动物肝细胞的培养方法
阅读：783发布：2020-05-13
专利汇可以提供动物肝细胞的培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供三维地培养 肝细胞 而简便地形成球形体的技术、和担负胆管排泄的转运蛋白MRP2的表达比现有方法更高的球形体形成技术。为解决前述课题，本 发明人 等发现了在纳米 支撑 片上肝细胞容易形成球形体的条件。具体而言，与NP片上涂布的I型胶原的浓度有关。此外，发现了与形成的球形体的排泄相关的基因表达量的提高条件。具体而言，预先形成球形体后层叠 生物 学基质。，下面是动物肝细胞的培养方法专利的具体信息内容。
1.动物肝细胞的培养方法，其特征在于，具有以下步骤：
在具有小于肝细胞的当量直径的当量间隔的纳米支撑片上，涂布被稀释至规定浓度的、与整联蛋白结合的蛋白质的步骤，
在涂布有与整联蛋白结合的蛋白质的上述纳米支撑片上，接种在规定的培养基中制备成规定的细胞密度的肝细胞的步骤，
以规定的时间周期更换培养基的步骤；
其中，在上述纳米支撑片上涂布与整联蛋白结合的蛋白质的步骤之后具有减压步骤。
2.根据权利要求1所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，在上述接种肝细胞的步骤中，以不会形成肌动蛋白应力纤维的方式使上述肝细胞粘附于纳米支撑片上，从而形成肝细胞球形体。
3.根据权利要求1所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，在培养液中添加胰岛素和地塞米松。
4.根据权利要求3所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，培养液中的胰岛素的浓度在1nM～100nM的范围内，地塞米松的浓度在1nM～250nM的范围内。
5.根据权利要求1所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，前述肝细胞的接种密
4 6
度为1×10 ～1×10 个细胞/ml的密度。
6.根据权利要求1所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，将前述肝细胞接种于已实施相应表面处理的纳米支撑片上后，24～48小时后层叠生物学基质。
7.根据权利要求6所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，生物学基质含有来源于基底膜的成分。
8.根据权利要求1所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，形成的球形体的直径为30～100im以下。
9.根据权利要求1所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，与整联蛋白结合的蛋白质为细胞外基质的成分。
10.根据权利要求9所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，细胞外基质成分含有I型胶原。
11.根据权利要求10所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，前述I型胶原的浓度
6 8
在1/10 ～1/10％(W/V)的范围内。
12.根据权利要求1所述的动物肝细胞的培养方法，其特征在于，更换培养基的时间周期为4小时～24小时。
动物肝细胞的培养方法
技术领域
背景技术
[0002] 药品开发的标准过程大致分为3个阶段。第一阶段为：调查药品需求并选择作为药品开发对象的疾病后，探索对疾病有效的物质，开发出目标药品候选物质(筛选)。接下来，第二阶段为：通过非临床试验、临床试验证实药品候选物质对对象疾病的诊断、治疗有效且安全，将其评价结果总结为新药认证申请书并获得国家承认。然后，第三阶段为：销售已获得承认的药品并将其用于医疗。有报告指出，从研究开发所用成本的观点来看该药物开发过程，则全部研究开发费用的30％有时甚至50％用在了动物实验中。
[0003] 动物实验被用于非临床试验和部分临床试验、初期筛选中。因此，在当前每种新药的开发费用接近1000亿日元的状况下，从降低研究开发费用的观点来说，开发低成本的替代试验法以代替动物实验，其成本降低效果是可以预见的。此外，从动物福祉、爱护动物的观点来看，特别是从目前的EU动向来看，削减动物实验已成为社会性的无法逆转的大趋势。进而，还有人指出，利用细胞进行的离体替代法，其在通过现有的动物实验难以理解的药物或化合物的体内动态的作用机理的阐明、特别是重要指标之一的肝脏中的代谢和解毒、胆管排泄的评价中是非常有利的(非专利文献1)。
