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脂质体包封的亲和性药物

阅读：306发布：2022-02-14

专利汇可以提供脂质体包封的亲和性药物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本说明书提供一种脂质体抗叶酸剂组合物，其包含：包括内部空间的脂质体；安置在所述内部空间内的生物活性抗叶酸剂；连接至所述脂质体的外部的空间稳定剂；和靶向部分，所述靶向部分包含对至少一种叶酸盐受体具有特异亲和性的蛋白质，所述靶向部分连接至所述空间稳定剂和所述脂质体的外部中的至少一者。，下面是脂质体包封的亲和性药物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种脂质体抗叶酸剂组合物，其包含：
包括内部空间的脂质体；
设置在所述内部空间内的生物活性抗叶酸剂；
连接至所述脂质体的外部的PEG；和
靶向部分，其包含对至少一种叶酸盐受体具有特异亲和性的蛋白质，所述靶向部分连接至所述PEG和所述脂质体的外部中的至少一者。
2.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述PEG的数量平均分子量(Mn)为200～5000道尔顿。
3.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，所述脂质体抗叶酸剂组合物还包含免疫刺激剂、可检测标志物和马来酰亚胺中的至少一种，所述免疫刺激剂、可检测标志物和马来酰亚胺中的至少一种设置在所述PEG和所述脂质体的外部中的至少一者上。
4.如权利要求3所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述免疫刺激剂和可检测标志物中的至少一种与所述PEG和所述脂质体的外部中的至少一者共价键合。
5.如权利要求3所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，免疫刺激剂是选自由蛋白质免疫刺激剂、核酸免疫刺激剂、化学免疫刺激剂、半抗原和佐剂组成的组中的至少一种。
6.如权利要求3所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述免疫刺激剂是异硫氰酸荧光素(FITC)。
7.如权利要求3所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述免疫刺激剂是选自由以下物质组成的组中的至少一种：荧光素、DNP、β葡聚糖、β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖。
8.如权利要求3所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述可检测标志物是选自由荧光素和异硫氰酸荧光素(FITC)组成的组中的至少一种。
9.如权利要求3所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述免疫刺激剂和所述可检测标志物相同。
10.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体的直径为30nm～
150nm。
11.如权利要求10所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体的直径为40nm～
70nm。
12.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体为阴离子脂质体或中性脂质体。
13.如权利要求12所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体的ζ电势小于或等于零。
14.如权利要求12所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体的ζ电势为0～-
150mV。
15.如权利要求12所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体的ζ电势为-30mV～-50mV。
16.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体由脂质体成分形成。
17.如权利要求16所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体成分包含阴离子脂质和中性脂质中的至少一种。
18.如权利要求16所述的脂质体，其中，所述脂质体成分是选自由以下物质组成的组中的至少一种：DSPE、DSPE-PEG-马来酰亚胺、HSPC、HSPC-PEG、胆固醇、胆固醇-PEG和胆固醇-马来酰亚胺。
19.如权利要求16所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体成分包含选自由以下物质组成的组中的至少一种：DSPE、DSPE-PEG-FITC、DSPE-PEG-马来酰亚胺、胆固醇和HSPC。
20.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体包封水性溶液。
21.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体包封生物活性抗叶酸剂和水性药学可接受载剂。
22.如权利要求21所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述药学可接受载剂包含海藻糖。
23.如权利要求21所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述药学可接受载剂包含5重量％～20重量％的海藻糖。
24.如权利要求21所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述药学可接受载剂包含浓度为5mM～200mM并且pH为2.8～6的柠檬酸盐缓冲液。
25.如权利要求21所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述药学可接受载剂包含总浓度为50mM～500mM的乙酸钠和乙酸钙。
26.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂是水溶性的。
27.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，每个脂质体包含少于200,000个分子的所述生物活性抗叶酸剂。
28.如权利要求27所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，每个脂质体包含10,000～100,
000个分子的所述生物活性抗叶酸剂。
29.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂是培美曲塞。
30.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂是洛美曲索。
31.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂是选自由下述物质组成的组中的至少一种：甲氨蝶呤、雷替曲塞、氨基蝶呤、普拉曲沙、洛美曲索、洛美曲索的噻吩类似物、洛美曲索的呋喃类似物、三甲曲沙、LY309887和GW 1843U89。
32.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂是选自由下述物质组成的组中的至少一种：氯胍、乙胺嘧啶、甲氧苄啶以及6-位取代的吡咯并和噻吩并[2,3d]吡咯并嘧啶类的GARFT抑制剂。
33.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂处于5～
8的pH。
34.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂处于2～
6的pH。
35.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分经由马来酰亚胺官能团共价结合至选自由脂质体成分和PEG分子组成的组中的至少一种。
36.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分对选自由以下组成的组中的至少一种具有特异亲和性：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。
37.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分对选自由以下组成的组中的至少两种具有特异亲和性：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。
38.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分对叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ具有特异亲和性。
39.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分对肿瘤细胞表面抗原上的表位具有特异亲和性，所述肿瘤细胞表面抗原存在于肿瘤细胞表面上但在非肿瘤细胞上不存在或不可及。
40.如权利要求39所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述肿瘤细胞是恶性细胞。
41.如权利要求39所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述肿瘤细胞表面抗原是选自由以下组成的组中的至少一种：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。
42.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分是包含抗体的抗原结合序列的蛋白质。
43.如权利要求42所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，抗体的所述抗原结合序列包含抗体来源的一个或多个互补决定区。
44.如权利要求42所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述蛋白质包含抗体。
45.如权利要求42所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分是选自由以下组成的组中的至少一种：抗体、人源化抗体、抗体的抗原结合片段、单链抗体、单域抗体、双特异性抗体、合成抗体、聚乙二醇化抗体和多聚体抗体。
46.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，每个脂质体包含至多200个靶向部分。
47.如权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，每个脂质体包含30～200个靶向部分。
48.一种将生物活性抗叶酸剂递送至在其表面上表达叶酸盐受体的肿瘤的方法，所述方法包括：
以递送治疗有效剂量的生物活性抗叶酸剂的量对所述肿瘤施用权利要求1所述的组合物。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述肿瘤位于受试对象中，并且所述施用选自由以下组成的组：
输注；
注射；
胃肠外施用；和
局部施用。
50.如权利要求49所述的方法，其中，所述受试对象是人。
51.如权利要求48所述的方法，其中，所述方法将脂质体抗叶酸剂组合物选择性地递送至所述肿瘤，其速率为不表达叶酸盐受体的细胞的2倍。
52.一种制备权利要求16所述的组合物的方法，所述方法包括：
形成混合物，所述混合物包含：
脂质体成分；
在水性溶液中的生物活性抗叶酸剂；
靶向部分；
将所述混合物均质化以在所述水性溶液中形成脂质体；和
将所述混合物挤出穿过膜以形成将所述生物活性抗叶酸剂包封在水性溶液中的脂质体。
53.如权利要求52所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
在所述挤出步骤后除去在脂质体外部的水性溶液中的过量生物活性抗叶酸剂。
54.如权利要求53所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
在所述除去步骤后冻干所述组合物以形成冻干组合物。
55.如权利要求54所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
通过在所述冻干步骤后将所述冻干组合物溶解在溶剂中来重构所述冻干组合物。
56.如权利要求52所述的方法，其中，所述混合物包含选自由甘露醇、海藻糖、山梨醇和蔗糖组成的组中的至少一种。
57.如权利要求52所述的方法，其中，一种或多种脂质体成分还包含空间稳定剂。
58.如权利要求52所述的方法，其中，所述空间稳定剂是选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸类聚合物和聚乙烯醇。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述PEG的数量平均分子量(Mn)为200道尔顿～
5000道尔顿。
60.如权利要求55所述的方法，其中，所述溶剂是水性溶剂。
61.一种脂质体抗叶酸剂组合物，其包含：
包含脂质体的介质，所述脂质体包括内部空间；
设置在所述内部空间内的水性生物活性抗叶酸剂；
靶向部分，其包含对至少一种叶酸盐受体具有特异亲和性的蛋白质，所述靶向部分设置于所述脂质体的外部。
62.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述介质是水性溶液。
63.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述介质是包含选自由甘露醇、海藻糖、山梨醇和蔗糖组成的组中的至少一种冷冻保护剂的水性溶液。
64.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其还包含：
连接到所述脂质体的外部的空间稳定剂，其中所述靶向部分连接于所述空间稳定剂和所述脂质体外部中的至少一者。
65.如权利要求64所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述空间稳定剂是选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸类聚合物和聚乙烯醇。
66.如权利要求65所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述PEG的数量平均分子量(Mn)为200道尔顿～5000道尔顿。
67.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其还包含免疫刺激剂、可检测标志物和马来酰亚胺中的至少一种，所述免疫刺激剂、可检测标志物和马来酰亚胺中的至少一种设置在所述空间稳定剂和所述脂质体的外部中的至少一者上。
68.如权利要求67所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述免疫刺激剂和可检测标志物中的至少一种与所述空间稳定剂和所述脂质体的外部中的至少一者共价键合。
69.如权利要求67所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，免疫刺激剂选自由蛋白质免疫刺激剂、核酸免疫刺激剂、化学免疫刺激剂、半抗原和佐剂组成的组中的至少一种。
70.如权利要求67所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述免疫刺激剂是异硫氰酸荧光素(FITC)。
71.如权利要求67所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述免疫刺激剂是选自由以下物质组成的组中的至少一种：荧光素、DNP、β葡聚糖、β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖。
72.如权利要求67所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述可检测标志物是选自由荧光素和异硫氰酸荧光素(FITC)组成的组中的至少一种。
73.如权利要求67所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述免疫刺激剂和所述可检测标志物相同。
74.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体的直径为30nm～
150nm。
75.如权利要求74所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体的直径为40nm～
70nm。
76.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体为阴离子脂质体或中性脂质体。
77.如权利要求76所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体的ζ电势小于或等于零。
78.如权利要求76所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体的ζ电势为0～-
150mV。
79.如权利要求76所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体的ζ电势为-30mV～-50mV。
80.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体由脂质体成分形成。
81.如权利要求80所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体成分包含阴离子脂质和中性脂质中的至少一种。
82.如权利要求80所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体成分是选自由以下物质组成的组中的至少一种：DSPE、DSPE-PEG、DSPE-马来酰亚胺、HSPC、HSPC-PEG、HSPC-马来酰亚胺、胆固醇、胆固醇-PEG和胆固醇-马来酰亚胺。
83.如权利要求80所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体由脂质体成分形成，并且所述脂质体成分包含选自由DSPE、DSPE-FITC、DSPE-马来酰亚胺、胆固醇和HSPC组成的组中的至少一种。
84.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体包封水性溶液。
85.如权利要求84所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述脂质体包封生物活性抗叶酸剂和水性药学可接受载剂。
86.如权利要求85所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述药学可接受载剂包含海藻糖。
87.如权利要求86所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述药学可接受载剂包含5重量％～20重量％的海藻糖。
88.如权利要求85所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述药学可接受载剂包含浓度为5mM～200mM并且pH为2.8～6的柠檬酸盐缓冲液。
89.如权利要求85所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述药学可接受载剂包含总浓度为50mM～500mM的乙酸钠和乙酸钙。
90.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂是水溶性的。
91.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，每个脂质体包含少于200,000个分子的生物活性抗叶酸剂。
92.如权利要求91所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，每个脂质体包含10,000～100,
000个分子的生物活性抗叶酸剂。
93.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂是培美曲塞。
94.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂是洛美曲索。
95.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂是选自由下述物质组成的组中的至少一种：甲氨蝶呤、雷替曲塞、氨基蝶呤、普拉曲沙、洛美曲索、三甲曲沙、LY309887和GW 1843U89。
96.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂是选自由下述物质组成的组中的至少一种：氯胍、乙胺嘧啶、甲氧苄啶以及6-位取代的吡咯并和噻吩并[2,3d]吡咯并嘧啶类的GARFT抑制剂。
97.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂处于5～8的pH。
98.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述生物活性抗叶酸剂处于2～6的pH。
99.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分经由马来酰亚胺官能团共价结合至选自由脂质体成分和空间稳定剂分子组成的组中的至少一种。
100.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分对选自由以下组成的组中的至少一种具有特异亲和性：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。
101.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分对选自由以下组成的组中的至少两种具有特异亲和性：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。
102.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分对叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ具有特异亲和性。
103.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分对肿瘤细胞表面抗原上的表位具有特异亲和性，所述肿瘤细胞表面抗原存在于肿瘤细胞表面上但在非肿瘤细胞上不存在或不可及。
104.如权利要求103所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述肿瘤细胞是恶性细胞。
105.如权利要求103所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述肿瘤细胞表面抗原是选自由以下组成的组中的至少一种：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。
106.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分是包含抗体的抗原结合序列的蛋白质。
107.如权利要求106所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，抗体的所述抗原结合序列包含抗体来源的一个或多个互补决定区。
108.如权利要求106所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述蛋白质包含抗体。
109.如权利要求106所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，所述靶向部分是选自由以下组成的组中的至少一种：抗体、人源化抗体、抗体的抗原结合片段、单链抗体、单域抗体、双特异性抗体、合成抗体、聚乙二醇化抗体和多聚体抗体。
110.如权利要求61所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，每个脂质体包含至多200个靶向部分。
111.如权利要求110所述的脂质体抗叶酸剂组合物，其中，每个脂质体包含30～200个靶向部分。
112.一种将生物活性抗叶酸剂递送至在其表面上表达叶酸盐受体的肿瘤的方法，所述方法包括：
以递送治疗有效剂量的生物活性抗叶酸剂的量对所述肿瘤施用权利要求61所述的组合物。
113.如权利要求112所述的方法，其中，所述肿瘤位于受试对象中，并且所述施用选自由以下组成的组：输注、注射、胃肠外施用和局部施用。
114.如权利要求113所述的方法，其中，所述受试对象是人。
115.如权利要求112所述的方法，其中，所述方法将脂质体抗叶酸剂组合物选择性地递送至所述肿瘤，其速率为不表达叶酸盐受体的细胞的2倍。
116.一种制备权利要求80所述的组合物的方法，所述方法包括：
形成混合物，所述混合物包含：
脂质体成分；
在水性溶液中的生物活性抗叶酸剂；
靶向部分；
将所述混合物均质化以在所述水性溶液中形成脂质体；和
将所述混合物挤出穿过膜以形成将所述生物活性抗叶酸剂包封在水性溶液中的脂质体。
117.如权利要求116所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
在所述挤出步骤后除去在脂质体外部的水性溶液中的过量的生物活性抗叶酸剂。
118.如权利要求117所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
在所述除去步骤后冻干所述组合物以形成冻干组合物。
119.如权利要求118所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
通过在所述冻干步骤后将所述冻干组合物溶解在溶剂中来重构所述冻干组合物。
120.如权利要求116所述的方法，其中，所述混合物包含选自由甘露醇、海藻糖、山梨醇和蔗糖组成的组中的至少一种。
121.如权利要求116所述的方法，其中，一种或多种脂质体成分还包含空间稳定剂。
122.如权利要求121所述的方法，其中，所述空间稳定剂是选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸类聚合物和聚乙烯醇。
123.如权利要求122所述的方法，其中，所述PEG的数量平均分子量(Mn)为200道尔顿～
5000道尔顿。
124.如权利要求119所述的方法，其中，所述溶剂是水性溶剂。
125.一种选择性地靶向叶酸盐受体的靶向脂质体组合物，其包含：
包括内部空间的脂质体；
设置在所述内部空间内的生物活性剂；
连接至所述脂质体的外部的空间稳定剂分子；和
靶向部分，其包含对至少一种叶酸盐受体具有特异亲和性的蛋白质，所述靶向部分与所述空间稳定剂和所述脂质体外部中的至少一者相连。
126.如权利要求125所述的靶向脂质体组合物，其中，所述空间稳定剂是选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸类聚合物和聚乙烯醇。
127.如权利要求126所述的靶向脂质体组合物，其中，所述PEG的数量平均分子量(Mn)为200道尔顿～5000道尔顿。
128.如权利要求125所述的靶向脂质体组合物，其中，所述生物活性剂包含选自由下述物质组成的组中的至少一种：玫瑰树碱、紫杉醇、培美曲塞、甲氨蝶呤、雷替曲塞、氨基蝶呤、普拉曲沙、洛美曲索、三甲曲沙、LY309887、GW 1843U89、氯胍、乙胺嘧啶、甲氧苄啶以及6-位取代的吡咯并和噻吩并[2,3d]吡咯并嘧啶类的GARFT抑制剂。
129.一种将生物活性抗叶酸剂递送至在其表面上表达叶酸盐受体的肿瘤的方法，所述方法包括：
以递送治疗有效剂量的生物活性抗叶酸剂的量对所述肿瘤施用权利要求125所述的组合物。
130.如权利要求129所述的方法，其中，所述肿瘤位于受试对象中，并且所述施用选自由以下组成的组：输注、注射、胃肠外施用和局部施用。
131.如权利要求130所述的方法，其中，所述受试对象是人。
132.如权利要求129所述的方法，其中，所述方法将脂质体抗叶酸剂组合物选择性地递送至所述肿瘤，其速率为不表达叶酸盐受体的细胞的2倍。
133.一种制备权利要求125所述的组合物的方法，其中，所述脂质体由脂质体成分形成，所述方法包括：
形成混合物，所述混合物包含：
脂质体成分；
在水性溶液中的生物活性剂；
靶向部分；
将所述混合物均质化以在所述水性溶液中形成脂质体；和
将所述混合物挤出穿过膜以形成将所述生物活性抗叶酸剂包封在水性溶液中的脂质体。
134.如权利要求133所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
在所述挤出步骤后除去在脂质体外部的水性溶液中的过量的生物活性抗叶酸剂。
135.如权利要求134所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
在所述除去步骤后冻干所述组合物以形成冻干组合物。
136.如权利要求135所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
通过在所述冻干步骤后将所述冻干组合物溶解在溶剂中来重构所述冻干组合物。
137.如权利要求133所述的方法，其中，所述混合物包含选自由甘露醇、海藻糖、山梨醇和蔗糖组成的组中的至少一种。
138.如权利要求133所述的方法，其中，一种或多种脂质体成分还包含空间稳定剂。
139.如权利要求138所述的方法，其中，所述空间稳定剂是选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸类聚合物和聚乙烯醇。
140.如权利要求139所述的方法，其中，所述PEG的数量平均分子量(Mn)为200道尔顿～
5000道尔顿。
141.如权利要求136所述的方法，其中，所述溶剂是水性溶剂。
142.一种提供权利要求80所述的组合物的试剂盒，所述试剂盒包含：
脂质体成分，
使用所述组合物以包封生物活性剂的说明书，和
可选的在单独的容器中的生物活性剂。

