权利要求

CTLA4Ig基因修饰的骨髄间充质干细胞的应用技术领域本发明涉及生物技术领域，特别涉及经CTLA4Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞的 新用途，具体是涉及经CTLA4Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞在制备诱导移植肝免疫 耐受药物中的应用。背景技术由各种原因（病毒、药物、肿瘤及遗传性疾病等）引发的终末期肝病严重威胁人 类健康。肝移植是目前治疗终末期肝病最为有效的方法，但是受者对移植物的排斥是 移植成功的主要障碍。近年来，免疫抑制剂的应用推动了肝移植的发展，但是，长期 应用免疫抑制剂所引起的多种毒副作用，不仅严重影响了患者的长期生存质量，也极 大地限制了肝移植的开展。诱导供者特异性免疫耐受、摆脱非特异免疫抑制剂的毒副 作用是移植肝良好再生和受者长期高质量存活的保障。随着基因工程和干细胞工程等 技术手段的迅速发展及相关理论和实践的不断完善，基因治疗和细胞治疗逐渐成为促 进肝移植物功能恢复的两个重要手段。T细胞是移植排斥的主要效应细胞，防止同种异型反应T细胞活化是防止移植排 斥发生的主要途径。T细胞活化增殖必须同时存在腿C/抗原肽-TCR和协同刺激信号， 阻断协同刺激信号将导致T细胞无能、凋亡或克隆丢失而引发免疫耐受。B7/CD28途 径在协同刺激信号通路中的作用最为肯定，干预该途径诱导特异性耐受己成为移植免 疫调节的基本思路。作为T细胞表面B7分子的另一个配体，细胞毒性T淋巴细胞相 关抗原4 (CTLA-4)与B7分子的亲和力较CD28高数十倍而优先结合B7分子并传递负 调控信号，从而阻断T细胞活化。CTLA4-Ig是CTLA-4胞外段与IgG Fc段的融合蛋白， 与细胞表面的B7分子结合起到封闭作用，通过阻断B7/CD28协同刺激通路而达到抑 制T细胞活化的目的。虽然CTLA4Ig在器官移植的研究中取得了部分成功，但单独使 用CTLA4Ig容易出现免疫耐受的逆转。骨髓间充质干细胞（bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是人们在骨 髓中发现的另一类干细胞，体外培养贴壁生长，梭形，是骨髓基质细胞的祖细胞。BMSCs 具有多向分化潜能，不仅可分化为外胚层的神经元和神经胶质细胞，还可以分化为中 胚层的成骨细胞和脂肪细胞以及内胚层的肝细胞。近期研究还发现BMSCs具有低免疫 原性和免疫调节作用。体外扩增获得的BMSCs无论在体外还是体内都具有抑制免疫反应的特性。研究证明，BMSCs低表达MHCI类抗原，而不表达MHCII类抗原以及B7-1、 B7-2、 CD40和CD40-L等协同刺激分子，可以抑制T细胞增值，使TH1细胞分泌IFN-Y减少，而使TH2细胞分泌IL-4增加；BMSCs可以抑制单核细胞向树突细胞（dendritic cells, DCs)分化，并削弱作为抗原递呈细胞的成熟DCs对T细胞的刺激作用；此外， MSCs还可以抑制IL-2介导的（natural killer cells, NK cells)的增殖。动物实验 也证实，BMSCs移植可以延长皮肤移植物的存活时间，而且受者自体的BMSCs输注又 可减弱受者对供者骨髓移植物的排斥反应。此外，BMSCs在体外易培养和扩增，在体 内是个相对静止、更新率低的群体，基因转移后外源基因的表达可以持续较长的时间， 并且其代谢活力高，有利于重组蛋白的分泌，是基因治疗理想的靶细胞。BMSCs的这 些特征使其在细胞治疗以及基因治疗的临床应用方面有着广阔的应用前景。但是，单独应用BMSCs不能维持移植物的长期存活，尤其在实质器官移植的研究 中（如心脏移植）并没有取得突破性进展。在构建组织工程骨组织的研究中，研究者 将CTLA4Ig基因转入异基因BMSCs中，以此转基因细胞为构建组织工程骨的种子细胞， 旨在通过CTLA4Ig阻断协同刺激通路的作用，延长异基因BMSCs自身在受体内的存活 时间。还有个别研究者将CTLA4Ig基因修饰的BMSCs用于移植物抗宿主病 (Graft-versus-host disease, GVHD)的治疗，但对于诱导实质器官移植耐受中的 应用还没见到研究报道。研究表明，免疫耐受不但在免疫细胞经过胸腺时发育产生，而且当免疫细胞进入 外周后也能产生。