【技术领域】

发明涉及一种猪瘟抗体ELISA诊断试剂盒，属于动物用生物制品制造领域。

【技术背景】

猪瘟又称经典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)，是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的高度致死性、接触性传染病。是世界粮农组织和各国政府密切关注的 主要传染病之一。根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》2005年版，CSF被列为法定报告的 疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。

世界各国都将猪瘟防疫列为国家动物卫生行政工作的重点，采取预防、防疫及检疫措施， 以提高养猪产业的收益。在发达国家，以全场扑杀的方式，成功地扑灭猪瘟，成为非猪瘟区； 我国则采取免疫、检疫和淘汰带毒猪的综合防疫措施，促进建立无规定动物疫病区，保证养 猪业迅速、稳定发展，以点带面，从而达到全面消灭猪瘟的目标，因此猪瘟兔化弱毒疫苗依 然是我国用于猪瘟预防控制的唯一手段。通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序 是提高群体免疫水平的保证，为猪瘟的综合防治提供了有力的技术支持。

多年来，人们一直致力于猪瘟抗体检测试剂盒的开发。猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白是其的主 要中和性抗原蛋白，它在病毒多聚蛋白上的氨基酸序列为690aa～1063aa，利用该蛋白进行 诊断抗体诊断技术的开发研究一致是人们研究的热点。为了获得猪瘟抗体用诊断抗原，先后 采用了原核表达E2抗原、真核表达E2抗原以及全病毒纯化等各种方法，但各有不同的问题。 主要原因有以下两个方面：①原核表达抗原：表达抗原为包涵体、敏感性差、酶联反应不稳 定；②全病毒纯化抗原：采用过两种方法，一种为硫酸铵沉淀法，另一种为超滤浓缩后超速 离心法，但成本太高、技术难度大、产量极低，猪瘟病毒容易裂解等。在我国建立的方法也 有ELISA方法、血凝抑制试验等，但均存在不稳定的特点。

【发明内容】

[本发明的目的]

是采用基因工程手段，将猪瘟病毒E2基因进行改造以获得蛋白表达量高、稳定性好和免 疫原性特异的可溶性E2蛋白。采取的技术策略是应用基因拼接技术在猪瘟病毒E2基因的两 侧加上分泌信号肽序列和纯化标签，并嵌合至杆状病毒表达载体中，构建重组杆状病毒，获 得可溶性表达抗原，以用于抗体检测试剂盒的组装工作以及猪瘟单克隆抗体的筛选工作。

[本发明的技术方案]

应用基因拼接技术扩增出蜂素肽基因信号肽序列、多肽接头序列及6×HIS序列的融合 序列，并将此序列克隆至载体pFastbacl(Invitrogen公司产品)，构建了一个命名为 pMEL-HIS的载体；

应用基因拼接技术，将猪瘟病毒石门株E2基因(SME2)进行PCR扩增并突变，将突变后的 猪瘟病毒E2基因序列用EcoRI/SalI双酶切，克隆至载体pMEL-HIS，转化筛选、测序鉴定。 将构建的载体命名为pMEL-SE2M-HIS；

将载体pMEL-SE2M-HIS转化大肠杆菌DH10Bac，与菌体中基因组重组后，经挑斑、PCR鉴 定，转染Sf9细胞，产生重组核型多角体病毒，此病毒命名为：苜蓿银纹夜娥核型多角体病 毒(Autographa californica nuclear polydedrosis virus，AcMNPV)(参考黎路林编著.杆状 病毒表达载体系统.武汉华中师范大学出版社出版，p1页)VFBMEL-SE2M-HIS株(2008年9 月26日本病毒株已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.2671)。将此病毒培养物进行纯化鉴定，获得猪瘟病毒石门株E2基因可溶性表达抗原，此 抗原可用于组装猪瘟病毒抗体检测试剂盒。

[具体实施方案]

一、构建路线：

构建含有猪瘟病毒基因E2基因的重组AcMNPV VFBMEL-SE2M-HIS的pMEL-SE2M-HIS载 体的技术路线(见附图1)。

二、载体构建

1.含信号肽及6×HIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的构建

设计4条引物，将信号肽序列、接头序列及6×HIS序列通过应用基因拼接(Gene splicing by over lap extension)技术进行PCR扩增，双酶切(BamHI/KpnI)pFastBacl载体和PCR产 物，连接、转化筛选、测序鉴定。重建的载体命名为pMEL-HIS。

