发明背景

原发性肝癌是全世界癌症死亡的主要原因之一。肝细胞癌 (HCC)是原发性肝癌的最常见类型，每年约发生120万例。在世界 上某些地区，如东南亚和南非，肝细胞癌是恶性肿瘤中最常见的类 型之一。在这些地区，这类疾病的高频出现似乎与肝炎的高发生率 有关。

对肝细胞癌的可愈性疗法目前限于非转移性疾病的个体，包括 外科手术切除肿瘤并进行或不进行肝移植。然而，即使是手术切除 和移植也不能治愈大多数肿瘤，因为切除术后又有复发。直到今 天，治疗中的化疗方法一直很不见效。过去二十多年来对肝细胞癌 的治疗未取得任何有意义的进展。

故，仍需要寻求一种针对肝细胞癌的有效治疗方法。这种治疗 方法最好应适用于这种病的发生率很高的不发达国家。而且，这种 治疗方法应适用于具有不可手术切除的肿瘤及患有转移性疾病的患 者。

发明简述

依据本发明的一个实施方案，提供了可用于预防或治疗哺乳动 物(包括人)体内的诸如肝细胞癌这样的癌症的方法，这种方法所 含步骤包括在哺乳动物体内产生针对甲胎蛋白分子的至少一部分氨 基酸序列的免疫应答。

产生免疫应答之步骤可包括给予哺乳动物至少一种组合物，其 中含有的一种肽包含甲胎蛋白的至少部分氨基酸序列；或给予至少 一种组合物，其中含有的一种肽包含甲胎蛋白的至少部分氨基酸序 列并有至少一个氨基酸被替代。产生免疫应答之步骤亦可包括给予 哺乳动物至少一种组合物，其中包含甲胎蛋白分子的至少部分cDNA 序列。更进一步，产生免疫应答之步骤可包括给予哺乳动物至少一 种组合物，其中含有转导了可表达甲胎蛋白cDNA的某种重组载体的 免疫系统细胞。

依据本发明的另一个实施方案，提供了用于免疫接种人体以预 防或治疗癌症的一种组合物。该组合物中含有选自下述成员的一种 肽：AFP5、AFP7、AFP13、AFP14、AFP18、AFP22、AFP23、 AFP28、AFP38、AFP39、AFP45、AFP49、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

发明图示

参照以下描述、所附权利要求书及附图，将能更好地理解本发 明的诸多特点、各个方面及优势：

图1是显示用人AFP49肽产生的CTL细胞相对细胞毒性的条形 图；

图2示针对肽靶和AFP靶检测的CTL标准铬释放试验所得特异性 裂解率对靶细胞之条形图，其中CTL由来自一位正常的HLA A2.1供 体、经肽刺激的PBMC产生；

图3为用BWIC3-一种mAFP阳性的鼠肿瘤细胞系-对经鼠AFP cDNA免疫接种过的小鼠(图中以空心盒表示)及未免疫的小鼠(图 中以实心方形表示)进行肿瘤激发后，平均肿瘤大小对激发后天数 的曲线；

图4为用EL4(亲代)-一种不产生mAFP的鼠肿瘤细胞系-对经 鼠AFP cDNA免疫接种过的小鼠(空心盒)及未免疫的小鼠(实心 圆)进行肿瘤激发后，平均肿瘤大小对激发后天数的曲线；

图5为用EL4(AFP)-一种能产生mAFP的鼠肿瘤细胞系-对经 鼠AFP cDNA免疫接种过的小鼠(空心盒)及未免疫的小鼠(实心 圆)进行肿瘤激发后，平均肿瘤大小对激发后天数的曲线；

图6为用稳定转染有AFP表达载体的FSA C3H本底纤维肉瘤细 胞或稳定转染有仅表达neo之载体的FSA C3H本底纤维肉瘤细胞平均 肿瘤直径对对免疫接种了小鼠AFP-AdV穿梭载体带neo表达质粒的 质粒DNA(实心圆，较低实心方形，实心菱形)的小鼠，和未经免 疫的小鼠(较高实心方形，实心倒三角形)进行肿瘤攻击后，平均 肿瘤直径对激发后天数的曲线；

图7为用BWIC3肿瘤对经能合成小鼠AFP基因的质粒载体免疫 接种过的小鼠(实心圆)和未免疫接种过的小鼠(实心方形)进行 肿瘤激发后，平均肿瘤直径对激发后天数的曲线；

图8为用BWIC3肿瘤对经能合成小鼠AFP基因的质粒载体免疫 接种过的小鼠(实心三角，实心菱形，实心倒三角)和未免疫接种 过的小鼠(实心圆和实心方形)进行肿瘤激发后，平均肿瘤直径对 激发后天数的曲线；

图9为分离自以不同感染复数(MOI)转导了AdVmAFP的鼠 DC的mRNA的RT-PCR分析结果(图中第4-7道)与分离自不同对 照的mRNA(图中第2，3，8，9道)的比较；

图10为用EL4(AFP)-一种产生mAFP的鼠肿瘤细胞系-对经 转导有AdVmAFP之树突细胞免疫接种过的小鼠(实心方形)，经 各种对照物免疫接种过的小鼠(朝上的实心三角及实心倒三角)及 未免疫的小鼠(实心圆)进行肿瘤激发后，平均肿瘤大小对激发后 天数的曲线；

图11为用BWIC3-一种能产生mAFP的鼠肿瘤细胞系-对经转导 有AdVmAFP之树突细胞免疫接种过的小鼠(实心方形)及未免疫的 小鼠(实心圆)进行肿瘤激发后，平均肿瘤大小对激发后天数的曲 线。

发明详述

依据本发明的一个实施方案，提供了用于预防或治疗哺乳动物 (如人)的癌症(包括肝细胞癌)的方法，其中所述癌症在其表面 上带有甲胎蛋白分子的至少部分，所述方法为在哺乳动物体内产生 针对甲胎蛋白分子至少部分的免疫应答。该方法涉及对有癌哺乳动 物进行免疫接种或基因操作以产生针对癌细胞表面上的甲胎蛋白分 子至少部分的免疫应答。然后，使该受感染哺乳动物的免疫系统破 坏带有该表面标志的癌症细胞，从而预防临床型癌症或治疗已有癌 症。

大多数人类肝细胞癌的细胞合成人甲胎蛋白(hAFP)，这是一种 609个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO：2)，这种蛋白质正常情况 下由胚胎肝细胞产生，至出生时停止产生。肝细胞癌的细胞倾向于 在其表面显示甲胎蛋白分子的至少部分。肝细胞癌中甲胎蛋白的存 在已被用作筛查和诊断的标志物。