供体抗原进入肝脏后被肝细胞获得，与供体发生反应的淋巴细胞克 隆就聚集在肝脏内，肝脏细胞产生一种急性期蛋白，它可破坏与供体发生反应的淋巴 细胞克隆，导致克隆清除，产生耐受。而肝内的Kupffer细胞对肝脏内发生的同种异 体刺激抗原的聚积具有特殊效应，抗原积聚越多，Kupffer细胞的捕获效应就越大。 有研究显示，骨髓干细胞门静脉输注较外周静脉输注更易诱导供者特异性耐受，即所 谓"门静脉耐受"，该现象的发生与上述肝脏作为特殊免疫器官在免疫耐受所起的特 殊作用有关。正是肝脏的这种特殊作用使其在移植过程中与其他器官存在差异。和免 疫排斥反应的多因素、多水平、多途径形成一样，器官移植耐受的诱导及其有效维持 也应通过多条途径实现，这也许是解决实质器官移植排斥问题理想方法。腺病毒（Adenovirus, Ad)载体系统具有如下特点：a、病毒基因组不整合到宿 主的基因组中，也就不会影响宿主结构基因的正常表达；b、可插入较大的外源基因 片段（8.5kb) ; c、可感染分裂细胞也可感染非分裂细胞，感染谱比较广；d、瞬时 表达而不是终身表达。与持续表达外源基因的其他载体（如逆转录病毒和慢病毒载体 等）相比，如果携带的目的基因为免疫抑制基因，那瞬时表达则不会使机体的免疫系统长时间处于抑制状态而导致感染或肿瘤的发生。另外载体上带有GFP (绿色荧光蛋 白）报告基因，可以通过绿色荧光蛋白的示踪很直观地观察到外源基因的表达。由于 腺病毒载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性，使其在基 因治疗的研究中受到人们的青睐，成为当今使用最多的病毒载体之一。发明内容本发明的目的是提供经CTLA4Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞的一种新用途，即 在制备诱导移植肝免疫耐受药物中的应用。本发明所述的应用是以经CTLA4Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞为活性成分在制 备诱导移植肝免疫耐受药物中的应用。本发明所提供的诱导移植肝免疫耐受的药物可采用注射剂的剂型。所述药物中经CTLA4Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞的浓度可为1 X 106至3X 106 个/mL。所述注射剂的溶剂的选择是多种多样的，如生理盐水、pH 7. 5-8. 5的TE缓冲液 等，优选为生理盐水。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载 体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。可采用门静脉输注的方式，将上述药物输注至移植肝内。上述药物的用量一般为lmL/次，仅在肝移植过程中，供肝植入开通肝脏血流后， 关腹前注射。为提高疗效，本发明的药物可以与抗生素、免疫刺激剂等进行组合治疗。上述药物的活性成分，即经CTLA4Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞，是将分泌性 表达CTLA4Ig融合蛋白的重组腺病毒体外感染骨髓间充质干细胞得到的。所述可分泌性表达CTLA4Ig融合蛋白的重组腺病毒，是将分泌性表达CTLA4Ig的 腺病毒表达载体转染包装细胞一人胚肾293细胞(HEK 293)等得到的。所述可分泌性表达CTLA4Ig的腺病毒表达载体，是先将CTLA4Ig基因插入 pAdTrack-CMV穿梭载体中巨细胞病毒(CMV)启动子的下游，得到携带CTLA4Ig基因的 重组穿梭载体，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-l共转化细菌后得到的 可分泌性表达CTLA4Ig的腺病毒表达载体。为胞外分泌性表达CTLA4Ig，所述CTLA4Ig基因的5，端还连接有抑瘤素M信号 肽编码序列。所述携带CTLA4Ig基因的重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-l共转化细菌后，在细菌内进行同源重组。所述携带CTLA4Ig基因的重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-1共转化的细菌可为£ coh' BJ5183等。