说明书全文

脂质体包封的亲和性药物

[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求于2014年8月14日提交的美国临时申请第62/037,597号、2015年3月9日提交的美国临时申请第62/130,493号和2015年3月13日提交的美国临时申请第62/133,265号的权益。通过援引并入每一个这些申请的全部内容。

背景技术

[0003] 由于癌症类型的多样性、参与疾病进展的机制和与潜在的患者遗传组成相关的患者变异性，癌症是非常难以治疗的疾病。治疗癌症的早期努力涉及使用细胞毒性剂，包括抗叶酸剂。抗叶酸剂是指拮抗(即阻断)叶酸(维生素B9)作用的一类分子。叶酸在体内的主要功能是充当参与丝氨酸、甲硫氨酸、胸苷和嘌呤生物合成的各种甲基转移酶的辅因子。因此抗叶酸剂抑制细胞分裂、DNA/RNA合成和修复以及蛋白质合成。

[0004] 引入抗叶酸剂作为抗癌剂的基本原理是基于叶酸盐对所有分裂细胞的存活是重要的，因为叶酸盐是细胞复制期间DNA(核酸)合成的必要成分。任何细胞(无论是正常细胞还是癌性细胞)吸收叶酸，主要由还原的叶酸盐载体(RFC)介导，其是对叶酸具有低亲和性的丰富的跨膜转运蛋白。

[0005] 由于癌细胞是快速生长的细胞，因此对叶酸盐形式的DNA前体具有高需求，所以它们对抗叶酸剂的作用易感。快速生长的正常细胞，例如排列在胃肠道和骨髓细胞的细胞，也使用主要经由RFC提供的叶酸盐而快速分裂。因此正常细胞也对抗叶酸剂易感，因为抗叶酸剂用于浸润和杀死癌细胞的RFC介导的转运机制也具有导致杀死快速生长的正常细胞的附带效应的可能性，由此导致不希望的抗叶酸剂相关毒性。

[0006] 抗叶酸剂通过干扰叶酸的作用、剥夺癌细胞的需要增殖或生长的DNA前体而起作用。作为一类的抗叶酸剂利用其在癌症治疗中的抗增殖作用，以抑制细胞生长和分裂，这导致癌细胞死亡。快速复制的癌细胞与大多数正常细胞相比需要的叶酸盐量增加，导致近70年前抗叶酸剂作为抗癌剂的临床开发。然而，虽然基于抗叶酸剂的疗法显示对癌症治疗有效，但由于迫切的临床困境，其临床发展常常脱轨。这个困境来自两个竞争的临床动态。一方面，将抗叶酸剂设计为叶酸盐模拟分子，其中大多数叶酸盐模拟分子旨在通过使用RFC作为优选的跨膜转运机制而到达癌细胞。另一方面，体内快速更新的正常组织，例如骨髓或肠道组织细胞，像癌细胞一样，也是高度叶酸盐依赖性的，并且也使用RFC作为主要的跨膜叶酸盐细胞供应机制。这两种临床动力学的净结果是例如骨髓和胃肠(GI)道细胞通常是危及患者生命的抗叶酸剂相关毒性的非常普遍的部位。这些毒性中的一些包括粘膜炎、腹泻、贫血、中性粒细胞减少和低白细胞计数。在患者中这些抗叶酸剂相关的顽固性副作用的后果是，表现出高度有效的细胞毒性或抗癌性质的抗叶酸剂通常在其开发过程中失败，或迄今为止在临床实践中应用有限，这是因为这些抗叶酸剂还倾向于在正常细胞中具有不可接受的毒性形式的虚弱性副作用。

[0007] 作为一类的抗叶酸剂仍然是一种有希望的癌症治疗方式，尽管对患者存在严重甚至危及生命的毒性的相关风险。挑战在于找出以减少和/或避免对正常细胞的损害的方式有效递送抗叶酸剂的方式。最近，由于获得了对癌症的更新颖的替代疗法，尽管抗叶酸剂具有在杀死癌细胞方面的卓越有效性，但是抗叶酸剂与这些疗法相比已经失去了优势。发明内容

[0008] 对含有水性生物活性剂如抗癌剂(抗肿瘤剂)的叶酸盐受体具有亲和性和特异性的中性或阴离子免疫脂质体对于在其细胞表面呈递叶酸盐受体的细胞具有出人意料的有效性。

[0009] 在一个示例性实施方式中，提供一种脂质体抗叶酸剂组合物。该脂质体抗叶酸剂组合物包含：包含内部空间的脂质体；设置在所述内部空间内的生物活性抗叶酸剂；连接至所述脂质体的外部的PEG；和靶向部分，该靶向部分包含对至少一种叶酸盐受体具有特异亲和性的蛋白质，所述靶向部分连接至所述PEG和所述脂质体的外部中的至少一者。对于权利要求1所述的脂质体抗叶酸剂组合物，所述PEG可以具有200道尔顿～5000道尔顿的数量平均分子量(Mn)。

[0010] 还提供了示例性脂质体抗叶酸剂组合物。该示例性脂质体抗叶酸剂组合物包括：包含脂质体的介质，所述脂质体包括内部空间；设置在所述内部空间内的水性生物活性抗叶酸剂；靶向部分，该靶向部分包含对至少一种叶酸盐受体具有特异亲和性的蛋白质，所述靶向部分位于脂质体的外部。该组合物中的介质可以是水性溶液。水性溶液可以包含选自由甘露醇、海藻糖、山梨醇和蔗糖组成的组的至少一种冷冻保护剂。脂质体抗叶酸剂组合物还可以包含连接到脂质体外部的空间稳定剂，其中靶向部分连接到空间稳定剂和脂质体外部中的至少一者。所述空间稳定剂是选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸类聚合物和聚乙烯醇。所述PEG可以具有200道尔顿～5000道尔顿的数量平均分子量(Mn)。

[0011] 在任何示例性组合物、脂质体、产品、试剂盒和方法中，可以引入以下段落的额外特征：

[0012] 脂质体抗叶酸剂组合物还可以包含设置在所述PEG和所述脂质体的外部中的至少一者上的免疫刺激剂和可检测标志物。脂质体抗叶酸剂组合物可以具有其中免疫刺激剂和可检测标志物中的至少一个与所述PEG和所述脂质体的外部中的至少一者共价键合的特征。所述免疫刺激剂可以是选自由蛋白质免疫刺激剂、核酸免疫刺激剂、化学免疫刺激剂、半抗原和佐剂组成的组中的至少一种。例如，所述免疫刺激剂可以是异硫氰酸荧光素(FITC)。作为另一实例，所述免疫刺激剂可以是选自由荧光素、DNP、β葡聚糖、β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖组成的组中的至少一种。所述可检测标志物可以是选自由荧光素和异硫氰酸荧光素(FITC)组成的组中的至少一种。作为实例，所述免疫刺激剂和所述可检测标志物相同，例如其可以是异硫氰酸荧光素(FITC)。

[0013] 脂质体抗叶酸剂组合物的直径可以为30nm～150nm，例如，40nm～70nm。作为另一特征，脂质体可以是阴离子脂质体或中性脂质体。例如，脂质体的ζ电势可以小于或等于零，例如为0～-150mV，或-30mV～-50mV。

[0014] 脂质体抗叶酸剂组合物包含脂质体。脂质体可以由任何脂质体成分形成。例如，脂质体成分可以包含阴离子脂质和中性脂质中的至少一种。作为另一实例，脂质体成分是选自由以下物质组成的组中的至少一种：DSPE、DSPE-PEG-马来酰亚胺、HSPC、HSPC-PEG、胆固醇、胆固醇-PEG和胆固醇-马来酰亚胺。作为另一实例，脂质体成分包含选自由以下物质组成的组中的至少一种：DSPE、DSPE-PEG-FITC、DSPE-PEG-马来酰亚胺、胆固醇和HSPC。

[0015] 如所讨论的，脂质体可以包封水性溶液。例如，脂质体可以包封生物活性抗叶酸剂和水性药学可接受载剂。药学可接受载剂可以包含海藻糖，例如5重量％～20重量％的海藻糖。药学可接受载剂可以包含浓度为5mM～200mM并且pH为2.8～6的柠檬酸盐缓冲液。与其它成分无关，药学可接受载剂可以包含总浓度为50mM～500mM的乙酸钠和乙酸钙。

[0016] 生物活性抗叶酸剂可以是水溶性的。作为实例，脂质体抗叶酸剂组合物可以具有脂质体，并且一些脂质体可以包含少于200,000个分子的生物活性抗叶酸剂。例如，脂质体可以包含10,000～100,000个分子的生物活性抗叶酸剂。

[0017] 生物活性抗叶酸剂可以包含培美曲塞。在另一示例性实施方式中，生物活性抗叶酸剂可以包含洛美曲索。在另一示例性实施方式中，生物活性抗叶酸剂是选自由下述物质组成的组中的至少一种：甲氨蝶呤、雷替曲塞、氨基蝶呤、普拉曲沙(pralatrexate)、洛美曲索、洛美曲索的噻吩类似物、洛美曲索的呋喃类似物、三甲曲沙(trimetrexed)、LY309887和GW 1843U89。作为选择，或者另外，生物活性抗叶酸剂是选自由下述物质组成的组中的至少一种：氯胍、乙胺嘧啶、甲氧苄啶以及6-位取代的吡咯并和噻吩并[2,3d]吡咯并嘧啶类的GARFT抑制剂。洛美曲索类似物例如描述于Habeck等,Cancer Research,第54卷，1021-1026页，1994年2月15日。

[0018] 在脂质体抗叶酸剂组合物中，生物活性抗叶酸剂可以处于5～8的pH。作为另外的选择，脂质体抗叶酸剂组合物可以包含处于2～6的pH的生物活性抗叶酸剂。

[0019] 任何部分，例如靶向部分、可检测标志物、免疫刺激剂、空间稳定剂和任何可选的部分和试剂，可以直接或间接与脂质体或脂质体成分结合。间接结合可以包括通过空间稳定剂(例如PEG)、诸如马来酰亚胺等官能团、离子键(亲和素、链亲和素和生物素等)或结合伴侣(NTA-镍等)的结合。还设想这些间接结合机制的组合，例如PEG-马来酰亚胺。

[0020] 在脂质体抗叶酸剂组合物或其它组合物中，靶向部分可以经由马来酰亚胺官能团与选自由脂质体成分和PEG分子组成的组中的至少一种共价结合。靶向部分可以对选自由以下组成的组中的至少一种具有特异亲和性：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。例如，靶向部分可以对选自由以下组成的组中的至少两种具有特异亲和性：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。作为又一实例，靶向部分可以对叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ所有三种都具有特异亲和性。

[0021] 在示例性实施方式中，所述靶向部分对肿瘤细胞表面抗原上的表位具有特异亲和性，所述肿瘤细胞表面抗原存在于肿瘤细胞表面上但在非肿瘤细胞上不存在或不可及。肿瘤细胞可以是例如恶性细胞。肿瘤细胞表面抗原是选自由以下组成的组中的至少一种：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。在亲和性的一个样品测定中，靶向部分与叶酸盐受体结合的亲和性可以比与还原型叶酸盐载体的结合亲和性高至少2倍、5倍、10倍、25倍、100倍、500倍或5000倍。

[0022] 在涉及靶向部分的示例性实施方式中，靶向部分是包含抗体的抗原结合序列的蛋白质。抗体的抗原结合序列包含抗体来源的一个或多个互补决定区。蛋白质可以包含抗体。在示例性实施方式中，靶向部分是选自由以下组成的组中的至少一种：抗体、人源化抗体、抗体的抗原结合片段、单链抗体、单域抗体、双特异性抗体、合成抗体、聚乙二醇化抗体和多聚体抗体。

