在降低MuRF 1基因的表达后，能够迅速而且高效的诱导细胞生肌分化。
提高6倍以上，从而证明在降低MuRF 1基因的表达后，能够迅速而且高效的诱导细胞生肌分化。
[0156] 在小鼠饥饿肌萎縮模型中，检测到MuRF 1基因的表达量下降的同时，细胞分化因 子a-actin的表达量提高近15%， myosin的表达量提高了近17%。
[0157] 五，c2cl2细胞和肌萎縮小鼠模型中抑制MuRF 1的表达对Myod和GDF_8基因表 汰的影响
[0158] 实验结果显示，在c2cl2细胞系中，siRNA重组腺病毒在有效降低MuRF 1的表达 的同时，使细胞的生肌负调控因子GDF-8表达量下降了 15X，生肌正调控因子Myod的表达 量提高了 20%。在小鼠饥饿肌萎縮模型中，注射siRNA重组腺病毒的实验组同对照组相比 myod的表达量提高10X以上，肌肉分化的负调控因子GDF-8表达量下降了 15%。 [0159] 实施例三：靶向Atrogin-1和MuRF 1联合载体的构建，细胞水平及动物水平药效14[0160] 1、双价干扰RNA载体的构律
[0161] 将上述已经证明有效的靶向Atrogin-l基因和MuRF 1基因3'端、5'端和中间区域的干扰片段表达盒（Hl+siRNA+U6)分别从重组载体PDC312+Hl+siRNA+U6上切下（以
A-3，-l(SEQ ID N0:1)和M-3'-l (SEQID N0 :4)为例），将表达盒分别用Klenow片段将末端
补齐后，分别与合成的酶切接头Xbal、 Sall， EcoRI、 BamHI相连接，并连接到腺病毒PDC312
载体的相应位点。送测序，腺病毒载体A-3' -1+M-3' -1构建成功。
A-3，-l(SEQ ID N0:1)和M-3'-l (SEQID N0 :4)为例），将表达盒分别用Klenow片段将末端
补齐后，分别与合成的酶切接头Xbal、 Sall， EcoRI、 BamHI相连接，并连接到腺病毒PDC312
载体的相应位点。送测序，腺病毒载体A-3' -1+M-3' -1构建成功。
[0162] 2、干扰RNA的药效学检测I
[0163] (1)、科允RNA麵餅白術效，翻
[0164] 实验结果显示，在c2cl2细胞系中，A-3' -1+M-3' _1重组腺病毒对Atrogin-l的 表达抑制效率达到60 % ，对MuRF 1的表达抑制效率达到50 % 。分化标志物myosin表达量 提高13倍。分析了转录因子NFk B-P65, C-F0S的表达量变化，证明无脱靶现象。 [0165] (2)、科允RNA云M駄，,，翻
[0166] 动物水平的western blotting分析，方法同上，动物水平的实验结果显示，在肌 萎縮小鼠模型中，A-3' -1+M-3' -1重组腺病毒对MuRF 1的抑制效率达到了 50%左右，对 Atrogin-l的抑制效率达到了 60%以上。与对照组相比，注射A_3' -1+M-3' -1重组腺病 毒的小鼠大腿腿部肌肉重量增加25%。组织病理分析结果显示，注射A-3' -1+M-3' -1重 组腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纤维横截面积比注射生理盐水和Pdc312的对照组增加约 35%，二型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大。
[0167] 上述实验结果说明含有A-3' -1+M-3' -1双价干扰序列的重组腺病毒能够精确的 耙向Atrogin-l基因和MuRF 1基因，在降低Atrogin-l和MuRFl基因的表达的同时，能显 著提高分化因子的表达，并降低分化抑制因子的表达，迅速而且高效的诱导细胞分化，抑制 I型肌纤维向II型肌纤维的转化，显著提高肌肉质量，与单独抑制Atrogin-l基因或MuRF 1基因相比，能够起到更好的治疗肌肉萎縮的效果。0168] IB089096序列表.ST25
0169] 序列表
0170] 〈110〉中国科学院微生物研究所
0171] 〈120〉干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA，包含其的载体及其应用
0172] 〈130>IB089096
0173] 〈160>9
0174] 〈170>PatentIn version 3.1
0175] 〈210>1
0176] 〈211>61
0177] 〈212>DNA
0178] 〈213〉人工序列
0179] 〈400>1
0180] gatc朋3朋c g朋ggagcgc catggatett c朋gagatet ccatggcgct ccttcgtttt 60
0181] t 61
0182] 〈210>2[0183
[0184
[0185
[0186:
[0187:
[0188:
[0189:
[0190:
[0191
[0192
[0193
[0194
[0195
[0196:
[0197:
[0198:
[0199:
[0200
[0201
[0202
[0203
[0204
[0205:
[0206:
[0207:
[0208:
[0209:
[0210
[0211
[0212
[0213
[0214
[0215:
[0216:
[0217:
[0218:
[0219:
[0220
[0221
〈211>65 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉2
gatca朋朋c tegttgaccc actcttgtcc ttc朋gagag gacaagagtg ggtc朋cteg 60
ttttt 65
〈210>3
〈211〉65
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400>3
gatc朋朋3g 3C3ttcagaa C3gc朋3gcc gtc朋g3g3g gctttgctgt tctg朋tgtc 60
ttttt 65
〈210〉4
〈211>59
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈400〉4
tcgaaaaaag gacag;atgag gaggaggatc aacagtcctc ctcctcatct gtccttttt 59
〈210>5
<211>61
〈212>DNA
〈213〉人工序列
〈400>5
gatcaaaaat ggagaacctg gagaagcatc tcttgaatgc ttctccaggt tctccatttt 60