具体来讲，所述可分泌性表达CTLA4Ig的腺病毒表达载体可为pAdeasy-CTLA4Ig。 所述分泌性表达CTLA4Ig基因的腺病毒表达载体可通过脂质体介导法转染人胚肾293细胞。本发明提供了经CTLA4Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞的新用途，即在制备诱导 移植肝免疫耐受药物中的应用。所述经CTLA4Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞是将分 泌性表达CTLA4Ig的重组腺病毒体外感染骨髓间充质干细胞得到的。实验证明，在肝 移植后，将CTLA4Ig基因修饰的受体同系的BMSCs经门静脉输注移植肝内， 一方面携 带异基因抗原肽的供、受双方成熟或幼稚的抗原递呈细胞进入受体胸腺后，反应性T 细胞经阴性选择被克隆性清除，使得受体骨髓细胞和供肝中的造血干细胞共存进而形 成理想的混合性嵌合，另一方面，使BMSCs通过自身免疫特性以及CTLA4与B7分子 高亲和力结合阻断协同刺激通路，进一步巩固混合性嵌合状态的维持，形成供者特异 性的网络致耐，实现由BMSCs介导并参与，由外周和中枢耐受机制共同参与的长期、 稳定的移植肝耐受。因而，可以本发明经CTLA4Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞为活 性成分制备诱导移植肝免疫耐受药物。本发明在肝移植的临床应用中具有重要的理论 意义，并为诱导肝移植供者特异性免疫耐受奠定了基础，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图说明图1A为经纯化及传代培养的大鼠BMSCs的细胞形态图1B为分离纯化体外扩增BMSCs表面标志的流式细胞术检测结果图2A为重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染大鼠BMSCs感染效率的流式细胞术鉴定结果图2B为重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染大鼠BMSCs后GFP表达的荧光显微镜观察结果图2C为转基因BMSCs表达CTLA4Ig的RT-PCR鉴定结果 图2D为转基因BMSCs表达CTLA4Ig的Western Blotting鉴定结果 图2E为转基因BMSCs表达CTLA4Ig的细胞免疫荧光化学鉴定结果 图2F为单向混合淋巴细胞反应检测转基因BMSCs分泌CTLA4Ig的免疫抑制功能 的鉴定结果图3A为肝移植术后各组大鼠生存率观察结果图3B为肝移植术后各组大鼠血生化指标检测结果图3C为肝移植术后各组大鼠移植肝组织病理学检查结果具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell， David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(w/v)百分比浓度或体积/体积(v/v)百分比浓度。所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由上海英骏公司完成。 实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以 达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生 物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照 实施例中的提示替换使用；在产业实施中，来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的 各种细胞均为离体的，并包括从细胞库中取得、或商业购买获得，还包括按照已有文 献的介绍制备获得，以及经可以商业获取的多种干细胞用已知方法诱导而来的。