[0023] 脂质体抗叶酸剂组合物或脂质体组合物的脂质体可以包含至多200或至多250个靶向部分/脂质体。作为实例，脂质体可以包含30～200个靶向部分。

[0024] 一个方面还涉及一种将生物活性抗叶酸剂递送至在其表面上表达叶酸盐受体的肿瘤的方法，所述方法包括：以递送治疗有效剂量的生物活性抗叶酸剂的量对所述肿瘤施用任何所述组合物，例如脂质体抗叶酸剂组合物。施用选自由以下组成的组：输注、注射、胃肠外施用和局部施用。受试对象可以是任何动物或任何哺乳动物。合适动物的实例列于本说明书中。例如，受试对象可以是人。

[0025] 组合物可以使用任何合适的方法制备。制备脂质体抗叶酸剂组合物或脂质体组合物的一个示例性方法包括以下步骤：形成混合物，所述混合物包含：(1)脂质体成分，(2)在水性溶液中的生物活性抗叶酸剂，(3)靶向部分，所述靶向部分可选地可以已经连接或键合至脂质体成分。后续步骤包括将所述混合物均质化以在所述水性溶液中形成脂质体，并且将所述混合物挤出穿过膜以形成将所述生物活性抗叶酸剂包封在水性溶液中的脂质体。所述方法可以包括在所述挤出步骤后除去在脂质体外部的水性溶液中的过量的生物活性抗叶酸剂的可选步骤。所述方法还可以包括在所述除去步骤后冻干所述组合物以形成冻干组合物的步骤。所述方法可以包括另一可选的步骤。该步骤是通过在所述冻干步骤后将所述冻干组合物溶解在溶剂中来重构所述冻干组合物。

[0026] 所述混合物包含选自由甘露醇、海藻糖、山梨醇和蔗糖组成的组中的至少一种。一种或多种脂质体成分还包含空间稳定剂。空间稳定剂是选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸类聚合物和聚乙烯醇。PEG的数量平均分子量(Mn)为200道尔顿～5000道尔顿。在制备组合物的方法中，溶剂可以是水性溶剂。

[0027] 提供了选择性地靶向叶酸盐受体的靶向脂质体组合物。示例性的靶向脂质体组合物包含：包括内部空间的脂质体；设置在所述内部空间内的生物活性剂；连接至所述脂质体的外部的空间稳定剂分子；和靶向部分，其包含对至少一种叶酸盐受体具有特异亲和性的蛋白质，所述靶向部分连接到所述空间稳定剂和所述脂质体外部中的至少一者。空间稳定剂是选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸类聚合物和聚乙烯醇。例如，PEG可以具有200道尔顿～5000道尔顿的数量平均分子量(Mn)。在该靶向脂质体组合物中，生物活性剂包含选自由下述物质组成的组中的至少一种：玫瑰树碱、紫杉醇、培美曲塞、甲氨蝶呤、雷替曲塞、氨基蝶呤、普拉曲沙、洛美曲索、洛美曲索的噻吩类似物、洛美曲索的呋喃类似物、三甲曲沙、LY309887、GW 1843U89、氯胍、乙胺嘧啶、甲氧苄啶以及6-位取代的吡咯并和噻吩并[2,3d]吡咯并嘧啶类的GARFT抑制剂。

[0028] 所述组合物可以例如通过形成混合物而制备，所述混合物包含：(1)脂质体成分；(2)在水性溶液中的生物活性抗叶酸剂；(3)靶向部分。接下来的步骤包括将所述混合物均质化以在所述水性溶液中形成脂质体；和将所述混合物挤出穿过膜以形成将所述生物活性抗叶酸剂包封在水性溶液中的脂质体。可选的步骤可以涉及在所述挤出步骤后除去在脂质体外部的水性溶液中的过量的生物活性抗叶酸剂。另一可选步骤涉及在所述除去步骤后冻干所述组合物以形成冻干组合物。另一可选步骤包括通过在所述冻干步骤后将所述冻干组合物溶解在溶剂中来重构所述冻干组合物。其它成分和步骤可以与本文讨论的其它制造方法共享。

[0029] 还提供了一种提供任何脂质体组合物(包括脂质体抗叶酸剂组合物)的试剂盒，所述试剂盒可以包含脂质体成分、使用所述组合物以包封生物活性剂的说明书和可选的在单独的容器中的生物活性剂。附图说明

[0030] 图1A是说明正常组织的示意图。

[0031] 图1B是说明癌组织的示意图。

[0032] 图2是说明示例性实施方式及其结合机制的示意图。

[0033] 图3是说明与细胞表面上的叶酸盐受体结合的荧光染料缀合抗体的示意图。

[0034] 图4是显示与表达叶酸盐受体α的细胞结合并内化到该细胞中的实例的示意图。

[0035] 图5是说明示例性脂质体组合物的内化对利用p38蛋白激酶途径的细胞增殖的作用的示意图。

[0036] 图6描述来自使用荧光染料对KB细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0037] 图7描述来自使用荧光染料对OVCAR-3(卵巢)细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0038] 图8描述来自使用荧光染料对NCIH2452(间皮瘤)细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0039] 图9描述来自使用荧光染料对CCD841(正常结肠)细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0040] 图10描述来自使用荧光染料对SL0003(肺)细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0041] 图11描述来自使用荧光染料对CCD841(正常结肠)细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0042] 图12是描述示例性脂质体组合物在正常或癌细胞中的表面水平的条形图。

[0043] 图13描述来自使用RhodoRed对卵巢癌细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0044] 图14描述来自使用RhodoRed对高KB叶酸盐受体α的细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0045] 图15描述来自使用RhodoRed对正常乳腺细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0046] 图16描述来自使用RhodoRed对正常结肠细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0047] 图17描述显示脂质体浓度依赖性靶向相比未靶向脂质体浓度依赖性检测的条形图。

[0048] 图18A描述来自对未处理细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0049] 图18B描述来自对用根据示例性实施方式的示例性脂质体组合物处理的细胞进行的流式细胞术分析的数据。

[0050] 图19描述暴露至所列出的各种试剂的肺癌细胞。

[0051] 图20是说明生长抑制与叶酸盐受体α表达之间的关系的线图。

[0052] 图21是总结了结果并证明示例性实施方式的示例性脂质体组合物抑制了癌细胞生长的条形图。

[0053] 图22A是描述正常细胞的细胞周期的示意图。

[0054] 图22B是显示在细胞周期的各种阶段中细胞的碘化丙锭定量的图表。

[0055] 图23A描述来自未经处理的细胞的碘化丙锭定量的数据。

[0056] 图23B描述来自用培美曲塞处理的细胞的碘化丙锭定量的数据。

[0057] 图24显示脂质体组合物的示例性实施方式导致的细胞周期停滞的条形图。

[0058] 图25描述分析细胞的Mac-1以确定成熟中的嗜中性粒细胞。

[0059] 图26A描述正常细胞的流式细胞术数据。

[0060] 图26B描述经培美曲塞处理的细胞的流式细胞术数据。

[0061] 图27是描述在经培美曲塞处理的样品和示例性实施方式处理的样品中的分化的噬中性粒细胞的数量。

具体实施方式

[0062] 如上所述讨论的，抗叶酸剂药物被设计为叶酸盐模拟分子，所述叶酸盐模拟分子一旦在细胞内则通过干扰叶酸盐的作用起作用，剥夺细胞需要复制和增殖的DNA前体。因为癌细胞是对叶酸盐形式的DNA前体具有高需求的快速生长的细胞，所以它们以与对叶酸盐相同的方式摄取抗叶酸剂药物，并且因此对抗叶酸剂的作用易感。但是，快速生长中的正常细胞，例如，排列在胃肠道的细胞和骨髓的细胞(例如噬中性粒细胞)，也使用主要通过RFC提供的叶酸盐快速分裂。因此正常细胞也对抗叶酸剂的毒性效应易感，这是因为大多数抗叶酸剂被设计用于浸润和杀死癌细胞的RFC介导的转运机制与正常细胞用于供给抗叶酸剂和叶酸盐的机制相同。结果，使用非常有希望和有效的抗叶酸剂的癌症治疗在患者的临床护理中曾经是极大挑战，这是因为所述治疗对快速生长的正常细胞造成附带损伤的高度可能性，从而导致抗叶酸剂相关的严重且可能危及生命的毒性。

[0063] 如上文所讨论，因其在癌症治疗中的抗增殖作用而使用作为一类的抗叶酸剂，以抑制细胞生长和分裂，这导致癌细胞死亡。与大多数正常细胞相比，快速复制的癌细胞需要增加量的叶酸盐。这导致近70年前抗叶酸剂作为抗癌剂的临床开发。但是，虽然基于抗叶酸剂的疗法显示对癌症治疗有效，但是抗叶酸剂的临床发展已经成问题，并且由于迫切的临床困境而常常脱轨。这个困境来自两个竞争的临床动态。一方面，抗叶酸剂被设计为叶酸盐模拟分子，其中大多数旨在使用RFC作为优选的跨膜转运机制到达癌细胞。另一方面，体内的快速更新组织，例如骨髓或肠道组织细胞，像癌细胞一样，也是高度叶酸依赖性的，并且也使用RFC作为主要的跨膜叶酸盐细胞供给机制。这两种临床动力学的净结果是骨髓和胃肠(GI)道细胞是危及患者生命的抗叶酸剂相关毒性的最普遍的部位。这些毒性中的一些包括粘膜炎、腹泻、贫血、中性粒细胞减少和低白细胞计数。这类毒性(单独地或作为组合)在许多情况下是基于抗叶酸剂的治疗导致患者死亡的原因。结果是，到目前为，许多有效的有希望的抗叶酸剂在其开发期间继续失败，不是因为缺乏对癌细胞的有效性，而是因为患者安全问题。仍然由于安全问题，已经设法达到成为药物的阶段的极少数在临床实践中也用途有限。

[0064] 作为一类的抗叶酸剂仍然是一种有希望的治疗癌症的方式，尽管对患者有严重甚至危及生命的毒性的相关风险。挑战在于找出以避免对正常细胞造成损伤的方式递送这些高效抗叶酸剂的方法。

[0065] 先前的努力通常集中于使用RFC递送抗癌剂。然而，本发明人利用在涉及叶酸盐受体(包括但不限于例如叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和/或叶酸盐受体δ)的癌细胞中特别普遍的另一途径。已经在癌症生物学中观察到，与正常细胞相比，癌细胞优先表达叶酸盐受体α，从而有效地摄取叶酸以用于维持其快速复制和增殖需要。与正常细胞相比，癌细胞非常有效地为自身供应包含在血流中的叶酸盐。癌细胞这样做的一种方式是通过其过表达叶酸盐受体(例如叶酸盐受体α)而进行。随着癌症的进展，肿瘤细胞表面叶酸盐受体α水平趋于增加，这最有可能是由于对叶酸盐供应的需求增加。

[0066] 由于其对叶酸盐受体α的高亲和性，常规研究将叶酸作为用于将抗癌或细胞毒性分子递送至癌细胞的靶向部分，目的是优先递送细胞毒性药物至癌细胞，而叶酸缀合至含有细胞毒性药物的脂质体或缀合至细胞毒性药物本身。这种方法在很大程度上没有导致患者安全性的改善，因为正如本发明人所认识到的，该方法没有意识到在利用叶酸盐途径作为向癌细胞递送细胞毒性剂的方法时的关键生物学差异，同时降低和/或最小化正常细胞对细胞毒性药物的暴露；用叶酸作为靶向配体，正常细胞不能避免毒性，因为这样的靶向药物仍然被正常细胞通过RFC摄取。换言之，使用叶酸作为靶向部分的靶向药物在生物学上与常规非靶向抗叶酸剂没有区别，因为这种构建体的药物与叶酸盐受体α和RFC都结合，如同任何其他被癌细胞和正常细胞无差别地摄取的叶酸盐模拟分子一样。因此，使用叶酸作为靶向部分不会提供细胞毒性剂向癌细胞的选择性递送同时避开正常细胞。因此，以叶酸作为靶向部分，药物相关毒性在患者护理中仍然成问题。因此，先行的专家指出，尝试利用叶酸盐受体作为用于选择性靶向癌细胞的手段可能是无效的，这引导本领域技术人员的努力背离对利用叶酸盐受体的尝试。

[0067] 迄今为止尚未尝试将抗叶酸剂靶向具有靶向部分的叶酸盐受体。因为抗叶酸剂模拟叶酸盐，所以人们不会考虑利用叶酸盐途径以靶向方式递送抗叶酸剂。这将被认为是多余的，因为还原的叶酸盐载体已经将叶酸盐转运到细胞中。从这种理解可以符合固有逻辑地推断出，由于抗叶酸剂模拟叶酸盐，抗叶酸剂药物将通过叶酸盐受体而被细胞有效吸收，并且将不必使用例如抗体的进一步辅助。本发明人采取了反直觉的方法。因为重要的是防止抗叶酸剂被正常细胞通过RFC吸收以减少或避免抗叶酸剂相关的毒性，本发明人发现这个目标特别可以通过利用癌症特异性形态(cance specific morphology)来实现，所述癌症特异性形态尚未被意识到可用于抗叶酸剂研究领域：肿瘤组织细胞导致极性的损失。

[0068] 细胞极性的破坏和组织解体是晚期上皮肿瘤的标志。如图1A所示，正常单层上皮通常包含显示不同顶端-基底极性的单独细胞的单层。细胞紧密堆叠并通过顶端连接复合体(图1A-101)彼此连接，其分离顶端和基底外侧膜结构域。在极性得以保持的正常组织中，叶酸盐受体α附着在位于远离血液循环中的叶酸并且不与其直接接触的细胞的顶端表面(图1A-102)。图1B说明高级上皮肿瘤中的细胞如何表现出顶端-基底极性的丧失和整体组织解体，使叶酸盐受体α与血液循环中的叶酸直接接触(1B-103)。本发明人认为肿瘤组织细胞的这一特征对于基于抗叶酸剂的疗法具有比传统认知所意识到的更大的意义。本发明人发现这具有恢复抗叶酸剂作为抗癌疗法的重要潜力，同时减少和/或甚至最小化与抗叶酸剂相关的严重和有时危及生命的毒性。

[0069] 在这方面，本发明人设计了一种化学实体以选择性靶向在癌细胞中高度表达的叶酸盐受体(例如叶酸盐受体α、β和δ)的方式递送抗叶酸剂，同时避免了RFC(正常细胞利用的叶酸盐途径)，从而选择性地将抗叶酸剂暴露于肿瘤组织细胞，同时减少或避免抗叶酸剂暴露于正常细胞。这之所以可能是通过认识到，肿瘤组织细胞在极性损失后不仅过表达和暴露叶酸盐受体(例如叶酸盐受体α)而且癌细胞中的叶酸盐受体与血液循环直接接触，而这两种情况都不是正常组织中的情况。由于具有与叶酸盐受体α的结构和功能上的相似性，该方法还可以扩展到其它细胞表面叶酸盐受体(例如叶酸盐受体β、叶酸盐受体δ等)。

[0070] 本公开内容大体上涉及用于递送各种生物活性剂(例如抗叶酸剂)的脂质体组合物，制备所述脂质体组合物的方法和使用所述脂质体组合物治疗患者的方法。在提供包封抗叶酸剂的脂质体方面这特别有用，所述脂质体靶向叶酸盐受体但不特异性靶向还原叶酸盐载体。