t 61
〈210>6
〈211〉61
〈212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gatcaaaaag gacagatgag gaggaggatc tcttgaatcc tcctcctcat ctgtcctttt 60
t 61
〈210>7
<211>2722
〈212>DNA
〈213〉鼠
〈400〉7
ccgggateaa tectgcgctc gggcagccgc tcagcattcc cagagtcagg aggcgacctt 60[0222] cccc皿cgcc tgcgcccctg tgagtg咖g gatccccgcg cccacccagg atccgcagcc 120
0169] 序列表
0170] 〈110〉中国科学院微生物研究所
0171] 〈120〉干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA，包含其的载体及其应用
0172] 〈130>IB089096
0173] 〈160>9
0174] 〈170>PatentIn version 3.1
0175] 〈210>1
0176] 〈211>61
0177] 〈212>DNA
0178] 〈213〉人工序列
0179] 〈400>1
0180] gatc朋3朋c g朋ggagcgc catggatett c朋gagatet ccatggcgct ccttcgtttt 60
0181] t 61
0182] 〈210>2[0183
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[0221
〈211>65 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉2
gatca朋朋c tegttgaccc actcttgtcc ttc朋gagag gacaagagtg ggtc朋cteg 60
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〈210>3
〈211〉65
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〈213〉人工序列
〈400>3
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〈210〉4
〈211>59
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈400〉4
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[0224] cccaacgcgc cgcateccct gggc皿gcca ggccggttcc tggctgtcaa tccgtcccgt 240
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[0226] ggccagagct gggtga卿c ggcggacggc tgg皿gcgct tcttggatga g皿皿gcggc 360
[0227] agcttcgtga gcgacctcag cagttectgc 皿C皿gg3gg tetecagtea gg卿atctg 420
[0228] ttcagcagcc tg皿ctecga cgtcgcagcc tC3g皿C3gC ■
[0229] ctcagtectt ccatc皿g皿 皿gtggatct atgttcacaa agg皿gtecg 540
[0230] 皿ggagcgcc atggatectg tectttgggg gaagctttca cttctcgact 600
[0231] gccatcctgg attccag^g attcaactec gtegte郷c tgttggagct gategc皿3g 660
[0232] tcacagctca catccctgag tggcatcgcc c^^g^ct tcatg^cat tttgg^3皿 720
[0233] gtggtectga aagttcttga 3g3ccagc^ ■cateagac ttetecggga acttctccag 780
[0234] actctcteca catccttatg C3cactggtg C3gagagtcg gc33gtctgt gctggtgggc 840
[0235] tgtgggtgta tcggatggag 3ccattctec 3ctggcagc3 gcagctg^t ■
[0236] tcagcaggcc tgccttcaaa ggcctcacga tcaccgacct gcctgtgtgc 960
[0237] ttecaactga acatcatgca g郷ctgagt gacgggcggg acctggtcag cctgggccag 1020
[0238] gcagccccag acctgcatgt gctragtgag gaccggctec tgtgga卿g actctgccag 1080
[0239] teccacttct C3g3g3ggC3 gattcgc皿g cgtttgatct tgtctgacaa 郷gragctg 1140
[0240] gattgga卿 agatgtettt teagcttgte cgatgttecc gragtetggg 1200
[0241] gtcaccctgc agctttgcaa acactgccac attctctcct gg皿gggrac tgaccatccg 1260
[0242] tgcacggcca 3C皿CCC3g3 gagctgctcc gtctcacttt cccctcaaga ctttetcaat 1320
[0243] ttgttcaagt tctgaateat CCC3gC3C3C gacaacactt cag皿ggctt cteattggat 1380
[0244] ggctgggagt cgggacactt catttgteaa tegtgtecat ttteagcatt ggcttga皿c 1440
[0245] tgcgggggat acgtcattga gg卿cgttg gcgggga卿 gatgragttg CCg3tgg皿3 1500
[0246] tttecaaatg tgaattccac atgag皿ctg gtecag皿皿 gc3ga皿tec tgte皿tega 1560