由于甲胎蛋白正常情况下存在于免疫系统发育阶段，很自然会 有假设认为免疫系统不会保留对该蛋白质的免疫应答能力。本发明 的一个方面涉及这样一个发现，即可促使哺乳动物的免疫系统将甲 胎蛋白作为一种外源蛋白质进行应答，并将表面带有甲胎蛋白至少 一部分的细胞作为外源细胞与之发生反应。故这种免疫应答的产生 可通过引起哺乳动物的免疫系统损坏肝细胞癌的细胞而用于预防肝 细胞癌和治疗该疾病。  

如本文所公开，免疫接种甲胎蛋白可经以下各种方式完成：免 疫接种含甲胎蛋白序列至少部分的合成肽，包括基于甲胎蛋白序列 的至少部分，但有替代或其他改变的合成肽；免疫接种甲胎蛋白 cDNA序列的至少部分，从而产生甲胎蛋白分子的至少部分并被呈递 给适当的免疫系统细胞；将基因工程化的抗原呈递细胞导入哺乳动 物体内；及应用基因治疗性病毒载体使甲胎蛋白分子的至少部分被 表达。这种免疫接种的目的是活化甲胎蛋白肽特异性T淋巴细胞产生 对抗携有这些表面标志物的细胞的免疫应答，较优选活化细胞毒性T 淋巴细胞以破坏肝细胞癌的细胞。

1)测定和生产可在人体内产生免疫应答的人甲胎蛋白肽

为测定是否人甲胎蛋白分子的任一部分均能在人体内引起免疫 应答，检验了衍生自人甲胎蛋白(hAFP)全分子(SEQ ID NO：2) 的一系列肽，以测定它们作为I类限制性肽能否产生抗肿瘤应答及能 否作为细胞毒性淋巴细胞(CTL)的目标分子。根据它们是否能与 HLA A2.1 I类结合沟相匹配来选择hAFP中可能有免疫原性的肽。之 所以选择HLA A2.1(世界卫生组织亚型命名法中的HLA A 0201)， 是因为它是白种人中最常见的等位基因，也在其它人种中广泛分 布。测定过程如下：

首先，根据已公布的共有序列鉴定来自hAFP(SEQ ID NO：2) 中有可能结合HLA A2.1的肽序列。HLA A2.1被确信可结合8至10个 氨基酸长的肽，但较优选九聚体肽。异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸 被认为是肽中2号位置的重要锚定残基，而异亮氨酸、亮氨酸和缬氨 酸被认为是肽中9或10号位(取决于肽长度)的重要锚定残基。

利用威斯康辛大学遗传学计算机研究小组程序“ find pattern” 筛选hAFP序列(SEQ ID NO：2)，并鉴定出含有2个强结合“锚 定”残基(一个在第2位，另一个相应在九肽或十肽的9位或10位) 的九肽和十肽(命名为“强”肽)；只有一个强结合锚定残基的肽 (名为“中间”肽)；或无强结合锚定残基，但有其他阳性结合残 基的肽(名为“弱”肽)，以检测出相配于HLA A2.1 I类结合基序 的适当肽序列。排除掉含有不止一个被认为能消除结合作用的残基 的肽序列。

筛选研究鉴别出共72段肽序列能配于HLA A2.1 I类结合基序， 但其中6段在进一步考查中被排除，因为它们高度疏水，难以合成。 所剩66段肽序列用Chiron Mimetopes(Victoria，Australia)按本领域 技术人员熟知的技术合成以备检验。它们包括10段“强”肽序列， 43段“中间”肽序列和13段“弱”肽序列。现参见表1，从右至左分 别显示66个肽序列中每一个的肽命名号，该肽序列代表的hAFP序列 (SEQ ID NO：2)的残基，肽所含氨基酸。肽命名号根据Chiron中 收取的肽顺序而定，故与hAFP分子(SEQ ID NO：2)氨基酸序列的 顺序无关。

            表I  人AFP肽序列  肽命名 hAFP蛋白内的残基  氨基酸序列  AFP1  AFP2  AFP3  AFP4  AFP5  AFP6  AFP7  AFP8  AFP9  AFP10  AFP11  AFP12  AFP13  AFP14  AFP15  AFP16  AFP17  AFP18  AFP19  AFP20  AFP21  AFP22  AFP23  AFP24  AFP25  AFP26  AFP27  AFP28  AFP29  AFP30  AFP31  AFP32  AFP33  AFP34  AFP35  AFP36  AFP37  AFP38  AFP39  AFP40  449-457  434-442  218-226  257-265  158-166  135-143  12-20  54-62  58-66  61-69  121-129  456-464  404-412  441-450  242-250  211-219  514-522  178-186  187-195  270-278  291-299  547-556  555-563  570-578  469-477  470-478  438-447  287-295  300-308  37-46  209-218  284-293  232-240  419-427  372-380  34-43  549-557  1-9  492-500  476-484  AITRKMAAT  AYTKKAPQL  LLNQHACAV  KLVLDVAHV  FMNKFIYEI  SIPLFQVPE  LLNFTESRT  FVQEATYKE  ATYKEVSKM  KEVSKMVKD  RHNCFLAHK  ATAATCCQL  YIQESQALA  QLTSSELMAI  KLSQKFTKV  KELRESSLL  SLVVDETYV  ILWAARYD  KIIPSCCKA  CRGDVLDCL  QQDTLSNKI  TMKQEFLINL  NLVKQKPQI  AVIADFSGL  LLACGEGAA  LACGEGAAD  KAPQLTSSEL  YICSQQDTL  TECCKLTTL  CTAEISLADL  VTKELRESSL  IMSYICSQQD  TRTFQAITV  FQKLGEYYL  RVAKGYQEL  SYQCTAEISL  KQEFLINLV  MKWVESIFL  PVNPGVGQC  AADIIIGHL

        表I(续)人AFP肽序列  肽命名 hAFP蛋白内的残基  氨基酸序列  AFP41  AFP42  AFP43  AFP44  AFP45  AFP46  AFP47  AFP48  AFP49  AFP50  AFP51  AFP52  AFP53  AFP54  AFP55  AFP56  AFP57  AFP58  AFP59  AFP60  AFP61  AFP62  AFP63  AFP64  AFP65  AFP66  140-148  306-315  453-461  539-548  235-243  380-388  433-441  403-411  542-550  585-593  117-126  169-178  253-262  360-369  423-432  507-516  545-554  572-581  577-586  294-302  278-287  417-425  24-33  65-74  350-358  52-60  QVPEPVTSC  TTLERGQCII  KMAATAATC  QAQGVALQTM  FQAITVTKL  LLEKCFQTE  VAYTKKAPQ  KTIQESQAL  GVALQTMKQ  GQEQEVCFA  SEEGRHNCFL  RHPFLYAPTI  TEIQKLVLDV  RRHPQLAVSV  GEYYLQNAFL  NRRPCFSSLV  LQTMKQEFLI  IADFSGLLEK  GLLEKCCQGQ  TLSNKITEC  LQDGEKIMSY  GLFQKLGEY  NEYGIASILD  KMVKDALTAI  FLASFVHEY  AQFVQEATY

