本发明涉及基于可生物降解聚氨基酸的新物质，该物质尤其用于活 性成分(AP)的运载。

本发明还涉及基于这些聚氨基酸的新型药物、化妆品、饮食或植物 保护组合物。这些组合物可以是允许运载AP的组合物类型，优选为乳 液、胶束、颗粒、凝胶、植入剂或薄膜的形式。

所考虑的AP有利地是具有生物活性的化合物，它可通过口、肠胃 外、鼻、阴道、眼、皮下、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、脑内、面 颊等对动物或人体给药。

本发明更具体涉及的AP(但不限于此)是蛋白质、糖蛋白、肽、 多糖、脂多糖、寡核苷酸、多核苷酸和有机分子。但它们也可以是化妆 品或植物保护产品，如除草剂、杀虫剂、杀真菌剂等。

在活性成分，尤其是药用活性成分的运载领域中，在很多情况下都 需要：

·保护它们不发生降解(水解、在向作用部位运行的过程中沉淀、 酶消化等)，直至到达它们的作用部位，

·和/或控制它们的释放速率，以便在给定的期间内保持恒定的 量，

·和/或将它们运载(保护它们的同时)到作用部位。

为此，已经对几种类型的聚合物进行了研究，而且其中的一些甚至 可以在市场上购买。例如，可以提到的是聚交酯类、聚丙交酯-乙二醇 类、聚氧乙烯-氧丙烯类、聚氨基酸类或多糖类聚合物。这些聚合物构 成了用于制备例如块状植入剂、微粒、纳米颗粒、囊泡、胶束或凝胶的 原料。这些聚合物除了应当适合制备这类系统外，它们还必须是生物相 容、无毒、不激发免疫应答和经济的，并且它们应当易于从身体中去除 和/或可生物降解。对于这最后一个方面而言，体内的生物降解应当产 生无毒产物。

以举例方式提及下述的各个专利、专利申请或科技文章描述的现有 技术涉及被用作制备AP运载系统的原料的聚合物。

专利US 4,652,441描述了用于封装激素LH-RH的聚交酯微囊。这 些微囊通过制备一种水包油包水乳液来生产，该乳液包括含有激素的水 性内层、固定所述激素的物质(明胶)、聚交酯油性层和水性外层(聚 乙烯醇)。AP的释放在皮下注射后经历了大于两个星期的时间。

专利US 6,153,193描述了基于两性聚氧乙烯-聚氧丙烯胶束的组合 物，以用于运载抗癌剂如阿霉素。

Akiyoshi等(J.Controlled Release 1998，54，313-320)描述了通过 接枝胆固醇而具有疏水性并在水中形成纳米颗粒的支链淀粉。这些纳米 颗粒可与胰岛素可逆络合而形成稳定的胶体混悬液。

专利US 4,351,337描述了基于亮氨酸和谷氨酸酯的两性共聚氨基 酸，它可以采用植入剂或微粒的形式来控制释放活性成分。所述活性成 分根据聚合物降解的速率而在一个非常长的周期内释放。

专利US 4,888,398描述了基于聚谷氨酸酯或聚天冬氨酸酯和任选的 聚亮氨酸的聚合物，其中烷氧基羰基甲基类的侧基无规地位于聚氨基酸 链上。这些由诸如甲氧基羰基甲基这样的侧基接枝的聚氨基酸可以采用 含有长效释放的AP的可生物降解的植入剂形式。

专利US 5,904,936描述了由聚亮氨酸-聚谷氨酸酯嵌段聚合物获得 的纳米颗粒，它能够形成稳定的胶体混悬液，其可自发地与具有生物活 性的蛋白质结合并且不破坏它们的性质。所述蛋白质可以在一个长周期 内在活体内受控释放。