[0071] 更具体而言，本公开内容基于如下发现，即对叶酸盐受体或含有多于一种叶酸盐受体的一种或多种生物活性剂(例如，抗癌(抗肿瘤)剂)具有亲和性和特异性的中性或阴离子脂质体(即非阳离子脂质体)对于在其细胞表面上呈递和表达叶酸盐受体的细胞出人意料地有效。

[0072] 在示例性实施方式中，提供脂质体抗叶酸剂组合物。所述脂质体抗叶酸剂组合物可以包含：包括内部空间的脂质体；设置在所述内部空间内的生物活性抗叶酸剂；连接至脂质体的外部的PEG；和靶向部分，其包含对至少一种叶酸盐受体具有特异亲和性的蛋白质，所述靶向部分连接至所述PEG和脂质体的外部中的至少一者。

[0073] 术语连接(attach,attached)是指例如任何类型的键合，例如共价键合，通过疏水相互作用的离子键合(例如，亲和素-生物素)键合，以及通过如马来酰亚胺等功能基团或者诸如PEG等连接子键合。例如，可检测标志物、空间稳定剂、脂质体、脂质体成分、免疫刺激剂可以彼此直接连接，或者通过马来酰亚胺官能团或通过PEG-马来酰亚胺基团连接。

[0074] 在一些示例性实施方式中，脂质体包括可增加其循环寿命的空间稳定剂。基本概念是，一种或多种空间稳定剂如亲水性聚合物(聚乙二醇(PEG))或糖脂(单唾液酸神经节苷脂(GM1))等占据紧邻脂质体表面的空间并且将其他大分子排除出该空间。因此，血浆调理素与脂质体表面的接近和结合受到阻碍，因此巨噬细胞与此类脂质体的相互作用或任何其它清除机制被抑制，并且循环中的脂质体的寿命增加。在示例性实施方式中，空间稳定剂或空间稳定剂群可以是PEG或包含PEG的组合。在示例性实施方式中，空间稳定剂可以是具有200至5000道尔顿的数量平均分子量(Mn)的PEG。这些PEG可以是任何结构，例如直链、支链、星形或梳状结构，并且可商购获得。

[0075] 包含在各种示例性实施方式的脂质体组合物中的脂质体可以是本领域已知的或稍后发现的任何脂质体。一般来说，示例性实施方式的脂质体可以具有任何脂质体结构，例如具有通过一个或多个脂双层与外部介质隔离的内部空间的结构，或具有带有亲脂中心部分的半透膜的任何微胶囊，其中所述膜隔绝出内部。脂双层可以是以亲水部(亲水性部分)和疏水部(疏水性部分)为特征的两亲分子的任何排列。通常将双层中的两亲性分子排列成二维片体，其中疏水性部分向内取向，而亲水性部分向外取向。形成示例性实施方式的脂质体的两亲性分子可以是任何已知的或稍后发现的两亲性分子，例如合成或天然来源的脂质或生物相容性脂质。示例性实施方式的脂质体也可以由两亲性聚合物和表面活性剂形成，例如聚合物囊泡(polymerosome)和拟囊泡(niosome)。出于本公开内容的目的，但并非限制，这些形成脂质体的材料也称为“脂质”。

[0076] 脂质体组合物可以是液体或可以是干燥的，例如干粉或干饼的形式。干粉或干饼可以在例如冻干条件下进行一次干燥(primary drying)，或者任选地，其可以经历两度仅一次干燥，也可以经历一次干燥和二次干燥(secondary drying)。在干燥形式中，粉末或饼可以例如具有1％至6％的水分，例如2％至5％的水分或2％至4％的水分。干燥的一个示例性方法是冻干(也称为冷冻干燥或冷干(cyrodessication))。本公开内容的任何组合物和方法可涉及脂质体、冻干脂质体或从冻干脂质体重构的脂质体。在冻干、冻干保护剂或冷冻保护剂中，可以使用保护冷冻干燥材料的分子。这些分子通常是多羟基化合物，例如糖(单糖、二糖和多糖)、多元醇及其衍生物、甘油或聚乙二醇、海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、右旋糖酐、甘油和氨基糖苷。冻干保护剂或冷冻保护剂可以例如占在脂质体外部或脂质体内部或者在脂质体外部和内部的溶液的至多10％或至多20％。

[0077] 示例性实施方式的脂质体可以例如具有30nm～150nm(纳米)的直径。在其他示例性实施方式中，脂质体可以例如具有40nm～70nm的直径。

[0078] 示例性实施方式的脂质体可以例如优选是阴离子性或中性的。也就是说，脂质体不应是阳离子的。电荷(即阴离子、中性或阳离子)的确定可以通过测定脂质体的ζ电势进行。在示例性实施方式中，脂质体的ζ电势小于或等于零。在另一示例性实施方式中，脂质体的ζ电势为0至-150mV。在另一示例性实施方式中，ζ电势应为-30mV至-50mV。

[0079] 脂质体的性质受用于制备脂质体的脂质的性质的影响。各种脂质已经用于制备脂质体。这些包括阳离子、阴离子和中性脂质。阳离子脂质用于制备通常用作基因转染剂的阳离子脂质体。阳离子脂质体上的正电荷使得能够与细胞表面上的负电荷相互作用。在阳离子脂质体与细胞结合后，脂质体通过胞吞作用在细胞内转运。然而，阳离子脂质体会与正常细胞和肿瘤细胞都结合。因为示例性实施方式旨在特异性和选择性靶向肿瘤细胞，同时基本避开正常细胞，所以不优选使用阳离子脂质。使用例如中性脂质(例如HSPC)和阴离子脂质(例如PEG-DSPE)的混合物导致较不可能与正常细胞非特异性结合的阴离子脂质体的形成。通过使用靶向肿瘤的抗体，例如叶酸盐受体抗体，包括例如叶酸盐受体α抗体、叶酸盐受体β抗体和/或叶酸盐受体δ抗体，可以实现对肿瘤细胞的特异性结合。

[0080] 作为实例，至少一种(或一些)脂质是两亲性脂质，其被定义为具有亲水性部分和疏水性部分(通常是亲水性头部和疏水性尾部)。疏水性部分通常取向至疏水相中(例如，在双层内)，而亲水性部分通常取向至水性相中(例如，在双层外)。亲水性部分可以包括极性或带电基团，例如碳水化合物、磷酸根、羧酸根、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团。疏水性部分可以包括非极性基团，其包括但不限于长链饱和以及不饱和脂肪族烃基和被一个或多个芳香族、环脂族或杂环基团取代的基团。两亲性化合物的实例包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。

[0081] 通常而言，例如，脂质是磷脂。磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸等。应当理解，可以使用其他脂质膜成分，例如胆固醇、鞘磷脂、心磷脂等。

[0082] 在示例性实施方式中，脂质可以是阴离子和中性(包括两性离子和极性)脂质，包括阴离子和中性磷脂。中性脂质在选定的pH下以不带电荷或中性两性离子形式存在。在生理pH，这样的脂质包括例如二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。两性离子脂质的实例包括但不限于二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)。阴离子脂质是在生理pH带负电荷的脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)和其它与中性脂质连接的阴离子改性基团。

[0083] 总体而言，阴离子和中性脂质在本文中称为非阳离子脂质。此类脂质可以含磷，但它们不限于此。非阳离子脂质的实例包括卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)、16-0-单甲基PE、16-0-二甲基PE、18-1-反式PE、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、磷酸二鲸蜡酯和胆固醇。

[0084] 示例性实施方式的脂质体可以使用脂质体成分(也称为脂质体组分)利用任何脂质体组装方法组装。脂质体成分例如包括，脂质如DSPE、HSPC、胆固醇和这些成分的衍生物。其它合适的脂质例如由Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,Alabama,美国)商购获得。
适于制造阴离子脂质体的市售带负电或中性带电的脂质的部分列表可以例如是以下中的至少一种：DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、DMPE、DPPE、DOPE、DMPA·Na、DPPA·Na、DOPA·Na、DMPG·Na、DPPG·Na、DOPG·Na、DMPS·Na、DPPS·Na、DOPS·Na、DOPE-戊二酰·(Na)2、四肉豆蔻酰基心磷脂·(Na)2、DSPE-mPEG-2000·Na、DSPE-mPEG-5000·Na和DSPE-马来酰亚胺PEG-2000·Na。

[0085] 这些脂质的衍生物可以例如至少包括一种或多种空间稳定剂和/或官能团与脂质体成分的键合(优选共价键合)，之后所述空间稳定剂和/或官能团应被认为是脂质体成分的一部分。官能团包括可用于将脂质体成分连接到另一部分(例如蛋白质)的基团。此类官能团至少包括马来酰亚胺。这些空间稳定剂包括选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸类聚合物和聚乙烯醇。

[0086] 因为脂质体成分可以包括与其结合的任何分子(即，化学品/试剂/蛋白质)，所以脂质体成分可以例如至少包括DSPE、DSPE-PEG、DSPE-马来酰亚胺、HSPC、HSPC-PEG、HSPC-马来酰亚胺、胆固醇、胆固醇-PEG和胆固醇-马来酰亚胺。在一个优选的实施方式中，构成脂质体的脂质体成分包括DSPE、DSPE-FITC、DSPE-马来酰亚胺、胆固醇和HSPC。

[0087] 在示例性实施方式中，脂双层的至少一种成分被官能化(或是反应性的)。如本文所使用，官能化成分是包含可用于将试剂和部分交联到脂质的反应性基团的成分。如果脂质被官能化，其形成的任何脂质体也被官能化。

[0088] 在示例性实施方式中，反应性基团是将与交联剂(或其它部分)反应以形成交联体的基团。反应基团可以位于脂质上的任何位置，这允许其接触交联剂并与另一部分(即，空间稳定剂、靶向部分等)交联。在一些实施方式中，其在脂质的头部基团中，包括例如磷脂。反应基团的实例是马来酰亚胺基团。马来酰胺基团可以在二硫醇交联剂的存在下彼此交联，二硫醇交联剂例如但不限于二硫苏糖醇(DTT)。

[0089] 应当理解，示例性实施方式考虑使用其它官能化脂质，其他反应性基团和其它交联剂。除了马来酰亚胺基团之外，反应性基团的其它实例包括但不限于其它硫醇反应性基团、如伯胺和仲胺等氨基、羧基、羟基、醛基、炔基、叠氮基、羰基、卤代乙酰基(例如碘乙酰基)、亚氨酸酯基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、巯基和吡啶基二硫基等。

[0090] 官能化和非官能化脂质可从许多商业来源获得，包括Avanti Polar 5Lipids(Alabaster,Ala.)。

[0091] 示例性实施方式的脂质体还可以包含设置在其外部的免疫刺激剂和/或可检测标志物。例如，免疫刺激剂或可检测标志物可与脂质体的外部、包括例如可选地与空间稳定剂离子键合或共价键合。

[0092] 免疫刺激剂，也称为免疫刺激药、免疫刺激物、半抗原和佐剂，是通过诱导免疫系统的任何成分的活化或增加活性来刺激免疫系统的物质。

[0093] 这些免疫刺激剂可以包括半抗原、佐剂、蛋白质免疫刺激剂、核酸免疫刺激剂和化学免疫刺激剂中的一种或多种。许多佐剂含有设计用于刺激免疫响应的物质，例如脂A、源自百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的蛋白质。一些佐剂可商购获得，例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)；Merck Adjuvant 65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham,Philadelphia,Pa.)；铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化的多糖；聚磷腈；生物降解性微球；单磷酰脂A和醌A(quil A)。细胞因子例如GM-CSF、白细胞介素-2、-7、-12和其它类似的生长因子也可以用作佐剂。在优选的实施方式中，免疫刺激剂可以是选自由荧光素、DNP、β葡聚糖、β-1,3-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖组成的组中的至少一种。

[0094] 可检测标志物可以例如至少包括放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂、酶、染料、墨、磁性化合物、生物催化剂或颜料，其能够通过本领域已知的任何合适的手段检测，例如磁共振成像(MRI)、光学成像、荧光/发光成像或核成像技术。

[0095] 免疫刺激剂和/或可检测标志物可以通过与脂质体共温育而连接到外部。例如，免疫刺激剂和/或可检测标志物可以通过疏水相互作用或者通过离子键与脂质体膜缔合，所述离子键例如亲和素/生物素键或金属螯合键(例如，Ni-NTA)。作为选择，免疫刺激剂或可检测标志物可以例如通过共价键合至脂质体成分或空间稳定剂(其是PEG)，而与脂质体的外部共价键合。

[0096] 一个示例性试剂是异硫氰酸荧光素(FITC)，基于发明人的实验其可出人意料地兼作免疫刺激剂和可检测标志物。

[0097] 示例性实施方式还提供包封内部空间的脂质体。在示例性实施方式中，内部空间可以包含但不限于水性溶液。内部空间可以包含生物活性剂，例如抗叶酸剂和水性药学可接受载剂。药学可接受载剂可以包括例如海藻糖。在示例性实施方式中，例如，海藻糖可以以约5％至20％重量百分比的海藻糖存在，或者以一种或多种冻干保护剂或冷冻保护剂的任意组合以总浓度5％至20％存在。内部空间可以例如包含浓度为5至200mM的柠檬酸盐缓冲液。柠檬酸盐缓冲液可以在2.8至6之间的pH缓冲内部空间。与海藻糖或柠檬酸盐浓度无关，药学可接受载剂可以包含总浓度为50mM至500mM的乙酸钠和乙酸钙。

[0098] 在示例性实施方式中，生物活性抗叶酸剂可以是例如水溶性生物活性剂。也就是说，生物活性剂可以形成水性溶液。根据示例性实施方式，每个脂质体可以包含含有小于200,000个分子的生物活性剂的内部空间。例如，在示例性实施方式中，脂质体可以包含10,
000至100,000的生物活性抗叶酸剂。

[0099] 在示例性实施方式中，生物活性剂可以是选自由以下组成的组中的至少一种：培美曲塞、洛美曲索、甲氨蝶呤、雷替曲塞、氨基蝶呤、普拉曲沙(pralatrexate)、其洛美曲索类似物、洛美曲索的噻吩类似物、洛美曲索的呋喃类似物、三甲曲沙(trimetrexed)、LY309887和GW 1843U89。在另一个实施方式中，生物活性剂可以是是选自由下述物质组成的组中的至少一种：氯胍、乙胺嘧啶、甲氧苄啶以及6-位取代的吡咯并和噻吩并[2,3d]吡咯并嘧啶类的GARFT抑制剂。在一个优选的实施方式中，生物活性抗叶酸剂是培美曲塞。在另一个示例性实施方式中，生物活性抗叶酸剂是洛美曲塞。

[0100] 包含生物活性剂的溶液的pH可以例如设定为5至8或2至6。

[0101] 根据示例性实施方式，包含在实施例的脂质体组合物中的脂质体也可以是靶向脂质体，例如在脂质体表面上包括一个或多个靶向部分或生物分布修饰剂的脂质体。靶向脂质体的示例性实施方式可以例如称为免疫脂质体。靶向部分可以是能够与期望靶标特异性结合或相互作用的任何试剂。在示例性实施方式中，靶向部分可以是特异性和亲和性地与叶酸盐受体(例如叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和/或叶酸盐受体δ)的部分。叶酸盐受体是独特的，与还原的叶酸盐载体不同，并利用不同途径到达细胞内部。根据示例性实施方式，靶向部分特异地和优先地与靶细胞结合，和/或内化到靶细胞中，脂质体包埋的实体在所述靶细胞中发挥其期望的效果。靶细胞可以是例如癌细胞、肿瘤细胞和/或转移细胞。在示例性实施方式中，携带靶向部分的脂质体由靶细胞内化。