下一步，在T2细胞稳定化试验中检验66段肽的每一段以浓度依 赖方式结合HLA A2.1、并因此稳固HLA A2.1的能力，步骤如下。将 每段肽与缺失TAP1和TAP2的T2细胞温育过夜，这类T2细胞已在前 一夜于室温温育以增加细胞表面MHC I类分子的表达。检测每个肽 在从0.1μM至100μM的肽浓度范围内结合HLA A2.1分子的能力。在 T2细胞系中，只有填满8至10肽的MHC分子能稳定在细胞表面。以 抗HLA A2抗体BB7.2(ATCC)和山羊抗小鼠FITC对T2细胞染色， 再用流式细胞仪分析HLA A2.1的稳定性。作为阳性结合对照，所用 为FLU基质肽(FLU基质1蛋白的第58-66位残基，GILGFVFTL) 和MART-1肽(MART-1的第27-35位残基，AAGIGILTV，完整 蛋白的GenBank录入号为U06452)。FLU基质肽一贯能在0.5μM的 浓度下将A2.1分子稳固在T2细胞表面。

现参见表II，其中列有66段hAFP肽中的22段。第1列为肽命名 号，第2列表示该肽序列代表的hAFP序列(SEQ ID NO：2)中的残 基，第3列表示该序列中锚定残基数。

表II的第4列是结合T2细胞表面之HLA 2.1所需的最小肽浓度。 正如所见，10段“强”肽序列中的6段，43段“中间”肽序列中的7 段显示能结合HLA 2.1。而13段“弱”肽序列无一显示可结合HLA A2.1。

更进一步，还在EBV类淋巴母细胞解离动力学试验中，随时间 检测66段肽之每一段与I类分子解离的速率，因为已发现，结合I类 分子的肽的解离动力学，即解离速率，可较明显预示该肽的免疫原 性。例如，  象病毒肽HPV 16 E7，EBV LMP2，FLU M1和HIV pol 等这类非自我结合肽，已发现显示有最慢解离动力学的最强结合肽 具有最高的免疫原性。还发现一些已知的自身蛋白质，来自gp100、 MART-1这类黑色素瘤抗原的免疫原性表位，有1个锚定残基，经 可溶性I类重建试验测得结合亲和力不太稳定，但有非常慢的解离动 力学。见，如，Bakker，A.B.，等，具有改善的MHC I类结合能力的 CTL表位类似物可诱导能识别野生型表位的抗黑色素瘤CTL。国际 癌症杂志，1997年70卷第3期302至309页；又见Van der Burg，S.H.， 等，自身抗原衍生的表位对MHC I类抗原能否显示低亲和力？(信 件)今日免疫学，1997.1892)97至98页；两篇文献均全文引入作为参 考。

                        表II人AFP肽序列及结合特点 肽命名  hAFP蛋白内  的残基 锚定残基 数 稳定T2细胞 上A2的最小 肽浓度 类淋巴母细 胞细胞上肽 稳定的时间 AFP3 AFP4 AFP5 AFP6 AFP7 AFP8 AFP13 AFP14 AFP16 AFP17 AFP18 AFP22 AFP23 AFP28 AFP34 AFP37 AFP38 AFP39 AFP45 AFP49 AFP60 AFP64  218-216  257-265  158-166  135-143  12-20  54-62  404-412  441-450(10mer)  211-219  514-522  178-186  547-56(10mer)  555-563  287-295  419-427  549-557  1-9  492-500  235-243  542-550  294-302  65-74(10mer)  2  2  2  1  1  1  1  2  1  2  1  2  1  1  1  1  1  0  1  1  1  2  0.5μM  0.5μM  0.1μM  (n.s.)(不稳定)  50μM  (n.s.)  10.0μM  50.0μM  (n.s.)  1.0μM  (n.s.)  (n.s.)  (n.s.)  50μM  100μM  (n.s.)  0.5μM  (n.s.)  100μM  (n.s.)  50μM  100μM (n.s.)(不稳定) (n.s.) ＞6hrs ＞6hrs ＞6hrs ＞2hrs ＞2hrs ＞2hrs 2hrs (n.s.) ＞6hrs 4hrs ＞6hrs 2hrs (n.s.) ＜2hrs ＜2hrs ＞6hrs ＞6hrs ＞6hrs (n.s.) (n.s.) 对照： MART-1肽   FLU基质肽    MART-1的残  基27-35  FLU基质1蛋  白残基58-66    1    2    50μM    0.5μM   2hrs   ＞6hrs

EBV类淋巴母细胞解离动力学试验按Van der Burg，S.H.，等，结 合MHC I类分子的肽的免疫原性取决于MHC-肽复合物的稳定性。 免疫学杂志，1996年156卷第9期3308至3314页所公开的进行，在此 将其全文引入作为参考。简而言之，在能使MHC分子不稳定的 pH3.2酸性温和缓冲液中使HLA A2.1 EBV类淋巴母细胞剥脱其表面I 类肽和β2微球蛋白。在β2微球蛋白的存在下，每段肽被迅速以200μ M过量脉冲加到剥脱后细胞上1小时。然后洗去剩余未结合肽，并将 细胞于37℃温育0，2，4，6个小时。每个时间点结束时均洗细胞并 用BB7.2抗体染色HLA A2。如果细胞的平均荧光强度比剥脱后未加 肽脉冲标记的细胞强至少1.5倍，就认为肽-I类分子复合物是稳定 的。

T2细胞稳定性试验和EBV类淋巴母细胞解离动力学试验均对每 段肽做了至少两次。仍参见表II，第5列显示肽在EBV类淋巴母细胞 上稳定的时间。正如所见，只有强肽中的3段(AFP5，AFP14和 AFP22)、43段中间肽中的12段(包括AFP49)和弱肽中的1段显示 水平较慢的解离动力学。综合考虑T2细胞稳定性试验和EBV类淋巴 母细胞解离动力学试验，可见有7段肽序列在两个试验中均有最好结 果，它们是AFP5、AFP7、AFP13、AFP14、AFP28、AFP38和 AFP45。