专利申请WO 00/30618描述了通过聚(谷氨酸钠)(聚谷氨酸甲酯、 聚谷氨酸乙酯、聚谷氨酸十六酯或聚谷氨酸十二酯)嵌段聚合物获得的 纳米颗粒，它能够形成稳定的胶体混悬液，其可自发地与具有生物活性 的蛋白质结合并且不破坏它们的性质。所述蛋白质可以在一个长周期内 在活体内控制释放。

这些两性共聚氨基酸利用疏水烷基侧链的存在被改性。

专利US 5,449,513描述了包含聚氧乙烯嵌段和诸如聚(β-苄基-L- 天冬氨酸酯)的聚氨基酸嵌段的两性嵌段共聚物。这些聚氧乙烯-聚天 冬氨酸苄酯聚合物形成可封装疏水活性分子如阿霉素或吲哚美辛的胶 束。

专利申请WO 99/61512描述了由疏水基团(与聚赖氨酸或鸟氨酸链 接的棕榈酸)和亲水基团(聚氧乙烯)官能化的聚赖氨酸和聚鸟氨酸。 这些聚合物，如由聚氧乙烯和棕榈酰链接枝的聚赖氨酸在胆固醇的存在 下形成可封装阿霉素或DNA的囊泡。

而且，已知借助于维生素E衍生物，更具体的是α-生育酚来形成 AP运载系统。

天然维生素E是由被称作生育酚的化合物之混合物构成的(参见 Burton和Ingold，Acc.Chem.Res.1986，19，194-201)，在这种混合物 中，α-生育酚衍生物占绝大多数。维生素E及其一些衍生物如今在食物 和化妆品中被用作维生素源或抗氧化剂。对于这些常见用途而言，发现 维生素E为D-α-生育酚的形式(其天然形式)或D，L-α-生育酚的形式 (外消旋和合成形式)。这两种产品在其剂量远远高于治疗剂量时被认 为是基本无毒的。α-生育酚的结构如下。

手性位置用星号标记。天然形式具有构型R，R，R，而合成形式是其 中手性碳独立地是R或S的混合物。

对于在活性成分运载领域中使用的维生素E的衍生物来说，在现阶 段，就发明人所知，除了其一端由α-生育酚-琥珀酸酯基团接枝的聚氧 乙烯类聚合物之外还没有基于α-生育酚的聚合物产品。而且，其链端由 α-生育酚-琥珀酸酯接枝的聚乙二醇(PEG化维生素E)可在市场上购 得，其商品名为TPGS 1000，由Eastman Chemical有限公司生产。这 种在1954年授予专利权的产品(US2,680,749)如今被用作口服维生素 E源。这种聚合物，就象α-生育酚-琥珀酸酯和未改性的α-生育酚一样， 已被提出用于活性成分的运载。

专利US 5,869,703描述了类似的化合物，在这类化合物中，聚氧乙 烯链在其一端包含α-生育酚，而在其另一端包含(甲基)丙烯酸残基。 这些α-生育酚衍生物被用来制备直接用在化妆品应用中的稳定的两性 囊泡(脂质体)。

专利申请WO 00/71163描述了用于Paclitaxel(抗癌产品)的增溶 作用的配方，该配方基于在其链端由α-生育酚-琥珀酸酯接枝的聚乙二 醇(TPGS 1000)并且基于α-生育酚。如今，与聚氧乙烯部分相关的毒 性是未知的，并且已知聚氧乙烯在活体内不降解。而且，该化合物在每 个聚合物链上只包含一个α-生育酚单元，而且其在溶液中的性质类似于 表面活性剂。在任何情况下，将这种产品用于运载的用途都将导致聚合 物-活性成分的组合不太稳定。

专利EP 0 243 446描述了α-生育酚(半)琥珀酸酯(α-生育酚的有 机酸衍生物)与胺盐一起在制备囊泡方面的用途。这些囊泡可用于封装 各种类型的活性成分，包括小分子、肽和蛋白质。该专利一般性地指出， 有机酸可以是氨基酸或聚氨基酸。但在这方面并未给出任何细节。只举 例说明了α-生育酚(半)琥珀酸酯。