[0004] 基于这样的背景，截至目前，利用细胞进行的替代法的探讨正广泛进行，但在预测临床反应方面存在很多限制。认为这是由于，这些培养法中细胞并未采取模拟实际活体内结构的结构(非专利文献2)。因此，需要构建更接近活体的三维结构和建立使用其的离体检测体系。其中，对使用肝细胞的离体检测尤为期待，并需要重要的筛选指标之一的肝脏中的代谢、胆小管排泄的评价体系。胆小管为2个以上肝细胞所围成的腔，通过紧密连接(tight junction)而关闭细胞间隙从而防止胆汁泄漏。肝脏通过细胞膜上表达的ATP依赖性转运蛋白而将胆汁、代谢产物从肝细胞输送至胆小管内。测定这样的胆管排泄量的技术中包括夹层法(非专利文献3)，但到目前为止还未显示出充分性能，未实现实用化。
[0005] 作为用于实现细胞的三维结构的器械，有纳米支撑细胞培养片(以下记载为“纳米支撑片”或“NP片”)(专利文献1)。NP片为应用纳米压印技术的微加工技术而制成的用于细胞培养、或组织培养的支架材料。纳米支撑片的优点在于，通过使用人工设计的微细的立体结构作为支架材料，能够期待作为三维培养用器械的效果。迄今为止，已有若干关于使用纳米支撑片培养细胞的报告(专利文献2、3)。
[0006] 专利文献1：日本特开2004-170935号公报
[0007] 专利文献2：日本特开2006-223197号公报
[0008] 专利文献3：日本特开2008-054566号公报
[0009] 非专利文献1：J.Cell Biol.101：914-923(1985)
[0010] 非专利文献2：J Biomol.Screen.9：273-285(2004)
[0011] 非专利文献3：FASEB J 3：174-177(1989)
发明内容
[0012] 发明要解决的问题
[0013] 现有的夹层培养法(以下记载为SW培养)为如下的方法：在肝细胞的底面层叠I型胶原并在肝细胞的上面层叠生物学基质，通过上述2种物质夹住细胞而2维平面培养的方法，具有能够对排泄到胆管的代谢产物进行定量的优点。但是，离体体系的SW培养中，存在计测的动态范围窄、无法计测微小的变动的问题。认为这是由于肝细胞一旦从活体内取出至活体外则本来的细胞功能降低、在培养皿中再构建而得的结构物中形成的胆小管数比活体内少。
[0014] 因此，通过以接近活体内组织的结构的三维方式培养细胞，使解决上述问题的工作迅速展开。具体而言，尝试了使用NP片进行培养。然而，关于使用NP片进行的细胞培养，专利文献2、3中虽记载了脂肪细胞的三维培养、或神经细胞的培养，但并未考虑肝细胞的培养，也不存在特化成肝细胞培养的记载。因此，想要将专利文献2和3的方法用于肝细胞培养时，存在无法形成所期望的球形体的问题。
[0015] 从上述理由出发，本发明目的在于提供使用NP片形成具有接近活体的结构、功能的三维肝细胞球形体的方法。
[0016] 解决问题的手段
[0017] 为解决前述课题，发现了在纳米支撑片上肝细胞形成球形体的条件。具体而言，条件是涂布NP片上所涂布的I型胶原。此外，发现了与形成的球形体的排泄相关基因的表达量提高条件。具体而言，条件是预先形成球形体后层叠生物学基质。
[0018] 发明效果
[0019] 通过应用本发明，能够在纳米支撑片上简便地形成肝细胞的三维结构，即球形体。所形成的球形体，其担负胆管排泄的转运蛋白MRP2的表达比现有方法更高，具有更接近活体的胆管排泄能力。通过使用这样的球形体，从而能够计测微量排泄且能够计测的动态范围较宽。计测的动态范围较宽则能够应用于药物开发过程的药物动态试验。
附图说明
附图说明
[0020] 图1是表示肝细胞球形体培养的培养步骤的图。
[0022] 图3是表示肝脏冷冻组织切片、NP球形体、平面培养细胞的免疫组织化学的图。
[0024] 图5是表示使用CDFDA的胆管排泄计测结果的图。
[0025] 图6是表示利用实时PCR进行基因表达解析的结果的图。
[0026] 图7是自动培养装置的整体构成图。
[0027] 图8是表示自动培养装置中的减压部(A)和培养部(B)的图。
[0028] 图9是表示自动化培养步骤的流程图。
[0029] 附图标记说明
[0030] 101NP片
[0031] 102细胞培养皿
[0032] 103粘接剂
[0033] 104I型胶原溶液
[0034] 105减压用容器
[0035] 106减压用泵
[0037] 108培养基
[0038] 109肝细胞
[0039] 110肝细胞球形体
[0040] 111减压腔