实施例1、经CTLA4Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞(丽SCs)中的表达及其功能鉴定一、 构建重组腺病毒Ad-CTLA4Ig通过&7 I和II位点将CTLA4Ig融合基因亚克隆至腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV (购自美国stratagene公司）（中，然后根据AdEasy Vector Systerm 操作方法，将该携带CTLA4Ig融合基因的重组腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒 pAdeasy-1 (购自美国stratagene公司）共同电转化至大肠杆菌BJ5183感受态细胞 中进行同源重组，在重组后的质粒通过脂质体Lipofectamine 2000 (购自Invitrogen 公司）介导转染293A细胞（购自南京凯基生物有限公司）进行包装和扩增，最终获 得完整的重组腺病毒Ad-CTLA4Ig。用TCID50法测定病毒滴度为6. 21X 107 PFU/mL。二、 大鼠BMSCs的分离及鉴定 1、大鼠BMSCs的分离取雄性LEWIS大鼠（购自北京维通利华实验动物中心），拉颈处死，用无菌剪刀 等手术器械分离大鼠股骨，用注射器吸取低糖DMEM培养液（购自Sigma公司）反复冲洗骨髓腔至颜色发白（约3-4次）。用400目筛网过滤冲洗液，离心，弃上清，收 集细胞。将骨髓细胞沉淀用PBS重悬，然后将其轻轻叠加到密度为1.083g/mL的大鼠 淋巴细胞分离液（购自TBD公司）上，1800rpm离心30分钟（室温下），小心吸取界 面间的乳白色单个核细胞层，加入含10X胎牛血清的DMEM培养液（预先加入青-链霉 素100U/mL)中充分混匀，离心，弃上清，洗涤细胞沉淀。将分离的BMSCs按2X107cm2 的浓度接种于装有低糖DMEM完全培养液的T-25cm2塑料培养瓶中，置于37°C、 5% C02 和饱和湿度的孵箱中培养48h后更换新鲜培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每隔2-3天 换液一次。待细胞长到80%融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞进行传代培养， 方法为：用细巴斯德吸管将消化细胞吹打成单细胞悬液后，以1X10VmL的浓度接种 于新的低糖DMEM培养液中，每隔2-3天换液一次，细胞传代，细胞形态如图1A所示。 2、大鼠BMSCs的鉴定取扩增后第3代的腿SCs，用0.25%胰蛋白酶消化，再用含1XBSA的PBS洗涤 后制成900y l含有1.5Xl(f个BMSCs的单细胞悬液，等分为三份，分别加入三个 Eppendof管中，1号管为标准对照，加入IgG-FITC和IgG-PE (Serotec公司）；2号 管加入5 y 1小鼠抗大鼠的CD29-PE和CD44-FITC单克隆抗体工作液（Serotec公司）； 3号管加入5 y 1小鼠抗大鼠的CD90-FITC和CD34-PE单克隆抗体工作液（Serotec公 司），在37。C下孵育30min，用含1%BSA的PBS洗涤后，用流式细胞仪（Becton Dickinson, USA)检测BMSCs的表面分子，结果如图1B所示，CD29、 CD90呈阳性， CD44呈弱阳性，而CD34呈阴性。BMSCs是骨髓中区别于造血干细胞的一群处于未分 化状态的非定向干细胞，检测结果表明用上述方法得到了纯化的BMSCs。三、 重组腺病毒Ad-CTLA4Ig体外感染BMSCs及感染效率的流式细胞术检测 将扩增至第4代的大鼠BMSCs按2 X 10V瓶接种于5个T 25-cm2的塑料培养瓶中，常规培养24h后，向各瓶依次加入M0I值为0、 50、 100、 150、 200的病毒量的重组 腺病毒Ad-CTLA4Ig毒液感染细胞，置37。C、 5%0)2培养箱中培养48h。培养结束后， 用0.25%胰酶消化各瓶细胞，离心，洗涤，重悬于500ul的PBS缓冲液中，用流式 细胞仪检测各管细胞的GFP的表达。结果如图2A所示（negative为阴性对照），M0I 值为100时，感染效率可达到91. 32%; M0I值为150时，感染效率即可达到99%以 上，但后续观察发现，当M0I值超过150时，细胞生长明显受到抑制，并开始出现细 胞死亡，所以后续实验中均以MOI值为100的病毒量感染BMSCs。四、 重组腺病毒Ad-CTLA4Ig在BMSCs中的表达鉴定 1、 GFP表达鉴定用0. 