因此，即使在现有技术中研究或提出了用于药用活性成分运载的大 量技术方案，但仍难以满足全部要求，因而依然不能令人满意。

在这种情况下，本发明的基本目的之一是提供新型聚合物原料，所 述原料可用于AP运载并可优化满足技术规程的所有要求：

°生物相容性，

°生物降解性，

°容易且经济地转化为活性成分运载颗粒的能力，

°这些颗粒本身能够：

◆形成稳定的水性胶体混悬液，

◆易于与许多活性成分结合，

◆并在活体内释放这些活性成分。

所述目的和其它目的可由本发明来实现，本发明首先涉及包含天冬 氨酸单元和/或谷氨酸单元的两性聚氨基酸，其特征在于这些单元中的 至少一部分携带包含至少一个α-生育酚单元的接枝侧链。

这些新型聚合物具有基于聚氨基酸的可生物降解骨架，所述聚氨基 酸带有含α-生育酚的侧链。这些聚合物与类似产品相比具有出人意料的 结合和/或封装性能，而且它们在酶的存在下容易降解。

本申请人的贡献在于完全合理和有利地把可生物降解的聚氨基酸， 具体是聚赖氨酸和/或聚谷氨酸与基于α-生育酚(维生素E)的接枝侧链 结合在一起用于AP的运载。

在本发明中，术语“聚氨基酸”不仅包括含2-20个氨基酸单元的低 聚氨基酸，而且还包括含有多于20个氨基酸单元的聚氨基酸。

优选地，本发明的聚氨基酸是低聚物或包含谷氨酸或赖氨酸重复单 元的均聚物，或者是包含这两类氨基酸单元的混合物的共聚物，所述单 元被含有α-生育酚的接枝侧链部分取代。在这些聚合物中考虑的单元是 具有D，L或D，L构型的氨基酸，并且对于谷氨酸酯或谷氨酸单元来说通 过它们的α-或γ-位链接，而对于赖氨酸或赖氨酸酯单元来说通过它们的 α-或β-位链接。

优选的氨基酸单元是具有L构型和α类型的键的氨基酸单元。

更优选地，本发明的聚氨基酸符合下述通式(I)

其中：

◆R1代表H、C2-C10直链或C3-C10支链烷基、苄基或末端氨 基酸单元；

◆R2代表H、C2-C10直链或C3-C10支链酰基，或者焦谷氨酸 基；

◆R3是H或者阳离子体，优选以下物质：

-金属阳离子，有利地选自钠、钾、钙和镁阳离子，

-有机阳离子，有利地选自：

●基于胺的阳离子，

●基于低聚胺的阳离子，

●基于聚胺的阳离子(特别优选聚乙烯亚胺)，

●基于一个或多个氨基酸的阳离子，有利地选自基于赖氨酸或精 氨酸的阳离子，

-或者阳离子聚氨基酸，有利地选自聚赖氨酸或低聚赖氨酸；

◆R4代表直接键或基于1-4个氨基酸单元的“间隔基”；

◆A独立地代表-CH2-(天冬氨酸单元)或-CH2-CH2-(谷氨酸单 元)基团；

◆n/(n+m)被定义为摩尔接枝度，其范围是0.5-100摩尔％；

◆n+m的范围是3-1000，优选30-300；

◆T代表α-生育酚单元。

对于这些常见用途来说，已发现维生素E是D-α-生育酚的形式(其 天然形式)，或者是D，L-α-生育酚的形式(外消旋和合成形式)。这两 种产物在其剂量远远高于治疗剂量时被认为是基本上无毒的。在本发明 中，优选这两种形式的α-生育酚。