[0041] 112减压部投入·取出口
[0043] 114连接部
[0044] 115减压泵
[0045] 116孵育器
[0047] 118去离子水
[0048] 119投入口
[0049] 120取出口
[0050] 121内部投入口
[0051] 122内部取出口
[0052] 123保管室
具体实施方式
[0053] 下面，对使用培养基材培养肝细胞而形成肝细胞块即三维球形体或组织样结构物的方法的具体实施方式进行详细说明。
[0054] 实施例1
[0055] 实施例1中表示用于在NP片上形成肝细胞球形体的步骤。
[0056] <肝细胞的制备>
[0057] 肝细胞的制备通过原位胶原酶灌流法进行。具体如下所述。将Fisher344系雄性大鼠(7～10周龄)在戊巴比妥麻醉下剖开腹部，在门静脉中插入导管，注入预灌流液(不2+ 2+
含Ca 和Mg 但含有EGTA的Hank′s液)。并切开肝脏下部的下腔静脉放出血液。接着打开胸腔，切开通入右心房的下腔静脉，用止血钳夹住肝脏下部的下腔静脉，进行灌流。确认肝脏已经充分脱除血液后停止灌流。将灌流液更换为胶原酶溶液，进行灌流。本实施例中使用含0.05％胶原酶的Hank’s液进行灌流，但不限于此。确认细胞间组织被胶原酶消化后停止灌流。切下肝脏，在冷Hank’s液中切碎，通过吹打进行分散直至分散为细胞。接着通过纱布过滤除去未消化的组织。对细胞悬浮液重复进行数次50G、1分钟的离心分离，以除去非实质细胞。接着，使用等渗Percoll液通过500G、5分钟的离心分离除去受伤的肝细胞。培养中使用的是，通过台盼蓝不相容试验(trypan blue-exclusion test)计测获得的肝细胞的存活率时存活率为85％以上的肝细胞。在此，培养中使用存活率85％以上的肝细胞，但并非限定于该条件，这是不言而喻的。此外，肝细胞的制备并非限定于原位胶原酶灌流法。
含Ca 和Mg 但含有EGTA的Hank′s液)。并切开肝脏下部的下腔静脉放出血液。接着打开胸腔，切开通入右心房的下腔静脉，用止血钳夹住肝脏下部的下腔静脉，进行灌流。确认肝脏已经充分脱除血液后停止灌流。将灌流液更换为胶原酶溶液，进行灌流。本实施例中使用含0.05％胶原酶的Hank’s液进行灌流，但不限于此。确认细胞间组织被胶原酶消化后停止灌流。切下肝脏，在冷Hank’s液中切碎，通过吹打进行分散直至分散为细胞。接着通过纱布过滤除去未消化的组织。对细胞悬浮液重复进行数次50G、1分钟的离心分离，以除去非实质细胞。接着，使用等渗Percoll液通过500G、5分钟的离心分离除去受伤的肝细胞。培养中使用的是，通过台盼蓝不相容试验(trypan blue-exclusion test)计测获得的肝细胞的存活率时存活率为85％以上的肝细胞。在此，培养中使用存活率85％以上的肝细胞，但并非限定于该条件，这是不言而喻的。此外，肝细胞的制备并非限定于原位胶原酶灌流法。
[0058] 进而，人肝细胞也能够通过同样的方法制备。
[0059] <涂布有I型胶原的NP片的准备>
[0060] 在培养皿(102)底面粘贴NP片(101)(图1的(a))。NP片(101)的粘贴没有特别限定，例如可以是瞬间粘接剂，也可以是双面胶带。此外，粘贴NP片(101)的容器也没有特别限定，可以是市售的细胞培养用皿，也可以是腔室玻片。实施例1中，表示的是在市售的细胞培养皿(102)上通过瞬间粘接剂(103)粘贴NP片(101)的例子。NP片(101)使用的是多片后述的具有规定头顶部直径的NP片。
[0061] 接着，用灭菌水将溶解于弱酸性溶液的I型胶原稀释至规定浓度，将1～1.5mL该稀释液(I型胶原溶液)104添加到粘贴在腔室玻片的NP片(图1的(a))上(图1的(b))。
[0062] 接着，为了使添加的I型胶原完全吸附于NP片，在减压用容器105内通过减压泵106实施减压操作(图1的(c))。减压操作在0.04大气压以下进行。减压时间没有特别限定，本实施例中进行10分钟。减压中使用的装置没有特别限定。在此，稀释液的规定浓
6 8
度的范围为1/10％(W/V)以上且1/10％(W/V)以下。虽并非限定于该范围，但超过该范围、低于该范围时，可能不能形成球形体。
6 8
度的范围为1/10％(W/V)以上且1/10％(W/V)以下。虽并非限定于该范围，但超过该范围、低于该范围时，可能不能形成球形体。
[0063] 最后除去I型胶原，添加PBS(-)107(图1的(d))。进行3次该操作，以洗涤I型胶原。
[0064] <肝细胞的培养>
