一种体外,斜牛下扩增人NK细胞的方法

财领域

本发明涉及免疫学与肝生物学领域，具微及有繊高NK细胞的^^其雑活性的一种 体外»^牛下扩增人NK细胞的方法。 背景駄

NK (自然雑，natural killer)细胞是机^Mg的免鄉胞，在棚中瘤、抗病#^免疫 中fe^重要的作用。由于NK细胞的，活性无MHC限制，因此称为自然杀伤。NK细胞的lE^tefc 要劍中瘤细胞、病^li^胞、鹏自身组织溯胞（如鹏胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体 抛中瘤、鹏染免疫的錢舰部分。由雅離点，NK细胞在细胞免疫治疗上有着广泛的应用 前景。但是A^卜周血中NK细胞的爐艮少（约占淋巴细胞的5%-20%)， M卜周血中分离NK细鹏 本昂贵，而且分离的NK细胞"i^P处于一瞎化拔态，在很^S上限制了雜临床上的应用。研 究显示，IL-2、 IL-12、 IL-15、 IL-18、 4-1BBL等细胞因子对促进NK细胞的分化成熟、活化、增 殖及细胞毒離有重要作用。多年来，人们一直尝试在体外培养^f牛下加戏些细胞因子，期望 能使NK细胞得到:AA的扩增。从以往的研^t看，采用向培养液中加Alffl胞因子的方法，夕卜周 血糊细胞（PBMC)敏14-21天的培养，會^f吏NK细胞扩增几十倍，^iiSlj50~60%。另外， ，灭活的K562细lfi^是IWr肿瘤细胞与PBMC共培养，也能使NK细胞扩增几十倍。但是， 这W增效果仍然不能满足实际的应用，总的说来，目前尚^有效的体夕hT增体系，所以NK细 胞的临床鹏受到了严重的限制。 发明内容

本发明提供了一W增人NK细胞的方法，使人PBMC中的NK细胞在体外培养^K牛下大规模 扩增，有«高服细胞的总量、纯度以^^活性。

本发明在体外培#^牛下扩增人NK细胞的方法是按如下技术方案实现的：采用基因工程的

3方法构建一种刺激NK细脏长的工翻胞，即把具有鹏NK细胞生长的厕细胞因子^ii在K562 细胞的膜表面，构建了敏几种细胞因子的工程细胞。紅程细flS^！ y射线赚灭活后与人PBMC 在体外进行共培养，结果表明这种刺激方法比目前已有的单纯向培养液中加入可溶性细胞因子的 扩增鄉要5肌百倍，紐3周的歸，PBMC中的非NK细鹏本上死t^失，NK细胞大難殖， NK细fl^ii?lj了 96%以上，NK细脱总W增了 1500倍以上。

本发明,的体夕hT增人nk细胞的方法的，征是，采用基因工程方法构建,的刺激细 胞，{狄PBMC中的NK细胞在体夕附定的線^f牛下与麟的刺鄉鹏同培养的雖中得到大 规模的扩增。m的刺鄉胞是指細基因工程的方法在传^HB^面分别鋭人IL-2、 IL-12、 IL-15、 IL-18、 4-1BBL五种细胞因子，^a几种细胞因子的传代细胞可以是K562细臓HFWT 细胞；特定的歸剝牛包括配第IJ^的培鎌。

本发明,的体夕HT增人nk细胞的方法的，征是在传^ffl胞表面，人il-2、 il-12、 IL-15、 IL-18、 4-lBBL几种细胞因子，是在基因水平将IL-2、 IL-12、 IL-15、 IL-18四种细胞因 子的基因分别与一mJ^膜蛋白的基因拼接。4-1BBL本身含有跨膜区，故不与跨膜蛋白的基因皿， 用其自身鎌的基因。随后将S^因分别克隆到餓^i^体pcDNA3.1，再转染K562细胞，构 建了麟的刺鹏胞。跨膜蛋白是指当IL-2、 IL-12、 IL-15、 IL-18基因与跨膜蛋白基因融合表 达后，倉辦将IL-2、 IL-12、 IL-15、 IL-18蛋白锚定在^ii^W^刚的一类蛋白。