25%胰酶消化第4代大鼠BMSCs，按2 X 1Q7瓶接种于4个1-25，2的塑料培养瓶中，培养24h后，按M0I二100的病毒量用Ad-CTLA4Ig感染细胞，分别培养1、 3、 7、 14天后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况，结果如图2B所示，感染24h即 有GFP表达，在第3天时表达量最强，以后逐渐开始减弱，在第14天时仍有表达。2、 RT-PCR鉴定基因水平表达按M0I = 100的病毒量用Ad-CTLA4Ig感染第3代大鼠骨髓BMSCs，常规培养3天， 用TRIZOL试剂并参照试剂盒说明书提取被感染细胞的总RNA，然后以提取的总RNA为 模板，反转录其中的mRNA为cDNA， 20u 1反转录体系为：5XAMV反转录缓冲液1， dNTPs(10mM) 2yl， RNAse抑制剂lul， AMV反转录酶0. 5ul， raRNA 2yl，重蒸水 11.5ul。然后以合成的cDNA为模板，在CTLA4Ig引物Pl (上游引物）：5， -ATGGGGGTACTGCTCACACA-3，及P2 (下游引物）：5， -CTATTTACCAGGAGAGCGGGA-3，的 引导下进行PCR扩增，同时，以大鼠"-actin基因为参照，用于扩增大鼠》-actin 基因的引物序列为P3，(上游引物):5， -AGAAAATCTGGCACCACACC-3，和P4，(下 游引物）：5， -AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3，。以Ad-GFP (用上述相同方法获得的不 含目的基因CTLA4Ig，仅含有GFP基因的重组腺病毒）感染的大鼠BMSCs作为对照。 PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2C所 示，AchCTLA4Ig-MSCs组可见大小约为1170bp的特异性条带出现，表明CTLA4Ig目的 基因在经Ad-CTLA4Ig感染的大鼠骨髓BMSCs中获得表达。3、 Western blotting鉴定蛋白水平表达按M0I = 100的病毒量用Ad-CTLA4Ig感染第3代大鼠骨髓BMSCs，常规培养3天 后，取10'个被重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMSCs，并以Ad-GFP (用上述相同 方法获得的不含目的基因CTLA4Ig，仅含有GFP基因的重组腺病毒）感染的大鼠BMSCs 作对照，分别加入200"1 Rappa细胞裂解液，在4"C下裂解过夜，然后12000rpm离 心30分钟，吸取上清，用BCA法测定蛋白浓度为4500y g/mL。然后，取等量经不同 腺病毒感染的细胞裂解液进行不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE)电泳，再用半 干式转印的方法将蛋白质转移至PVDF膜上，接着用5%脱脂奶粉封闭2小时， 一抗均 为兔来源抗CTLA4抗体（购于santa cruz公司），4°〇孵育过夜（12-24小时），用 TBST洗膜3次，每次10分钟，然后加入辣根过氧化物酶偶连的抗兔二抗（购于中杉 金桥生物技术有限公司），室温孵育l小时后，用TBST洗膜4次，最后，用ECL化 学发光检测试剂盒（购自Santa Cruz公司）于暗室自显影。检测结果如图2D所示（泳 道1和2为被重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMSCs，泳道3为被重组腺病毒Ad-GFP 感染的大鼠BMSCs)，发现被重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMSCs的蛋白在 47kd-66kd之间有特异性条带出现，而对照组未出现，与预期结果相符，从而在蛋白水平上证明CTLA4-Ig融合蛋白在经Ad-CTLA4Ig感染的大鼠骨髓BMSCs中获得表达。 4、免疫荧光鉴定细胞水平表达按MOI = 100的病毒量用Ad-CTLA4Ig感染第3代大鼠骨髓BMSCs ，常规培养3天 后，将经重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMSCs接种于96孔板中，并以Ad-GFP (用 上述相同方法获得的不含目的基因CTLA4Ig，仅含有GFP基因的重组腺病毒）感染的 大鼠BMSCs作对照，细胞密度为104细胞/孔。