接着利用表III第1列所列的肽在体外产生肽特异性CTL，方法 按Plebanski，M.等，人外周血中肽特异性初级细胞毒性T淋巴细胞应 答的诱导。欧洲免疫学杂志，1995年25卷第6期1783至1787页所公开 的进行，并检验CTL裂解A2.1阳性、AFP阳性肝细胞癌细胞的能 力。裂解试验可以说明肽是人AFP的某种天然加工的、有免疫原性 的表位，是潜在的靶抗原。按本领域技术人员熟知的技术，用BB7.2 (HLA A2)抗体(ATCC)对HLA A2.1供体及细胞系进行筛选，并 经PCR和UCLA组织定型实验室的直接序列分析进一步确证和定亚 型。简而言之，针对表III AFP肽中所列各肽产生肽特异性CTL，方 法如下：来自某正常A2.1供体的外周血单核细胞(PBMC)2×107用 Ficoll梯度纯化。于1ml无血清的培养基中用50μg/ml肽脉冲处理这些 PBMC，37℃90分钟。然后清洗细胞一次，再当天置于24孔板中， 每孔3×106个PBMC(于1.5ml含10％自身血清的RPMI培养基中)， 并加入溶于RPMI/10％自身血清的IL-7(10ng/ml)和KLH(4.5μ g/ml)。每周通过取出未吸附细胞，按PBMC对CTL 1∶1的比例将 它们加入新鲜的、经肽脉冲过、洗净并照射过的PBMC中，从而对 CTL进行重新刺激。每周加10单位/ml IL-2两次。

                    表III人AFP肽的细胞毒性 肽命名号 CTL培养物 CD4/CD8表型 T2+特异性肽 的细胞毒性 AFP+/HLA A2.1+ HepG2细胞毒性   AFP3    CD8+ 50∶1    74％ 10∶1    28％ 20∶1    7％ 5∶1    4％   AFP4    CD8+ 50∶1    94％ 10∶1    15％ 20∶1    7％ 5∶1     4％   AFP5    CD8+ 50∶1    75％ 10∶1    41％ 20∶1    7％ 5∶1     4％   AFP6    CD8+ 50∶1    52％ 10∶1    17％   (n.t.)   AFP7    CD8+ 50∶1    22％ 10∶1    0 50∶1    15％ 10∶1    6％   AFP22    CD8+/CD4+ 20∶1    56％ 5∶1     13％ 20∶1    24％ 5∶1     9％   AFP23  CD8+/CD4+ 20∶1    45％ 5∶1     10％ 20∶1    15％ 5∶1     2％   AFP37    CD8+/CD4+ 25∶1    32％ 5∶1     16％ 25∶1    2％ 5∶1     0   AFP38    CD8+/CD4+ 50∶1    54％ 10∶1    18％ 50∶1    12％ 10∶1    0   AFP39    CD8+/CD4+ 50∶1    54％ 10∶1    18％ 50∶1    29％ 10∶1    12％   AFP45    CD8+/CD4+ 50∶1    25％ 10∶1    14％ 50∶1    27％ 10∶1    9％   AFP49    CD8+/CD4+ 50∶1    46％ 10∶1    23％ 50∶1    45％ 10∶1    17％   FLU的残基 58-66    CD8+ 50∶1    100％ 10∶1    45％   n.t.   MART-I的残 基27-35    CD8+ 50∶1    100％ 10∶1    80％   n.t.

培养3周后，在标准的4小时31Cr释放试验中检验推定由 hAFP肽刺激生成的CTL的细胞毒性。还检验其对经用来生成该CTL 的特异性hAFP肽脉冲过的T2细胞的肽特异性杀伤作用，并与经作为 对照的FLU基质肽或MART-1肽脉冲过的T2细胞的杀伤进行比较。 用NK敏感性靶K562评估非特异性NK杀伤作用。还检验CTL对HLA

A2.1阳性、AFP阳性的人肝细胞癌细胞系HepG2的杀伤作用。

现参见表III，显示来自正常供体、用于产生CTL、得出阳性肽 细胞毒性结果的12段AFP肽的细胞性毒检验结果。第2列显示大批量 淋巴细胞培养物的CD4/CD8表型。第3和4列分别显示对经肽脉冲过 的T2细胞和对HepG2靶的细胞毒性水平及其效应物(CTL)对靶细 胞的比率(E∶T)。

如表III所见，证实肽AFP22、AFP39、AFP45和AFP49可高水 平地特异性杀伤AFP+、HLA A2.1+的HepG2细胞。还可注意到 AFP22和AFP49有一个四氨基酸重叠，即hAFP(SE ID NO：2)的 547-550位残基。且AFP22与AFP23有两个氨基酸(即SEQ ID NO：2 的555-556位残基)重叠，后者显示或多或少的HepG2杀伤作用。

再次检验用AFP49产生的CTL，其仍保持对HepG2的细胞毒 性。进一步，用另两位正常HLA A2.1供体制备新的AFP49肽产生的 CTL培养物。用其它靶细胞来确证用AFP49所观察到的细胞毒性作 用是AFP抗原特异性的及I类限制性的。

现参见图1，示有这些检验的代表性数据。首先，为确证所观 察到的细胞毒性是I类限制的，用抗β2微球蛋白抗体封闭了HepG2细 胞上CTL与T细胞受体的相互作用。这导致HepG2的裂解显著减少。 接着，为消除非特异性NK/LAK杀伤作用，加入了40倍过量的未标 记(冷)K562细胞。这并未导致HepG2裂解的显著减少。更进一 步，HepG2细胞与γIFN(50单位/ml)温育过夜上调了其表面MHC I 类的表达。正如所见，MHC I类表达的上调增加了HepG2的裂解。 此外也利用一种AFP+、HLA A2.1阴性的肝细胞癌细胞系Hep3B， 即一种I类错配的肝细胞癌细胞系作为靶细胞。AFP49 CTL以很低水 平裂解这些Hep3B。所观察到的这种小量Hep3B裂解现象在加入过 量的冷K562细胞后即可消除，而特异性杀伤HepG2的现象在加入冷 K562细胞后仍然保持着。

现参见图2，显示有CTL的标准铬释放试验中特异性裂解率对 靶细胞的条形图，其中CTL是经肽脉冲来自正常HLA A2.1供体的 PBMC生成的，已测试过肽靶和AFP靶。为确证CTL的肽特异性， 每一培养物均对经生成CTL培养物的特异性肽脉冲过的T2细胞进行 检验(图上最左边的各带)，并与经不同HLA A2.1结合肽(作为对 照)脉冲过的T2细胞的检验(从左数第2组的各带)进行比较。正如 所见，AFP49肽培养物、AFP49 V9肽培养物、AFP5肽培养物和对照 FLU基质肽培养物均显示肽特异性，对经特异性肽脉冲过的T2细胞 能够裂解，但不裂解经其他肽脉冲过的T2细胞。

