尽管病毒型载体业已显示有效将治疗性DNA递送至包括心血管 系统、肺、肾和肿瘤在内的各种组织中，但是主要的顾虑仍然在于使 用腺病毒和逆转录病毒的安全性，这些病毒可能会引起免疫应答和具 有插入突变潜在性[1，2]。为了克服这些缺点，业已报道了几种非病毒 方法，包括脂质型载体体系和电穿孔法。最近，我们和其它研究者已 报道超声微泡在肾、心血管组织和肿瘤中显著提高基因转染率[3-12]。 然而，将超声微泡介导的基因/药物治疗用于腹膜疾病(包括腹膜纤维 化，术后腹膜粘连，腹膜炎和腹膜肿瘤)还没有报道过。
超声本身被认为是对人体无害的，广泛用于许多临床目的，包括 物理治疗，诊断，指导深部器官活检，局部药物递送和遗传物质递送， 在美国专利第5,190,766号中已有描述。根据在美国专利中所描述， 大部分微泡造影剂还是安全的试剂且广泛应用于临床，其中包括含气 脂类(美国专利第5,580,575号)和白蛋白微泡如Optison[13-16]。大部 分微泡在室温都为液态，但体温中它们变成具有平均3μm直径的含气 微泡。微泡有弹性且可压缩，是超声的有效反射物。
微泡通过在超声束中共振；根据声波的压力变化快速收缩和膨胀 来发挥作用。微泡可通过自身和作为携带药物或遗传物质的媒介帮助 药物送递，用于位点特异性治疗和基因治疗[13-16]。
利用超声微泡技术转移基因的明确机制仍基本未知。它可与声孔 效应、超声机械指数和超声频率[15，16]有关。基于超声的策略原理 是使用超声造影剂降低由超声能量引起的空化阈值。利用微泡和包被 物质的物理性质，可将基因引入(incorporate)超声造影剂中[13，14]。
可经静脉内或局部注射荷有基因的微泡，再将超声能量施用到所 述靶区域。随着微泡进入超声作用区域，它们空化并局部释放 DNA[13，14]。空化也有可能引起局部冲击波增加细胞通透性，从而 提高细胞内的DNA摄取[13-16]。扫描电镜术也可证明，超声连同微 泡(Optison)在细胞表面瞬时形成在24小时内不再能检测的孔(＜5μm) [17]。
在患有晚期肾病并接受最方便价廉的肾脏替代疗法：持续腹膜透 析(PD)的患者中，腹膜炎/纤维化是常见的并发症。它是PD技术失效 的主要原因，导致这些PD患者改换更昂贵的血液透析。另外，腹膜 粘连也是一种纤维化病变，其发生在相当大比例的接受腹部外科的患 者中，并促使各种并发症包括肠梗阻、女性不育症和慢性腹痛，导致 高发病率和死亡率以及造成卫生保健的高额支出。我们已经表明，腹 膜纤维化由称为转化生长因子β(TGF-β)的纤维生成介质通过其下游 信号通路激活Smad2/3来介导。本发明提供了由超声触发的、荷有基 因的微泡来局部释放名为Smad7的抗纤维化和抗炎基因，以特异性抑 制TGF-β/Smad信号途径，从而抑制腹膜纤维化以及在各种疾况下与 长期腹膜纤维化相关的腹膜炎。
发明简述
本发明提供了一种方法，用于将一种或多种基因、DNA分子或质 粒递送至患者腹膜区来治疗其中的腹膜疾病，该方法包括提供含有一 种或多种用来治疗腹膜疾病的基因、DNA分子或质粒的微泡来源；向 患者腹膜区灌注所述微泡；将充足超声能量提供给腹部区，以使所述 一种或多种基因、DNA分子或质粒从微泡转染至腹膜区，以渗透其中 构成的腹膜组织。
附图简述
通过阅读以下优选实施方案的详细描述以及附图，本发明进一步 的特征和优点将是显而易见的，所述附图为：
图1显示显微照片和功能数据表明本发明的超声微泡治疗腹膜组 织的安全性。
图2显示超声微泡介导的Smad7转基因在腹膜组织中表达的效 率，其通过抗-flag-m2Smad7免疫染色和RT-PCR(B)证明，其中U表 示尿毒症，PD表示腹膜透析，CV表示对照载体。
图3通过蛋白印迹和RT-PCR，证明超声微泡介导的Smad7基因 疗法阻断腹膜TGF-Smad信号转导(p-Smad2/3)的激活而不阻断其表达 的机制。
图4揭示了超声微泡介导的Smad7基因疗法在腹膜透析期间促进 腹膜功能的疗效。