[0102] 在本公开内容的任何示例性实施方式中，靶向部分可以是抗体的抗原结合序列的蛋白质。在示例性实施方式中，蛋白质可以例如具有至少抗体的抗原结合位点的三维结构。此类作为靶向部分的蛋白质的一个实例是抗体。然而，完整抗体不是必须的。例如，作为任何示例性实施方式的靶向部分的蛋白质可以包含抗体来源的一个或多个互补决定区(CDR)。可以充当靶向部分的合适蛋白质的实例包括选自由以下组成的组中的至少一种：抗体、人源化抗体、抗体的抗原结合片段、单链抗体、单结构域抗体、双特异性抗体、合成抗体、聚乙二醇化抗体和多聚体抗体。抗体可以具有这些特征的组合。例如，人源化抗体可以是抗原结合片段，并且也可以是聚乙二醇化和多聚化的。叶酸盐受体α抗体是可商购获得。

[0103] 可以使用的示例性抗体是针对叶酸盐受体α的鼠类抗体。该序列在美国专利第US5646253号中描述。例如，基于公开的序列，合成基因并将其置于瞬时表达载体中，并且在HEK-293瞬时表达系统中产生抗体。抗体可以是完整抗体、Fab或所讨论的各种抗体变体中的任一种。

[0104] 每个脂质体可包含例如30至250个靶向部分，例如30至200个靶向部分。作为选择，每个脂质体可包含小于220个靶向部分，例如小于200个部分。靶向部分可以例如通过共价键合而连接至脂质体的外部。脂质体外部的分子可以例如至少包含脂质、空间稳定剂、马来酰亚胺和胆固醇等。在示例性实施方式中，靶向部分可以经由马来酰亚胺官能团与选自由脂质体成分和空间稳定剂(如PEG分子)组成的组中的至少一种共价结合。有可能所有的靶向部分都结合到一种成分例如PEG。也有可能靶向部分结合到不同的成分。例如，一些靶向部分可以结合到脂质成分或胆固醇上，一些靶向部分可以结合至空间稳定剂(例如，PEG)，而其它靶向部分可结合至可检测标志物或结合至另一靶向部分。

[0105] 在示例性实施方式中，靶向部分对至少一种或多种抗原具有亲和性和特异性，其中抗原选自由以下组成的组：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。在示例性实施方式中，靶向部分对选自由以下组成的组中的至少两种具有特异亲和性(即亲和性和特异性)：叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。在另一示例性实施方式中，靶向部分对三种抗原具有特异性亲和性，它们例如是叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。靶向部分可以对抗原的表位具有亲和性和特异性，因为有时靶向部分不结合完整抗原，而仅结合抗原的许多表位中的一个表位。在示例性实施方式中，靶向部分对存在于肿瘤细胞上但在非肿瘤细胞上不存在或不可及(inaccessible)的肿瘤细胞表面抗原上的表位具有特异亲和性。例如，在一些情况下，肿瘤抗原可以位于正常细胞和恶性癌细胞的表面上，但是肿瘤表位可以仅暴露于癌细胞中。作为另一实例，肿瘤抗原可以经历癌中的确认变化，该变化导致癌细胞特异性表位被呈现。对上述表位具有特异亲和性的靶向部分是有用的并设想在示例性实施方式中。在这些实施方式中，具有癌细胞特异性表位的肿瘤细胞可以是癌细胞。此类肿瘤细胞表面抗原的实例至少包括叶酸盐受体α、叶酸盐受体β和叶酸盐受体δ。

[0106] 示例性实施方式涉及脂质体抗叶酸剂组合物，其包含：包含脂质体的介质，所述脂质体包括内部空间；设置在所述内部空间内的水性生物活性抗叶酸剂；靶向部分，其包含对至少一种叶酸盐受体具有特异亲和性的蛋白质，所述靶向部分设置在所述脂质体的外部。在示例性实施方式中，所述介质是水性溶液。在示例性实施方式中，内部空间，外部空间(即，介质)或内部空间和介质都含有以上列出的一种或多种冻干保护剂或冷冻保护剂。在示例性实施方式中，优选冷冻保护剂甘露醇、海藻糖、山梨醇和蔗糖。

[0107] 如以上所讨论的，示例性实施方式的脂质体可以包含可以增加其在循环中的寿命的空间稳定剂。基本概念是一种或多种空间稳定剂(例如亲水性聚合物(聚乙二醇(PEG))或糖脂(单唾液酸神经节苷脂(GM1))等)占据紧邻脂质体表面的空间，并且将其它大分子排除出该空间。因此，血浆调理素与脂质体表面的接近和结合受到阻碍，所以巨噬细胞与此类脂质体的相互作用或任何其它清除机制被抑制，并且循环中的脂质体的寿命增加。

[0108] 对于引入空间稳定剂的任何示例性实施方式，空间稳定剂可以是选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸类聚合物和聚乙烯醇。在示例性实施方式中，空间稳定剂或空间稳定剂的群体是PEG。在示例性实施方式中，空间稳定剂是具有200至5000道尔顿的数量平均分子量(Mn)的PEG。这些PEG可以是任何结构，例如直链、支链、星形或梳状结构，并且可商购获得。

[0109] 根据示例性实施方式，脂质体组合物可以作为含有示例性实施方式的示例性脂质体组合物和载剂(例如药学可接受载剂)的药物组合物提供。药学可接受载剂的实例是生理盐水、等渗右旋糖、等渗蔗糖、林格氏溶液和汉克斯溶液。可以加入缓冲物质以提供对于储存稳定性最佳的pH。例如，约6.0至约7.5的pH、更优选约6.5的pH对于脂质体膜脂质的稳定性而言是最佳的，并且提供对所包埋实体的优异保留。通常浓度为2mM至20mM的组氨酸、羟乙基哌嗪-乙基磺酸盐(HEPES)、吗啉代乙基磺酸盐(MES)、琥珀酸盐、酒石酸盐和柠檬酸盐是示例性缓冲物质。其它合适的载剂包括例如水、缓冲水溶液、0.4％NaCl和0.3％甘氨酸等。可以加入蛋白质、碳水化合物或聚合稳定剂和张力调节剂，例如明胶、白蛋白、右旋糖苷或聚乙烯吡咯烷酮。组合物的张力可用葡萄糖或更惰性的化合物如乳糖、蔗糖、甘露醇或糊精调节至0.25mol/kg至0.35mol/kg的生理水平。这些组合物可以通过常规的公知灭菌技术，例如通过过滤来灭菌。所得水性溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂在施用前与无菌水性介质合并。

[0110] 药物脂质体组合物还可以含有接近生理条件所需的其它药学上可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂以及张力调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙，等等。另外，脂质体悬浮液可以包括保护脂质免受储存时自由基和脂质过氧化损伤的脂质保护剂。合适的是亲脂性自由基猝灭剂(例如α-生育酚)和水溶性铁特异性螯合剂(例如铁氧胺(ferrioxamine))。

[0111] 流体药物制剂中示例性实施方式的脂质体的浓度可以广泛地变化，即从通常小于约0.05重量％，或至少约2重量％至10重量％，到高达30重量％至50重量％，并且会主要通过液体体积、粘度等根据所选择的具体施用模式进行选择。例如，可以增加浓度以降低与治疗相关的流体负荷。这在具有动脉粥样硬化相关的充血性心力衰竭或严重高血压的患者中是特别期望的。作为选择，可以将由刺激性脂质组成的脂质体药物组合物稀释至低浓度以减轻施用部位的炎症。

[0112] 示例性实施方式涉及将生物活性剂(例如抗叶酸剂)递送至在其表面上表达叶酸盐受体的肿瘤的方法。示例性方法包括以对肿瘤递送治疗有效剂量的生物活性抗叶酸剂的量，施用本公开内容中的至少一种任何含有脂质体的组合物的步骤。

[0113] 脂质体药物组合物的施用量将取决于被包封在脂质体内的具体治疗实体、所治疗的疾病状态、所使用的脂质体的类型以及临床医生的判断。通常，脂质体药物组合物的施用量将足以递送治疗有效剂量的具体治疗实体。

[0114] 递送治疗有效剂量所需的脂质体药物组合物的量可以通过药物测试领域常见的例行体外和体内方法来确定。参见例如，D.B.Budman,A.H.Calvert,E.K.Rowinsky(编者)，Handbook of Anticancer Drug Development，LWW，2003。各种治疗实体的治疗有效剂量是本领域技术人员公知的；并且根据示例性实施方式，通过药物脂质体组合物递送的治疗实体提供与通过在其例行非脂质体制剂中施用相同量的治疗实体所获得的活性相比至少相同或更高的活性。通常，示例性实施方式的脂质体药物组合物的剂量可以例如为0.005mg至约500mg治疗实体/kg体重，最经常地为约0.1mg至约100mg治疗实体/kg体重。

[0115] 有效量是足以提供医学上期望的结果的试剂的剂量。有效量将在健康从业者的知识和专长内根据以下因素而变化：期望的结果、所治疗或预防的具体病症、所治疗的受试者的年龄和身体状况、病症的严重性、治疗的持续时间、并行或组合治疗的性质(如果有的话)、具体的施用途径和类似因素。通常优选使用最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。

[0116] 例如，如果受试者具有肿瘤，则有效量可以是减少肿瘤体积或负荷(例如通过对肿瘤成像而确定)的量。有效量也可以通过血液或其它体液或组织(例如活检)中癌细胞的存在和/或频率来评估。如果肿瘤影响组织或器官的正常功能，则可通过测量组织或器官的正常功能来评估有效量。在一些情况下，有效量是减轻或消除一种或多种、优选所有症状所需的量。

[0117] 示例性实施方式提供药物组合物。药物组合物是无菌组合物，其优选在药学可接受载剂中包含样品脂质体和优选的抗叶酸剂。

[0118] 术语“药学可接受载剂”可以例如是指一种或多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，其适于施用至示例性实施方式所考虑的人或其他受试者。

[0119] 术语“载剂”表示天然或合成的有机或无机成分，脂质体组合物与其组合以便于施用。药物组合物的成分以防止显著损害其期望的药物功效的相互作用的方式混合。合适的缓冲剂包括乙酸和盐(1％至2％W/V)、柠檬酸和盐(1％至3％W/V)、硼酸和盐(0.5％至2.5％W/V)以及磷酸和盐(0.8％至2％W/V)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003％至0.03％W/V)、氯丁醇(0.3％至0.9％W/V)和对羟基苯甲酸酯(0.01％至0.25％W/V)。

[0120] 除非本文另有说明，否则可使用多种施用途径。所选择的具体方式当然会取决于所选择的具体活性剂、所治疗的具体病症和治疗功效所需的剂量。一般而言，所提供的方法可以使用医学上可接受的任何施用模式来实施，这是指产生有效水平的所需响应而不引起临床上不可接受的不良作用的任何模式。可能的施用途径包括注射，通过肠胃外途径例如肌内、皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、关节内、硬膜内、鞘内、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注等，以及口、鼻、粘膜、舌下、气管内、眼部、直肠、阴道、眼部、局部、经皮、肺部、吸入。

[0121] 在示例性实施方式中，脂质体药物组合物可以例如作为液体溶液或悬浮液制备为输注组合物、注射组合物、肠胃外组合物或局部组合物。然而，也可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体载体中的固体形式。该组合物也可以根据本领域已知的方法例如配制成肠溶衣片剂或凝胶胶囊。

[0122] 为了将根据示例性实施方式配制的脂质体药物递送至中枢神经系统的肿瘤，将脂质体直接缓慢、持续地颅内输注到肿瘤中(对流增强递送，或CED)可能是特别有利的。参见Saito等,Cancer Research,第64卷，2572-2579,2004；Mamot等,J.Neuro-Oncology,第68卷，1-9,2004。组合物也可以例如直接施用于组织表面。持续释放、pH依赖性释放或其它特定的化学或环境条件介导的释放施用也特别包括在示例性实施方式中，例如通过诸如储存物注射或可侵蚀植入物等手段。以下列出数个具体实例用于说明。

[0123] 对于口服施用，化合物可以例如通过将脂质体组合物与本领域公知的药学可接受载剂组合来配制。此类载体能够使制剂成为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液(slurries)、薄膜(films)和悬浮液等，以用于由待治疗的受试者口服摄取。合适的赋形剂可以例如包括：填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。可选地，口服制剂还可以配制在用于中和内部酸条件的盐水或缓冲液中，或者可以在没有任何载剂的情况下施用。

[0124] 可口服使用的药物制品包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的软的密封胶囊。推入配合胶囊可以包含悬浮在合适的液体(例如水性溶液、缓冲溶液、脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中的脂质体组合物。另外，可以加入稳定剂。用于口服施用的所有制剂应该是适于此类施用的剂量。

[0125] 对于颊部施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

[0126] 对于通过吸入施用，所述组合物可以使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾形式来便利地递送。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供递送经计量的量的阀门来确定剂量单位。

[0127] 当需要全身性地递送组合物时，它们可以配制成用于通过注射的肠胃外施用，例如通过弹丸注射或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中。药物肠胃外制剂包括所述组分的水性溶液。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖苷。作为选择，脂质体的悬浮液可以制备为油基悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油如芝麻油、合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯。

[0128] 作为选择，脂质体组合物可以是粉末形式或冻干形式，以用于在使用前用合适的载剂(例如无菌无热原水)构建。

[0129] 组合物还可以配制在直肠或阴道组合物中，例如栓剂或滞留灌肠剂，其例如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。

[0130] 示例性实施方式涵盖使用示例性实施方案的组合物和脂质体，向患有或有风险发展癌症(包括例如实体瘤癌症)的受试者施用试剂。在示例性实施方式中，癌症可以例如通过叶酸盐受体在其细胞表面上的表达而辨别。叶酸盐受体可以例如包括叶酸盐受体α、叶酸盐受体β或叶酸盐受体δ。示例性实施方式设想组合物能够对这些受试者递送更高量的生物活性剂(单独或组合)而不过度递送至正常细胞(即，不表达叶酸盐受体的细胞)。

[0131] 可以治疗表达叶酸盐受体的任何癌症。应当注意，一些癌症可以在早期阶段表达叶酸盐受体，而大多数癌症可以在晚期阶段表达叶酸盐受体。癌症可以是癌、肉瘤或黑素瘤。癌包括但不限于基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、CNS癌、结肠和直肠癌、肾或肾细胞癌、喉癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC，包括腺癌、巨细胞(或燕麦)细胞癌和鳞状细胞癌)、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌(包括基底细胞癌和鳞状细胞癌)、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、直肠癌、呼吸系统癌症和泌尿系统癌症。