再参见图2，测试这些肽特异性CTL培养物中的每一种对转导 了AdVhAFP或对照AdVRR5的M202(HLA A2.1+/AFP-)黑色素 瘤细胞的杀伤。两种AFP肽-AFP5和AFP49，以及在AFP49的第9位 替换了一个氨基酸的AFP49L9〔SEQ ID NO：3；GVALQTMKL〕及 AFP49V9〔SEQ ID NO：4；GVALQTMKV〕，这些肽的肽特异性 CTL培养物均显示出对转导了AdVhAFP的M202细胞比对RR5对照转 导的M202细胞的杀伤作用更显著。FLU肽特异性CTL培养物对 M202/AdVhAFP和M202/RR5都能杀伤，有相似的本底水平细胞毒作 用。

已知M202细胞能正确加工并呈递HLA A2.1限制性的、免疫显 性MART-1肽。故它们是转导AdVhAFP的理想细胞系，预期来自 AFP的正确HLA A2.1限制性表位将被加工并呈递在其表面。因此， 这个实验证明AFP5、AFP49、AFP49L9(SEQ ID NO：3)及 AFP49V9(SEQ ID NO：4)是天然加工并呈递的肽，可用来引导 CTL杀伤AFP阳性肿瘤。而且，正如所见，AFP49L9(SEQ ID NO：3)和AFP49V9(SEQ ID NO：4)的肽特异性CTL培养物比 AFP49的肽特异性CTL培养物能更有效地杀伤M202/AdVhAFP，故 AFP49L9(SEQ ID NO：3)和AFP49V9(SEQ ID NO：4)均为引导 对AFP阳性细胞产生免疫应答的改良肽。

因此，根据此公开内容可以体会到，本发明包括预防或治疗哺 乳动物(含人)体内的癌症，其中癌症细胞携有甲胎蛋白分子的至 少部分作为表面标志物。该预防或治疗是通过给予该哺乳动物一种 含肽组合物而达到的，所述肽包含甲胎蛋白分子的至少一部分，或 是甲胎蛋白分子的至少部分通过取代或其他变化而产生的。这些肽 包括AFP5、AFP7、AFP13、AFP14、AFP18、AFP22、AFP23、 AFP28、AFP38、AFP39、AFP45、AFP49、AFP49L9(SEQ ID NO：3)和AFP49V9(SEQ ID NO：4)。

2)用甲胎蛋白cDNA免疫接种哺乳动物以产生针对表面上携有甲 胎蛋白的细胞(包括肝细胞癌的细胞)的免疫应答

用甲胎蛋白cDNA免疫接种哺乳动物可产生免疫应答，该免疫 应答可部分或彻底地保护机体对抗表面携有甲胎蛋白的肿瘤细胞 (包括肝细胞癌的细胞)的攻击。这一效应可按如下证实：

按如下步骤生成人甲胎蛋白cDNA：首先，用PCR技术从Hep3B 细胞(ATCC提供)所得总RNA制备人甲胎蛋白cDNA，其中总RNA 是用Trizol法(Life Technologies，Gaithersburg，MD，按厂家建议)和 RNAZolB法(TelTest，Frlendswood，TX)制得的。利用约1μg总 RNA，采用Perkin Elmer RT-PCR盒和根据以公布序列设计的AFP特 异性引物，进行RT-PCR反应。5′引物是5′GCA ACC ATG AAG TGG GT。3′引物是5′AAC TCC CAA AGC AGC ACG AGT。这 些引物包括了全长编码区(ATG至终止密码子)，并在引物中引入 了一个限制性内切酶位点XbaI，且终止于6个碱基(CTC TCT)， 以促进PCR之后的酶解切割。引物序列由Operon Technologies合 成，为50nM规模，未纯化。

在琼脂糖凝胶上分析上述制得的人甲胎蛋白PCR cDNA产物以 检查其大小。大小正确的产物在Qiagen PCR快速净化柱上纯化，用 XbaI酶消化(其酶切位点设计在引物中)，再按照本领域技术人员 熟知的技术，在克隆反应中将其克隆进pRcCMV(对人)或pCR3.1 (用于鼠)哺乳动物表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。经 小量制备分析识别阳性质粒。大量制备这些阳性质粒，用UCLA的 DNA测序核心设备。对其中的一等份进行测序，以确证插入片段的 序列正确。序列数据只是一条链的，证实了AFP插入片段的一致 性。因此，克隆到的人AFP cDNA等同于已公布的人AFP序列 (GenBanK录入号J00077，J00076，V01514，SEQ ID NO：1的48至 1877位碱基)。

采用上文用于克隆人AFP cDNA的公开方法的相应方法，但使 用的是小鼠特异性引物，克隆鼠AFP cDNA(mAFP cDNA)。5′鼠特 异性引物是5′GCC ATG AAG TGG ATC ACA。3′鼠特异性引物 是TTA AAC GCC CAA AGC ATC A。用于分离总RNA的小鼠AFP 阳性细胞系为Hepa16。本文所公开的所有稳定转染子和肌肉内注射 实验均用含信号序列的cDNA克隆得到或进行。

接着，将mAFP cDNA放入真核表达载体VR1012(Vical，Inc.， San Diego，CA)中。该VR1012表达载体包含强组成型CMV立即早期 启动子/增强子，内有一个可增强表达的内含子，一个BGH终止子和 用于体内表达的poly A序列。

给C57BL/6小鼠肌肉内注射含mAFP cDNA的VR1012 100μg或 盐水对照，3周内每周1次。末次注射一周后，用4×106个活BWIC3 肝细胞癌细胞攻击经VR1012 mAFP cDNA免疫接种的小鼠及未免疫 接种的对照组小鼠，所述癌细胞来自同系小鼠体内进行性生长的肿 瘤制成的单细胞悬液。BWIC3是一种mAFP阳性鼠细胞系。

现参见图3，可见经免疫接种的动物(空心盒)相比于对照组 动物(实心方形)显示了肿瘤生长延迟或完全的保护作用。这些发 现重复多次出现。在一相关实验中，肌内注射可表达MART-1黑色 素瘤抗原的质粒载体未能保护动物抵抗BWIC3肝细胞癌细胞的攻击 (数据未显示)。

另一组实验中，通过用mAFP cDNA稳定转染EL4(H-2b)淋 巴瘤构建了一株代用性的鼠肝细胞癌细胞系。这个EL4(mAFP)肿瘤 细胞系具有与亲代EL4细胞系相同的体内生长动力学。经RT-PCR 发现EL4(mAFP)肿瘤细胞系产生的AFP水平只有BWIC3肝细胞癌细 胞系的1％或更少。