(1)引物序列为：

MFP：GATCGGATCCATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTAT

MRP：GAAATGTATACGACCATAAAAACAAGGGCA

HFP：TCAGATTCCACGAAGTCGACGGCGCCATGGGAC

HRP：AATAGGTACCGTGATGGTGATGGTGATGTCCCATGGCGCCGTCGACTTCGT

将上述引物稀释至100μm备用。

(2)具体操作过程如下：

1)取2×pfu Taq DNA polymerase mix(Tianz公司产品)20μl，MFP、MRP各5μl，无酶 水补至40μl，72℃反应30min。

2)取2×pfu Taq DNA polymerase mix(Tianz公司产品)20μl，HFP、HRP各5μl，无酶 水补至40μl，72℃反应30min。

3)取2×pfu Taq DNA polymerase mix(Tianz公司产品)20μl，第1、第2步反应产物 各1μl，MFP、HRP各1μl，无酶水补至40μl，94℃预变性3min，然后94℃30sec，55℃30sec，72 ℃10sec，25cycles，最后72℃反应10min。

4)将PCR反应产物电泳，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。

5)将纯化回收的PCR产物及pFastBacl用BamHI/KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收 纯化。

6)将双酶切及纯化回收的PCR产物及pFastBacl载体连接，转化Top10感受态细胞(Tianz 公司产品)，涂板、挑斑筛选。

7)将挑取的菌斑进行测序鉴定，证明pFastbacl中克隆的序列为：

GGATCCATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTATGCGGACCCAGAATT CAGATTCCACGAAGTCGACGGCGCCATGGGACATCACCATCACCATCACGGTACC。克隆序列与设计序列一致。

2.突变序列的E2基因

有文献报道，密码子的使用频率会严重影响基因的表达量，甚至不表达。E2基因在昆虫 细胞中的密码子使用频率低于20％高达40多处。设计了42条引物，应用基因拼接技术，将 SME2基因进行PCR扩增并突变。突变后基因的密码子使用频率均高于20％。突变后的序列克 隆至pGEM-T-easy(promega公司产品)中，获得的克隆命名为：pBSE2M。

用于突变反应的模板为带有SME2基因的质粒载体，构建过程参考文献(中国兽医学报 2005年V25(6)：564～566)进行。

将突变后的序列克隆至pGEM-T-easy(promega公司产品)中进行测序验证，突变序列与 设计序列一致(参见附图2.石门株E2基因原始序列与突变序列比对)。

3.AcMNPV重组质粒的构建：

以pBSE2M为模板，用引物E2MFP(带有EcoRI酶切位点)、E2MRP(带有SalI酶切位点)重 新扩增，将扩增产物用EcoRI/SalI双酶切，和载体pMEL-HIS连接，转化筛选、测序鉴定。 克隆序列与设计的目标序列一致，将构建的载体命名为pMEL-SE2M-HIS。

(1)引物序列为：

E2MFP：AGTAGAATTCAGACTGGCCTGCAAGGAAGATTACA

E2MRP：ACGTGTCGACCCAGTACTGATACTCGCCCTTCA

(2)操作过程为：

1)2×pfu Taq DNA polymerase mix(Tianz公司产品)20μl，E2MFP、E2MRP各1μl，无 酶水补至40μl，94℃预变性3min，94℃30sec，55℃30sec，72℃lmin，25cycles，最后72℃反 应10min。

2)将PCR反应产物电泳，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。

3)将纯化回收的PCR产物及pMEL-HIS用EcoRI/SalI双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收 纯化。

4)将双酶切及纯化回收的PCR产物及pMEL-HIS线性化载体连接，转化Top10感受态细 胞(Tianz公司产品)，涂板、挑斑筛选。

5)将挑取的菌斑进行测序鉴定，证明pMEL-SE2M-HIS中克隆的序列正确。 三、重组杆粒DNA

将pMEL-SE2M-HIS转化DH10Bac构建出的杆粒DNA命名为：pFBMEL-SE2M-HIS。

1.试剂配制：

SOC培养基：2％Bacto tryptone，0.5％Bacto yeast extract，10.0mM Nacl，2.5mM KCl， 将以上组分高压灭菌后，加入滤菌的Mg2+溶液和葡萄糖溶液，调至浓度为：20mM MgSO4、 MgCl2(10mM each)，20mM葡萄糖。