该α-生育酚源于天然或合成。

根据本发明的第一实施方案，聚氨基酸是α-L-谷氨酸酯或α-L-谷氨 酸均聚物。

根据本发明的第二实施方案，聚氨基酸是α-L-天冬氨酸酯或α-L-天 冬氨酸均聚物。

根据本发明的第三实施方案，聚氨基酸是α-L-天冬氨酸酯/α-L-谷氨 酸酯或α-L-天冬氨酸/α-L-谷氨酸共聚物。

有利地，携带含至少一个α-生育酚单元的接枝侧链的天冬氨酸单元 和/或谷氨酸单元的分布要使得如此形成的聚合物是无规、嵌段型或多 嵌段型聚合物。

根据另一种定义形式，本发明的聚氨基酸的摩尔质量是 2000-100000克/摩尔，优选5000-40000克/摩尔。

而且，本发明聚氨基酸的α-生育酚的摩尔接枝度是3％-70％，优选 5％-50％。

显然，本发明的聚氨基酸根据接枝度的不同能够以几种方式来使 用。用于形成本发明的以各种不同形式封装活性成分的聚合物的方法对 于本领域技术人员来说是已知的。更多细节请参阅以下这些特别相关的 参考文献：

“Microspheres，Microcapsules and Liposomes；Vol.1.Preparation and Chemical applications”Ed.R Arshady，Citus Books 1999.ISBN： 0-9532187-1-6。

“Sustained-Release Injectable Products”Ed.J.Senior and M. Radomsky，Interpharm Press 2000.ISBN：1-57491-101-5。

“Colloidal Drug Delivery Systems”Ed.J.Kreuter，Marcel Dekker， Inc.1994.ISBN：0-8247-9214-9。

“Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology”Ed. D.L.Wise，Marcel Dekker，Inc.2000.ISBN：0-8247-0369-3。

由于聚氨基酸在大约3％-10％的较低接枝度下在pH为7.4的水 (如使用磷酸盐缓冲液)中根据聚合物的浓度而形成胶体混悬液或凝 胶，因此聚氨基酸也是极其有利的。而且，形成胶体混悬液分散相的聚 氨基酸颗粒可以很容易地与诸如蛋白质、肽或小分子的活性成分结合。 对于优选的形成操作的描述参见本申请人的专利申请WO 00/30618，它 包括把聚合物分散在水中，并在AP的存在下培育溶液。该溶液随后可 用0.2μm过滤器过滤，并在随后直接注射到患者体内。

当接枝度高于10％时，聚合物可形成能够结合或封装AP的微粒。 在这种情况下，该微粒可通过以下方式形成：把AP和聚合物共溶于合 适的有机溶剂中，随后将混合物从水中沉淀出。随后过滤回收这些颗粒， 随后可用于口服给药(以凝胶胶囊、压制和/或涂敷形式，或者以分散 在油中的形式)，或者在重新分散到水中后经肠胃外给药。

当接枝度大于30％时，由于可电离的羧酸酯官能团的数量较少，因 此聚合物再分散到水相中变得更加困难，因而聚合物发生沉淀。在这种 情况下，可将聚合物溶解在诸如N-甲基吡咯烷酮这样的生物相容溶剂 中或诸如Miglyol这样的合适的油中，随后进行肌内注射或者皮下注射 或者注射到肿瘤内。溶剂或油的扩散会使聚合物在注射部位发生沉淀， 形成沉积物。这些沉积物随后通过聚合物的扩散和/或腐蚀和/或水解或 酶解而提供控制释放。

通常，本发明的中性或电离形式的聚合物可以单独使用或者用在液 体、固体或凝胶组合物中，并且在水性或有机介质中使用。

应当理解，基于聚氨基酸的聚合物根据pH和组成的不同可包含中 性(COOH形式)或电离的羧酸官能团。因此，在水相中的溶解度直接 取决于游离COOH的含量(未由维生素E接枝的)并取决于pH值。 在水溶液中，反阳离子可以是诸如钠、钙或镁阳离子这样的金属阳离子， 或者诸如三乙醇胺、三(羟甲基)氨基甲烷这样的有机阳离子或者诸如 聚乙烯亚胺这样的聚胺。