本发明中在体外麟剝牛下扩增人NK细胞的方法具有以下优点：NK细胞的扩增倍,到了 显著繊高，比单纯向i^^中掺入可溶性IL-2、 IL-12、 IL-15、 IL-18鹏纯K562要高几百倍; 并且，提高了nk细胞的，，扩增获得的服细«©可以超1』96%;与夕卜周血中直接分离的NK 细胞相比，按本发明扩增的NK细I6^活性提高20倍、y 4職^i魏力口 300多倍，魏NKp46 離性受体的服细綠0.31%提高到65%，相差约200倍。

本发明中扩增人NK细胞的关键是用人PBMC为原始材料，在特定的斜牛下把PBMC与采用基 因工程的方法构建的刺,胞一起培养。Tffi结合实施例具体介绍本发明中在体夕hT增人NK细胞的旅。

实施例l: CD8 a ^i^膜区基因的克隆。

为了倉辦将IL-2、 IL-12、 IL-15、 IL-18细胞因子以膜蛋白形式^ii在K562细胞的膨卜层， 首先^S些细胞因子的M卜部分分别与CD8 a链跨膜区基因融合。 ，的CD8 a ^!^膜区基因(CD8tm)为：

CD8加是用下面的两段蹄,合成的： CD8F: 5， tcggatcctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactgg 3， CD8R: 5， atgcggccgcttagcagtaaagggtgataaccagtgacaggagaaggaccccacaagtcccgg 3，

这两段核苷^iii3I火、延伸得到了鎌的CD8 a ^!^膜区基因，基因的5'端和3'端分 别引入了 BamH I和Not I酶切位点。利用这两个酶切位点，将CDS a ,膜区基因克隆至 pcDNA3. l+/Neo ，,载体上，测序正确后备用。构建含CD8 a ,膜区基因的载体称为： pcDNA3. KD8。

实施例2: IL"2、 IW2、 IL"15、 IL48基因在K562细鹏上的就。

采用RT-PCR的方、M别从人PBMC中提取mRNA，扩增IL-2、 IL-12、 IL_15、 IL-18的cDNA。

扩增IL^2的上游引物是IL"2F: 5'tegctagcatgtacaggatgcaactectg3，，下游引物是IL-2R: 5'toggatcc

agteagtgttgagatgatgc 3，，上下游弓l物中分别弓l入了 Mie I和BamH I酶切位点；

扩增IL-12的上游引物是IL-12F: 5'tagctagcatgtggccccctgggteagcct3，，下游引物是IL42R: 5，

toggatecggaagcattcagatagctc 3，，上下游弓l物中分别引入了 Nhe I和BamH I酶切位点；

扩增IL45的上游引物是IL-15F: 5'togctagcalgagaatttogaaaccacatttgag3'，下游引物是IL45R:

5' teggatecagaagtgt^tgaacatttggac3'，上下游弓l物中分别弓l入了 Nhe I和BamH I酶切位点；

扩增IL-18的上游引物是DU8F: 5'togctagcatggctgctgaaccagtagaagac3，，下游引物是E^18R:

5， teggatec gtottogttt^aacagtgaaarttatag 3，，上下游弓l物中分别弓l入了 Nhe I和BamH I酶切位点；

扩增的IL-2、IL"12、IL45、IL-18 cDNA用Nhe I和BamH I双酶切后分别克隆到pcDNA3.1《D8载体中CD8a^^膜区基因的上游，然后分别转染K562细胞，G418繊单个克,胞，抗体染 色鉴定，最后分别获得了以跨鹏:^felL-2、 IL-12、 EL-15、 IL-18的K562工程细胞（刺激NK 细胞扩增的K562细胞)。

IL"2与CD8a^^膜区的融合基因（IL^2CD8)序列为：

gctagcatgtecaggatgcaactoctgtottgcattgcactaagtottgcact^toacaaacagtgcacctacttcaagttetacaaagaaaacacagctacaa

ctggagcatttactgc^atttaca^^attttgaatggaattaataattacaagaatc

ccaa^tcaccaggatgotcacatttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatctteagtgtctagaa

gaagaactcaaacctctg^ggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggacttaatcag

caatatcaacgtaatagttc^gaactaaagggatctgaaacaacattcatgtg^aatatgctgatgagac^caacca

ttgtagaatttc^aacaga^gattaccttttgtcaaagcatcatctcaacac^actggatcctacatctgggcgccct^gcc^gacttg^gggtccttctc