图5显示组织学和免疫组织化学的显微照片，通过Mason三色染 液(蓝色)染色和胶原蛋白I免疫染色(棕色)，表明超声微泡介导的 Smad7基因疗法抑制与尿毒症大鼠中腹膜透析相关的腹膜纤维化。
图6是半定量数据，显示了在腹膜透析期间超声微泡介导的 Smad7基因疗法通过抑制胶原蛋白I和胶原蛋白III的mRNA和蛋白 表达，来阻滞腹膜纤维化。
图7是半定量数据，显示了在腹膜透析期间超声微泡介导的 Smad7基因疗法通过阻断α-SMA+肌成纤维细胞和纤连蛋白表达来抑 制腹膜纤维化。
图8显示了在超声微泡介导的Smad7基因治疗之后，组织学和免 疫组化的显微照片。根据Mason三色染液(蓝色)和胶原蛋白I免疫染 色(棕色)表明，该疗法抑制了与术后腹膜粘连相关的腹膜纤维化。
图9是定量实时PCR数据，显示了超声微泡介导的Smad7基因 疗法通过阻断胶原蛋白I、胶原蛋白III、α-SMA和纤连基因表达来 抑制与术后腹膜粘连相关的腹膜纤维化。
优选实施方案详述
本发明提供了一种方法，用于将一种或多种基因、DNA分子或质 粒递送递送至患者腹膜区来治疗患者腹膜疾病，该方法包括提供含 有一种或多种用于治疗腹膜疾病的基因、DNA分子或质粒的微泡来 源；将微泡灌注至患者腹膜区；给予腹部区充足超声能量，以使所述 一种或多种基因、DNA分子或质粒微泡破裂，允许其穿透其中构成 的腹膜组织。
优选所述微泡为大量成膜蛋白(filmogenic protein)包裹的不溶性 微泡，并充有不溶性全氟化碳气体，例如(不限于)全氟甲烷，全氟乙 烷，全氟丙烷，全氟丁烷或全氟戊烷。在一个实施方案中，所述微泡 直径为约1-约5微米。
所述超声能量应优选按约0.5-约5MHz的频率给予腹膜区，且应 足以使患者腹膜腔(包括腹膜壁和肠系膜在内)中的所述微泡破裂。普 通技术人员应能理解，应对所施用的超声能量的量进行调整，使之足 够降解、胀裂、破裂或分裂微泡，而不造成对腹膜区或包裹在微泡内 的DNA的损伤。所述DNA应能从微泡释放至邻近腹膜组织，在那里 它能被病变细胞和其它细胞吸收，而该DNA或其自身可掺入到或转 染至宿主细胞基因组。
利用本发明可治疗的腹膜疾病包括腹膜腔内的炎症、纤维化、术 后腹膜粘连或癌症。腹膜疾病可由腹膜输注/透析、手术、创伤、感染、 遗传或系统性疾病引起或与它们相关。
重要的是，所述一种以上DNA分子或质粒包括：寡核苷酸、DNA、 DNA质粒、siRNA、shiRNA和微小RNA。在一个实施方案中，所述 DNA分子是SMAD7转基因，而在优选实施方案中，所述DNA分子 为SMAD7 cDNA。
因此，本发明提供了用于预防和治疗腹膜疾病(如腹膜炎/纤维化 和术后腹膜粘连)新方法，其利用超声介导并涉及使靶基因从含气微泡 局部释放至腹膜组织。本发明有几个优点。
超声微泡介导基因疗法用于腹膜纤维化是安全的，因为它既不会 造成可检测的组织学和功能上的损伤，也不会对正常腹膜组织有细胞 毒性。将小DNA分子连同造影剂注射进腹膜腔中，随后以1MHz、2 W/cm2的物理治疗水平进行经皮肤超声。此外，在进行超声辐照时通 过将温度控制在约37℃，避免超声诱导的热量对组织的损伤也是可行 的。我们发现，能量输出为2W/cm2、辐照间隔时间为30秒、总时间 为4-6分钟，对于超声直接辐照皮肤而言是安全的。
本发明的重要优点在于超声介导的基因转移至腹膜组织是暂时 的或瞬时的，所述转染的Smad7基因在该腹膜组织中3-4周内将会逐 渐降解，在14天时再次进行基因转移以维持高水平Smad7是可行的。 这表明与基于病毒的技术介导稳定转基因表达所不同的是，超声可不 将靶基因引入基因组。这可解释为什么超声介导的是暂时转基因表 达。同样地，就根据先前报道[1，2]的插入诱变潜在性而言，病变组 织中Smad7转基因的瞬时表达表明超声介导的基因转移比基于病毒 的方法更安全。高基因转染率是超声微泡介导基因转染的第二个优 点。事实上，我们发现超过80％的腹膜细胞转染有Smad7基因，这与 我们之前报道一致，即在正常和患病大鼠肾的不同细胞类型中超声使 基因转染率显著增至约1000倍[10-12]。