用4%多聚甲醛固定细胞半小时，然后 用0. 3%Triton-100破膜15分钟，3% HA处理5-10分钟，用正常山羊血清封闭， 一抗为兔来源抗大鼠CTLA4抗体（购于santa cmz公司），4。C孵育过夜（12-24小 时），PBS洗膜3次，每次5分钟，用罗丹明标记二抗（购于北京中杉金桥生物技术 有限公司）室温孵育1小时后PBS洗涤3次，每次5分钟，最后，在荧光显微镜下观 察感染细胞内CTLA4Ig融合蛋白的表达情况。结果如图2E所示（GFP表示被重组腺病 毒Ad-GFP感染的大鼠BMSCs， CTLA4表示被重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMSCs， Merge表示前两者的叠加），证明经Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMSCs细胞内有CTLA4Ig 的表达。五、混合淋巴细胞反应（MLR)鉴定转基因丽SCs分泌CTLA4Ig的免疫抑制功能1、 制备经Ad-CTLA4Ig感染的大鼠骨髓BMSCs的浓縮培养上清液按MOI = 100的毒液量用Ad-CTLA4Ig感染第3代大鼠骨髓服SCs，常规培养7天 后收集培养上清，用IOKD的离心超滤管浓縮（购自Millipore公司），4°C、 4000rpm 离心40分钟，将浓縮液-7(TC保存备用。2、 混合淋巴细胞反应（MLR)鉴定转基因丽SCs分泌CTLA4Ig的免疫抑制功能 拉颈处死LEWIS大鼠及SD大鼠（购自北京维通利华实验动物中心）各1只，无菌剖取其脾脏分离脾细胞。向SD大鼠脾细胞重悬液中加入丝裂霉素C 25ug/mL，置 37°C、 5%0)2孵箱中孵育30min，洗涤3次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液 调整细胞浓度为1X107mL，用作MLR的刺激细胞。将LEWIS大鼠脾细胞作为反应细 胞，同样用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1X107mL。然后向 96孔板的每孔中分别加入100y 1的反应细胞和刺激细胞悬液建立混合淋巴细胞培养 体系，再分别向体系中加入O、 50、 100、 200ul的步骤1获得的浓縮培养上清液， 混匀后将96孔板置37。C、 5%(:02孵箱中培养6天，然后用MTS (购自Pr咖ega公司） 检测细胞的增值情况。结果如表1和图2F所示，加入浓縮培养上清后可抑制反应细 胞的增值，且存在量效关系，即加入浓缩培养上清液的量越大抑制效应越明显，证明 此免疫抑制功能主要是由经Ad-CTLA4Ig感染的大鼠骨髓BMSCs分泌性表达的 CTLA4-Ig起作用。表l:细胞的增值情况table see original document page 11实施例2、门静脉输注经CTLA4Ig基因修饰的BMSCs诱导移植肝免疫耐受 一、建立大鼠肝移植排斥模型以雌性DA大鼠（购自哈尔滨医科大学实验动物中心）为供鼠，雌性LEWIS大鼠 为受鼠，体重均在180-200g，行原位肝移植。供、受体大鼠于术前禁食12h ，自由 饮水。受体术前15min肌注阿托品0. 03mg。 （l)供体手术：乙醚麻醉，十字切口进腹， 游离肝周韧带，暴露肝上下腔静脉，结扎、切断左膈下静脉、肝食管静脉交通支。游 离肝下下腔静脉至左肾静平面，结扎并切断右肾上腺静脉和右肾动、静脉。游离门静 脉，分别结扎幽门静脉、脾静脉。距肝门约0.5cm处游离肝外胆管，自胆管远端切开 插入自制的硬膜外导管并固定。穿刺下腔静脉，注入2mL肝素钠液(肝素钠120u/mL)， 使供体全身肝素化。穿刺腹主动脉，止血钳阻断穿刺点以下的腹主动脉，用4C乳酸 林格液灌注，速度为2. 5mL/min，结扎第一肝门后的腹主动脉。剪开肝上、下腔静脉， 让灌注液流出，结扎、离断肝固有动脉，幽门静脉下方离断门静脉，沿膈肌环处切断 肝上上腔静脉。行供肝修剪，分别安置门静脉袖套管和肝下下腔静脉袖套管，8-0线 结扎固定。供肝置4t:乳酸林格液保存。（2)受体手术：乙醚麻醉，正中切口进腹，自 镰状韧带顺时针方向游离肝脏，缝扎左膈静脉，结扎右肾上腺静脉，游离右肾静脉水 平以上肝下下腔后方间隙。于肝门胆管分叉处剪断胆管。结扎切断肝动脉。血管夹于 右肾静脉、幽门静脉上水平分别夹闭下腔静脉和门静脉。