LA—Bac抗性琼脂平板：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，琼脂12g，1000ml去离 子水溶解，高压灭菌，冷却至55℃左右，加入卡那霉素至50μg/ml，庆大霉素至7μg/ml，四 环毒至10μg/ml，IPTG(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside)至40μg/ml，Bluo gal(5-Bromo-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)至100μg/ml。

抗性LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，1000ml去离子水溶解，高压 灭菌，冷却至55℃左右，加入卡那霉素至50μg/ml，庆大霉素至7μg/ml，四环素至10μg/ml。

2.具体操作如下：

将DH10Bac菌(Invitrogen公司)37℃ 180r/min培养过夜，次日早取0.5ml 3000r/min 室温离心5min，弃上清，并将残液吸干。加入50μl克必隆常态转化液(天泽基因公司)和5μl pMEL-SE2M-HIS质粒混匀，—20℃冷冻30min，取出后冰上静置10min，加入1ml SOC培养基， 37℃ 180r/min培养4h.取100μl涂LA—Bac抗性琼脂平板。37℃培养48h。取白斑接种5ml抗 性LB培养基，37℃培养过夜。用碱裂解法提取杆粒DNA。PCR鉴定，测序结果与设计序列一 致。

四、转染及重组AcMNPV的获得

将重组杆粒pFBMEL-SE2M-HIS用转染试剂Cellfectin转染sf9细胞，扩大培养，收集 培养上清进行PCR鉴定。证明获得重组AcMNPV VFBMEL-SE2M-HIS。

1.试剂：

转染试剂：cellfectin(Invitrogen)

Grace’s Insect Cell Cμlture Medium(powder)：GIBCOBRL公司，Cat No：11300-043

Fetal Bovine Serum(FBS)：Invitrogen公司，Cat No：26140-079

水解乳蛋白(Lactalbumin Hydrolysate)：GIBCOBRL公司，Formula No：89-50861N

酵母提取物(Yeast Extract)：OXOID公司，L21

TNM-FH培养基：取Grace’s Insect Medium powder(1L量)，水解乳蛋白3.333g，酵母提 取物3.333g，NaHC03 0.35g，加三蒸水800ml，调至pH6.2，用三蒸水定容至1L。加青霉素至 终浓度100μg/ml，链霉素0.25μg/ml，两性霉素B0.25μg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌后加入 10％FBS，分装，4℃保存备用。

2.操作过程：

(1)将处于对数生长期的sf9细胞用弯头巴氏吸管吹散后转移至60mm组织培养皿中， 吸附约0.5h。数量约2×106个细胞，约可铺满70％～80％的面积。

(2)准备转染液：

1)100μlGrace培养基与9μl cellfectin混合。

2)100μlGrace培养基与4μl杆粒DNA混合。

3)将1)、2)两部分液体轻轻混合，室温静置30min后加入800μl Grace培养基，即为 转染液。

(3)小心地吸走60mm组织培养板上的培养基，并用Grace培养基轻轻漂洗两遍。并吸 走所有培养基。

(4)将转染液轻轻地全部加入到60mm组织培养板中，与sf9细胞室温作用4h。期间 要轻轻摇动数次。

(5)4h后将1mlTNM-FH加至60mm组织培养皿中，用封口膜封口后于细胞培养箱中27 ℃培养。转染后每天观察转染细胞单层的形态变化及生长特征，细胞出现明显的细胞病变， 72h后收集上清，做为病毒基础种子液。记为P1 Stock。