ctgtc^tggttatoaccctttactgctaagcggccgc

IL42与CD8(xa^膜区的融合基因（IL"12CD8)序列为-

gctagcalgtggccccctgggtc^cctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtc%catccagcggctcgccc^t glccctgcag^ccggctcagca^lgtccagcgcgcagcctcctccttgggctaccctggtcctcc^gaccacctca gtt^gcc^aaacctccccgtggccactcc^acccaggaatgdccca^ccttcaccactcccaaaacctgctgagg fficgtcagcaaca^ctccaga^gccag^caaactctagaattttacccagcacttctgaagagmtffltca^aaga

gcctggcctocagflaagacctcttttatg3tggccc^ccttagtagt

gcaggccdgaatdcaacagtgagactgtgccacaaa gctctgcatacttcttcatgctdcag^attcgggca gcttccggatcctacatc^ggcgccct^gccgggacttg^gggtccttctectgtcactggttatcaccctttac^ctaagcgg ccgc

IL-15与CD8a^l^膜区的融合基因（IL"15CD8)序列为-

gctagcatgagaatttcgaaaccacatHgagaagtatOccatccagtgctacttgtgdtacttctaaacagtcattttctaac^aagct^cattca^tcttcatt ttgggctgtttcag^cagggcttectaaaacag3Hgccaactgggtgaa^taata^tgatt^aaaaaat^aagatcUattcaatctatgcatattgatgc tactttatatec鹏aagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaa^aagtgcfflctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtat tcatgatacagtagaaaatctgatcatoctagcaaacaacagtttgtottctaatgggaatgtaacagaatctg^^caaagaatgtgaggaactggaggaaa aaaatattaaagaatftt^cag^ttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttc^gatcctacatctgggcfficcttggccgggacttgtggggtccttctoctgtca c^ggQatcaccctttac^gctaagc銘ccgc

IL"18与CD8aHl^膜区的融合基因（IH8CD8)序列为:ttatcaccctttactgotaa^:ggccgc

实施例3:冬1BBL基因在K562细M上的表达。

44BBL本身就Ji^膜蛋白，不需要和CD8(x^5^膜区基因融合，直接克隆到pcDNA3.H/Neo 餓S^体即可。44BBL基因的扩增与i^m胞因子扩增相同，也j^ffl RT-PCR的^法从人 PBMC中获f媒mRNA。扩增44BBL的上游引物是4"1BB-F: 5，tcgctagcatggaatecgcctotg9cgcttcac3，， 下游引物是44BB"R: 5，togg3tottattccgacctoggtg3aggpg3，， ^i:下游引物中分别引入了Nhel和BamH I酶切位点；扩增的4■lBBLcDNA用NheI和BamHI■切后克隆到pcDNA3.1+/Neo载体中，然 后分别转染K562细胞，G418筛选单个克隆细胞，抗体染色鉴定，最后获得了以跨膜形式毅 4"1BBL的K562工程细胞（刺激NK细胞扩增的K562细胞)。 ，的4"1BBL基因为：

gccttgggccctggtcg^gggc^p^gctgctgctgctcgc^ccgcctgcgccgtcttcctcgcctgcccc^gg ccg^gtccggggctcgcgcctcgcccggctccgpggccagcccgag9ctocgcgagggtcccgagctttegcccgacgat ca^o^gpctetiggacctgcggp^ggcalgtttgpgcag!Clgg(ggcccaaaalgdctgctplcgalgggcccct g3gc^gtacag^cccaggcctggcaggcgtgtccc^acggggggx^agctacaa^3ggacacgaaggagc^g

gtttcacttjgpgctgpacctgcagccactgggc1c1gptgctggggccgccgccc%gctttgaccgtggacc^ccacc

cgcctcctccg^ggctcggaactcggccttcggtttccagggccgct^c^cacc^ag^ccggccagcgcctgggcg

tccatcttcacactgaggccagggcacgpcatgcc^gcagcttacccagggcgccac^tct^ggactcttccggg^

acccccgaaalcccagcpggactcccttcaccgaggtcggaalaaggatcc 实施例4: NK细胞的体夕hT增培养。

M^的M^PBMC分为两份，其中一份用于^;细胞仪分析扩增前NK细胞的含量与表 面丰琉，另一份加入24孔培鎌中，銜L3万个细胞，同时加入等量的经IO, 000rad的Y射线 灭活的K562工程细胞ClL-12、 IL-15、 IL"18、 4^1BBL的K562工程细胞，或IL-2、 IL-12、 IL-15、 IL-18、 44BBL的K562Ig细胞)。37。C二氧化碳孵箱蹄，每三^f孔中的液体进行半 量换液，扩增培养21天。培,为含10Q/。小牛血清的RPM1640、 100IU/ml的IL>2。用M细胞 仪分析扩增培养的细胞中NK细胞的含量与表面标记。以CD56+CD3-作为NK细胞的»标记。 结果表明扩增前NK细胞在PBMC中的含量为6。/。，经过21天的扩增后，NK细胞的纯度 H^12、 IW5、 IM8、 4-1BBL的K562工程细胞'剌酶为95%，'敬IL"2、 IW2、 IW5、 IL48、

