本发明鉴定了在肝细胞中myc/雌激素受体融合蛋白的表达可以使 肝细胞有条件地永生化。当肝细胞在存在雌激素受体配体的条件下培养 时,它是永生化的。从肝细胞中除去该配体就去掉了细胞的永生能力, 细胞则显示“正常的”特征,并可望从肝脏原位肝细胞中表达肝细胞的 标志物。
本文所使用的术语“肝细胞”指的是可由肝脏获得的任何上皮细胞, 它可以实行由肝脏进行的一种或多种功能。来源于任何物种的肝细胞都 在本发明的范围之内,然而优选的肝细胞为哺乳动物的肝细胞,最优选 地为人的肝细胞。可以使用胎儿或成人的肝细胞,也可以使用在体外由 前
体细胞分化而来的肝细胞,例如由胚胎干细胞或多能干细胞分化而来 的肝细胞(参见US 6506574)。
根据本发明的肝细胞保留了“正常的”肝细胞的特征性标志物。有 七类肝细胞的mRNA标志物,表1列出了这七类标志物及每一类的实例。 在本
专利申请详述的研究中,将这些标志物种的五种用来表征人类胎儿 肝脏的克隆,它们分别为清蛋白、甲胎蛋白、细胞
角蛋白-18、cyp 3A4 和cyp3A7。
本文中使用的术语“永生”指的是有能力进行扩展增殖的细胞。本 发明的肝细胞当在存在例如4-OHT的雌激素受体配体的条件下生长时 是“永生的”。正如本领域技术人员所理解的那样,由一个细胞或一个 细胞群落在体外扩展成的细胞培养物被称为“细胞系”。它与原代细胞 不同,原代细胞仅能分裂有限的次数,通常少于10-20次分裂,然后 细胞就会衰老并最终死亡。本文中使用的术语“有条件地永生”指的是 细胞在某一特定的生长条件下为分裂中的未成熟细胞,而在其他条件下 为完全成熟的细胞。根据本发明,负责永生化细胞的环境条件为雌激素 受体配体的存在。
可以持续的永生并可被雌激素受体配体永生化的肝细胞的特征是 该肝细胞中存在myc/雌激素受体融合蛋白。不希望拘囿于理论,似乎 该配体(例如4-OHT)激活了雌激素受体。雌激素受体的激活使癌蛋白 myc二聚体化并被转运至细胞核内,在核内它起转录因子的作用,启动 允许增殖发生的基因的表达。在没有配体时,含有myc癌蛋白的融合蛋 白仍然被表达,但是它停留在
细胞质中,而不会发生进一步的增殖。因 此可向培养基中加入配体以使肝细胞增殖(永生化),还可以除去配体 以使细胞表现为正常的非增殖肝细胞。
本发明的肝细胞由于myc/雌激素受体融合蛋白的表达而有条件地 永生。本文中使用的术语“融合蛋白”指包括天然状态下分开表达的两 种蛋白或肽序列的重组蛋白,它以单多肽链的形式表达。
融合蛋白可包括任何myc蛋白和任何雌激素受体或这些蛋白的任 何片段,只要这些片段分别保留了被雌激素受体配体激活的能力和激活 转录导致细胞增殖的能力即可。优选地,myc蛋白为c-myc。优选地, 雌激素受体被突变,使它与17β-雌二醇的高亲和结合受阻而不影响它 对配体4-OHT的高亲和结合。这种突变可为缺失、置换或插入一个或多 个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中融合蛋白由人类c-myc基因与 小鼠雌激素受体相融合而组成。更优选地,融合蛋白含有如本文中SEQ ID NO.2所定义的氨基酸序列。如前所述,SEQ ID NO.2的任何同系物 或功能性片段都在本发明的范围之内。
如本文所述,术语“同系物”指两种或多种生物多聚体之间的相似 性或同一性,所述生物多聚体包括DNA、RNA和