使用本发明基因疗法的另一重要优点是：利用本发明中阐述的诱 导型基因疗法来将病变组织中所转染基因的表达控制在治疗水平内， 并且不产生副作用。例如，虽然Smad7基因的过表达能够阻断 TGF-β/Smad信号转导和阻滞组织瘢痕化，但是据表明由多西环素 (doxycycline)诱导的Smad7在肾中的加强表达会导致大量细胞凋亡和 急性肾损伤。因此，将Smad7基因表达水平控制在治疗水平，而在尝 试过表达Smad7时使副作用最小化是至关重要的。
本发明的另一方面是以下的局部疗法：通过直接注射Smad7基因 和微泡造影剂的混合物至腹膜腔，随后经由腹部皮肤直接进行超声局 部治疗。这显著增强了局部疗效，同时使经静脉途径系统给予药物或 基因所致的副作用最小化。
对于腹膜疾病而言，从荷有基因的微泡至局部腹膜组织的超声介 导基因转移是安全有效的疗法。作为液体或白蛋白形式的含气微泡(直 径3μm)能携带药物/基因以形成荷有药物/基因的微泡[13-16]。微泡有 弹性、可压缩并且是超声的有效反射物。微泡通过在超声束中共振； 根据声波的压力变化快速收缩和膨胀来发挥作用，导致由超声能量引 起的空化阈值的降低[13-16]。可经静脉内或局部注射荷有基因的微泡 并将超声能量施用到靶区域。随着微泡进入超声作用区域，它们空化 并局部释放DNA和药物。空化也有可能造成增加细胞通透性的局部 冲击波，因而提高细胞内摄取DNA[13-16]。
在本研究中，将pcDNA3中的于NH2端具有flag标签(m2)的鼠 Smad7 cDNA亚克隆至四环素诱导型载体pTRE中，得到 pTRE-m2Smad7。为了实现多西环素(四环素衍生物)诱导Smad7转基 因表达，使pTRE-m2Smad7和改良的pTet-on载体：pEFpurop-Tet-on 共转染至腹膜腔。在试点研究中，我们发现，在转染后第二天观察到 外源Smad7在腹膜组织中的基因表达高峰，且转基因表达以时间依赖 的形式减少。为了确保转染的有效性，在PD的第1天和第14天将外 源Smad7施用到尿毒症大鼠的腹膜腔中。接受了无Smad7插入的空 载体的PD尿毒症大鼠作为治疗对照。转染的过程如下。使大鼠吸入 异氟烷进行麻醉。将质粒和微泡(Optison，Amersham Health Inc.， Princeton，NJ，USA或者SonoVue，Bracco International B.V.，Amsterdam， Netherlands)的混合物按1∶1体积比制备。然后立即将含有100ug质 粒的混合溶液注射至腹膜腔。然后将介导超声的凝胶施用到祛毛的腹 部皮肤。超声换能器(Sonitron 2000，Rich-Mar Corp.，Inola，Oklahoma， USA)以输入频率1MHz、输出强度2W/cm2、工作比(duty cycle)20％ 间隔30s总时为4分钟直接施用到腹膜壁上。在所述基因转移步骤之 后，注射1毫升的多西环素(500μg/ml，Sigma)至腹膜腔以诱导Smad7 转基因表达，随后饮用水中以200μg/ml多西环素来维持转基因表达 的诱导作用。
用于腹膜纤维化的超声微泡介导的基因疗法的安全性是本发明 的最重要方面。用于腹膜纤维化的超声微泡介导的基因疗法是安全 的，因为它是非侵袭性的；通过将小DNA分子与造影剂注射进腹膜 腔中，随后以1MHz、2W/cm2的物理治疗水平进行4分钟经皮肤的 超声处理，既不会造成可检测的组织学和功能上的损伤，也不会对正 常腹膜组织有细胞毒性。超声本身被认为是对人体无害的，并广泛用 于许多临床目的，包括物理治疗、诊断、指导深部器官活检、局部递 送药物和遗传物质[13-16]。所述微泡造影剂也是安全的，且广泛应用 于临床。业已充分证明的是，微泡能通过自身帮助药物递送，并作为 携带药物或遗传物质的试剂用于位点特异性治疗和基因疗法[13-16]。 