给C57BL/6小鼠肌内注射含mAFP cDNA的VR1012 100μg或注 射盐水作对照，一周一次，共三周。末次注射一周后，用7×105个 活EL4(亲代)或EL4(mAFP)细胞攻击经VR1012 mAFP cDNA免 疫接种的小鼠和未经免疫接种的对照组小鼠。

现参见图4，可以看到，当用EL4(亲代)细胞攻击时，经免疫 接种的动物(空心盒)及对照动物(实心圆)显示无差别(p＝ 0.07，斯氏T检验)。但正如图5所见，接受EL4(mAFP)细胞攻击 时，经免疫接种的动物(空心盒)与对照动物(实心圆)相比确实 显示有部分保护作用(P＝0.07，斯氏T检验)。这些发现亦重复出 现多次。

另一系列实验中，用稳定转染了的小鼠纤维肉瘤细胞系作替 代，证实对表面携有甲胎蛋白的细胞的攻击有保护作用。首先，用 DOTAP脂转染法(Boehringer Mannheim)按厂家建议、或用 CaPO4沉淀法(按本领域技术人员熟知的方法)制备稳定转染的小 鼠纤维肉瘤细胞系。简短说，DOTAP脂转染法在一个6孔板中每孔 使用1×105个细胞，提前一晚吸附过夜。将2.5μg质粒(鼠AFP pCR3.1)混入于25μl的20mM Hepes中，将15μl脂质混入于50μl Hepes中，室温混15分钟。将之加入1ml培养基(RPMI 1640，内含 10％胎牛血清及抗生素)稀释，再加入孔中的细胞上。4至6小时 后，用2ml新鲜培养基取代溶液。48至72小时后，用G418(遗传霉 素)@500μg/ml(总浓度，75％活性)开始选择。选择2至3周后， 用RT-PCR检验每一个可能的转染子表达小鼠AFP RNA、neo- RNA的情况，并用鼠APRT基因表达情况进行半定量。

如下证实AFP免疫接种在抑制哺乳动物体内肿瘤产生方面的效 力。按照本领域技术人员熟知的技术制备小鼠AFP-pCR3.1质粒和 小鼠AFP AdV穿梭载体质粒(pAC CMVpLpA)，并构建小鼠AFP- Vical载体VR1012。用上述的mAFP PCR3.1稳定转染鼠纤维肉瘤细 胞系FSA、NFSA、MCAK和SVEC。

给C3H小鼠每周肌内注射质粒DNA进行免疫接种，共三周，所 述质粒DNA是利用Qiagen质粒制备试剂盒制备成无内毒素的小鼠 AFP-AdV穿梭载体带neo的表达质粒(50μg质粒溶于50μl PBS 中)。然后用稳定转染有表达AFP的载体的FSA C3H本底纤维肉 瘤、或稳定转染了只表达neo的载体自身的FSA C3H本底纤维肉瘤细 胞攻击C3H小鼠，以测定是否产生了AFP抗自身抗原应答，或应用 表达新霉素的稳定转染子是否会产生能掩盖AFP应答的抗neo(非自 身抗原)应答。肿瘤细胞在体内传代，利用单细胞悬液进行肿瘤攻 击。

现参见图6，可见至肿瘤攻击后第18天，以稳定转染有AFP表达 载体的FSA C3H本底纤维肉瘤细胞攻击的免疫接种CH3小鼠中只有1 只(图中较下部的实心方形)显示有一点肿瘤生长(一个3mm× 3mm大小的肿瘤)，其余4只同样处理的CH3小鼠(实心圆)并未有 任何肿瘤生长的迹象。与之相比，5只以稳定转染有AFP表达载体的 FSA C3H本底纤维肉瘤细胞攻击的未免疫接种C3H小鼠中有2只(图 中上部的实心方形)显示有一点肿瘤生长(平均6.8mm2)。FSA亲 代肿瘤细胞和neo载体-FSA细胞在免疫接种的CH3小鼠(实心菱 形)和未免疫接种的CH3小鼠(实心倒三角)中的生长相似。重复 该实验步骤获得了相似的结果(数据未给出)。

用来自Jackson实验室(Bar Harbor Maine)的C57L/J(“不 活泼”)小鼠进行第二个实验。给这些小鼠免疫接种来自Vical (VR1012)的质粒载体，所述质粒载体中不含新霉素，故只合成小鼠 AFP基因。用一种同系鼠肿瘤细胞系，即来自ATCC的BWIC3，攻 击C57L/J小鼠。这些BWIC3细胞合成的小鼠AFP水平远高于上文所 述稳定转染的鼠纤维肉瘤细胞所合成的水平。

照上文所述用mAFP-Vical载体免疫接种C57L/J小鼠，然后于皮 下对每只小鼠用1×106个BWIC3细胞进行肿瘤攻击。现参见图7，可 以看到，肿瘤攻击后第14天，未免疫接种的C57L/J小鼠(实心方 形)生成的肿瘤比免疫接种过的C57L/J小鼠(实心圆)内的肿瘤平 均大两倍。

第三个实验中，用只合成小鼠AFP基因的质粒载体(VR1012) 免疫接种另一批C57L/J小鼠，再如上述用1×106个BWIC3细胞攻 击。现参见图8，可以看到，攻击后第17天，所有五只未免疫接种的 小鼠(实心圆和实心方形)均有肿瘤，平均肿瘤直径为11.4mm2。 与之相比，经mAFP-Vical免疫接种的5只小鼠中有3只(实心三角) 的肿瘤平均直径为9mm2，1只(实心菱形)有一个3mm2的小肿瘤， 1只(实心倒三角)未显示有肿瘤。

因此，正如可从本公开内容领会的那样，本发明包括对哺乳动 物(含人)体内的癌症进行预防或治疗，其中癌症细胞携有甲胎蛋 白的至少部分作为表面标志物。预防或治疗是通过给该哺乳动物施 用一种含甲胎蛋白cDNA至少一部分的组合物，以产生针对甲胎蛋白 分子至少部分的免疫应答而达到的。

3)用基因工程化的树突细胞免疫接种哺乳动物，以针对表面有 甲胎蛋白的细胞，包括肝细胞癌细胞。

用转导了可表达鼠AFP甲胎蛋白cDNA的重组腺病毒载体 (AdVmAFP)的树突细胞免疫接种哺乳动物，产生了一种可部分或彻 底地保护动物抵抗肝细胞癌细胞攻击的免疫应答。这一效应可证实 如下：