[0065] 将如前所述通过原位胶原酶灌流法而制备的肝细胞109悬浮于培养基108中，接种到同样如前所述准备的涂布有I型胶原的NP片中(图1的(e))。培养基使用了含有包含血清(FCS)、胰岛素、地塞米松的培养基(以下记载为培养基(10％FCS+))的Williams E培养基，但培养基并没有特别限定。本实施例中，特别使用含有10％FCS、8.6nM胰岛素、255nM地塞米松的Williams E培养基。接种后，使用CO2孵育器在5％CO2、37℃的条件下开始培养，经过18小时以上后，进行首次培养基更换，以后每24小时更换培养基。接种后第
18小时以后的培养中使用的培养基没有特别限定，本实施例中使用从培养基(10％FCS+)中除去FCS后的培养基(以下记载为培养基(FCS-))。此外，肝细胞的接种密度在本实施例
5
中为1×10 个细胞/ml，但并不限定于该浓度。在此，培养中使用的NP片为如下四种：(1)头顶部的直径为0.18μm的NP片(以下记载为0.18NP)、(2)头顶部的直径为0.5μm的NP片(以下记载为0.5NP)、(3)头顶部的直径为1.0μm的NP片(以下记载为1.0NP)、(4)头顶部的直径为2.0μm的NP片(以下记载为2.0NP)。此外，添加到NP片中的I型胶原的
6 6 8 8
浓度为如下四种：(1)1/10％(W/V)以上、(2)1/10％(W/V)、(3)1/10％(W/V)、(4)1/10％(W/V)以下。在共计16种条件下进行培养。根据条件，也有能够形成球形体110的(图1的(f))。16种条件下培养的结果如图2所示，由此确定形成球形体的最适条件。由此可知，
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使用任意一种NP片时，I型胶原浓度为1/10％(W/V)以上且1/10％(W/V)以下为最优选的条件。
18小时以后的培养中使用的培养基没有特别限定，本实施例中使用从培养基(10％FCS+)中除去FCS后的培养基(以下记载为培养基(FCS-))。此外，肝细胞的接种密度在本实施例
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中为1×10 个细胞/ml，但并不限定于该浓度。在此，培养中使用的NP片为如下四种：(1)头顶部的直径为0.18μm的NP片(以下记载为0.18NP)、(2)头顶部的直径为0.5μm的NP片(以下记载为0.5NP)、(3)头顶部的直径为1.0μm的NP片(以下记载为1.0NP)、(4)头顶部的直径为2.0μm的NP片(以下记载为2.0NP)。此外，添加到NP片中的I型胶原的
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浓度为如下四种：(1)1/10％(W/V)以上、(2)1/10％(W/V)、(3)1/10％(W/V)、(4)1/10％(W/V)以下。在共计16种条件下进行培养。根据条件，也有能够形成球形体110的(图1的(f))。16种条件下培养的结果如图2所示，由此确定形成球形体的最适条件。由此可知，
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使用任意一种NP片时，I型胶原浓度为1/10％(W/V)以上且1/10％(W/V)以下为最优选的条件。
[0066] 实施例2
[0067] 实施例2中对实施例1中说明的NP肝细胞球形体的有效性进行评价。以下按照评价程序和评价结果的顺序对各评价法进行说明。
[0068] <免疫染色>
[0069] 为表明形成的肝细胞球形体的结构为接近活体内的肝脏组织的结构，而进行免疫染色。关注的分子为细胞-细胞间粘附蛋白质中的E-钙粘蛋白和作为细胞骨架蛋白质的肌动蛋白。E-钙粘蛋白是指担负着细胞-细胞间的粘附结合的膜蛋白质之一，是细胞间相互结合并进而构建更高级的组织所必需的蛋白质。此外，肌动蛋白是细胞之间粘附并进而形成高级结构时对细胞提供物理支持的细胞骨架蛋白质。这两种蛋白质的表达是用于表示组织已经成为组织所必须的指标。
[0070] 免疫染色的程序如下所示。首先，按照实施例1，使用涂布有I型胶原的NP片形成肝细胞球形体(以下记载为NP常规培养)。本实施例中，根据实施例1的结果，在目标骨架蛋白质即肌动蛋白和细胞-细胞间粘附蛋白即E-钙粘蛋白尤其发达、已构建接近球形的6
球形体的2.0NP上涂布1/10％(W/V)的I型胶原而形成球形体，但并非限定于该条件。形成的球形体用PBS(-)洗涤3次，固定。本实施例中，使用4％多聚甲醛固定15小时，但并非限定于该方法。用PBS(-)洗涤3次，在非离子表面活性剂中浸渍5分钟以破坏细胞膜。本实施例中，使用了0.5％TritonX，但并非限定于该物质。用PBS(-)洗涤3次后，进行封闭。
