【技术领域】
[0001] 本
发明涉及精子保存技术领域，具体地说，涉及一种稀少精子冷冻保护剂及其应用。【背景技术】
[0002] 随着现代文明进步与社会工业化发展，环境污染愈加严重，精液异常增多，导致不育症的发病率已达到10％，成为常见
疾病。1992年，卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术的出现为不育症患者带来了福音。严重男性不育症患者，如严重少、弱精子症即精子
密度＜(1～5)×106/mL(每个高倍
视野(high power field，HPF)1～5条)、梗阻性无精子症及非梗阻性无精子症患者，可通过手术获取睾丸或附睾精子，虽然所得精子数量较少，但均可通过ICSI技术生育子代。
[0003] 稀少精子冷冻保存主要是针对临床上常见的少、弱精症或无精症患者通过睾丸、附睾活检获得数量极少的精子进行冷冻保存，在女方需要接受
辅助生殖技术治疗时，确保在取卵当天有可使用的精子是整个治疗过程中的重要环节，可以将这些事先已冷冻保存的精子复苏后进行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)而获得子代，医学上称之为“生殖保险”。
[0004] 目前每个ICSI治疗周期的妊娠率在40％～45％，那么部分患者有可能需要重复多次ICSI治疗。如果没有在术前对其丈夫稀少精子进行冻存，则每个周期治疗都需进行睾丸、附睾活检。少精症患者的精子不稳定，也有可能得不到精子以致取消治疗周期。睾丸、附睾活检是创伤性手术，多次反复操作不仅给患者带来心理压
力和经济负担，而且还可能造成睾丸、附睾组织
纤维化，导致不可逆的睾丸萎缩、生精功能退化，甚至内分泌功能丧失而需要外源性睾
酮替代治疗。如果能在术前将获得的精液中少量精子或睾丸、附睾活检得到的数量有限的精子进行冻存，则可以保证这类患者使用辅助生殖技术的安全性，故稀少精子的成功冻融意义非常重大。
[0005] 由于临床上来源于各种类别的稀少精子的数量很少，
质量也不好，尤其通过显微外科手术获取的睾丸组织的精子，
显微镜下观察这部分精子的运动是非常微弱的，且精子细胞膜尚未完全成熟，精子核DNA的
稳定性也较差，如果按照传统的冷冻保护剂方法去冷冻这部分精子，冷冻过程中因
温度下降及细胞内
冰晶形成等因素会导致一定程度的精子损伤，如冰晶形成引起的细胞结构机械损伤、渗透压急剧改变、局部
活性氧含量的迅速升高都可损伤精子的质膜、鞭毛、线粒体、顶体、细胞核等细胞器的结构与功能，影响精子的存活率、活力、形态、受精能力及所携带的遗传物质的完整性，甚至诱发精子的凋亡。由于本来精子运
动能力就很弱，复苏以后就更不易找到活动的精子。事实表明采用常规精液标本那样的冷冻保存办法来冻融临床的稀少精子已被证明效果很差，引起的精子损伤可降低辅助生殖技术的受精率、妊娠率，提高流产率。因此，如何降低冷冻对精子的损伤，尤其是对少精、弱精子及睾丸获取的精子冷冻保存是这项技术中最难以突破的
瓶颈。
[0006] 中国
专利文献CN201310172542.2，公开日2014.10.15，公开了一种精子冷冻保护剂，包括体积比为5∶1∶1的无菌去离子
水、新鲜卵黄与甘油，还包括枸橼酸钠、
葡萄糖、果糖、咖啡因与环糊精，其质量配比关系为：新鲜卵黄0.2mg/ml、甘油0.15mg/ml、枸橼酸钠13mg/ml、葡萄糖10mg/ml、果糖5mg/ml、咖啡因1mg/ml与环糊精1mg/ml。其配置方法如下所述：首先，用容器盛装100ml无菌离子水。接着，依次先后加入1.22g枸橼酸钠、0.78g葡萄糖、0.68g果糖、20ml新鲜卵黄、20ml甘油、0.5g咖啡因与0.5g环糊精。最后一步为，将上述各原料物质混匀后放56℃水浴箱30分钟灭活，待冷却后，过滤分装成品，待用。