[0132] 肉瘤是骨(骨肉瘤)和软组织(纤维肉瘤)中出现的间质瘤。肉瘤包括但不限于脂肉瘤(包括粘液性肉瘤和多形性肉芽肿)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性外周神经鞘瘤(也称为恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤或神经源性肉瘤)、尤文氏瘤(Ewing's tumors)(包括骨的尤文氏肉瘤、骨外(即非骨)尤文肉瘤和原始神经外胚层瘤)、滑膜肉瘤、脉管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、卡波西肉瘤、血管内皮瘤，韧带状瘤(desmoid tumor)(也称为侵袭性纤维瘤病)、隆凸突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、恶性纤维性组织细胞瘤(MFH)、血管外皮细胞瘤、恶性间充质瘤、肺泡软性部分肉瘤(肺泡软组织肉瘤)、肺泡软组织肉瘤、上皮样肉瘤、透明细胞肉瘤、促结缔组织增生性小细胞肿瘤、胃肠道基质肿瘤(GIST)和软骨肉瘤。

[0133] 黑素瘤是由皮肤和其他器官的黑素细胞系统产生的肿瘤。黑素瘤的实例包括但不限于慢性黑质瘤、浅表扩散性黑色素瘤、结节黑素瘤和肢端性黑素瘤。

[0134] 癌症可以是实体瘤淋巴瘤。实例包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和B细胞淋巴瘤。

[0135] 癌症可以是但不限于骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内肿瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤或横纹肌肉瘤。

[0136] 示例性实施方式可以在可能受益于如本文所考虑的试剂的递送的任何受试者中实施。人类受试者是示例性实施方式中的优选受试者，但受试者还可以包括动物，例如家庭宠物(例如狗、猫、兔、雪貂等)、家畜或农场动物(例如，牛、猪、绵羊、鸡和其他家禽)、马(例如良种马)、实验动物(例如小鼠、大鼠、兔等)以及哺乳动物等。受试者还包括鱼和其他水生物种。

[0137] 对其递送试剂的受试者可以是正常受试者。作为选择，它们可具有或可能有风险发展某病症，该病症可经诊断或可受益于递送一种或多种特定药剂。在示例性实施方式中，此类病症包括癌症(例如实体瘤癌症或非实体瘤癌症，如白血病)。在更优选的实施方式中，这些病症包括涉及在其细胞表面上表达叶酸盐受体的细胞的癌症。

[0138] 用于诊断示例性实施方式所包含的病症的测试是本领域已知的，并且为普通医学从业者所熟悉。确定细胞类型是否表达叶酸盐受体可以使用市售的抗体进行。这些实验室测试包括但不限于显微镜分析、培养依赖性测试(例如培养物)和核酸检测测试。这些包括湿法固定、染色增强显微镜法、免疫显微镜(例如，FISH)、杂交显微镜、颗粒凝集、酶联免疫吸附测定、尿液筛选测试、DNA探针杂交、血清学测试等。除了运行上述实验室测试，医学从业者通常也将采用完整病史，并进行全面体检。

[0139] 患有癌症的受试者可以是例如具有可检测的癌细胞的受试者。有风险发展癌症的受试者可以例如是具有高于发生癌症的正常概率的受试者。这些受试者包括例如已经被证明与发展癌症的较高可能性相关的具有遗传异常的受试者、具有家族性倾向于癌症的受试者、暴露于癌症引发剂(即，致癌物质)(例如烟草、石棉或其他化学毒素)的受试者、以及先前治疗过癌症和表现缓解的受试者。

[0140] 在示例性实施方式中，所述方法可以以与不表达叶酸盐受体的细胞相比较高(例如大于其至少2倍)的速率选择性递送脂质体抗叶酸剂组合物。

[0141] 示例性实施方式涉及本公开内容的任何组合物的制造方法。在示例性实施方式中，所述方法包括形成包含以下的混合物：(1)脂质体成分；(2)在水性溶液中的生物活性抗叶酸剂；和(3)靶向部分。然后可以将所述混合物均质化以在水性溶液中形成脂质体。此外，可以将所述混合物透过膜挤出以形成将所述生物活性抗叶酸剂包封在水性溶液中的脂质体。应当理解，脂质体成分包含本公开内容的任何脂质(包括胆固醇)，其包括官能化脂质和与靶向部分、可检测标志物和空间稳定剂连接的脂质，或所有这些的任何子集。进一步注意，在水性溶液中的生物活性抗叶酸剂可以包括针对脂质体内部或外部进行过讨论的任何试剂和化学品，包括例如缓冲剂、盐和冷冻保护剂等。

[0142] 该方法可以进一步包括以下可选步骤：在所述除去步骤后冻干所述组合物以形成冻干组合物。如上所述，在水性溶液中的生物活性抗叶酸剂可以包含冷冻保护剂，其可以是本公开中列出的任何冷冻保护剂。如果将组合物冻干，可以优选冷冻保护剂。

[0143] 此外，在冻干步骤之后，所述方法可以包括以下可选步骤：通过在所述冻干步骤后将所述冻干组合物溶解在溶剂中来重构所述冻干组合物。重构的方法是公知的。一种优选的溶剂是水。其它优选的溶剂包括盐溶液和缓冲溶液。

[0144] 尽管讨论了某些示例性实施方式，但应当理解，脂质体可以通过本领域已知或即将已知的任何方法制备。例如参见G.Gregoriadis(编者),Liposome Technology,第1-3卷，第一版，1983；第二版，1993,CRC Press,45Boca Raton,Fla.。适于制造脂质体组合物的方法的实例包括挤出、反相蒸发、超声、溶剂(例如乙醇)注射、微流化、洗涤剂透析、醚注射和脱水/再水合。脂质体的尺寸可以通过控制用于低压挤出的膜的孔径或在微流化或任何其它合适的方法中使用的压力和次数来控制。

[0145] 通常，生物活性抗叶酸剂被包含在内部，即，在脂质体的内(内部)空间中。在示例性实施方式中，取代的铵被部分地或基本上完全地从围绕脂质体的外部介质中除去。此类去除可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法实现，例如稀释、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、透析、超滤、沉淀等。因此，一个可选的步骤可以包括以下步骤：在所述挤出步骤之后除去脂质体外部的水性溶液中的生物活性抗叶酸剂。

[0146] 另一个示例性实施方式涉及选择性靶向叶酸盐受体的靶向脂质体组合物，其包括：包含内部空间的脂质体；设置在所述内部空间内的生物活性剂；连接到脂质体外部的空间稳定剂分子；和靶向部分，所述靶向部分包含对至少一种叶酸盐受体具有特异亲和性的蛋白质，所述靶向部分连接至所述空间稳定剂和所述脂质体的外部中的至少一者。

[0147] 该示例性实施方式的成分可以与本公开内容的其它实施方式所述的相同。例如，生物活性剂、空间稳定剂(可以是PEG)如本公开内容的其它部分中所述。

[0148] 在示例性实施方式中，示例性实施方式的生物活性剂可以是玫瑰树碱、紫杉醇或本公开内容中列出的任何其它生物活性剂。还设想了与玫瑰树碱或紫杉醇相关的试剂。这些试剂至少包括紫杉烷类，例如多西他赛和卡巴他赛。

[0149] 示例性实施方式进一步涵盖组合物和方法的体外应用。体外使用可以是例如在其中需要选择性处理细胞亚群的应用，例如细胞培养和组织工程。例如，在培养来自正常患者或患有癌症的患者的干细胞期间，可以用所讨论的样品组合物或样品脂质体处理细胞以解决癌性细胞亚群。癌性亚群可以因为供体最初具有癌症或因为细胞在体外过程中自发转化而导致。

[0150] 根据示例性实施方式，脂质体和脂质体组合物可以在试剂盒中提供，所述试剂盒包括具有脂质体的容器，和可选地具有实体和说明书(例如涉及在一种或多种应用中使用脂质体组合物的程序或信息)的容器。此类说明书可以经由任何介质(例如，硬版纸拷贝页、电子介质或对包含说明书的数据库或网站的访问权)来提供。

[0151] 实施例

[0152] 以下实施例旨在说明而非以任何方式、形状或形式(不论明确地或隐含地)限制本发明。尽管它们是可以使用的那些实例的典型例，但是也可以替代地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。

[0153] 使用包括实施例部分中的步骤的本公开内容的方法，构建示例性组合物和示例性脂质体，例如脂质体抗叶酸剂组合物。示例性组合物包含示例性脂质体。示例性组合物和示例性脂质体都用于实施例部分中描述的实验中，并且本公开内容的具体实施方式贯穿本公开内容，并且不意味着限定本公开内容的全部范围。

[0154] 实施例1：含有培美曲塞和半抗原的叶酸盐受体α靶向脂质体的生产

[0155] 培美曲塞脂质体的生产

[0156] 培美曲塞二钠七水合物(ALIMTA)是高度水溶性的，在中性pH的溶解度为100mg/ml。培美曲塞通过以下步骤包封在脂质体中。首先，称量脂质体膜的脂质成分，并在约65℃作为在乙醇中的浓缩溶液合并。在该实施例中，所使用的脂质是氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG-2000(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000])、PEG-DSPE-马来酰亚胺和PEG-DSPE-FITC。HSPC：胆固醇：PEG-DSPE的摩尔比为约55:
40:5。接下来，将培美曲塞以100mg/ml的浓度溶解于水性缓冲液中。将药物溶液加热至65℃。使用小孔针将乙醇脂质溶液注射到培美曲塞溶液中。在该步骤期间，使用磁力搅拌器充分搅拌药物溶液。混合在升高的温度(63℃～72℃)进行，以确保脂质处于液晶态(与在低于脂质转变温度Tm＝51℃～54℃的温度获得的凝胶态相反)。结果，脂质水合化并形成在水性核心中含有培美曲塞的多个双层(多层)囊泡(MLV)。

[0157] 使用过滤器挤出降低MLV的尺寸

[0158] 通过使用三次通过堆叠(径迹蚀刻的聚碳酸酯)膜的高压挤出，将MLV片段化成所需尺寸的单层(单个双层)囊泡。在第一次通过期间使用的膜具有200nm的孔径。在第二次通过期间使用的膜具有100nm的孔径，随后最后一次通过利用80nm孔径膜。在挤出过程中，温度保持高于Tm以确保脂质膜的塑性。作为挤出的结果，尺寸大且异质的层状MLV变成小的、均质(80nm～100nm)的单层囊泡(ULV)，所述单层囊泡的内部螯合药物。使用具有后散射检测器(90°)的Malvern Zetasizer NanoZ仪器(Southborough,MA)在25℃于石英微量比色皿中测量水动力尺寸(直径)。在分析之前将样品在制剂基质中稀释50倍。

[0159] 结果显示，使用过滤器挤出降低尺寸的脂质体的平均粒径为85nm，PDI为0.007，ζ电势为-43.7。作为过滤器挤出的替代方案，高压微流化也可用于降低脂质体的尺寸。发明人已经能够使用例如单独高压过滤器挤出或微流化或其组合等方法，产生尺寸为40nm及以上(例如30nm～150nm(数据未显示))或甚至小于30nm、特别是40nm～120nm的尺寸的脂质体。

[0160] 切向流过滤(TFF)和药物配制

[0161] 在已经产生含有培美曲塞的ULV之后，使用针对合适的缓冲液中的透析或切向流渗滤去除脂质体外培美曲塞。尽管可以使用任何缓冲溶液，在本实施例中使用的缓冲液是5mM柠檬酸钠，60mM氯化钠，pH 6.1。透析完成后，使用0.22微米过滤器进行过滤灭菌。

[0162] 抗叶酸盐受体α抗体的巯基化

[0163] 为了使抗体与脂质体上的PEG-DSPE-马来酰亚胺部分缀合，需要将抗体巯基化。在该实施例中，使用Traut试剂(Themo Fisher Scientific)实现抗体的巯基化。将抗体加入到在pH为8.1的新鲜制备的14mM Trauts试剂和5mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水中。在温和搅拌下温育60分钟后，通过针对200体积的25mM HEPES pH7.0，60mM NaCl透析至少4小时，从过量Trauts试剂中分离巯基化抗体。

[0164] 巯基化抗体与培美曲塞脂质体的缀合

[0165] 基于每个脂质体的期望抗体数目计算待使用的巯基化抗体的量。将2倍过量的硫醇化抗体的每种制品加入经渗滤的无菌脂质体中。将反应容器用氮气覆盖，并在4℃的室温缓慢搅拌温育过夜。通过在反应混合物中加入100mM L-半胱氨酸-HCl溶液至终浓度为15mM来封闭未反应的马来酰亚胺基团，而停止偶联反应。然后通过使用尺寸排阻色谱从抗体缀合的脂质体中分离游离的的巯基化抗体。

[0166] 实施例2：实验中所使用的细胞系

[0167] 实验中使用的细胞系可从诸如ATCC(美国典型培养物保藏中心，美国弗吉尼亚州马纳萨斯市)的来源商购获得。细胞系、其ATCC登录号和生长条件如下所列。

[0168] Calu-3(ATCC HTB-55)；EMEM(Cat.#30-2003)；10％HI FBS；1％Pen/Strep；1％L-谷氨酰胺。

[0169] KB；EMEM(Cat.#30-2003)；10％HI FBS；1％Pen/Strep；1％L-谷氨酰胺。

[0170] CCD841(ATCC CRL-1790)；EMEM(Cat.#30-2003)；10％HI FBS；1％Pen/Strep；1％L-谷氨酰胺。

[0171] Hs578Bst(ATCC HTB-125)；Hybri-Care培养基pH 7.0(Cat.#46-X)；30ng/ml小鼠EGF；10％HI FBS；1％Pen/Strep；1％L-谷氨酰胺。

[0172] NCI-H2087(ATCC CRL-5922)；RPMI-1640(Cat.#30-2001)；5％HI FBS；1％Pen/Strep；1％L-谷氨酰胺。

[0173] NCI-H2452(ATCC CRL-5946)；RPMI-1640(Cat.#30-2001)；10％HI FBS；1％Pen/Strep；1％L-谷氨酰胺。

[0174] OVCAR-3(ATCC HTB-161)；RPMI-1640(Cat.#30-2001)；20％HI FBS；1％Pen/Strep；1％L-谷氨酰胺。

[0175] SKBR3；McCoy 5A培养基；10％HI FBS；1％Pen/Strep；1％L-谷氨酰胺。

[0176] SL0003(ATCC PTA-6231)；F-12K培养基；10％HI FBS；1％Pen/Strep；1％L-谷氨酰胺。

[0177] A549(ATCC CCL-185)；F-12K培养基；10％HI FBS；1％Pen/Strep；1％L-谷氨酰胺。

[0178] 实施例3：确定一个样品构建体的结合特异性

[0179] 利用与荧光染料缀合的单克隆抗体通过流式细胞术测量细胞表面上叶酸盐受体α的水平。与抗体处理前的线(参见例如图6，线602和604)相比，抗体结合后(见例如图6，线606)的向右偏移表明通过流式细胞术检测到受体。直方图(例如，图6，线606)相对于未处理的细胞(参见例如图6，线602和604)向右偏移得越多，在细胞表面上受体的水平越高。该图展示出在癌细胞上的高水平的叶酸盐受体α，但在正常细胞上是几乎检测不到的水平。

