技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物医学领域，特别涉及一种基于液态金属的冷冻保护剂。
背景技术
[0002] 常规血管冷冻保护剂主要有二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷
酮(PVP)、羟乙基
淀粉(HES)、聚
氧化乙烯(PEO)、海藻糖等。其中，DMSO是普遍采用的渗透型冷冻保护剂，属于低分子中性物质，在溶液中有
水合作用，能增加溶液粘性，从而弱化
冰晶结晶行为，达到冷冻保护的目的。DMSO在低温环境下无毒，但4℃以上毒性较大，尤其是在体温环境下会引起
机体较大毒性反应，这大大降低了经冷冻保存复苏后血管生物利用的可靠性。聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等属于非渗透型冷冻保护剂，分子量较大，对细胞渗透性较差，冷冻时无法改变细胞内结冰情况，在较高的降温速率时，无法调控细胞内的结冰情况，无法起到冷冻保护作用。乙二醇单独作为冷冻保护剂使用时，对平滑肌及内皮细胞的损伤较大，因而经常联合DMSO和聚乙二醇使用。由于常规冷冻保护剂的
传热效果有限，血管保存面临着冷冻过程中细胞内外结晶速度不一致、血管细胞抗冻性不均匀的问题，其结果是造成冷冻复苏的血管活
力底下，从而导致移植效果较差。因此，寻求及发展有效的血管冷冻保护剂是本领域亟需解决的技术难题。
[0003]
专利公开号为CN1491538A公开了一种血管
玻璃化保存液，包括聚
蔗糖、海藻糖、抗冻剂及高效渗透剂混合物，但仍不可避免存在血管组织内外
温度梯度较大的问题。
发明内容
[0004] 为了克服
现有技术的缺点，本发明提供一种基于液态金属的冷冻保护剂。所述冷冻保护剂可大大提升血管冷冻保护剂的传热效果，既适用于慢速冷冻，也适用于快速玻璃化冻存。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006] 一种冷冻保护剂，含有液态金属或其
合金，所述液态金属或其合金的熔点在60℃以下。
[0007] 所述液态金属选自Ga和/或Bi；所述液态金属合金选自GaIn合金、GaInSn合金、InBiSn合金或GaInSnZn合金中的一种或多种。优选GaIn24.5。
[0008] 优选地，所述冷冻保护剂还可以含有
基础保护剂，其添加量为冷冻保护剂总
质量的15-45％；或者添加量为冷冻保护总体积的10-20％。
[0009] 所述基础保护剂选自选自二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、聚氧化乙烯或海藻糖中的一种或多种。
[0010] 优选地，所述冷冻保护剂中还可以含有高导热性能纳米颗粒，其导热系数>2W/m·K，直径在10～500nm之间；其添加量为冷冻保护剂总质量的0.01～10％，优选1-2％。
[0011] 进一步优选，所述冷冻保护剂含有液态金属或其合金、基础保护剂和高导热性能纳米颗粒；其中，所述高导热性能纳米颗粒的添加量为每ml基础保护剂中添加10mg高导热性能纳米颗粒。
[0012] 所述高导热性能纳米颗粒选自氧化镁纳米颗粒、四氧化三
铁纳米颗粒、三氧化二铁纳米颗粒或金纳米颗粒中的一种或多种。本发明中将液态金属与高导热性能纳米颗粒相结合，可进一步提高冷冻保护剂在降温和复温过程中的传热效果，为大尺度的血管冷冻保存提供更为优异的换热效果。
[0013] 作为本发明优选的实施方式之一，所述冷冻保护剂中液态金属或其合金占总体积的1-99％。
[0014] 作为本发明优选的实施方式之一，所述冷冻保护剂由如下体积百分比的组分组成：基础冷冻保护剂1-20％，液态金属或其合金1-99％；或者基础冷冻保护剂1-20％，液态金属或其合金80-99％。
[0015] 进一步优选，所述冷冻保护剂由以体积百分数计80-90％液态金属或其合金和10-20％基础冷冻保护剂组成。更优选，所述冷冻保护剂由以体积百分数计80-84％液态金属或其合金和16-20％基础冷冻保护剂组成。