[0007] 然而，研发专
门针对少、弱精子，睾丸、附睾精子冷冻保存、复苏的保护剂仍然是十分必要的。【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对
现有技术中的不足，提供一种稀少精子冷冻保护剂。
[0009] 本发明的再一的目的是，提供所述的稀少精子冷冻保护剂的用途。
[0010] 本发明的另一的目的是，提供一种精子冷冻保存方法。
[0011] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0012] 一种稀少精子冷冻保护剂，它由以下成分组成：
氯化钠5.2-5.8mmol/L、氯化
钾4.2-4.6mmol/L、
硫酸镁0.18-0.22mmol/L、
磷酸二氢钾0.35-0.40mmol/L、氯化
钙1.8-
2.1mmol/L、果糖2.8-3.2mmol/L、海藻糖2.8-3.2mmol/L、
柠檬酸钠1.35-1.40mmol/L、甘
氨酸0.92-1.04mmol/L、谷氨酰胺0.95-1.05mmol/L、己酮可可
碱1.8-2.1mmol/L、维生素E
2.8-3.2ml/L、HSA 1.8-2.2g/L、甘油130-150ml/L、硫酸庆大霉素0.95-1.1g/L，余量为超纯水。
[0013] 优选地，所述的稀少精子冷冻保护剂由以下成分组成：氯化钠5.5mmol/L、
氯化钾4.5mmol/L、
硫酸镁0.2mmol/L、磷酸二氢钾0.37mmol/L、
氯化钙2.0mmol/L、果糖3.0mmol/L、海藻糖3.0mmol/L、柠檬酸钠1.37mmol/L、甘氨酸1mmol/L、谷氨酰胺1mmol/L、己酮可可碱
2.0mmol/L、维生素E 3.0ml/L、HSA 2.0g/L、甘油140ml/L、硫酸庆大霉素1.0g/L，余量为超纯水。
[0014] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0015] 如上所述的稀少精子冷冻保护剂的用途，用于制备精子冷冻
试剂。
[0016] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0017] 一种稀少精子冷冻保存方法，包括以下步骤：
[0018] a)使用如上所述的稀少精子冷冻保护剂稀释精液样本，所述的稀少精子冷冻保护剂与精液的体积比为1∶(1-2)；
[0019] b)将精液-稀少精子冷冻保护剂混合物放置在室温下作用最少5分钟；
[0020] c)将精液-稀少精子冷冻保护剂混合物装入保存容器中扣在
支架上，然后在液氮面上熏蒸10分钟；
[0021] d)将载有保存容器的支架转移到-196℃液氮存储罐中保存。
[0022] 优选地，步骤a)中，所述的稀少精子冷冻保护剂与精液的体积比为1∶2。
[0023] 优选地，步骤c)中，所述的保存容器是超细冷冻麦管，将精液-稀少精子冷冻保护剂混合物装入超细冷冻麦管后转入塑料外
套管中扣在
铝支架上，然后在液氮面上熏蒸10分钟。
[0024] 所述的超细冷冻麦管可参见中国专利文献CN 201320029800.7。
[0025] 本发明优点在于：本发明综合了各种化学物质组合成稀少精子冷冻保护剂，将它用于保护精液中无活动能力的少、弱活精子，能明显增加那些原本精液中微弱摆动、不前向运动的精子其冻融后有活动能力，并且对精子生理功能力无明显的影响，冷冻复苏率高，因此可用于少、弱精子，睾丸、附睾精子冷冻保存，有助于辅助生殖技术治疗的顺利开展。【具体实施方式】