蛋白质序列。序列同一 性的概念为本领域所熟知,指的是两个序列之间同一性的程度。相似性 的概念也同样为本领域所熟知,在考虑两个序列之间的相像程度时要包 括对结构和功能影响不大的两个序列之间的保守性差异。例如谷氨酸可 被天冬氨酸置换而对蛋白质结构或功能影响不大,这两个残基就是“相 似的”。相反地,天冬氨酸残基与苯丙氨酸残基之间就没有相似性。本 发明范围内包括的同系物必须与本文定义的小鼠雌激素受体和人类 c-myc序列具有高度的相似性。同一性和相似性可通过任何熟知的
算法 进行计算,所述算法例如Needleman-Wunsch、Smith-Waterman、BLAST 或FASTA。同源性可在核酸水平或氨基酸水平上测定。优选地,本发明 范围内的同系物应在核酸水平或氨基酸水平上具有至少50%、更优选地 至少60%、再更优选地大于70%、最优选地大于80%、例如90%的同源性, 所述同源性是使用BLAST程序在默认条件下计算的。
本发明的肝细胞表达c-myc/雌激素受体融合蛋白。编码该融合蛋 白的多核苷酸分子在本文中被称为“融合多核苷酸”,它可以以任何形 式存在于肝细胞中,例如为以质粒形式存在于肝细胞中或整合至宿主的 基因组中。
优选地,通过将融合多核苷酸引入至肝细胞基因组中而使得肝细胞 有条件地永生化。将异源多核苷酸整合至宿主基因组中的方法为本领域 所熟知,可以使用任何合适的方法。优选地,使用反转录
病毒感染来将 融合多核苷酸整合至肝细胞基因组。用于将遗传物质整合至外源基因组 中的反转录病毒载体为本领域所熟知,可以使用任何这样的载体。优选 地,载体为兼向性反转录病毒,最优选地,载体为pLNCX(BD Biosciences Clontech)。
可在任何合适的产生病毒的细胞中将载体与融合多核苷酸装配在 一起。优选地,病毒由来源于TEFLY病毒生产细胞系的Fly-CO42细胞 产生。
pLNCX载体含有驱动新霉素抗性基因的LTR启动子。在筛选过程中 在培养基中使用新霉素(也被称为遗传霉素和G418)以使得仅有表达 新霉素抗性基因的细胞存活下来。可在未感染的靶细胞上进行新霉素的 滴定以确认消除未感染细胞所需要的浓度。可以使用任何抗生素抗性基 因来帮助筛选感染细胞,但是抗生素抗性并不是必须的。
可以使用任何启动子来启动融合多核苷酸的表达。优选地,该启动 子与启动任何抗生素抗性基因的表达的启动子不相同。优选地,用cmv 启动子来驱动融合多核苷酸的表达。
合适的融合多核苷酸的实例为本文的SEQ ID NO.1所定义的 c-mycERTam,它包括与小鼠雌激素受体相融合的人类c-myc基因,该小 鼠雌激素受体被突变以消除它与17β-雌二醇的高亲和结合但不影响它 对合成药物4-OHT的高亲和结合。可在蛋白质中产生这种功能改变的对 多核苷酸的任何突变,包括插入、置换和缺失,都在本发明的范围之内。 优选地,突变为点突变。在一个优选的实施方案中,通过引入点突变将 681位氨基酸的野生型甘氨酸变为精氨酸。c-mycERTam的同系物和功能 性片段也在本发明的范围内。
对本领域技术人员显而易见的是,为将反转录病毒载体整合至肝细 胞基因组中,肝细胞应处于增值过程中。为使整合最大化,应在肝细胞 高速增值时加入病毒13。为研究增殖速度,优选的对增殖标志物Ki67 进行
染色,Ki67是一种在细胞周期的G1后期、S期、M期和G2期表达 但在GO期不表达的核蛋白14。为进一步提高感染的成功率,可在感染 过程中向培养基中加入例如溴化己二甲铵(也被称为聚凝胺)的促进剂。 它在高浓度时对一些细胞有毒性,但是它已经成功地用于对人类胎儿肝 细胞的感染15-17。