本实施例中，在1％FBS(fetal bovine serum)中浸渍30分钟而进行封闭，但并非限定于该方法。然后，用一抗进行作用。本实施例中，使用了兔抗人E-钙粘蛋白单克隆抗体进行作用，但免疫动物种属并非限定于兔，例如可以为小鼠，也可以为山羊。此外，关于一抗的作用温度和时间，本实施例中是在4℃进行一昼夜，但并非限定于此。接着，用含有非离子表面活性剂的PBS(-)洗涤后，再仅用PBS(-)洗涤。本实施例中，使用了0.05％吐温20/PBS(-)，但并非限定于该物质。然后，用带荧光染料的二抗进行作用。本实施例中，用带FITC的抗兔IgG抗体进行作用，但免疫动物种属并非限定于兔，例如可以为小鼠，也可以为山羊。此外，关于作用温度和时间，本实施例中是在37℃进行1小时，但并非限定于该方法。接着，使用同样的方法洗涤。接着对肌动蛋白纤维进行染色。本实施例中，用带罗丹明的鬼笔环肽在室温下作用5分钟，但作用时间并非限定于此。用PBS(-)洗涤1次，进行核染色。本实施例中，用Hoechst33342在室温下作用5分钟，但并非限定于该方法。最后用Milli-Q水洗涤，封入。
球形体的2.0NP上涂布1/10％(W/V)的I型胶原而形成球形体，但并非限定于该条件。形成的球形体用PBS(-)洗涤3次，固定。本实施例中，使用4％多聚甲醛固定15小时，但并非限定于该方法。用PBS(-)洗涤3次，在非离子表面活性剂中浸渍5分钟以破坏细胞膜。本实施例中，使用了0.5％TritonX，但并非限定于该物质。用PBS(-)洗涤3次后，进行封闭。
本实施例中，在1％FBS(fetal bovine serum)中浸渍30分钟而进行封闭，但并非限定于该方法。然后，用一抗进行作用。本实施例中，使用了兔抗人E-钙粘蛋白单克隆抗体进行作用，但免疫动物种属并非限定于兔，例如可以为小鼠，也可以为山羊。此外，关于一抗的作用温度和时间，本实施例中是在4℃进行一昼夜，但并非限定于此。接着，用含有非离子表面活性剂的PBS(-)洗涤后，再仅用PBS(-)洗涤。本实施例中，使用了0.05％吐温20/PBS(-)，但并非限定于该物质。然后，用带荧光染料的二抗进行作用。本实施例中，用带FITC的抗兔IgG抗体进行作用，但免疫动物种属并非限定于兔，例如可以为小鼠，也可以为山羊。此外，关于作用温度和时间，本实施例中是在37℃进行1小时，但并非限定于该方法。接着，使用同样的方法洗涤。接着对肌动蛋白纤维进行染色。本实施例中，用带罗丹明的鬼笔环肽在室温下作用5分钟，但作用时间并非限定于此。用PBS(-)洗涤1次，进行核染色。本实施例中，用Hoechst33342在室温下作用5分钟，但并非限定于该方法。最后用Milli-Q水洗涤，封入。
[0071] 为了比较，在此对通过现有的平面培养而获得的肝细胞进行免疫染色，对E-钙粘蛋白和肌动蛋白的表达量进行检验。现有的平面培养如下进行。在市售的胶原包被培养皿5
中，将肝细胞以1×10 个细胞/ml的密度悬浮在前述培养基中进行接种。接种后经过18小时以上后进行首次培养基更换，以后每24小时更换培养基。接种后第18小时以后的培养中使用的培养基如前所述(以下记载为平面培养)。对通过这样的平面培养而获得的细胞，通过前述方法进行免疫染色。
中，将肝细胞以1×10 个细胞/ml的密度悬浮在前述培养基中进行接种。接种后经过18小时以上后进行首次培养基更换，以后每24小时更换培养基。接种后第18小时以后的培养中使用的培养基如前所述(以下记载为平面培养)。对通过这样的平面培养而获得的细胞，通过前述方法进行免疫染色。
[0072] 同样，为了比较，对冷冻肝脏组织切片也进行免疫染色，对E-钙粘蛋白和肌动蛋白的表达量进行检验。冷冻切片的制备方法如下所述。将大鼠剖开腹部后直至通过预灌流液脱除血液为止，均按照实施例1进行。然后，切取肝脏的一部分，加入包埋剂，用-80℃的冷冻装置进行冷冻。使用冷冻样品通过冷冻切片机制作切片。对这样获得的冷冻切片按照前述方法进行免疫染色。
[0073] 如上制备的NP球形体、平面培养、冷冻切片的3种免疫染色结果如图3所示。可知，与肝脏切片(图3的(a))同样地，在肝细胞球形体(图3的(b))中，E-钙粘蛋白在细胞-细胞间浓缩。此外可知，与E-钙粘蛋白同样地，肌动蛋白在肝脏切片(图3的(d))和球形体(图3的(e))中均局部存在于细胞膜的一部分中，呈支持细胞膜的状态。与此相对，在现有的平面培养中，在活体的肝脏组织中表达的E-钙粘蛋白显示为没有表达(图3的(c))、肌动蛋白应力纤维呈拉伸状态(图3的(f))，可知与本来的结构是不同的。从而，与现有的平面培养相比，利用NP片进行的球形体培养从结构方面来看能够更接近活体的组织。综合上述，使用NP的培养中，肌动蛋白应力纤维不拉伸、检测到了E-钙粘蛋白的表达，由此可认为由于细胞-细胞间的粘附超过了细胞-基材间的粘附，因此已形成了细胞-细胞间的粘附较发达的三维立体结构。