此外，腹膜腔内注射小DNA也是安全的。在进行超声辐照时通过将 温度控制在约37℃避免由超声引起的对组织的热损伤也是可行的。 我们发现能量输出在2W/cm2、辐照间隔时间为30秒、持续至多6分 钟对于超声直接辐照皮肤而言是安全的。如图1所示，不存在可检测 到的、与超声微泡治疗有关的组织学或功能损伤。最重要的是，我们 还发现进入腹膜组织的超声介导的基因转移是暂时性的，这与临床治 疗相似。经转染的Smad7基因在该腹膜组织中于3-4周内逐渐降解， 因其实用且无侵袭性，在14天时再次进行基因转染以维持高水平 Smad7是可行的。这表明，与基于病毒的技术介导稳定转基因表达不 同的是，超声可不将靶基因引入基因组中。这可解释为什么超声介导 暂时的转基因表达。同样地，就插入突变的潜在性而言[1，2]，病变 组织中Smad7转基因的瞬时表达表明，超声介导的基因转移比基于病 毒的方法更安全。总体而言，所述超声微泡基因治疗方法是安全的。
由超声微泡系统介导的高基因转染率是本发明的另一个显著优 点。长期以来业已表明，低基因转染率是使用非病毒型基因递送系统 例如裸DNA和脂质体时的主要缺点。通过超声引发使基因从微泡中 释放的高基因转染率通过以下结果得以证实：超过80％的表面间皮细 胞层腹膜细胞和亚间皮细胞(submesothelial cell)呈flag-M2 Smad7转基 因阳性(图2A)，导致Smad7的显著上调(图2B)，这是抗腹膜纤维化 的关键机制，因为Smad7的过表达可通过抑制Smad2/3磷酸化来阻断 TGF-β/Smad信号转导的激活(图3C)。
利用超声微泡技术来预防和治疗腹膜纤维化的有效性是本发明 的关键方面。尽管腹膜纤维化是使腹膜透析技术失效的主要原因和共 同特征，但尚无专一且有效的疗法可用来预防和治疗该疾病。本发明 已表明，超声介导的Smad7基因从白蛋白型微泡中释放，能够基本抑 制临床特征为晚期肾病的尿毒症大鼠中与腹膜透析相关的腹膜纤维 化的发展。如图1-7所示，由超声微泡介导基因疗法致使的腹膜Smad7 过表达，导致Smad2/3活性的基本抑制(图3C)，从而阻滞膜膜透析相 关的腹膜纤维化(由保留腹膜功能来说明(图4))；减弱腹膜纤维增厚(图 5)；通过抑制胶原蛋白I和胶原蛋白III、纤连蛋白和α-SMA表达来 阻止腹膜纤维化(图6，7)。
此外，本发明还证明了超声介导的Smad7基因表达能够阻滞大鼠 中的与术后腹膜粘连/纤维化相关的腹膜纤维化(图8)。事实上，外科 擦伤(surgical abrasion)四周后，该大鼠出现明显腹膜粘连，包括α -SMA、胶原I和III、纤连蛋白的过表达。TGF-β的表达增强和 TGF-β/Smad信号转导的活化被超声微泡介导的Smad7转染阻断(图8， 9)。因此，经超声微泡介导系统来阻断TGF-β/Smad信号转导途径展 现了用于预防术后腹膜粘连的安全新型疗法。
本发明的另一个重要方面是：如本文所述，利用诱导型基因疗法 来将病变组织中转染基因的表达控制在治疗水平内却不引起副作用； 而且这已应用于基因治疗。例如，虽然Smad7的过表达能够阻断 TGF-β/Smad信号转导和阻滞组织瘢痕化，但是我们之前的结果也表 明由高浓度多西环素诱导的Smad7在肾中的过高表达会导致大量细 胞凋亡和急性肾损伤[10]。因此，将Smad7转基因表达水平控制在治 疗水平，而在尝试使Smad7过表达时将副作用最小化是至关重要的。
利用直接腹膜注射荷有Smad7的微泡，再将局部超声施用到病变 皮肤的局部疗法是最有价值的一种。这避免了使用全身治疗。事实上， 传统腹膜疾病治疗依靠全身用药。这种方法通常不是有效的且可能造 成不良副作用。本发明已克服这一缺点，并大大提高了负性TGF-β信 号转导分子Smad7局部表达有效性，从而抑制TGF-β/Smad介导的腹 膜纤维化。
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