首先，按本领域技术人员熟知的方法构建表达鼠AFP的重组腺 病毒载体(AdVmAFP)。见如，Ribas，A.，L.H.Butterfield， W.H.McBride，S.M.Jilani，L.A.Bui，C.M.Vollmer，R.Lau， V.B.Dissette，B.Hu，A.Y.Chen，J.A.Glaspy和J.S.Economou，1997年。 用重组腺病毒转导的鼠树突细胞基因性免疫接种黑色素瘤抗原 MART-1/Melan-A。癌症研究57卷2865页；Toloza，E.M.，K.Hunt， S.Swisher，W.McBride，R.Lau，S.Pang.K.Rhoades，T.Drake， A.Belldegrum，J.Glaspy，和J.S.Economou 1996年。用重组白介素2腺 病毒载体进行体内癌症的基因治疗。癌症基因治疗3卷11页，本文将 其全文引入作为参考。然后，按照本领域技术人员所熟知的技术， 从经GM-CSF和IL-4作用分化7天的C57BL/6骨髓产生树突细胞。 见如，Ribas，A.，L.H.Butterfield，W.H.McBride，S.M.Jilani，L.A.Bui， C.M.Vollmer，R.Lau，V.B.Dissette，B.Hu，A.Y.Chen，J.A.Glaspy和 J.S.Economou，1997年。用重组腺病毒转导的鼠树突细胞基因性免疫 接种黑色素瘤抗原MART-1/Melan-A。癌症研究57卷2865页； Inaba，K.，M.Inaba，N.Romani，H.Aya，M.Deguchi，S.Ikehara， S.Muramatsu，和R.M.Steinman，1992年。从加有粒细胞/巨噬细胞集 落刺激因子的小鼠骨髓培养物中产生大量树突细胞。实验医学杂志 176卷1693页，将其全文引入作为参考。

现参见图9，显示分离自以不同感染复数(MOI)转导了 AdVmAFP的鼠树突细胞(DC)的mRNA的RT-PCR分析。从左至 右读，第1道示凝胶大小标准品；第2道示作为阴性对照的mAFP阴 性细胞的结果；第3道示用作阴性对照的鼠树突细胞的结果；第4至7 道示分别以10、100、1000和5000的MOI转导了AdVmAFP的鼠树突 细胞的结果；第8道示用作阳性对照的BWIC3细胞的结果(最靠顶 的线约1.9kb)；第9示双蒸水(DDW)的结果，作为无模板的对照 检测PCR污染问题。正如所见，表达鼠AFP的重组腺病毒载体 (AdVmAFP)成功地转导了树突细胞。

随后，准备3组C57BL/6小鼠，每组5只，每周静脉内注射一次 以100的MOI分别转染有AdVmAFP或RR5(E1缺失的空腺病毒)的 5×105个树突细胞，或未转染的树突细胞，其二周。这三组小鼠及 另一组未经注射而充当对照的小鼠在末次注射一周后用7.5×105个 EL4(AFP)攻击。结果示于图10。正如所见，注射RRS的小鼠(朝 上的实心三角)或注射未处理树突细胞的小鼠(实心倒三角)，及 对照小鼠(实心圆)均未显示有对抗肿瘤攻击的保护作用。与之相 比，注射了以MOI 100转染有AdVmAFP的树突细胞5×105个的小鼠 (实心方形)显示有针对肿瘤攻击的部分保护作用。

更进一步，准备另一组5只小鼠，2周内每周静脉内注射一次以 MOI 100转染有AdVmAFP的树突细胞5×105个。末次注射转导了的 树突细胞一周后，用4×106个BWIC3肿瘤细胞攻击该组小鼠，将产 生的应答与另一组未注射的类似对照小鼠比较。该检测结果示于图 11。正如所见，免疫接种小鼠(实心方形)显示针对肿瘤攻击的保 护作用比对照小鼠(实心圆)更显著，证实用转导了的树突细胞进 行治疗比较有效。

因此，正如根据本公开内容可以领会的那样，本发明包括对哺 乳动物(含人)体内的癌症进行预防或治疗，其中的癌症细胞携有 甲胎蛋白分子的至少部分作为表面标志物。这种预防或治疗是通过 给该哺乳动物施用一种含免疫系统细胞(如树突细胞)的组合物完 成的，其中所述免疫系统细胞转导了能表达甲胎蛋白cDNA的重组载 体。

实施例1

对哺乳动物体内肝细胞癌的治疗

依据本发明的一个实施方案，提供了一种通过在人体内产生针 对甲胎蛋白分子至少部分的免疫应答而治疗人体内肝细胞癌的方 法。该方法包括用本文所公布方法之一的相似方法或相关方法免疫 接种此人，或对此人进行基因操作，以产生针对甲胎蛋白的免疫应 答。在一个较优选实施方案中，对此肝细胞癌病人进行免疫接种， 以产生针对甲胎蛋白分子至少部分(如针对AFP5、AFP7、 AFP13、AFP14、AFP18、AFP22、AFP23、AFP28、AFP38、 AFP39、AFP45或AFP49)的免疫应答。该免疫接种导致此人的免 疫系统攻击表面具有甲胎蛋白分子相应部分的肝细胞癌细胞。

尽管参照某些较优选实施方案对本发明进行了十分详尽的讨 论，但其它实施方案也可能是可行的。故所附权利要求书的精神和 范围应不限于在此所包含的对较优选实施方案的描述。

与相关申请的前后对照

本申请是现已放弃的题为“用于预防及治疗肝细胞癌的方法和 组合物”(于1997年2月13日提出申请)的美国专利申请系列号 60/038,375的部分继续申请，以及共同未决的题为“肝细胞癌的预防 及治疗”(于1998年2月13日提出申请)的国际专利申请 PCT/US98/02753的部分继续申请，它们的内容均全文引入本文作为 参考。

                         序列表

(110)Economou，James S.

     Butterfield，Lisa H.