当对根据本发明的肝细胞进行研究时,优选地在任何研究之前除去 所有的4-OHT,这是因为4-OHT可产生对细胞色素p450酶CYP3A4的抑 制作用,还可能与其他化学物质反应。
根据本发明的肝细胞的用途包括涉及例如药物或毒物的化学物质 对肝脏细胞的影响的体外评估的任何方法,包括但不限于:内生物和外 源物的代谢研究、肝脏毒性和肝癌引发性(hepatocarcinogenicity) 的研究、肝脏相关的人类限制性疾病例如
肝炎或疟疾的研究和心血管研 究。
该细胞专
门可用于ADME/Tox测试中,以检测药物候选物是否适用 于体内,具体而言是评估药物候选物对肝细胞(以及肝脏)的影响并测 定其毒性。如本领域技术人员所理解的那样,在ADME/Tox测试中使用 了多种技术。这些技术通常包括在体外使肝细胞与潜在的药物化合物相 接触和测量肝细胞的反应。这种反应可以以各种方式测量,包括但不限 于测量生长和增殖速度、表达特性和酶活性分析。可以进行潜在药物化 合物的滴定,以评估是否存在这样一种剂量使得该化合物在该剂量时对 肝细胞有毒性。基于这类测试的结果确定该化合物用作药物的适用性。
在一个优选的实施方案中,培养条件可使完全分化的代谢表达标志 物的长期表达最优化。这类培养方法为本领域已知,包括三维培养聚集 和胶原夹心培养,这在例如Richert et al.,(2002)28中有述。
特别地,可以预计该细胞可用于高通量筛选。
适用的高通量筛选分析公开于下列文献:Waring et al., (2001)21、Barton et al.,(2002)22、Hamadeh et al.,(2002)23、de Longueville et al.,(2003)24、Adam et al.,(2001)25、Seow et al., (2001)26和Anderson(1991)27,上述每一篇文献的内容都以援引的方式纳入 本文。
在根据本发明的肝细胞中使用4-OHT作为增殖
信号的优点在于:这 种合成化学物质在正常人体中并不存在,这使得根据本发明的肝细胞可 被用作药物。具体而言,肝细胞可在移植疗法中被用于治疗性细胞系18。 已经认识到肝细胞移植是治疗肝脏疾病的一种选择,将健康的肝细胞移 植到患病的或被损坏的肝脏中可以替代被疾病损坏的细胞。细胞移植看 起来优于器官移植。任何损害肝功能的疾病都可以通过移植根据本发明 的肝细胞来治疗,所述疾病包括但不限于:癌症、肝硬化、所有类型的 肝炎和由于药物或
乙醇过量导致的损害。涉及肝细胞的兽医治疗也在本 发明的范围之内。
根据本发明的肝细胞也可以用于肝脏辅助设备(LAD)中,肝脏辅 助设备也称为
生物人工肝脏设备。LAD可以在例如急性肝功能衰竭时执 行肝脏的功能。LAD可以置于体外而进行
透析作用,或者可被移植至患 者体内。LAD的主要用途是在患者急性肝功能衰竭后立刻对患者进行支 持,但是也可以在移植后用于支持患者直至移植的肝脏完全发挥功能。 LAD通常包括至少一个装有代谢活性肝细胞的容器。然后患者的血液与 肝细胞相接触,肝细胞就像肝脏那样对血液进行处理。
通过下面的非限制性
实施例进一步描述本发明。
实施例1
材料和方法
除另外指明的之外,所有化学物质均购自Sigma公司。
组织培养
所有的细胞均在Millennium
培养箱(Jencon)中在37℃、5%CO2 的条件下生长。细胞在常规基础上培养,每周更换三次培养基。当达到 90%会合度时进行传代。