(6)将重组病毒提取DNA进行PCR测序鉴定，序列正确，证明获得了AcMNPV VFBMEL-SE2M-HIS。

五、表达产物分析及鉴定

将鉴定好的病毒传代扩大培养，第二代记为P2 Stock，第三代记为P3 Stock。前三代均 做为种毒，取第4代培养上清包被进行ELISA鉴定。

1.试剂配制：

包被液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，溶于1L双蒸水。

PBS：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4 2.83g，溶于1L去离子水中。

PBSM：PBS中加入5％脱脂奶粉，用于封闭液。

PBST：PBS中加入0.05％Tween-20，用于洗涤液。

PBSTM：PBST中加入5％脱脂奶粉，用于稀释血清样本。

TMB显色液：

显色液A：200mgTMB加入到100mL无水乙醇中，充分溶解。

显色液B：Na2HP O4 14.6g、柠檬酸9.33g，加注射用水至900mL，调pH至5.0～5.4， 补加注射用水定容至1000mL。

工作液：10mL显色液B加入9mL双蒸水，再加入1mL显色液A，混匀后加入50μL 0.75％ 过氧化氢尿素溶液。

终止液：2M H2SO4。

2.操作过程：

(1)取病毒培养上清，用包被液稀释50×，每孔包被100μl，4℃过夜。

(2)弃包被液，每孔加入PBSM 300μl，37℃封闭40min。

(3)吸干，用PBST洗3次，每次300μl。

(4)将猪瘟高免血清用PBSTM稀释500×，每孔加入100μl，37℃温育40min。

(5)吸干，用PBST洗3次，每次300μl。

(6)将HRP标记二抗(Sigma公司)用PBSTM稀释2000×，每孔加入100μl，37℃温育30min。

(7)吸干，用PBST洗3次，每次300μl。

(8)每孔加入100μl TMB工作液，避光作用10min，加入50μl终止液，450nm波长处测 吸光值。

3.结果如下：

4.结果判定：

AcMNPV VFBMEL-SE2M-HIS获得了分泌性表达，且与对照有明显的差异。至此，E2基因在 杆状病毒表达系统得分泌性表达，对猪瘟病原免疫抗原的制备获得了突破性的进展。该表达 产物具有开发猪瘟病毒检测ELISA试剂盒的潜力。

六、诊断试剂盒的组装及使用

1.试剂盒的组分

试剂盒组成包括：经抗原包被、封闭的ELISA板、HRP标记McAb、阳性血清对照、阴性 血清对照、10×PBS、10×PBST、脱脂奶粉、TMB显色液A和B、0.75％过氧化氢尿素溶液、终 止液。

2.组分的制备

(1)抗原的制备

病毒培养：待sf9细胞铺满单层，弃培养基，接入重组病毒P3种子液至培养液的0.3％～ 0.5％，23～27℃培养至75％CPE产生，收获病毒液。

方法一：收集病毒培养上清，用硫酸铵沉淀法浓缩，用分子筛层析，收集猪瘟病毒E2蛋 白组份，测定蛋白浓度，分装后—80℃冻存备用。

方法二：收集病毒培养上清，加入0.1％的甲醛溶液灭活病毒，分装后—80℃冻存备用。

方法三：Ni离子柱HisTrap HP(GE Heathcare产品，17-5247-01)纯化。收集病毒培养上 清，加入0.1％的甲醛溶液灭活病毒后，用Ni离子柱纯化，按产品说明书进行，获得的产物 为E2重组蛋白，测定蛋白浓度，分装后—80℃冻存备用。