[0026] 下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0027] 本文中，所述的氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、果糖、海藻糖、柠檬酸钠、甘氨酸、谷氨酰胺、己酮可可碱、维生素E、HSA、甘油、硫酸庆大霉素均购于上海国药集团化学试剂有限公司。
[0028]
实施例1本发明稀少精子冷冻保护剂(一)
[0029] 氯化钠5.5mmol/L、氯化钾4.5mmol/L、硫酸镁0.2mmol/L、磷酸二氢钾0.37mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、果糖3.0mmol/L、海藻糖3.0mmol/L、柠檬酸钠1.37mmol/L、甘氨酸1mmol/L、谷氨酰胺1mmol/L、己酮可可碱2.0mmol/L、维生素E 3.0ml/L、HSA 2.0g/L、甘油140ml/L、硫酸庆大霉素1.0g/L，余量为超纯水。
[0030] 具体配置过程：取一消毒干净的玻璃容器盛装500ml超纯水。接着使用分析天平依次先后精确称取各成分，加入氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、果糖、海藻糖、柠檬酸钠、谷氨酰胺、己酮可可碱、甘氨酸、维生素E、HSA、甘油、硫酸庆大霉素，用磁力搅拌器充分搅拌混匀，将超纯水加至1000ml。使用0.22μm
过滤器过滤后分装，置
冰箱保存。
[0031] 实施例2本发明稀少精子冷冻保护剂(二)
[0032] 氯化钠5.8mmol/L、氯化钾4.2mmol/L、硫酸镁0.22mmol/L、磷酸二氢钾0.35mmol/L、氯化钙2.1mmol/L、果糖2.8mmol/L、海藻糖3.2mmol/L、柠檬酸钠1.35mmol/L、甘氨酸1.04mmol/L、谷氨酰胺0.95mmol/L、己酮可可碱2.1mmol/L、维生素E 2.8ml/L、HSA 2.2g/L、甘油130ml/L、硫酸庆大霉素1.1g/L，余量为超纯水。
[0033] 实施例3本发明稀少精子冷冻保护剂(三)
[0034] 氯化钠5.2mmol/L、氯化钾4.6mmol/L、硫酸镁0.18mmol/L、磷酸二氢钾0.40mmol/L、氯化钙1.8mmol/L、果糖3.2mmol/L、海藻糖2.8mmol/L、柠檬酸钠1.40mmol/L、甘氨酸0.92mmol/L、谷氨酰胺1.05mmol/L、己酮可可碱1.8mmol/L、维生素E 3.2ml/L、HSA 1.8g/L、甘油150ml/L、硫酸庆大霉素0.95g/L，余量为超纯水。
[0035] 实施例4本发明稀少精子冷冻保护剂的应用
[0036] 1、研究材料和方法
[0037] 1.1研究对象
[0038] 1)精液标本来源于医院男科不育门诊就诊的50例少弱精症患者的精子，禁欲48h～7d，手淫方式或
电刺激取精于干燥无菌的取精杯内，60min内完全
液化。按WHO5推荐方法进行精液常规分析。
[0039] 2)84例无精子症患者显微外科手术行睾丸活检术获取的精子进行分析。
[0040] 总的134例样本来源分类见表1。
[0041] 表1 134例样本来源分类
[0042]样本分类 例数
NOA睾丸精子样本 15
OA睾丸精子样本 69
少弱精患者精液样本 45
电刺激精子样本 5
合计 134
[0043] 1.2主要试剂
[0044] 1)含5％HSA的HTF培养液(美国Ivrine公司，90125)；
[0045] 2)稀少精子体外培养液(江苏泰利达
生物制药有限公司)；
[0046] 3)实施例1的稀少精子冷冻保护剂。
[0047] 1.3操作方法
[0048] 1)显微外科手术获取的睾丸组织，置含5％HSA的HTF培养液中，睾丸组织用
剪刀或用弯成7字形的