本发明的聚合物通过本领域技术人员熟知的方法获得。这些聚氨基 酸可通过至少两种方式获得：

●把α-生育酚接枝到聚氨基酸上，或者

●α-生育酚的NCA衍生物的聚合反应，随后选择性水解。

在第一种情况下，聚氨基酸，例如均聚谷氨酸酯、均聚天冬氨酸酯 或者嵌段、多嵌段或无规形式的谷氨酸酯/天冬氨酸酯共聚物，可根据 标准方法制备。

获得α类聚氨基酸的最常用技术是基于N-羧基氨基酸酐(NCA)的 聚合反应，其描述例如可参见文章“Biopolymers，1976，15，1869”和H.R. Kricheldorf的著作“alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related Heterocycles”Springer Verlag(1987)。NCA衍生物优选是NCA-O-Me， NCA-O-Et或NCA-O-Bz衍生物(Me＝甲基，Et＝乙基和Bz＝苄基)。 聚合物随后在合适的条件下水解，得到酸形式的聚合物。这些方法受到 了本申请人的专利FR 2 081 226中的描述的启发。可用于本发明的一些 聚合物，例如不同分子量的聚(α-L-天冬氨酸)、聚(α-L-谷氨酸)、 聚(α-D-谷氨酸)和聚(γ-L-谷氨酸)类的聚合物可从市场上购买。α-β 类聚天冬氨酸是通过缩合天冬氨酸(得到聚琥珀酰亚胺)并在随后进行 碱性水解而获得的(参见Tomida等的Polymer 1997，38，4733-36)

α-生育酚与酸官能团的偶联可以很容易地通过聚氨基酸与维生素E 在下述条件下的反应来进行，即在偶联剂碳二亚胺以及优选的催化剂如 4-二甲基氨基吡啶的存在下，在诸如二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡 咯烷酮(NMP)或二甲基亚砜(DMSO)这样的溶剂中。接枝度通过组 分和反应物的化学计量或者反应时间而进行化学控制。

在第二种情况下，合成具有如下结构的α-生育酚的NCA衍生物。 该合成类似于Poché等在Macromolecules 1995，28，6745-53中所述的 硬脂酰谷氨酸酯N-羧酸酐的合成。

α-生育酚-谷氨酸酯的NCA衍生物随后与例如谷氨酸苄酯NCA共 聚，获得谷氨酸酯或谷氨酸官能团，在室温下在三氟乙酸和氢溴酸的混 合物中进行苄基官能团的选择性水解反应。应当说明，第二种合成方法 仅仅通过改变单体加成顺序就可以很容易地制备无规、嵌段或多嵌段共 聚物。

通过由1-4个氨基酸构成的间隔基偶合维生素E可以通过维生素E 与合适的被保护氨基酸的连续反应或通过与低聚肽的反应来进行，其中 被保护氨基酸随后被去除保护，从而在聚合物上具有可接枝的氨官能 团。例如，α-生育酚与亮氨酸单元的合成根据本领域技术人员熟知的常 规方法并根据下述方案来制备：

应当说明，将α-生育酚直接接枝到聚合物上可通过酯官能团来进 行，而当存在基于氨基酸的间隔基时，所述接枝通过氨官能团来实现。 就象制备酯键一样，可采用相同的方式利用标准偶联剂如二烷基碳二亚 胺来形成酰胺键。

根据本发明的一个变化形式，该变化形式所涉及的氨基酸不仅携带 α-生育酚接枝侧链，而且每个分子还具有至少一个与谷氨酸酯和/或天冬 氨酸酯单元连接的聚亚烷基二醇类接枝侧链，优选具有下式(II)：