[0180] 作为构建的示例性脂质体组合物的一部分的示例性脂质体，与细胞的细胞表面结合，所述细胞为叶酸盐受体α阳性而不是叶酸盐受体α阴性的细胞。示例性脂质体含有针对叶酸盐受体α的抗体。当将示例性脂质体与叶酸盐受体α+细胞一起短时间(30分钟)温育时，可以通过利用流式细胞术测量脂质体中整合的FITC的水平而检测细胞表面上的示例性脂质体。直方图的峰的偏移表明在细胞表面上检测到示例性脂质体。峰越向右偏移，在细胞上检测到的示例性脂质体越多。

[0181] 在该实验中，发明人确定示例性脂质体与细胞的结合以获得它们的亲和性和特异性。简言之，将包含可检测标志物的示例性脂质体与细胞一起共温育，并通过流式细胞术分析细胞。以下数据显示，示例性脂质体结合至叶酸盐受体α阳性的癌细胞，而不是叶酸盐受体α阴性的正常细胞。

[0182] 图3是描述细胞表面上叶酸盐受体α的测量的示意图。

[0183] 图6是如通过流式细胞术所测量，表达高表面水平的叶酸盐受体α的KB癌细胞系的代表性直方图。在图6中，标记602＝无抗体；标记604＝同种型对照；标记606＝抗叶酸盐受体αAPC。

[0184] 图7是如通过流式细胞术所测量，表达高表面水平的叶酸盐受体α的OVCAR-3癌细胞系的代表性直方图。在图7中，标记702＝无抗体；标记704＝同种型对照；标记706＝抗叶酸盐受体αAPC。

[0185] 图8是如通过流式细胞术所测量，表达高表面水平的叶酸盐受体α的NCIH2452癌细胞系的代表性直方图。在图8中，标记802＝无抗体；标记804＝同种型对照；标记806＝抗叶酸盐受体αAPC。

[0186] 图9是源自表达低表面水平的叶酸盐受体α的结肠上皮的正常细胞系的代表性直方图。在图9中，标记902＝无抗体；标记904＝同种型对照；标记906＝抗叶酸盐受体αAPC。

[0187] 图2是描述示例性脂质体结合至细胞表面的示意图。

[0188] 图10是SL0003(肺)细胞系的代表性直方图。肺癌细胞系结合高水平的示例性脂质体。标记1002＝未处理的细胞。标记1004＝经示例性脂质体处理的细胞。

[0189] 图11是CCD841(肺)细胞系的代表性直方图。叶酸盐受体α阴性细胞系结合少量的示例性脂质体。标记1102＝未处理的细胞。标记1104＝经示例性脂质体处理的细胞。

[0190] 图12显示源自肺(SL0003)和卵巢(OVCAR-3)细胞的复合数据，证明与源自结肠(CCD841)和乳腺(Hs578)的正常细胞相比，细胞表面上的高水平的示例性脂质体结合，P<0.05。显示的是在37℃温育30分钟或4小时时检测到的示例性脂质体的表面水平。

[0191] 在这些实验中，如下进行测定：

[0192] 收集细胞并在0.2％胎牛血清白蛋白的PBS(FACS缓冲液)中洗涤。将细胞重悬浮于100μl体积的FACS缓冲液中。加入5μl与APC缀合的抗叶酸盐受体α单克隆抗体(cat#FAB5646A；R&D Systems)。将细胞在4℃于黑暗中温育30分钟。加入100μl的FACS缓冲液以洗涤细胞，然后通过流式细胞术(FL4)评价细胞。为了测量细胞表面上的示例性脂质体。收集细胞，计数，并在0.2％胎牛血清白蛋白的PBS(FACS缓冲液)中洗涤。将20,000个细胞重悬于
100μl体积的FACS缓冲液中。将2μl示例性脂质体加入细胞中。将细胞在37℃温育30分钟，用FACS缓冲液洗涤，并通过流式细胞术评价。

[0193] 实施例4：对样品组合物和样品脂质体进行的RhodoRed实验

[0194] 图4是描述细胞中脂质体样品的示意图。将样品脂质体用pH-RhodoRed标记，其在降低的pH存在下(例如在细胞的内溶酶体中)发荧光。内化被看作相对于未处理的细胞，峰向右侧偏移。

[0195] 图13显示示例性脂质体的经RhodoRed标记的细胞被卵巢癌细胞内化。这是明显的，因为峰1504(用示例性组合物/示例性脂质体处理的细胞)偏移到未处理的峰1502的右侧。类似地，在图14中，看到相对于未处理的峰1502，随着示例性脂质体的量增加，经处理的峰开始向右偏移，如在峰1504、1506、1508、1510和1512中所见，其分别涉及10μl、20μl、30μl、40μl和50μl(参见图17)。将相同的数据绘制在图17的条形图中。在图17中，评估了缺乏抗叶酸盐受体α的对照pH-RhodoRed标记的脂质体(FOLR1)以用于比较。缺乏抗FOLR1的脂质体未被KB细胞内化。相反，pH-RhodoRed标记的样品脂质体被KB细胞内化。如图所示，图17中的数据是在37℃温育18小时的结果，剂量响应，也在图14中定量。叶酸盐受体α阴性的正常细胞系(乳腺细胞；左图和结肠；右图)不内化pH-RhodoRed标记的样品脂质体。图15显示在正常乳腺细胞中内化最小。峰1704相对于峰1702仅略微偏移。图16显示在正常结肠细胞中内化最小，因为峰1802和1804基本上不偏移。

[0196] 为了进一步评价内化，通过PhosFlow评价SL0003肺癌细胞的MAP激酶活化水平。描绘细胞内的样品脂质体活化激酶的示意图显示于图5中。图18A和图18B显示在处理后30分钟时培美曲塞对降低p38磷酸化的基础水平的作用。图18A显示了具有52.5％的经磷酸化p38的未处理细胞。在图18B中当包含示例性脂质体的示例性组合物处理细胞时，该百分比降低至8.95％。图19显示处理后30分钟后癌细胞和正常细胞中p38的磷酸化水平的定量。样品组合物和样品脂质体标记为“靶向脂质体”，其影响SL0003肺癌细胞中的p38活化。

[0197] 发明人对数据解释如下：样品脂质体进入FOLR1阳性的细胞。将样品脂质体用染料(RhodoRed)标记，如果该染料进入细胞，其只能通过流式细胞术检测。将各种细胞与不同量的RhodoRed标记的样品脂质体一起温育，并通过流式细胞术(FL2.)测量荧光水平。RhodoRed标记的样品脂质体进入表达FOLR1的癌细胞，而不是FOLR1阴性的正常细胞。显示的是卵巢癌细胞且峰向右偏移，表明药物已经进入细胞(图13)。用滴定量的RhodoRed标记的样品脂质体对FOLR1高KB细胞进行相同的实验(图14)。这些数据在图17中定量。当用高浓度处理时，样品脂质体进入KB细胞，但是缺乏抗-FOLR1抗体的对照脂质体不能进入所述细胞。

[0198] 样品脂质体进入细胞的第二种量度是细胞内的活化途径。细胞通过活化激酶(在这种情况下是p38)对与其受体结合的配体响应。可以通过流式细胞术测量活化的激酶。将细胞与样品脂质体温育30分钟，然后用温和洗涤剂裂解。通过流式细胞术用抗体检测活化的p38激酶。红线门下方的偏移表示更高水平的磷酸化p38(参见图18A和18BG)。癌细胞可以具有更高基础水平的活化激酶。在这种情况下，培美曲塞与样品脂质体相似地降低p38活化，证明样品脂质体内的培美曲塞是有活性的(图19)。

[0199] 实验条件如下：

[0200] 对于图4、13、14、15、16和17：测量RhodoRed标记的样品脂质体的摄取。将细胞(OvCAR-3、KB、正常结肠和正常乳腺)在实验前一晚以7,000细胞/孔铺平板。第二天，用以下物质处理细胞：1)无药物；2)RhodoRed标记的抗FOLR1单克隆抗体(MABFRAH H/L)Ab-(1μl)；3)样品脂质体(脂质体FOLR1Ab缀合的-(5μl)；4)非靶向pH RhodoRed的脂质体-(5μl)/无抗FOLR1的脂质体。将细胞在37℃温育18小时和24小时。加入100μl冰冷的FACS缓冲液，并通过流式细胞术(FL2)评价细胞。

[0201] 此外，对于图17，测量p38磷酸化(PhosFlow)SL0003，以10,000个细胞/孔接种正常结肠细胞和正常乳腺细胞。用以下物质处理细胞：新鲜培美曲赛(50μM,10μM)，LEAF-00(脂质体070715MPF；5traut/50Mab,15traut/50Mab,45traut/50Mab)(13.33X稀释度)，抗叶酸盐受体α(MABFRA H/L 1.01mg/ml)(13.33X稀释度)，以确定抗体在样品脂质体中的作用，或无处理。将细胞轻轻混合并迅速置于温育器中。在每个时间点(30分钟～4小时)，将板从温育器中取出并立即用甲醛固定，终浓度为2％。将板在室温下温育5分钟。除去25μl培养基。加入25μl的FACS缓冲液。加入100μl细胞裂解缓冲液(FACS缓冲液，0.2％triton X-100，
0.3％甲醛)。将细胞收集到1.5ml离心管中并涡旋3分钟以裂解细胞。加入PE-缀合的抗P38(BD Pharmingen)抗体或PE-缀合的同种型对照，并将细胞于4℃在黑暗中温育30分钟。加入
200μl的FACS缓冲液以洗涤。将管旋转并小心地除去上清液。在流式细胞仪(在FL2中)上读取细胞。

[0202] 实施例5：MTS测定

[0203] MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)测定是用于评估细胞代谢活性的公知的比色测定。细胞系用于测定，它们的生长条件如下：

[0204] (a)Calu-3:EMEM,10％HI FBS,1％Pen/Strep,1X L-谷氨酰胺；

[0205] (b)KB:EMEM,10％HI FBS,1％Pen/Strep,1X L-谷氨酰胺；

[0206] (c)NCI-H2087:RPMI,5％HI FBS,1％Pen/Strep,1X L-谷氨酰胺；

[0207] (d)NCI-H2452:RPMI,10％HI FBS,1％Pen/Strep,1X L-谷氨酰胺；

[0208] (e)SKBR3:McCoy’s,10％HI FBS,1％Pen/Strep,1X L-谷氨酰胺；

[0209] (f)CHO:FreeStyle CHO,5％HI FBS,1％Pen/Strep,1X L-谷氨酰胺；

[0210] (g)A549:F-12K,10％HI FBS,1％Pen/Strep,1X L-谷氨酰胺；和

[0211] (h)SL0003:F-12K,10％HI FBS,1％Pen/Strep,1X L-谷氨酰胺。

[0212] 前一晚，根据在96孔组织培养板中每个细胞系所需的细胞量接种细胞。每个孔中的最终体积为100μL(参见用于参考的细胞系表；所有细胞系获自ATCC)。使用的细胞系和测定条件如下：

[0213] (1)Calu-3:10000细胞/孔。原液是3.1×105/ml：将3.55mL细胞稀释至7.45mL的完全培养基。向各孔转移100μl(μl是指微升)。

[0214] (2)KB：3000细胞/孔。原液是2.0×105/ml：将1.65mL细胞稀释至9.35mL的完全培养基。向各孔转移100μl。

[0215] (3)NCI-H2087：3000细胞/孔。原液是3.7×105/ml：将892μl细胞稀释至10.1mL的完全培养基。向各孔转移100μl。

[0216] (4)NCI-H2452：5000细胞/孔。原液是5.0×104/ml：不必稀释。

[0217] (5)SKBR3：4000细胞/孔。原液是5.5×105/ml：将800μl细胞稀释至10.2mL的完全培养基。向各孔转移100μl。

[0218] (6)CHO：3000细胞/孔。原液是3.6×105/ml：将1mL细胞稀释至11mL的完全培养基。向各孔转移100μl。

[0219] (7)A549：3000细胞/孔。原液是2.3×105/ml：将1.43mL细胞稀释至9.57mL的完全培养基。向各孔转移100μl。

[0220] (8)SL0003：3000细胞/孔。原液是2.3×105/ml：将1.43mL细胞稀释至9.57mL的完全培养基。向各孔转移100μl。

[0221] 将接种的细胞在37℃和5％CO2温育过夜。第二天，在细胞特异性细胞培养基中制备药物，并滴定2倍稀释浓度加入细胞。制品如下：

[0222] 培美曲塞七水合物(5mM原液)。最大稀释(Top dilution)10μM：向998μl完全培养基中加入2μl原液。

[0223] 示例性脂质体/脂质体FOLR-1Ab(0.4mg/ml＝666.67μμM)。最大稀释10μM：向591μl完全培养基中加入9μl原液。

[0224] 脂质体Lot 0707F(原液是2mM)。最大稀释10μM：向597μl完全培养基中加入3μl原液。

[0225] 在第4天，用MTS测定测量对细胞增殖的影响。向各孔中加入10μl试剂(CelltiterAqueous One Solution)。这是当存在广泛的细胞增殖时变为深紫色的比色测定。将平板在37℃温育2小时，并在490nm处测量吸光度。使用对于各细胞系设置为100％的未处理细胞吸光度值计算细胞生长的百分比抑制。

[0226] 实施例6：样品脂质体对细胞增殖的影响

[0227] 图20显示癌细胞上的叶酸盐受体α表面水平与对样品脂质体生长抑制的易感性相关。显示的是A中的抑制水平；p＝0.05。为了进一步评估样品脂质体对细胞周期的影响，用培美曲塞或样品脂质体处理SL0003(肺癌)细胞4天。

[0228] 图21是显示源自患有肺或乳腺癌的患者的细胞系用滴定浓度的培美曲塞或示例性脂质体处理的图。将细胞在37℃孵育90小时，通过MTS评估细胞活力和数量。显示的是与具有约10mM培美曲塞的样品脂质体相比，10mM培美曲塞的结果。样品脂质体显示与培美曲塞类似的功效。

[0229] 将细胞裂解，DNA用碘化丙啶标记以定量细胞周期(图23A)。培美曲塞处理诱导细胞在S期累积(图23B)。复合数据证明样品脂质体对细胞周期诱导与培美曲塞相同的作用，在S期中细胞的累积显示在图24中。

[0230] 该数据显示培美曲塞是通过停止癌细胞分裂的有效化学疗法。发明人测试了样品脂质体中含有的培美曲塞是否有效抑制细胞分裂。用10mM培美曲塞或具有估计匹配浓度的培美曲塞的样品脂质体处理一些癌细胞系4天。然后评价分裂的细胞的数量。数据显示样品脂质体和培美曲塞对各细胞系具有相似的作用。

[0231] 细胞表面上的FOLR1表达(参见图20)与对样品脂质体的易感性相关。发明人使用培美曲塞对细胞分裂能力的影响的第二种量度。用培美曲塞处理的细胞不能产生新的DNA并且被捕获在细胞周期的S期。样品脂质体具有与培美曲塞相同的效果。

[0232] 实施例7：样品脂质体对细胞周期的影响的评价

[0233] 如描述MTS测定的实施例(实施例5)中所述制备SL0003(肺癌)细胞。

[0234] 对于该测定，将细胞培养4或5天(显示的是第5天)。更具体而言，将SC0003细胞(肺腺癌)接种在96孔板中，并且第二天用滴定浓度的LEAF-001或培美曲塞治疗。在第5天，用FACS缓冲液，0.2％triton X-100，0.3％甲醛裂解细胞。DNA用碘化丙啶染色30分钟，用碘化丙啶标记以评价细胞周期。