(2)试剂配制

1)包被液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，溶于1L双蒸水。

2)PBS：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4 2.83g，溶于1L去离子水中。

3)PBSM：PBS中加入5％脱脂奶粉，用于封闭液。

4)PBST：PBS中加入0.05％Tween-20，用于洗涤液。

5)PBSTM：PBST中加入5％脱脂奶粉，用于稀释血清样本。

6)TMB显色液：

显色液A：200mgTMB加入到100mL无水乙醇中，充分溶解。

显色液B：Na2HPO4 14.6g、柠檬酸9.33g，加注射用水至900mL，调pH至5.0～5.4，

补加注射用水定容至1000mL。

7)工作液：10mL显色液B加入9mL双蒸水，再加入1mL显色液A，混匀后加入50μL0.75％ 过氧化氢尿素溶液。

8)终止液：2M H2SO4。

(3)ELISA反应板的包被、封闭

1)将抗原用包被液按一定浓度稀释后，包被ELISA板，每孔包被100μl，4℃包被12h。

2)用PBST洗涤3次，每次300μl/孔，在洗板机上进行。

3)用PBSM进行封闭，每孔300μl，37℃封闭40min，用PBST洗涤3次，每次300μl/ 孔，在洗板机上进行。

4)将HRP标记标记McAb、猪瘟阳性血清和猪瘟阴性血清(均为中国兽医药品监察所制 备供应)及其他成分分装成小份，一一放入试剂盒中，封闭，帖签，4℃保存。

3.使用

(1)猪瘟阳性、阴性和待检血清用PBSTM稀释25×，每孔加入100μl，37℃温育40min。

(2)吸干，用PBST洗3次，每次300μl。

(3)将HRP标记McAb用PBSTM稀释2000×，每孔加入100μl，37℃温育30min。

(4)吸干，用PBST洗3次，每次300μl。

(5)每孔加入100μl TMB工作液，避光作用10min，加入50μl终止液，450nm波长处读取吸 光值。

4.结果判定

只有阴性对照的平均OD450nm大于0.5，阳性对照的阻断率大于50％，检测结果才有效。

阻断率＝(阴性平均值OD450nm—待检OD450nm)/阴性OD450nm X100％

阻断率>40％为阳性

阻断率<30％为阴性

阻断率在30％～40％为可疑。

【附图说明】

本发明涉及的苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polydedrosis virus，AcMNPV)VFBMEL-SE2M-HIS株(2008年9月26日本病毒株已送交中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.2671)。

图1构建含有猪瘟病毒pMEL-SE2M-HIS基因的重组核型多角体病毒技术路线

图2石门株E2基因原始序列与突变序列比对

SE2：石门株E2基因原始序列MUTSE2：石门株E2基因突变序列

【本发明的优点】

1本发明中所用的诊断抗原为猪瘟E2蛋白，是评价猪瘟免疫水平的主要蛋白。E2蛋白 为猪瘟诱导产生体液免疫的主要优势抗原，抗体产生时间早，持续时间长。

2应用基因拼接(Gene splicing by over lap extension)的方法对基因进行改造， 速度快，准确性高。获得密码子优化的猪瘟病毒SM毒株不带TMR(跨膜区)的全长E2基因。

3将蜂素肽基因MEL与目的基因6His重组，并在目的基因与6His之间引入一段柔性氨 基酸接头，能够在连接的同时最大可能的保证两抗原间的空间结构，以保持蛋白的天然活性。

4用猪瘟E2蛋白建立ELISA诊断方法，具有操作简便、快捷，所需试剂及实验条件简 单的优点，并具有良好的特异性与敏感性，为猪瘟的诊断及免疫评价提供了良好的方法。

本发明的积极效果：使用本发明所涉及的试剂盒对猪瘟诊断及免疫评价快速、敏感、特 异，可在2h内完成一次检测。

<110>中国兽医药品监察所

<120>猪瘟抗体ELISA诊断试剂盒

<160>7

<210>1

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建含信号肽及6×HIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的所用引物MFP：

<400>1

GATCGGATCC ATGAAATTCT TAGTCAACGT TGCCCTTGTT TTTATGGTCG TAT  53

<210>2

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建含信号肽及6×HIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的所用引物MRP：

<400>2

ATTCTGGGTC CGCATAGATG TAAGAAATGT ATACGACCAT AAAAACAAGG GCA  53

<210>3

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建含信号肽及6×HIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的所用引物HFP：

<400>3

CTTACATCTAT GCGGACCCAG AATTCAGATT CCACGAAGTC GACGGCGCCA TGGGAC  56

<210>4

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建含信号肽及6×HIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的所用引物HRP：

<400>4

AATAGGTACC GTGATGGTGA TGGTGATGTC CCATGGCGCC GTCGACTTCG T  51

<210>5

<211>135

<212>DNA

<213>人工序列

<200>

<223>pFastbacl中克隆的序列

<400>5

GGATCCATGA AATTCTTAGT CAACGTTGCC CTTGTTTTTA TGGTCGTATA CATTTCTTAC  60

ATCTATGCGG ACCCAGAATT CAGATTCCAC GAAGTCGACG GCGCCATGGG ACATCACCAT  120

CACCATCACG GTACC                                                  135

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建核型多角体病毒重组质粒所用引物E2MFP：

<400>6

AGTAGAATTC AGACTGGCCT GCAAGGAAGA TTACA  35

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建核型多角体病毒重组质粒所用引物E2MRP：

<400>7

ACGTGTCGAC CCAGTACTGA TACTCGCCCT TCA   33