其中：

R′4代表直接键或基于1-4个氨基酸单元的“间隔基”；

X是选自氧、氮和硫的杂原子；

R5和R6独立地代表H或直链C1-C4烷基。

n的范围是3-1000。

优选地，所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇。

根据本发明的另一个优选特征，所述聚亚烷基二醇的摩尔接枝百分 数是1％-30％。

这些侧基(II)的接枝是利用本身已知并且根据本领域技术人员能 力范围内的技术来进行的，如通过与谷氨酸酯和/或天冬氨酸酯单体的 羧基形成酰胺、酯或硫酯键。这些技术尤其可以是用于把α-生育酚接枝 到聚氨基酸骨架上的那些技术，所述技术的描述参见本专利申请。

本发明的另一个方面涉及包括至少一种上述聚氨基酸的药物、化妆 品、饮食或植物保护组合物。

根据本发明的一个有利变化，这种组合物除了α-生育酚之外还包括 至少一种活性成分，该活性成分可以是治疗、化妆、饮食或植物保护的 活性成分。

优选的，该活性成分是蛋白质、糖蛋白、多糖、脂糖、寡核苷酸、 多核苷酸或肽。

更优选地，活性成分是疏水、亲水或两性有机“小分子”。

根据本发明的描述，术语“小分子”具体是指非蛋白质分子。

所述组合物可以采用纳米颗粒、微粒、溶液、乳液、混悬液、凝胶、 胶束、植入剂、粉末或薄膜的形式。

根据其特别优选的形式之一，包含或不包含活性成分的组合物是聚 氨基酸纳米颗粒和/或微米颗粒和/或胶束在水相中的稳定胶体混悬液。

本发明组合物是药物组合物时可以通过口、肠胃外、鼻、阴道、眼、 皮下、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、大脑内或面颊给药。

还可预见该组合物采用在生物相容溶剂中的溶液形式，它可通过皮 下、肌内注射或注射到肿瘤中。

根据另一种变化形式，本发明组合物的配制要使其可注射，并且使 其能够在注射部位形成沉积物。

本发明还涉及包括本发明聚氨基酸和活性成分的组合物，它可用于 制备以下物质：

●药品，尤其用于口、鼻、阴道、眼、皮下、静脉内、肌内、真 皮内、腹膜内或大脑内给药，这些药品的活性成分具体可以是蛋白质、 糖蛋白、与一个或多个聚亚烷基二醇链链接的蛋白质{例如，聚乙二 醇(PEG)，在这种情况下，它们被称作“PEG化”蛋白质}、肽、多 糖、脂糖、寡核苷酸、多核苷酸和疏水、亲水或两性有机小分子；

●和/或营养物；

●和/或化妆品或植物保护产品。

本发明的另一个方面涉及一种制备以下物质的方法

●药品，尤其用于口、鼻、阴道、眼、皮下、静脉内、肌内、真 皮内、腹膜内或大脑内给药，这些药品的活性成分具体可以是蛋白质、 糖蛋白、与一个或多个聚亚烷基二醇链链接的蛋白质{例如，聚乙二 醇(PEG)，在这种情况下，它们被称作“PEG化”蛋白质}、肽、多 糖、脂糖、寡核苷酸、多核苷酸和疏水、亲水或两性有机小分子；

●和/或营养物；

●和/或化妆品或植物保护产品。

这种方法的特征在于它主要包括使用至少一种如上所述的聚氨基 酸和/或如上所述的组合物本身。

如上所述，把一种或多种AP与本发明的α-生育酚接枝的聚氨基酸 结合的技术具体可参见专利申请WO 00/30618。

本发明还涉及一种治疗方法，该方法主要在于通过口、肠胃外、鼻、 阴道、眼、皮下、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、大脑内或面颊给药 在本发明中所述的组合物。

根据一个具体实施方案，该治疗方法主要在于使用在生物相容溶剂 中的溶液形式的上述组合物，并在随后将其通过皮下、肌内注射或者注 射到肿瘤中，优选它在注射部位形成沉积物。