[0247] ctttttettt tcccteacga tttgcaagca 3gactete皿 ggc皿g皿ct ctetgtcagc 1620
[0248] C3tgg皿3Cg gagtcctctt gagttcccte ggc皿皿3gc 1680
[0249] gatgg^cac tctgttteca gttgtteaga g皿g皿gg皿 1740
[0250] gatg皿cgct gtcattgaga aacccttggg ctttgggttt ggattcgggg tttgttttca 1800
[0251] gcaggcc皿g aagtetetcc acctgaaatc tgcacgggct teagtcctte tcctetgaag 1860
[0252] atgccacaca atggtctecc tcte皿3gca tegcgtgttc tctggcaaca tectttetct 1920
[0253] ggg郷咖t gtctgtgttt catgteagtt ctetectctg tg皿gtgatc te卿tggga 1980
[0254] 郷ctgtteg aaaagccctc tcttggttct gacttcctgt ccccccagtc 2040
[0255] cctctcagtc cctgcacctc ttctcctttc atgttgtcac tcctgteggg 雄cggg郷 2100
[0256] ccagcte皿g gtcatg皿g3 g卿attegg cacctgtgca tgctcagaac 2160
[0257] tttccattte actcttcctt cttctegcct gacttctegg cttgtccggg cttccttgag 2220
[0258] tgtcttcatg gateagtgga tgtctgggac cttegg卿g cccaagaact g郷cttgag 2280
[0259] tctcacacte gccagtte皿 cattctgcca gctgctgttt cccctcggca 2340
[0260] ggcc皿tgag ctgaggcact gtctgttctg teggcccagc atccaactca agtcaccctg 2400朋ccgggact ttttcacaag catgatttca aagaaagcct gategatgtg ttcgtcttea 2460
[0262] acttgtttca ggactgagtt 3g3gc皿3g3 te皿gagtcc cgggggttct tgtg卿rag 2520
[0263] 3g3C3tg朋C actgtgg皿g 3皿ggag皿g gagatctcag ggctteagga gtteattcct 2580
[0264] ggggtggggg aaatgttttt atettttect ttttecagat tgttgctttt ctecaatgte 2640
[0265] catetetttg caattgtett tgctgttttt ttttteaatc tcra皿te皿attgccacte 2700
[0266] tgcatgctct tggC皿3C皿gc 2722
[0267] 〈210>8
[0268] 〈211>1053
[0269] 〈212>DNA
[0270] 〈213〉鼠
[0271] 〈400>8
[0272] aatctggcct gattcctgat gga^cgcte gg卿3gC3g 60
[0273] ctgatctgcc ccatctgcct gg卿tgttt accaagcctg tggtcatcct gccctgccaa 120
[0274] cacaacctct gccgg皿gtg tgccaacgac atcttccagg ctgcgaatcc ctactggacc 180
[0275] ■ccgcggtg gctcagtgtc catgtctgga ggtcgtttcc gttgcccctc gtgccgccat 240
[0276] g^gtgatca tggaccggca cggggtgtac ggcctgcaga ggaacctgct ggtgg^^c 300
[0277] atcattgaca tctacaagca ggagtgctcc agtcggcccc tgC3g^3gg cagccacccg 360
[0278] atgtg固gg aacatctact gtctcacgtg tgaggtgcct 420
[0279] acttgctcct tgtg固ggt gtttggggct caccaggcct gtgaggttgc ccctttgcaa 480
[0280] agcatcttcc gactgagctg tctccatgct ggtggcgggg 540
[0281] ■cgaccgag tgcagacgat catctctcag ctggtggact cgtgc卿gt g3CC33gg3g 600
[0282] aatagccacc 郷tg皿gga ggagctgagt acaccctcta cgccatcctg 660
[0283] gatgag^ga 3g3gCg3gCt gctgcagcgg 3tC3CgC3gg g卿ctgggc 720
[0284] ttcatcgagg ctctgatcct ccagtecagg gagcagctgg ^^gtccac caagcttgtg 780
[0285] gagaccgcca tccagtccct ggatgagccc ccttcctctc ■gtgCC33g 840
[0286] cagctcatca agaagcctcc ^gggctgcc 3gCtgggg^ g3C3g3gC皿 ■
[0287] ggctttg卿 ctttactctg gactteg^c ggccttgagg 960
[0288] gccattgact ttgggac卿tg郷郷ag g郷agttte c卿卿gga ggctgatgag 1020
[0289] ga卿gggcg tgacc3C3g3 gggac3cc皿tea 1053
[0290] 〈210>9
[0291] 〈211>60
[0292] 〈212>DNA
[0293] 〈213〉人工序列
[0294] 〈400>9
[0295] gatcaaaaag cctccaagct gtgccttgtt caagagacaa ggcacagctt ggaggttttt 60
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