[0016] 作为本发明优选的实施方式之一，所述冷冻保护剂由如下体积百分比的组分组成：79-84％液态金属或其合金、15-20％基础冷冻保护剂，及1％的高导热性能纳米颗粒。
[0017] 本发明所述冷冻保护剂在制备中采用加热、融化、搅拌、弱
碱溶液清洗四部流程，为了保障液态金属的无菌性，在配制完毕后，置于紫外灯下照射30分钟。
[0018] 本发明还提供所述冷冻保护剂在血管冷冻保护、器官冻存、生物整体冻存保护等领域中的应用。
[0019] 本发明所述冷冻保护剂可用于血管冷冻保护(如血管慢速冷冻保存、快速玻璃化冻存)以及器官冻存及生物整体冻存保护。在具体使用时，常温下，将含有液态金属或其合金的冷冻保护剂灌注于
注射器，通过柔性
注射管连接至血管组织，将注射针插入血管，推动注射器将冷冻保护剂缓缓注入血管，注射完毕后拔出注射装置；进行冷冻；在降温时冷冻保护剂转
化成固体，起到
支架作用，以保持血管自然形态，有效防
止血管壁的塌陷和
变形。在血管复温时，将血管组织放入温热水浴复温，冷冻保护剂变为液态，将注射针置入血管，
抽取冷冻保护剂进行回收，避免在体温环境下引起机体毒性反应。此外，由于所述液态金属及其合金具有良好的
导电性和导热性，在冷冻保存降温时，利用其高导热性在三维组织内实现快速降温；复苏时还可利用其导电性接通
电流实现快速增温，有助于抑制血管在复温过程中的重结晶，提高冷冻复苏率。
[0020] 本发明所述冷冻保护剂具有较高的热导率，如镓的热导率为29.3W/m·K，相比较于传统冷冻保护剂DMSO(热导率为0.28W/m·K)，热导率提升了100倍，大大提升了冷冻保护剂的传热效果，既适用于慢速冷冻，也适用于快速玻璃化冻存，且安全无毒。
[0021] 本发明所述的冷冻保存剂大大降低了毒性较大的冷冻保护剂DMSO的使用浓度，提高了冷冻复苏率，更好地保持了血管的原有功能。而且在降低冻存血管毒性，提高冷冻效果的同时，可大大提高血管在组织工程、细胞移植和再生医学领域应用的安全性，具有极高的可行性和应用推广价值。与传统冷冻保护剂相比，本发明所述血管移植成活率可提高15～20％，血管移植成活率较高。
具体实施方式
[0022] 以下
实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0023] 实施例1
[0024] 本实施例提供了一种基于液态金属的血管冷冻保护剂，其组分为(以体积百分数计)：85％金属镓、15％DMSO。
[0025] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有15％DMSO 50ml冷冻管平衡1分钟，之后保存于-80℃超低温
冰箱，以-1℃/min的速度降至-
80℃，12小时后再转移至-196℃液氮中长期保存。
[0026] 实施例2
[0027] 本实施例提供了一种基于液态金属的血管冷冻保护剂，其组分为(以体积百分数计)：90％金属镓、10％DMSO。
[0028] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有15％DMSO 50ml冷冻管平衡1分钟，之后保存于-80℃超低温冰箱，以-1℃/min的速度降至-
80℃，12小时后再转移至-196℃液氮中长期保存。
[0029] 实施例3
[0030] 本实施例提供了一种基于液态金属的血管冷冻保护剂，其组分为(以体积百分数计)：85％合金GaIn24.5、15％DMSO。
[0031] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有15％DMSO 50ml冷冻管平衡1分钟，之后保存于-80℃超低温冰箱，以-1℃/min的速度降至-
80℃，12小时后再转移至-196℃液氮中长期保存。
[0032] 实施例4
[0033] 本实施例提供了一种基于液态金属的血管冷冻保护剂，其组分为(以体积百分数计)：85％合金GaIn24.5和15％DMSO，其中15％DMSO中含有10mg/ml氧化镁纳米颗粒。
[0034] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后保存于-80℃超低温冰箱，以-1℃/min的速度降至-80℃，12小时后再转移至-196℃液氮中长期保存。