可与本发明聚氨基酸结合的AP的例子是(而不论它们是否是(纳 米或微米)颗粒的形式)：

°蛋白质，如胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素、红细胞 生成素或细胞因子；

°肽，亮丙瑞林或环孢菌素；

°小分子，如属于蒽环类药、taxoid或喜树碱类的那些；

°以及它们的混合物。

通过下述实施例将更好地理解本发明，并且本发明的优点及实施方 案的变化形式将会变得更加清晰，这些实施例描述了α-生育酚接枝的聚 氨基酸的合成，以及它们转化为AP运载系统(纳米颗粒的稳定水性混 悬液)，并且揭示了这种系统与AP(有机小分子、蛋白质等)结合形 成药物组合物的能力。

实施例1：聚合物P1

用合成的α-生育酚接枝的聚谷氨酸酯的合成

相对于聚氧乙烯标准具有大约10000的质量的α-L-聚谷氨酸酯聚合 物是通过NCAGLuOMe的聚合反应，并在随后水解而获得的，所述方 法的描述参见专利申请FR 2 801 226。将5.5克这种α-L-聚谷氨酸酯聚 合物通过在40℃加热2小时而溶解在92毫升的二甲基甲酰胺(DMF) 中。一旦该聚合物溶解，则将温度降至25℃，并连续加入预先溶解在6 毫升DMF中的1.49克D，L，α-生育酚(＞98％，来源于Fluka)、预 先溶解在6毫升DMF中的0.09克4-二甲氨基吡啶和预先溶解在6毫升 DMF中的0.57克二异丙基碳二亚胺。在25℃下搅拌8小时之后，将反 应介质倒入800毫升含15％氯化钠和盐酸的水中(pH2)。随后过滤回 收沉淀的聚合物，用0.1N的盐酸洗涤，接着用水洗涤。随后将该聚合 物重新溶解在75毫升的DMF中，并从如上所述的含盐和酸的pH为2 的水中再次沉淀出该聚合物。在水洗两次之后，将聚合物用二异丙醚洗 涤几次。随后在40℃下真空烘干该聚合物。收率约为85％。

通过质子NMR测定的接枝度约为7.8％，通过HPLC分析显示生 育酚的残留量小于0.3％。

Mw(通过GPC测定，用NMP洗提)＝17500克/摩尔(聚甲基丙 烯酸甲酯当量)。

实施例2、3、4和5：聚合物P2、P3、P4和P5的合成

以相同的方式制备包含可变量的生育酚的聚合物

表1     聚合物     α-生育酚     接枝度     P2   合成的：D，L     5.2％     P3   合成的：D，L     12.8％     P4   合成的：D，L     20.0％     P5   合成的：D，L     50.0％

在所有情况下，有效接枝的生育酚的量均通过NMR来测定。

实施例6：聚合物P6

用天然α-生育酚接枝的聚谷氨酸酯的合成

用类似的方法使用7.3％的天然D-α-生育酚(纯度98.5％，法国 ADM公司)合成聚合物P6。

摩尔质量是17400(GPC NMP，PMMA当量)。

实施例7：水溶液中的聚合物的分析

将聚合物以10-40毫克/毫升的浓度溶解在pH为7.4的磷酸盐缓冲 盐溶液中，通过添加0.1N的氢氧化钠调节pH为7.4。目测溶解情况。

表2：在pH7.4的盐水中的溶解度   聚合物   接枝度     浓度     外观 P1(D，L)     7.8％    10-30毫克/毫升 可溶且透明 P3(D，L)     12％    10毫克/毫升 非常细小的沉淀 P4(D，L)     20％    10毫克/毫升 非常细小的沉淀 P6(D)     7.3％    10-30毫克/毫升 可溶且透明

磷酸盐缓冲液：0.01M磷酸盐、0.0027M的KCl和0.137M的NaCl。

通过电子透射观察沉积在载体上的聚合物P1的透明溶液可以发现 存在15-25nm的纳米颗粒。聚合物P1、P6和α-生育酚琥珀酸酯在pH 为7.4的水中(磷酸盐缓冲液)的浓度为15毫克/毫升的溶液的对比分 析表明，只有α-生育酚琥珀酸酯产生了如专利EP 0 243 446所述的囊泡 的乳状溶液特性。