[0074] <氨代谢能力测定>
[0075] 为了检验具有接近活体的结构的球形体的功能，测定了肝脏的重要功能即氨代谢能力。在活体内中，氨主要在肠内、肾脏内生成，随血流到达肝脏，肝脏利用尿素循环将氨转变成尿素。为测定肝脏的这种氨代谢能力，使用市售的专用试剂盒。首先，按照前述方法使用2.0NP片进行NP常规培养，从而形成肝细胞球形体。为了比较，按照前述平面培养法进行培养。并在培养开始72小时后更换为氨培养基，对培养基的一部分进行取样。更换培养基后培养24小时后，同样对培养基进行取样。对各取样液，按照试剂盒的说明制备样品。测定630nm的吸光度，算出该24小时的氨减少(代谢)量。此外，预先使用氨浓度已知的样品求出标准曲线。另一方面，取样时刻的细胞数的测定是对细胞用SDS增溶后添加Hoechst33258并测定荧光强度而求得的(激发波长355nm，荧光波长460nm)。本实施例中采用了市售的试剂盒，但也可以是其它任意方法。
[0076] 由这样对在NP片上再构建的三维结构即球形体的氨代谢能力进行测定的结果可知，与现有的平面培养相比，NP球形体优势明显、氨代谢活跃进行(图4)。可认为，采取接近肝细胞本来的结构，并恢复活体内肝细胞本来保持的极性，这些都与功能的提高有关。
[0077] <胆小管排泄的研究>
[0078] 为了检验通过NP形成的球形体的肝功能，对肝脏的重要功能之一的向胆小管中的排泄能力进行了测定。本实施例中，投与局部存在于形成胆小管的细胞膜上的蛋白质即MRP2的基质即5-羧基-2’，7’-二氯荧光黄二乙酸酯(CDFDA)，并检验其是否排泄到胆管中。如果MRP2具有活性则其会以5-羧基-2’，7’-二氯荧光黄(CDF)形式被排泄到胆管中。
[0079] 测定的方法如下所述。首先，按照前述方法使用2.0NP片进行NP常规培养，从而形成肝细胞球形体。为了比较，在胆管排泄的定量计测中采用公知的夹层培养(以下记载5
为SW培养)。SW培养如下所述。在市售的胶原包被培养皿中，将肝细胞以1×10 个细胞/ml的密度悬浮在前述培养基中进行接种。开始培养，4小时后进行首次培养基更换，24小时后更换成含有生物学基质的培养基(以下记载为生物学基质培养基)，以后每24小时按照前述方法更换培养基而进行培养(模式图为图5的(k))。并在培养开始的24、48、72、96小
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时后进行测定。在各个时间用Hank’s液(含Ca 、Mg )洗涤细胞1次，更换成含有CDFDA
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的培养基后，在37℃孵育20分钟。用Hank’s液(含Ca 、Mg )洗涤3次，用荧光显微镜观察。本测定并非限定于该条件。此外，在此例示出使用Matrigel(注册商标)等作为生物学基质的例子，但可知并非限定于此。
为SW培养)。SW培养如下所述。在市售的胶原包被培养皿中，将肝细胞以1×10 个细胞/ml的密度悬浮在前述培养基中进行接种。开始培养，4小时后进行首次培养基更换，24小时后更换成含有生物学基质的培养基(以下记载为生物学基质培养基)，以后每24小时按照前述方法更换培养基而进行培养(模式图为图5的(k))。并在培养开始的24、48、72、96小
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时后进行测定。在各个时间用Hank’s液(含Ca 、Mg )洗涤细胞1次，更换成含有CDFDA
2+ 2+
的培养基后，在37℃孵育20分钟。用Hank’s液(含Ca 、Mg )洗涤3次，用荧光显微镜观察。本测定并非限定于该条件。此外，在此例示出使用Matrigel(注册商标)等作为生物学基质的例子，但可知并非限定于此。
[0080] 测定的结果是，在24小时的时刻观察到被摄入到NP球形体、SW培养的CDFDA呈蓄积在细胞内的状态(图5的(a)、(f))。可认为，这是由于接种后24小时尚未形成胆管、或者即使已经形成但具有功能的MRP2尚未在胆管部位表达。然后，在48小时时，蓄积在细胞内和胆管两者中(图5的(b)、(g))，72小时(图5的(c)、(h))、96小时(图5的(d)、(e)、(i)、(j))时在细胞内已无残留，被排出到胆管中。可认为，这是由于随着时间的经过而逐渐形成胆管，CDFDA以CDF形式被排出道胆管中。由该结果可知，与SW法同样地，在NP球形体中也形成了胆管，具有功能的MRP2局部存在于胆管中。