7"BBL的K562工程细胞'刺、鹏为93%。 NK细胞的数ft!A扩增初的3万/孑UU扩增后的5千万 和5-5千万，分别扩增了 1666倍和1833倍。 实施例5: NK雑離实验

'就11^12、 IL-15、 H8、冬1BBL的K562工翻胞，刺激组扩增的NK细胞以及'魏IL"2、 IL-12、 IL>15、 IL-18、 44BBL的K562工禾麴胞，刺鹏扩增的NK细胞，分别与K562细胞作用， 观察NK细胞对K562细胞的，率。NK细胞（，细胞）与K562细胞（耙细胞）的比例为5:2。 ^ffl胞与,胞37'C二氧化碳孵箱孵育4小时后加入甲謝禺氮唑盐(methy 1hiazolyl tetrazolium ， MTT)再孵育4小时，570nm波长测OD值并计算維率。雑率（％) = (1—(^ffl勵卩, 胞孔的OD值—^a胞孔OD衝/ ,胞孔OD值）xl00%;'魏IL-12、 IW5、 IL"18、 44BBL 的K562工禾翻胞，刺、^a扩增的NK细胞的雑率为80%，'鋭IL-2、IL-12、IL45、IL48、冬1BBL 的K562工禾魏胞'刺^i扩增的NK细胞的雑率为85%。说明书與虫部分„列表

<110>江门罗森生物制I9W限公司

<120> —种体外培养剝牛下扩增人NK细胞的方法

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18

DNA

<213> CD8 a鹏膜区

<220> <221> <222> <223> <400> 1 gga tcc Gly Ser

etc ctg Leu Leu

CDS

(1)...(78)

tac ate tgg Tyr lie Trp 5

tea ctg gtt Ser Leu Val 20

gcg ccc ttg gec ggg act tgt ggg gtc ctt 45 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

10 15 ate acc ctt tac tgc taa gcg gec gc 86 lie Thr Leu Tyr Cys *

25

<210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <400>

CD8F

2

teggatccta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg 60

<210> 3

<211>

<212>腿

<213> CD8R

<220>

<221>

<222><223> <■> 3

atgcggccgc ttagcsgtsa 3gggtgsta3 ccagtgacsg gsgaaggacc ccacaagtcc 60 egg 63

<210> 4 <211> <212> DNA <213> LL-2F <220> <221> <222> <223> <400> 4

tcgctagcat gtacaggstg caactcctg 29

<210> 5 <211> <212> DNA <213>化-2R <220> <221> <222> <223> <400> 5

tcggatccag tcagtgttga gatgatgc 29

<210> 6 <211> <212> DNA <213>工L-12F <220> <221> <222> <223> <400> 6

tsgctagest gtggccccct gggtcagcct 30

<210> 7 <211> <212> DNA <213> ILi-12R <220> <221> <222> <223> <機> 7

tcggatccgg aagcattcag atagctc 27<210> 8 <211> <212> DNA <213> IL-15F <220> <221> <222> <223> <400> 8

tcgctsgcat gagastttcg aaaccacatt tgsg 34

<210> 9 <211> <212> DNA <213> IL-15R <220〉 <221> <222> <223> <400> 9

tcggatccag aagtgttgat gaacatttgg ac 32

<210> 10 <211> <212> DNA <213> IL-18F <220> <221> <222> <223> <400> 10

tcgctagcat ggctgctgsa ccagtagaag ac 32

<210> 11 <211> <212> DNA <213> i:L-18R <220> <221> <222> <223> <400> 11

tcggatccgt cttcgttttg ascsgtgsac attatag 37

<210> 12 <211> <212> DNA <213>化-2CD8 <220><221>

<222> (7)...(543>

<223>

<■> 12

get age atg tac agg atg caa etc ctg tct tgc att gca eta agt 45 Met Tyr Arg Met Gin Leu Leu Ser Cys lie Ala Leu Ser 15 10 ctt gca ctt gtc aca sac sgt gca cct act Leu Ala Leu Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr

15 20 25

333 sea cag ct3 ess ctg gsg cat tta ctg Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu

30 35 40

att ttg aat gga att ast ast tac 33g ast lie Leu Asn Gly lie Asn Asn Tyr Lys Asn

45 50 55

atg etc acs ttt asg ttt tac atg ccc aag Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

60 65 70

aaa cat ctt csg tgt eta gas gas gaa etc !Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu

75 80 85

gtg eta 33t tts get C33 age aaa sac ttt Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe

90 95 100

gac tt3 stc age 3at stc sac gta sta gtt ctg gaa ct3 aag gga 360 Asp Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie Val Leu Glu Leu Lys Gly

105 110 115

tct gaa acs acs ttc atg tgt gsa tat get gat gag aca ges acc 405 Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr

120 125 130

att gts gaa ttt ctg asc sga tgg stt acc ttt tgt caa age ate 450 lie Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Cys Gin Ser lie

135 140 145

ate tea aca ctg act gga tec tac ate tgg gcg ccc ttg gcc ggg 495 lie Ser Thr Leu Thr Gly Ser Tyr lie Trp Ala Pro Leu Ala Gly

150 155 160

act tg^ 999 ctt ebc ctg tea ctg g^b ate acc ctt tac tgc 540 Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val lie Thr Leu Tyr Cys

165 170 175

taa gcg gcc gc 548

★

<210> 13

<211>

<212> DNA

<213> I1>12CD8

<220>

<221>

12

tcs sgt tct 3C3 3sg 90 Ser Ser Ser Thr !Lys

ctg gat tta cag atg 135 Leu Asp Leu Gin Met

ccc asa etc sec sgg 180 Pro Lys Leu Thr Arg

sag gcc aca gaa ctg 225 Lys Ala Thr Glu Leu

aaa cct ctg gsg gaa 270 Lys Pro lieu Glu Glu

cac tta aga ccc agg 315 His Leu Arg Pro Arg<222> (7)...(843)

<223>

<機> 13

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45 50 55

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60 65 70

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75 80 85

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90 95 ■

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105 110 115

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120 125 130

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135 140 145

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

gag act gtg cca caa aaa tec tec ctt gsa gaa ccg gat ttt tat 675 Glu Thr Val Pro Gin !Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr

210 215 220

aaa act aaa ate aag etc tgc ata ctt ctt cat get ttc aga att 720Lys Thr Lys lie Lys Leu Cys lie

225 230 egg gca gtg act att gat aga gtg Arg Ala Val Thr lie Asp Arg Val

240 245 gga tec tac ate tgg gcg ccc ttg Gly Ser Tyr lie Trp Ala Pro Leu

255 260 etc ctg tea ctg gtt stc acc ctt Leu Leu Ser Leu Val lie Thr !Leu

270 275

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235

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Tyr Cys *

<210> 14

<211>

<212> DNA

<213>化-15CD8

<220>

<221>

<222> (7)...(570)

<223>

<■> 14

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15 20 25

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75 80 85

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90 90 100

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120 125 130

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aac act tct gga 495

Asn Thr Ser Gly

ggg gto ett etc 540

Gly Val Leu Leu

gcc gc 578

<210> 15

<211>

<212> DNA

<213> IL-18CD8

<220>

<221>

<222> (7)...(663>

<223>

<400> 15

get age atg get get gsa cca gt3 gaa gac aat tgc 3tc aac ttt 45 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys lie Asn Phe 15 10 gtg gca atg aaa ttt 3tt gac aat scg ctt tac ttt ata get gaa 90 Val Ala Met Lys Phe lie Asp Asn Thr Leu Tyr Phe lie Ala Glu

15 20 25

gst gat gss aac ctg gaa tea gst tac ttt ggc aag ctt gsa tct 135 Asp Asp Glu Asn Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser

30 35 40

sas tts tea gtc ats sga ast ttg ast gac caa gtt etc ttc att 180 Lys Leu Ser Val lie Arg Asn Leu Asn Asp Gin Val Leu Phe lie

45 50 55

gac ess gga aat egg cct eta ttt gaa gat 3tg 3ct gat tct gac 225 Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp

60 65 70

tgt aga gat sat gca ccc egg acc at3 ttt stt ata agt atg tat 270 Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr lie Phe lie lie Ser Met Tyr