[0235] 洗涤细胞并通过流式细胞术(FL2)进行评价。图22A描绘了显示细胞周期的示意图。实验结果示于图22B中。通过抑制前体嘌呤和嘧啶核苷酸的形成，培美曲塞防止了正常细胞和癌细胞的生长和存活所需的DNA和RNA的形成。

[0236] 实施例8：样品脂质体降低培美曲塞对骨髓来源的嗜中性粒细胞的毒性[0237] CD34+细胞被诱导分化为具有IL-3、干细胞因子和G-CSF的嗜中性粒细胞。在第2天，在椭圆形中描述的成熟嗜中性粒细胞急剧增加(图26A)。在培美曲塞(2mM至50mM)的存在下，嗜中性粒细胞分化被抑制(图26B；n＝4个供体)。

[0238] 在图25A和图25B中绘出的圆形中Mac-1在嗜中性粒细胞上的表达显示在图25中。如图27所示，样品脂质体(10mM培美曲塞)降低培美曲塞对嗜中性粒细胞分化的毒性(n＝3个供体)。细胞用估算培美曲塞为10mM的样品脂质体的处理两天。通过流式细胞术评估分化的嗜中性粒细胞的数量，如图26A和26B所示。圆圈表示表达Mac-1和CD15的成熟嗜中性粒细胞。

[0239] 培美曲塞处理的副作用之一是减少血液中的嗜中性粒细胞。这是CD34+干细胞在骨髓中不分化或发展成成熟嗜中性粒细胞的结果。发明人测量了与相同剂量的培美曲塞(10mM)相比，样品脂质体对嗜中性粒细胞分化的影响。购买来自4个供体的干细胞，并用一组生长因子处理以诱导嗜中性粒细胞分化。也用培美曲赛处理的CD34+细胞未能发展成成熟嗜中性粒细胞。

[0240] 称为Mac-1的分子的水平在更成熟的嗜中性粒细胞上升高。该分子在绘制在图上的圆圈中的细胞上升高。向红色偏移表明细胞上的水平增加。

[0241] 与之相反，样品脂质体能够通过允许更多的细胞发展成中性粒细胞而减少该毒性。参见例如图27。

[0242] 实验如下进行：CD34+干细胞获自ATCC。将CD34+细胞在37℃解冻1分钟。在冰上时，将细胞转移至冷的干细胞培养基(“StemSpan SFEM”-Stem Cell Tech.cat.#9650)，10％热活化的胎牛血清(HI FBS.)。每个小瓶含有约5×105个细胞/ml。将细胞置于96孔组织培养板中约35,000个细胞/孔。

[0243] 嗜中性粒细胞GROWTH培养基在如上所述的StemSpam培养基中含有100ng/ml人干细胞因子(SCF-Sigma H8416,lot#MKBT8036V)、20ng/ml人粒细胞集落刺激因子(G-CSF-Sigma H5541,lot#SLBC9602V)、10ng/ml的人IL3重组体(Sigma SRP3090,lot#1008AFC13)。

[0244] 细胞也进行如下处理：1)单独的没有生长细胞因子的StemSpam培养基；2)StemSpam培养基+生长细胞因子；3)50μM、10μM或2μM培美曲塞；4)样品脂质体(相当于10μM培美曲塞)，或5)抗叶酸盐αAb(1.01mg/ml)-5μg/ml。

[0245] 将细胞温育1到5天，并在每个时间点使用针对CD15、Mac-1和CD34的抗体通过流式细胞术测定成熟嗜中性粒细胞。图中圆圈所示的细胞是表达Mac-1和CD34的嗜中性粒细胞。

[0246] 实施例9：结果和讨论

[0247] 叶酸盐受体α表达限于在非癌症状态下人类的胎儿/胚胎期以外的特定器官。如图1A所示，在正常极性的设置中，正常简单上皮包括显示不同顶端-基底极性的单独细胞的单层。细胞紧密堆叠并通过顶端连接复合物彼此连接，其分离顶端和基底外侧膜结构域(图1A标记101)。在保持极性的正常组织中，叶酸盐受体α附着在位于远离血液循环中的叶酸并与其不直接接触的细胞的顶端表面(图1A标记102)。与之相反，细胞极性破坏和组织解体的是晚期上皮肿瘤的标志。图1B显示高级上皮肿瘤中的细胞如何显示顶端-基底极性的丧失和整体组织解体，使叶酸盐受体α与血液循环中的叶酸直接接触(图1B，标记103)。此外，与碰巧表达叶酸盐受体α的正常细胞相比，肿瘤组织细胞通常表达更高水平的叶酸盐受体α。肿瘤组织细胞与正常上皮细胞的这种区别特征是设计用于恢复抗叶酸剂作为抗癌疗法同时使相关的严重和有时危及生命的毒性最小化的新型化学实体的设计的核心。此类化学实体以选择性地特异性地靶向叶酸盐受体α方式递送抗叶酸剂，而不是叶酸，但是叶酸盐受体α特异性靶向部分绕过RFC。该方法限制抗叶酸剂暴露于仅仅由于细胞极性的损失而导致的肿瘤组织细胞，因为这些肿瘤组织细胞在该受体与血液循环直接接触的时间中过表达叶酸盐受体α。对于其中表达叶酸盐受体α的有限正常组织并非如此，因为受体不与循环血液直接接触。

[0248] 下文中，叶酸盐受体α也可以与描述编码叶酸盐受体α蛋白的基因的叶酸盐受体α互换地使用。两个术语可互换使用以描述叶酸盐受体α蛋白。另外，为了说明的目的，将提及新型的化学实体，示例性脂质体(也称为靶向脂质体)。用于制造示例性组合物和示例性脂质体的方法在整个说明书和至少在实施例1中公开。下面的讨论涉及对数种示例性组合物和数种示例性脂质体进行的一些实验。这不意味着限定了所有可能的示例性组合物和所有可能的示例性脂质体。

[0249] 图2说明了示例性脂质体及其如何与表达叶酸盐受体α的细胞结合。除了作为半抗原，FTIC还用作成像剂，其允许示例性脂质体与表达叶酸盐受体α的细胞的表面上的叶酸盐受体α的结合可视化，而图3一方面说明设计用于记录与叶酸盐受体α的结合的构建体，另一方面将暴露于细胞表面的叶酸盐α受体的数量定量。

[0250] 图4示出了使用RhodoRed将示例性脂质体内化至表达叶酸盐受体α的细胞中。该实验是为了证明示例性脂质体以不依赖生物活性剂有效负载(payload)的方式被内化。图5使用p38蛋白激酶途径作为对应激的细胞响应的读出进一步说明示例性脂质体的内化对细胞增殖的影响。

[0251] 后续系列图示(图6至11)描述了首次显示所使用的叶酸盐受体α靶向抗体优先结合叶酸盐受体α的实验和结果。在这些实验中，利用与荧光染料缀合的单克隆抗体通过流式细胞术测量细胞表面上叶酸盐受体α的水平。向右偏移表示通过流式细胞术检测到受体。直方图向右偏移越多，受体在细胞表面上的水平越高。这些图证明了癌细胞上高水平的叶酸盐受体α(图6至8)，但在正常细胞上为几乎检测不到的水平(图9)。

[0252] 示例性脂质体具有优先靶向叶酸盐受体α的抗体。当示例性脂质体与叶酸盐受体α阳性细胞温育短时间(30分钟)时，可以通过流式细胞术测量在示例性脂质体中整合的FITC的水平来检测细胞表面的示例性脂质体。直方图线向右偏移表明在细胞表面上检测到示例性脂质体。直方图向右偏移得越多，在细胞上检测到的示例性脂质体药物越多。实验显示，示例性脂质体结合至表达叶酸盐受体α的肺癌细胞(图10)，但不结合至正常结肠上皮细胞(图11)。

[0253] 使用过表达叶酸盐受体α的多种癌细胞系(肺SL0003和卵巢OVCAR-3)和源自结肠(CCD841)和乳腺(Hs578)组织的正常细胞重复上述示例性脂质体结合实验。图12显示，与源自结肠(CCD841)和乳腺(Hs578)的正常细胞相比，源自具有高水平细胞表面叶酸盐受体α的肺(SL0003)和卵巢(OVCAR-3)癌细胞的复合数据证明在细胞表面上的示例性脂质体结合的显著更高的水平(p值<0.05)。图12中显示的数据包括在37摄氏度温育30分钟和4小时时检测的示例性脂质体的表面水平。

[0254] 进行另一系列实验以显示在与表达叶酸盐受体α的细胞结合时，示例性脂质体进一步进入细胞(内化)。这通过两种方式评估：

[0255] 首先，用染料(RhodoRed)标记示例性脂质体，所述染料仅能通过流式细胞术检测，如果其进入细胞(图4)。将各种细胞与不同量的RhodoRed标记的示例性脂质体温育，并通过流式细胞术(FL2)测量荧光水平。图13中显示的是，卵巢癌细胞向右偏移，表明示例性脂质体已进入细胞。RhodoRed标记的示例性脂质体进入表达叶酸盐受体α的癌细胞(图13-14)，而不是叶酸盐受体α阴性的正常细胞(图15-16)。

[0256] 此时相同的实验利用滴定量的RhodoRed标记的示例性脂质体在表达高叶酸盐受体α的KB细胞中特异性地进行，如图17所示，当用高浓度处理时，示例性脂质体进入KB细胞，但缺少抗叶酸盐受体α抗体的对照脂质体不能进入细胞。

[0257] 总之，来自RhodoRed实验的这些结果提供了下述证据，即在示例性脂质体的设计构建体中使用的技术使得作为递送系统的示例性脂质体(其除了叶酸或其类似物以外，还配备有叶酸盐受体靶向部分)，进入表达叶酸盐受体α的癌细胞，而与其脂质体生物活性剂有效负载无关。此外，相同的实验证明，示例性脂质体优先靶向表达叶酸盐受体α的癌细胞而限制了正常细胞暴露于生物活性剂有效负载。

[0258] 进入细胞的示例性脂质体的第二种策略是基于评估细胞内活化途径。细胞通过活化p38蛋白激酶途径而响应于来自与其受体结合的配体的应激或内化(图20)。可以通过流式细胞术测量活化的激酶。将细胞与示例性脂质体温育30分钟，然后用温和洗涤剂裂解。利用抗体通过流式细胞术检测活化的p38激酶。癌细胞可以具有更高的基础水平的活化的激酶(图18A)。在对照线门下的偏移表明更高水平的磷酸化的p38。在这种情况下，培美曲塞与在两种不同浓度(10μM和50μM)时相似地减少p38活化。示例性脂质体更显著地磷酸化p38，证明示例脂质体内的培美曲塞是具有活性的(图19)。

[0259] 进行另一系列实验以显示示例性脂质体以与匹配浓度的游离培美曲塞相似的程度抑制细胞增殖，因为培美曲塞是停止癌细胞分裂的有效化学疗法。通过抑制前体嘌呤和嘧啶核苷酸的形成，培美曲塞防止正常细胞和癌细胞的生长和存活所需的DNA和RNA的形成。这通过两种方式完成：

[0260] 首先，发明人测试包含在示例性脂质体内的培美曲塞是否有效地抑制细胞分裂，也称为细胞增殖。用10mM培美曲塞或具有估计匹配浓度的培美曲赛的示例性脂质体处理数种癌细胞系4天。然后评价分裂细胞的数量。结果证明，细胞生长抑制和在癌细胞表面上的叶酸盐受体α表达之间存在相关性(图20)。结果进一步显示，不仅表达叶酸盐受体α的癌细胞对示例性脂质体有易感性，而且示例性脂质体和培美曲塞对每种细胞系具有相似的作用(图21)。

[0261] 为了进一步评价示例性脂质体对细胞周期的影响，使用第二种方法来测量培美曲塞对细胞分裂能力的影响。基本原理是用培美曲塞处理的细胞不能产生新的DNA并被捕获在细胞周期的S期(图22a和22b)。用滴定浓度的培美曲塞或示例性脂质体处理源自患有肺或乳腺癌患者的细胞系。将细胞在37℃温育90小时，并通过MTS评估细胞存活率和数量。将细胞裂解，用碘化丙啶标记DNA以将细胞周期定量(图23a)。数据显示培美曲塞处理诱导细胞在S期积累(图23b)。此外，将SC0003细胞(肺腺癌)接种在96孔板中，次日用滴定浓度的示例性脂质体或培美曲塞处理。在第5天，将细胞固定并裂解，并用碘化丙啶标记DNA以评价细胞周期。结果证明，如通过S期中细胞积累所测量的，对每种细胞系，示例性脂质体诱导与培美曲塞相同的对细胞周期的影响(图24)。

[0262] 进行另一个实验以评估示例性脂质体对骨髓细胞的影响。理由是，抗叶酸剂治疗(如含有培美曲塞的治疗)的副作用之一是减少血液中的嗜中性粒细胞，导致严重的有时危及生命的感染。这是由于CD34+干细胞在骨髓中不分化或发育成成熟嗜中性粒细胞。发明人测量了与相同剂量的培美曲塞(10mM)相比的示例性脂质体对嗜中性粒细胞分化的影响。购买来自四个人供体的干细胞，并用一组生长因子处理以诱导嗜中性粒细胞分化。更具体而言，CD34+干细胞被诱导分化成具有IL-3、干细胞因子和G-CSF的嗜中性粒细胞。将细胞用10mM培美曲塞处理2天或估算为10mM培美曲塞的示例性脂质体处理两天。通过流式细胞术评估分化的嗜中性粒细胞的数量。

[0263] 结果显示，在不存在培美曲塞时，在第2天成熟嗜中性粒细胞显着增加，如图25和图26A的椭圆形区域所示。然而，在存在培美曲塞(2mM至50mM)时，嗜中性粒细胞分化受抑制(图26B；n＝4个供体)，证明用培美曲塞处理的CD34+干细胞未能发展成成熟嗜中性粒细胞。与游离的培美曲塞相反，在类似的培美曲塞浓度下，示例性脂质体与培美曲塞相比能够通过允许更多的CD34+干细胞发育并成熟为分化的中性粒细胞来减少这种毒性(图27)。

[0264] 总之，来自所进行的实验的这些结果提供了下述证据，即在示例性脂质体的设计构建体中使用的技术使得作为生物活性剂/有效负载的递送系统的示例性脂质体(其除了叶酸或其类似物以外，还配备有叶酸盐受体靶向部分)进入表达叶酸盐受体α的肿瘤细胞(这无关于其脂质体生物活性剂有效负载)，保持生物活性剂在表达叶酸盐受体α的癌细胞中的功效，并使正常细胞暴露于抗叶酸剂有效负载(例如培美曲塞有效负载)的毒性作用最小化，从而提供将虽然非常有效但是是有毒的试剂(例如作为一类的抗叶酸剂)重新引入临床环境中的机会，而没有典型相关的严重的有时危及生命的毒性。

[0265] 虽然已经参考当前优选实施方式描述了本发明，但是应当理解，在不脱离本发明的主旨的情况下可以进行各种修改。因此，本发明的范围应当参考所附权利要求以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围来确定。所有引用的论文和参考文献的公开内容，包括专利申请和出版物，出于所有目的通过援引并入本文。

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