[0081] <实时PCR>
[0082] 为了检验所形成的球形体维持着类似于肝脏组织的高级结构、或保持着肝脏的特异性功能，使用实时PCR法进行定量性基因表达解析。测定刚采集后的肝细胞的靶标基因(表1)的表达量，算出设该值为1时的各培养条件下的表达量，进行表达量的比较。
[0083] 表1
[0084]
[0085] 对3种培养条件之间进行比较(图6(b))。第一个是在前述2.0NP上的NP常规培养(图6(b)，2.0NP)。第二个的条件是在2.0NP上接种肝细胞后第48小时层叠生物学基质(以下记载为NP生物学基质层叠培养。图6(b)，2.0NP+M)。生物学基质为自细胞外基质提取的成分，一直以来作为提供更接近活体环境的试剂被用于细胞生物学实验中。此外，在前述的SW法中通过使用生物学基质也实现了肝功能的提高。由上述可认为，在NP球形体中用生物学基质进行作用也能期待更好的效果。同时，通过利用现有细胞系进行研究，获知球形体过大的话(直径50μm以上)在培养基成分的渗透和氧的供给方面是不利的，会从球形体内部发生坏死，因此认为使球形体的直径维持为50μm以下的状态对于提高球形体的功能而言也是重要因素。可认为，以上预备研究的结果是：能够通过层叠生物学基质而期待高功能化，进而能够控制球形体的大小，因此决定采用该方法。生物学基质层叠培养的-6具体方法如下所述。在涂布有10 ％(W/V)的I型胶原的NP片上接种肝细胞。使用培养基(10％FCS+)开始培养，18小时后进行首次培养基更换，24小时后更换成无血清培养基(培养基(10％FCS-))。进而，24小时后更换成生物学基质培养基，以后每24小时用培养基(10％FCS-)进行培养基更换，培养96小时。另外，第3个为SW培养(图6(b)，SW)。
[0086] 实验方案如图6(b)所示。对这样获得的NP常规培养、NP生物学基质层叠培养、SW培养，在培养开始24、48、72、96小时后，通过胰蛋白酶处理回收球形体和细胞，在1500rpm、4℃离心5分钟。使用专用的试剂盒提取总RNA。对1.0μg的总RNA进行逆转录反应，获得cDNA样品。使用获得的cDNA进行实时PCR。采用TBP作为内标基因，采用MRP2作为靶标基因，将以刚采集后的肝细胞的表达量为1时的、各条件的相对值作为表达量。解析手法使用的是ΔΔCt法(使用在1个循环的检测差异下扩增产物具有2倍量的差异这一理论。由于不需要制作标准曲线，因此具有能够处理多样品的优点。也称为比较Ct法。)，但也可以使用标准曲线法。
[0087] 实验的结果表明，肝脏特异性转运蛋白MRP2在在NP球形体上层叠生物学基质即2.0NP+M的条件下，与不层叠生物学基质的2.0NP、SW培养相比表达更高(图5的(a))。这并非仅仅是简单层叠生物学基质的效果，暗示了肝细胞预先形成球形体的重要性。
[0088] 实施例3
[0089] 以下说明的是能够实现实施例1所述的一系列培养步骤的自动化的培养装置构成、和自动培养步骤。自动培养装置整体构成图如图7所示，自动培养装置中的减压部和培养部的细节如图8所示，培养自动化流程图如图9所示。在输入部输入条件，并使其显示在显示部。输入的条件为I型胶原注入部的I型胶原注入量、减压部的减压腔内压力、减压时间、液体注入·抽吸部的胶原液抽吸量、注入洗涤液量、洗涤次数、细胞悬浮液注入部的细胞液注入量、培养部的培养部内温度、培养部内CO2浓度、更换培养基前的培养时间(培养基更换周期)、培养基更换部的培养上清抽吸量、更换用培养基、更换用培养基温度、培养基更换量、和用于控制培养部和培养基更换部两者的总培养时间等。显示部中显示所输入的上述信息。
[0090] 此外，可通过将上述输入的条件中的多个条件预先组合存储于存储器中，从而使输入简化。也可以预先存储多种条件，通过显示部选择在哪个条件下执行步骤。
[0091] 输入的信息被传送到控制部并收纳在存储器等中。基于输入的信息从存储器发出一系列命令，从而开始培养步骤。另外，培养步骤的动作控制被控制部所搭载的中央处理装置统一管理。所有步骤在洁净室内进行。
[0094] 带有NP片的培养皿首先被送入I型胶原注入部，从投入·取出口而进入其中。I型胶原注入部具备I型胶原、将I型胶原注入培养皿的喷嘴。I型胶原注入量可以预先存储在存储器中，但优选该量为掩藏NP片突起前端部程度的量。