75 80 85

aaa gat age cag cct ags ggt atg get gta act ate tct gtg asg 315 Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala Val Thr lie Ser Val Lys

90 95 100

tgt gsg aaa stt tea act etc tec tgt gag 33c ass stt att tec 360. Cys Glu Lys lie Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys lie lie Ser

105 110 115

ttt sag gsa 3tg 33t cct cct gat sac ate sag gst acs asa sgt 405 Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn lie Lys Asp Thr Lys Ser

120 125 130

gac ate ata ttc ttt cag aga agt gtc ccs ggs cat gat 33t 33g 450

15Asp lie lie Phe Phe Gin Arg Ser

135 140 3tg caa ttt gsa tct tcs tea tsc Met Gin Phe Glu Ser Ser Ser Tyr

150 155 gs3 333 gsg sgs g3c ctt ttt 333 Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe :Lys

165 170 gaa ttg ggg gat aga tct ata atg Glu Leu Gly Asp Arg Ser lie Met

180 185 gga tec tac stc tgg gcg ccc ttg Gly Ser Tyr lie Trp Ala Pro Leu

195 200 etc ctg tea ctg gtt ate acc ctt Leu Leu Ser Leu Val lie Thr Leu

210 215

Val Pro Gly His Asp Asn Lys 145

gaa gga tac ttt eta get tgt 495 Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys 160

etc att ttg aas asa gag gst 540 lieu lie Leu Lys Lys Glu Asp 175

ttc act gtt caa aac gaa gac 585 Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 190

gcc ggg act tgt ggg gtc ctt 630

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu 205

tac tgc taa gcg gcc gc 671

Tyr Cys *

<210> 16 <211> <212> DNA <213> 4-1BB-F <220> <221> <222〉 <223> <400> 16

tegctagcat ggaatacgee tetgacgett cac 33

<210> <211> <212> <213> <220〉 <221〉 <222> <223> <400>

17 DNA

4一1BB—R

17

teggatcett attccgacct cggtgaaggg ag 32

<210> 18 <211〉

<212> DNA

<213> 4-1BB-R <220> <221>

<222> (7)...(624)

<223〉

<400> 18

16get age 3tg gsa tsc gcc tct gac get tea ctg gac ccc g3a gcc 45 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala 15 10

ccg tgg cct ccc gcg ccc cgc get cgc gcc tgc cgc gta ctg cct 90

Pro Trp Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro

15 20 25

ccc gsc gst ccc gcc ggc etc ttg ctg egg cag ggc atg ttt 135

Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gin Gly Met Phe

30 35 40

gcg cag ctg gtg gcc C33 gtt ctg ctg stc gat ggg ccc ctg 180

Ala Gin Leu 45 Val Ala Gin 50 Asn Val Leu Leu 55 lie Asp Gly Pro Leu

age tgg tsc agt CC3 ggc ctg ges ggc gtg tec ctg scg ggg 225

Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly

60 65 70

ggc ctg age gsg gac 3cg aag gsg ctg gtg gtg gcc 270

Gly Leu Ser Tyr I>ys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys

75 80 85

get gg3 gtc t3C t3t gtc ttc ttt cts gsg ctg egg cgc gtg 315

Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gin Leu Glu Leu Arg Arg Val

90 95 100

gtg gcc ggc ggc ggc tec gtt tC3 ctt gcg ctg C3C ctg 360

Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu

105 110 115

cag cca ctg cgc tct get get ggg gcc gcc gcc ctg get ttg 3CC 405

Gin Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr

120 125 130

gtg gsc ctg CC3 ccc gcc tec tec get egg 33C teg gcc ttc 450

Val Asp Leu 135 Pro Pro Ala 140 Ser Ser Glu Ala Arg 145 Asn Ser Ala Phe

ggt ttc cag ggc cgc ttg ctg C3C ctg agt gcc ggc cag cgc ctg 495

Gly Phe Gin Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gin Arg Leu

150 155 160

ggc gtc cat ctt gsg gcc 3gg gca cgc est gcc tgg csg 540

Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gin

165 170 175

ctt sec csg ggc gcc gtc ttg etc ttc egg gtg 3CC ccc 585

Leu Thr Gin Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro

180 185 190

gsa 3tC CC3 gcc gg3 etc cct ccg 3gg teg gsa tec 630

Glu lie Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

195 200 205

17