注射器针头体视镜下处理完后，将组织悬液采用梯度离心的方法处理后去上清，加入稀少精子体外培养液1ml放置于5％CO2，37℃箱中培养30分钟至3小时。然后从培养液中取出小量液滴，显微镜下计数精子浓度。
[0049] 2)体外获取的少、弱精子待液化后显微镜下计数其浓度：将密度少于2×106/ml，活动率小于10％的样本，加入1.5ml Modified-HTF(Irvine Scientific company)液中处理，离心后去上清后，添加稀少精子体外培养液1ml，再放置于5％CO2，37℃箱中培养30分钟至3小时。然后从培养液中取出小量液滴，显微镜下计数精子浓度。
[0050] 3)分别取部分精子观察精子的活动力，测定精子存活率。取有存活精子的病例进行冷冻保存。精子的活动力及存活率按WHOth5标准判断。
[0051] 4)稀少精子冷冻操作
[0052] ①将待冷冻保存的精液样本液化后，测量精液总体积，并进行精液分析；
[0053] ②根据精子密度、精液体积按照1:2(体积/体积)使用实施例1的稀少精子冷冻保护剂稀释，加入冷冻保护剂过程需小心地逐滴加入并与精液完全混合；
[0054] ③将精液与稀少精子冷冻保护剂的混合物放置在室温下作用最少5分钟；
[0055] ④将精液-稀少精子冷冻保护剂混合物装入超细冷冻麦管，两端封闭；
[0056] ⑤将超细冷冻麦管转入塑料外套管容器中倒扣在铝支架上，然后在液氮面上熏蒸10分钟；
[0057] ⑥将载有样本的塑料外套管容器的铝支架转移到-196℃液氮存储罐中保存。
[0058] 5)冷冻精子的复苏
[0059] ①液氮罐中取出超细冷冻麦管在37℃水浴中3秒；
[0060] ②取出超细麦管，搽去外套管的水迹，剪去两端封口，套上注射器将超细麦管中的精液轻轻吹出置复苏液滴里；
[0061] ③为了避免死精子及稀少精子冷冻保护剂等导致细胞毒性效应，建议精液复苏后尽快稀释或脱离稀少精子冷冻保护剂；
[0062] ④将复苏后的冷冻精液加入1ml稀少精子体外培养液直接进行精子梯度离心后，去上清，将离心管底的沉淀物加入0.1ml稀少精子体外培养液混匀后行ICSI或IVF
体外受精。
[0063] 1.4统计学分析
[0064] 所有数据以X±S表示，采用t检验。
[0065] 2、研究结果
[0066] 共134例严重少、弱、睾丸精子，使用实施例1的稀少精子冷冻保护剂冻融复苏后，均能找到活动精子，见表2。
[0067] 表2 134例不同样本冻融复苏的结果
[0068]
[0069] 实施例5比较本发明的稀少精子冷冻保护剂和CN201310172542.2的精子冷冻保护剂
[0070] 我们还对54例临床正常男性精液标本做了两种冷冻保护剂(实施例1的稀少精子冷冻保护剂和CN201310172542.2的精子冷冻保护剂)的冻融复苏的比较。
[0071] 54例样本在试验前均按WHO5推荐方法进行精液常规分析。所有实验步骤均按实施例4的稀少精子冷冻方法操作实施。将已进行精液常规分析后的精子样本一分为二，一份添加CN201310172542.2常规卵黄、甘油的精子冷冻保护剂，一份添加实施例1的稀少精子冷冻保护剂，两种保护剂与精子添加的量均为1∶2(一份保护剂+二份精液)，冷冻前后均计数精子的活动力(PR％)、精子形态学、顶体完整率、DNA断裂指数以及精子冻融复苏率。详细结果见表3，从54例正常精子样本采用两种精子冷冻保护剂的冷冻复苏结果来看，精子冷冻前后的活动力(PR％)和复苏率P值小于0.01。
[0072] 表3 54例两种不同成分的保护剂冻融结果比较
[0073]
[0074] 综上所述，本发明的稀少精子冷冻保护剂与以往传统精子冷冻液不同，特别适用于临床严重少、弱精子症、睾丸及附睾获取的精子样本的冻融技术，可以明显保存少、弱精