[0095] 注入I型胶原后的培养皿从投入·取出口而取出至外部，接着被送至减压部(图8(A)-1、2。图8(A)-1是从上部观察减压部的图，图8(B)-2是从横向观察减压部的图。)。
培养皿从减压部投入·取出口(112)进入减压腔(111)，关门。减压动作控制由控制部来进行。具体而言，将培养皿送入腔(111)后，减压腔和减压泵(115)的连接部(114)所带的开关阀(113)打开，减压至0.04大气压以下。进行10分钟以上减压后，关闭开关阀(113)，待恢复至大气压程度时减压操作结束。该减压泵和/或门、阀的开关动作在减压操作结束后，从减压部投入·取出口(112)取出并送入洗涤部。洗涤部具备在前端保持有抽吸喷嘴的抽吸装置、和在前端保持有注入喷嘴的洗涤液。洗涤液没有特别限定，本实施例中使用PBS(-)。此外，各喷嘴的前端部具有能够更换的装置，以防止污染。通过洗涤部进行I型胶原液的抽吸、洗涤液的注入后，将洗涤液的抽吸和注入重复规定次数。注入量和洗涤次数预先存储于存储器中。
培养皿从减压部投入·取出口(112)进入减压腔(111)，关门。减压动作控制由控制部来进行。具体而言，将培养皿送入腔(111)后，减压腔和减压泵(115)的连接部(114)所带的开关阀(113)打开，减压至0.04大气压以下。进行10分钟以上减压后，关闭开关阀(113)，待恢复至大气压程度时减压操作结束。该减压泵和/或门、阀的开关动作在减压操作结束后，从减压部投入·取出口(112)取出并送入洗涤部。洗涤部具备在前端保持有抽吸喷嘴的抽吸装置、和在前端保持有注入喷嘴的洗涤液。洗涤液没有特别限定，本实施例中使用PBS(-)。此外，各喷嘴的前端部具有能够更换的装置，以防止污染。通过洗涤部进行I型胶原液的抽吸、洗涤液的注入后，将洗涤液的抽吸和注入重复规定次数。注入量和洗涤次数预先存储于存储器中。
[0096] 洗涤操作结束后，培养皿被送入细胞悬浮液注入部。细胞悬浮液注入部中具备细胞悬浮液、和将细胞悬浮液注入培养皿的喷嘴。注入预先存储于存储器中的规定量。此外，细胞悬浮液注入部内，采用载台能够上下左右振动的构成，以使得注入的细胞悬浮液能够均一地接种到培养皿中。此外，细胞悬浮液注入部配有隔热材料，能够通过控制部控制温度。
[0097] 注入细胞悬浮液后的培养皿(以下记载为培养细胞)接着被送入培养部(图8(B)-1、2。图8(B)-1为从上部观察减压部的图，图8(B)-2为从横向观察减压部的图。)。
培养部配有液化二氧化碳罐(117)和二氧化碳监测器，以使孵育器(116)内的CO2浓度保持恒定。此外，为了使孵育器内的湿度保持恒定而配有去离子水(118)。通过控制部能够进行温度控制和时间管理。被送入培养部的培养细胞从投入口(119)被送入孵育器内，经由内部投入口(121)被送入上段的保管室(123)。培养部中通过将孵育器内部分成2个区域，从而能够培养大量的培养细胞，并将CO2浓度的变动抑制为较低。培养了规定时间后的培养细胞经由内部取出口(122)、取出口(120)被送入培养基更换部。
培养部配有液化二氧化碳罐(117)和二氧化碳监测器，以使孵育器(116)内的CO2浓度保持恒定。此外，为了使孵育器内的湿度保持恒定而配有去离子水(118)。通过控制部能够进行温度控制和时间管理。被送入培养部的培养细胞从投入口(119)被送入孵育器内，经由内部投入口(121)被送入上段的保管室(123)。培养部中通过将孵育器内部分成2个区域，从而能够培养大量的培养细胞，并将CO2浓度的变动抑制为较低。培养了规定时间后的培养细胞经由内部取出口(122)、取出口(120)被送入培养基更换部。
[0098] 在培养基交换部具备在前端保持有抽吸喷嘴的抽吸装置、和在前端保持有注入喷嘴的培养基。培养基更换部具有若干个温度受控制部控制的小室，培养细胞根据目的被送入规定温度的培养基更换室更换培养基。各喷嘴的前端部具有能够更换的装置，以防止污染。完成培养基更换的培养细胞再次被送入培养部进行培养。
[0099] 分别进行规定时间、规定次数的培养和培养基更换，能够获得期望的球形体。
[0100] 工业上的应用性
[0101] 迄今为止，细胞培养以2维平面上的单层培养为主流，但活体内环境为三维的，模拟该环境的细胞培养体系和具有三维结构的细胞群的形成是必不可少的。本发明通过限定NP片上涂布的I型胶原的浓度，不仅容易地形成这样的具有三维结构的细胞块即球形体，而且利用本发明而形成的球形体为保持了胆管排泄能力的、表现出接近活体肝脏组织功能的球形体，在药物开发筛选领域的利用价值很高。
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