[0035] 实施例5
[0036] 本实施例提供了一种基于液态金属的血管冷冻保护剂，其组分为(以体积百分数计)：80％金属Ga、20％DMSO。
[0037] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有15％DMSO 50ml冷冻管平衡1分钟，最后将血管直接转移至-196℃液氮中长期保存。
[0038] 实施例6
[0039] 本实施例提供了一种基于液态金属的血管冷冻保护剂，其组分为(以体积百分数计)：80％金属Ga、20％DMSO，其中20％DMSO中含有10mg/ml氧化镁纳米颗粒。
[0040] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有15％DMSO 50ml冷冻管平衡1分钟，最后将血管直接转移至-196℃液氮中长期保存。
[0041] 实施例7
[0042] 本实施例提供了一种基于液态金属的血管冷冻保护剂，其组分为(以体积百分数计)：80％金属GaIn24.5、20％DMSO。
[0043] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有15％DMSO 50ml冷冻管平衡1分钟，最后将血管直接转移至-196℃液氮中长期保存。
[0044] 实施例8
[0045] 本实施例提供了一种基于液态金属的血管冷冻保护剂，其组分为(以体积百分数计)：80％GaIn24.5、20％DMSO，其中20％DMSO中含有10mg/ml氧化镁纳米颗粒。
[0046] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有15％DMSO 50ml冷冻管平衡1分钟，最后将血管直接转移至-196℃液氮中长期保存。
[0047] 实施例9
[0048] 本实施例提供了一种基于液态金属的血管冷冻保护剂，其组分为(以体积百分数计)：100％GaIn24.5。
[0049] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有15％DMSO 50ml冷冻管平衡1分钟，最后将血管直接转移至-196℃液氮中长期保存。
[0050] 对照组1
[0051] 对照组1提供了一种常规冷冻保护剂PBS溶液，以体积百分比计，其中含有15％DMSO。
[0052] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有15％DMSO 50ml冷冻管平衡1分钟，之后保存于-80℃超低温冰箱，以-1℃/min的速度降至-
80℃，12小时后再转移至-196℃液氮中长期保存。
[0053] 对照组2
[0054] 对照组2提供一种常规冷冻保护剂PBS溶液，以体积百分比计，其中含有20％DMSO。
[0055] 室温下，将此血管冷冻保护剂注射进入拟冷冻保存的血管，之后将血管移入含有15％DMSO 50ml冷冻管平衡1分钟，最后将血管直接转移至-196℃液氮中长期保存。
[0056] 效果实验
[0057] 将实施例1-9及对照组1-2所得冷冻保护剂用于小鼠血管冷冻保存，并在复温后进行血管内皮细胞和平滑肌细胞活性检测，同时检测利用相同方法冷冻复温的血管移植存活率。结果如表1所示：
[0058] 表1.血管冷冻复苏后的细胞存活率及移植血管存活率
[0059] 血管细胞存活率 移植血管存活率
实施例1 67％ 54％
实施例2 62％ 51％
实施例3 59％ 53％
实施例4 70％ 58％
实施例5 78％ 72％
实施例6 80％ 76％
实施例7 71％ 66％
实施例8 73％ 69％
实施例9 42％ 36％
对照组1 12％ 10％
对照组2 18％ 12％
[0060] 结论：相比较传统血管冷冻保护剂，本发明所述液态金属冷冻保护剂具有细胞活性保持完好，毒性低，移植效果好的优点。其中，实施例4-8效果更优。
[0061] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