于门静脉分叉以上穿剌门静 脉，缓慢注入2.0-2.5mL的乳酸林格液，将肝脏内血液回输入循环中。用Satinsky 钳连同部分膈肌夹闭肝上上腔静脉，贴近肝脏切断肝上上腔静脉。于分叉处切断门静 脉。于肝下缘切断肝下下腔静脉，移除受体肝脏。将供肝原位植入受体腹腔。以8-0 的无损伤线连续缝合肝上下腔静脉，后将供肝门静脉袖套管插入受体门静脉，5-0线 结扎固定，恢复肝血流，结束无肝期，无肝期时间为（14土2)min。将肝下下腔静脉套 管插入受体下腔静脉，5-O线结扎固定。将胆管插管插入受体胆管，结扎固定，关腹。 受体手术时间约（55土10)min。 （3)术后护理：术后保温至大鼠苏醒。单笼喂养，自由进食饮水。术后3天每日肌注青霉素10万单位。术后一周存活率为100%。术后第 6-7天大鼠开始逐渐出现活动减少，食欲不振，精神萎靡，尿液变黄等改变，受鼠多 数在术后第14-16天死亡。证实成功建立了大鼠肝移植排斥模型。二、鼠原位肝移植联合门静脉输注经CTLA4Ig基因修饰的BMSCs诱导移植肝耐受 术前用0. 25%胰蛋白酶消化本发明经重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染72h后的第3 代雄性LEWIS大鼠的BMSCs， PBS充分洗涤3次，将IX 106个细胞重悬于0. 5mL 0. 9 %的生理盐水中。行大鼠原位肝移植手术，过程与步骤一相同。在供肝植入后，开通 血流，用27G注射器经门静脉将上述CTLA4Ig基因修饰的BMSCs细胞悬液缓慢注入肝 叶，然后关腹作为实验组（CTLA4Ig-BMSCs组）。同时以肝移植术后注入生理盐水为 阴性对照组（control组），阳性对照组为免疫抑制剂治疗组（immunosuppressor组）， 即从术前1天开始肌注环孢素A(CsA， Sandoz公司产品）3mg/kg，连续用药14天。1、 术后受鼠生存情况的观察阴性对照组于术后第6-7天开始大都出现食量减少，体重降低，毛发蓬乱，精神 萎靡，嗜睡，行动迟缓，尿色深黄，伴皮肤耳廓黄染逐渐加重，在14-16天内相继死 亡，尸检发现肝脏肿胀，无腹腔内出血等手术操作失误致死因素。实验组与免疫抑制 剂治疗组术后精神饱满，饮食活动良好，未见皮肤黄染，小便清亮，恢复顺利，存活 时间最长超过120天。各组大鼠的生存率统计结果如图3A所示，实验组与免疫抑制 剂治疗组的生存率没有统计学差异，而二者的生存率明显高于阴性对照组。上述实验 结果证明肝移植联合门静脉输注本发明经CTLA4Ig基因修饰的BMSCs可使受者对移植 肝发生耐受，使其长期存活。2、 受鼠肝功能生化检测分别于上述术后第-l、l、3、7、10、14及28天经受鼠内眦静脉取血0. 5mL，12000rpm 离心15min，分离血清200ul上全自动血液生化仪检测血清丙氨酸转氨酶（ALT)、 天冬氨酸转氨酶（AST)、白蛋白（Alb)及总胆红素（Tbil)。结果如图3B所示， 实验组ALT、 AST及Tbil的血清浓度明显低于阴性对照组，Alb值明显高于阴性对照 组；而各项生化检测结果与免疫抑制剂治疗组没有显著差别，证明肝移植联合门静脉 输注经CTLA4Ig基因修饰的BMSCs可促进移植肝功能恢复，从而使其长期存活。3、 移植肝组织病理学检査分别于上述肝移植术后第10、 30、 60天活杀各组受鼠，取肝组织，用10%中性 福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚4-6um，常规脱腊后进行苏木素-伊红（HE)染色， 光学显微镜下观察。结果如图3C所示（1为阴性对照组术后14天；2为免疫抑制剂组术后10天；3为免疫抑制剂组术后60天；4为实验组术后10天；5为实验组术后30天；6为实验组术后60天），实验组术后IO天时有轻度排斥反应出现，但到30 天时发现排斥反应已经消失，60天时仍然无排斥反应出现，且在30天时发现肝组织 内有大量的小胆管增生；免疫抑制剂组在术后IO天时无免疫排斥反应，而在第60天 出现轻度排斥反应。上述检测结果进一步证明输注本发明经CTLA4Ig基因修饰的BMSCs 可使受者对移植肝发生耐受，使其长期存活，因而可以其为活性成分制备诱导移植肝 免疫耐受的药物。

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