     Ribae Bruguera，Antoni

(120)肝细胞癌的预防及治疗

(130)119691

(140)

(141)

(150)60/038,375

(151)1997-02-13

(160)4

(170)PatentIn Ver.2.0

(210)1

(211)2032

(212)DNA

(213)人

(220)

(221)CDS

(222)(48)..(1874)

(400)1

tccatattgt gcttccacca ctgccaataa caaaataact agcaacc atg aag tgg   56

                                                    Met Lys Trp

                                                      1

gtg gaa tca att ttt tta att ttc cta cta aat ttt act gaa tcc aga   104

Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr Glu Ser Arg

      5                  10                  15

aca ctg cat aga aat gaa tat gga ata gct tcc ata ttg gat tct tac    152

Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr

 20                  25                  30                  35

caa tgt act gca gag ata agt tta gct gac ctg gct acc ata ttt ttt    200

Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe

                 40                  45                  50

gcc cag ttt gtt caa gaa gcc act tac aag gaa gta agc aaa atg gtg    248

Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val

             55                  60                  65

aaa gat gca ttg act gca att gag aaa ccc act gga gat gaa cag tct    296

Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser

         70                  75                  80

tca ggg tgt tta gaa aac cag cta cct gcc ttt ctg gaa gaa ctt tgc    344

Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys

     85                  90                  95

cat gag aaa gaa att ttg gag aag tac gga cat tca gac tgc tgc agc    392

His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys Ser

100                 105                 110                 115

caa agt gaa gag gga aga cat aac tgt ttt ctt gca cac aaa aag ccc    440

Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys Pro

                120                 125                 130

acc cca gca tcg atc cca ctt ttc caa gtt cca gaa cct gtc aca agc    488

Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr Ser

            135                 140                 145

tgt gaa gca tat gaa gaa gac agg gag aca ttc atg aac aaa ttc att    536

Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe Ile

        150                 155                 160

tat gag ata gca aga agg cat ccc ttc ctg tat gca cct aca att ctt    584

Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile Leu

    165                 170                 175

ctt tgg gct gct cgc tat gac aaa ata att cca tct tgc tgc aaa gct    632

Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys Ala

180                 185                 190                 195

gaa aat gca gtt gaa tgc ttc caa aca aag gca gca aca gtt aca aaa    680

Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr Lys

                200                 205                 210

gaa tta aga gaa agc agc ttg tta aat caa cat gca tgt gca gta atg    728

Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val Met

            215                 220                 225

aaa aat ttt ggg acc cga act ttc caa gcc ata act gtt act aaa ccg    776

Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu

        230                 235                 240

agt cag aag ttt acc aaa gtt aat ttt act gaa atc cag aaa cta gtc    824

Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val

    245                 250                 255

ctg gat gtg gcc cat gta cat gag cac tgt tgc aga gga gat gtg ctg    872

Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu

260                 265                 270                 275

gat tgt ctg cag gat ggg gaa aaa atc atg tcc tac ata tgt tct caa    920

Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln

                280                 285                 290

caa gac act ctg tca aac aaa ata aca gaa tgc tgc aaa ctg acc acg    968

Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr

            295                 300                 305

ctg gaa cgt ggt caa tgt ata att cat gca gaa aat gat gaa aaa cct    1016

Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro

        310                 315                 320

gaa ggt cta tct cca aat cta aac agg ttt tta gga gat aga gat ttt    1064

Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe

    325                 330                 335

aac caa ttt tct tca ggg gaa aaa aat atc ttc ttg gca agt ttt gtt    1112

Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val

340                 345                 350                 355

cat gaa tat tca aga aga cat cct cag ctt gct gtc tca gta att cta    1160

His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu

                360                 365                 370

aga gtt gct aaa gga tac cag gag tta ttg gag aag tgt ttc cag act    1208

Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr

            375                 380                 385

gaa aac cct ctt gaa tgc caa gat aaa gga gaa gaa gaa tta cag aaa    1256

Glt Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lye

        390                 395                 400

tac atc cag gag agc caa gca ttg gca aag cga agc tgc ggc ctc ttc    1304

Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe

    405                 410                 415

cag aaa cta gga gaa tat tac tta caa aat gcg ttt ctc gtt gct tac    1352

Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala Tyr

420                 425                 430                 435

aca aag aaa gcc ccc cag ctg acc tcg tcg gag ctg atg gcc atc acc    1400

Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr

                440                 445                 450

aga aaa atg gca gcc aca gca gcc act tgt tgc caa ctc agt gag gac    1448

Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp

            455                 460                 465

aaa cta ttg gcc tgt ggc gag gga gcg gct gac att att atc gga cac    1496

Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His

        470                 475                 480

tta tgt atc aga cat gaa atg act cca gta aac cct ggt gtt ggc cag    1544

Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln

    495                 490                 495

tgc tgc act tct tca tat gcc aac agg agg cca tgc ttc agc agc ttg    1592

Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu

500                 505                 510                 515

gtg gtg gat gaa aca tat gtc cct cct gca ttc tct gat gac aag tzc    1640

Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe

                520                 525                 530

att ttc cat aag gat ctg tgc caa gct cag ggt gta gcg ctg caa acg    1688

Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr

            535                 540                 545

atg aag caa gag ttt ctc att aac ctt gtg aag caa aag cca caa ata    1736

Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile

        550                 555                 560

aca gag gaa caa ctt gag gct gtc att gca gat ttc tca ggc ctg ttg    1784

Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu

    565                 570                 575

gag aaa tgc tgc caa ggc cag gaa cag gaa gtc tgc ttt gct gaa gag    1832

Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu

580                 585                 590                 595

gga caa aaa ctg att tca aaa act cgt gct gct ttg gga gtt            1874

Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val

                600                 605

taaattactt caggggaaga gaagacaaaa cgagtctttc attcggtgtg aacttttctc  1934

tttaatttta actgatttaa cactttttgt gaattaatga aatgataaag acttttatgt  1994

gagatttcct tatcacagaa ataaaatatc tccaaatg                          2032

<210>2

<211>609

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr

  1               5                  10                  15

Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu

             20                  25                  30

Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr

         35                  40                  45

Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser

     50                  55                  60

Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp

 65                  70                  75                  80

Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu

                 85                  90                  95

Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp

            100                 105                 110

Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His

        115                 120                 125

Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro

    130                 135                 140

Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn

145                 150                 155                 160

Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro

                165                 170                 175

Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys

            180                 185                 190

Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr

        195                 200                 205

Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys

    210                 215                 220

Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val

225                 230                 235                 240

Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln

                245                 250                 255

Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly

            260                 265                 270

Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile

        275                 280                 285

Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys

    290                 295                 300

Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp

305                 310                 315                 320

Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp

                325                 330                 335

Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala

            340                 345                 350

Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser

        355                 360                 365

Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys

    370                 375                 380

Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu

385                 390                 395                 400

Lsu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys

                405                 410                 415

Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu

            420                 425                 430

Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met

        435                 440                 445

Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu

    450                 455                 460

Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile

465                 470                 475                 480

Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly

                485                 490                 495

Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe

            500                 505                 510

Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp

        515                 520                 525

Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala

    530                 535                 540

Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys

545                 550                 555                 560

Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser

                565                 570                 575

Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe

            580                 585                 590

Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly

        595                 600                 605

Val

(210)2

(211)9

(212)PRT

(213)人

(400)3

Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Leu

(210)4

(211)9

(212)PRT

(213)人

(400)4

Gly Val AlaLeu Gln Thr Met Lys Val

  1              5