实施例8：染料在聚合物P1上的吸附

根据本发明的主题之一，聚合物可以采用与活性成分结合并且在水 中的胶体混悬液形式。对于这种应用来说，下面的实验表明，某些聚合 物，尤其是生育酚接枝度约为5％-10％的那些聚合物的吸附能力大于现 有技术中类似化合物的吸附能力。

针对此研究，聚合物P1与包含接枝到聚谷氨酸酯上的十二醇链的 类似聚合物进行比较。这种聚合物的描述参见专利WO 00/30618。

该研究以下述方式进行：将聚合物溶解在pH为7的水溶液(磷酸 盐缓冲液)中，并添加5毫克被称作橙OT(Rn CAS：2646-17-5)的 染料。将溶液置于超声波浴中1小时，以便结合。离心处理所述溶液以 除去未结合的染料，在该染料的λmax(495nm)测定光密度。

表3：     聚合物     接枝度   聚合物浓度   归一化OD   P1   (α-生育酚)     7.8摩尔％   13.8毫克/毫升     1   对比聚合物*   (十二醇)     15摩尔％   17.3毫克/毫升     0.45

*WO 00/30618

可以发现，在聚合物P1的摩尔接枝度小于对比聚合物的摩尔接枝 的一半，且聚合物质量浓度略小的情况下，聚合物P1具有高得多的与 染料橙OT结合的能力。

实施例9：聚合物P7的合成

包含α-生育酚亮氨酸接枝侧链的聚谷氨酸酯的合成

首先用下述方式合成α-生育酚亮氨酸衍生物。

D，L-α-生育酚(4.3克)与BOC-亮氨酸(2.3克)在4-二甲氨基吡啶 (244毫克)和二异丙基碳二亚胺(1.5克)的存在下在15毫升二氯甲 烷中反应。在30℃下2个小时后，产物在二氧化硅柱中过滤提纯。获 得5g的α-生育酚亮氨酸BOC产物(77％收率)。其结构用NMR波谱 法测定。该产物的去保护是在三氟乙酸中在5-10℃下进行1小时。在 通过二氧化硅过滤提纯之后，分离出3.3克所需产物(78％收率)。其 结构用NMR波谱法测定。

随后在与实施例1相同的条件下在聚谷氨酸上进行接枝反应，其接 枝度为7％。聚合物结构和接枝度通过NMR波谱法测定。

实施例10：聚合物P8的合成

包含α-生育酚接枝侧链和聚乙二醇接枝侧链的聚谷氨酸酯的合成。

进行与实施例1相同的接枝反应，使用11摩尔％的α-生育酚和2 摩尔％的式为MeO(CH2CH2O)aCH2CH2NH2且摩尔质量为3000的氨基 甲氧基聚乙二醇(Shearwaters公司的产品)。获得酸形式的聚合物， 其收率为72％。通过质子NMR测定α-生育酚接枝度为10.9％，而聚乙 二醇接枝度为1.9％。

实施例11：胰岛素的吸附

制备在1毫升水中含1毫克聚合物P1和7毫克胰岛素的pH为7 的溶液，并将该溶液温育2小时。随后超滤该混悬液(10000xG，20分 钟，100KDa阈值)。利用HPLC分析滤液中的游离胰岛素，差值则为 结合的胰岛素量。测量显示对于所使用的胰岛素的结合度大于95％。在 相同的条件下，实施例8的对比聚合物有40％的结合度。因此聚合物 P1的结合能力更大。

实施例12：在酶的存在下聚合物P1在活体内的降解

将聚合物P1在pH为7.5的情况下以20毫克/毫升的浓度溶解(磷 酸盐缓冲液，10mM的钙阳离子)。添加0.1毫升蛋白酶(10毫克/毫 升的溶液)，并通过水性GPC监测降解。

可以发现较快速的降解，原始聚合物的半衰期约为100分钟。