培养基
在组织培养过程中使用了八种培养基。人类胎儿肝脏细胞和克隆在 所有这些培养基上培养。将这些培养基使用1升的过滤单元(Nalgene) 进行过滤灭菌,并在使用前预热至37℃。这八种培养基分别被称为培 养基A、B、C、D、E、F、G和H,分别具有下列的组成:
培养基A:无精氨酸Williams E标准培养基(Gibco),2.2g/L的
碳酸氢钠、10%的透析胎牛血清(dFBS)(Gibco 26400-044)、2mM的L- 谷氨酰胺、100nM的胰岛素、100 IU/ml的青霉素-
链霉素(Gibco)、0.4mM 的L-
鸟氨酸、5.5μM的氢化可的松、20ng/ml的表皮生长因子(EGF)。
培养基B:Dulbecco改进eagle培养基(DMEM),10%的胎牛血清(FBS) (HyClone)、50mg/ml的艮他霉素、2mM的L-谷氨酸、20ng/ml的EGF。
培养基C:Williams E标准培养基(Gibco)∶DMEM(1∶1),1∶50 的不含维生素A的B27添加混合物(50×)(Gibco)、10%的FBS、2mM 的L-谷氨酰胺、100IU/ml的青霉素-链霉素、5.5μM的氢化可的松、 100nM的胰岛素、10mM的烟酰胺、20ng/ml的EGF、10ng/ml的肝细胞 生长因子(HGF)(Peprotech)。
培养基D:Williams E标准培养基(Gibco)∶DMEM(1∶1),10%的 FBS、2mM的L-谷氨酰胺、100 IU/ml的青霉素-链霉素。
培养基E:Williams E标准培养基(Gibco)∶DMEM(1∶1),4%的 FBS、2mM的L-谷氨酰胺、100IU/ml的青霉素-链霉素。
培养基F:DMEM F12,0.03%的人血清清蛋白、100mg/ml的人类转 铁蛋白、16.2mg/ml的腐胺
盐酸盐(putrescine dihydrochlorid)、 5mg/ml的重组人胰岛素、60ng/ml的孕酮、2mM的L-谷氨酰胺、40ng/ml 的亚硒酸钠(硒)、10单位/ml的肝素钠、40ng/ml的皮质酮、50mg/ml 的艮他霉素、10mM的烟酰胺、20ng/ml的EGF、10ng/ml的HGF。
培养基G:Williams E标准培养基(Gibco)∶DMEM(1∶1),1∶50 的不含维生素A的B27添加混合物(50×)(Gibco)、10%的FBS、2mM 的L-谷氨酰胺、100IU/ml的青霉素-链霉素、5.5μM的氢化可的松、 100nM的胰岛素。
培养基H:DMEM,10%的FBS、100nM的胰岛素、5.5μM的氢化可 的松、100IU/ml的青霉素-链霉素。
包被
使用经过包被和未经包被的组织培养塑料板。将牛皮1型胶原用无 菌瓶装水(Fresenius Kabi)稀释作为包被液,按6μg/cm2的浓度加入 进行包被。最后在使用前将塑料板用PBS洗涤。
肝脏
在终止妊娠后获得人类胎儿肝脏。在研究开始前获得了本地NHS伦 理委员会的批准。
解离
收到在湿
冰上的RPMI培养基中保存而运到的人类胎儿肝脏。将肝 脏用+4℃、pH7.2的无
钙离子HEPES液(Gibco)洗涤2次,用+4℃、 pH7.2、无钙离子、含有0.5mM的乙二醇-双(b-氨基乙醚)-N,N,N’,N’- 四乙酸(EGTA)的HEPES液洗涤1次。将肝脏用解剖刀切碎并置于37 ℃的酶溶液中20分钟,所述酶溶液为含有0.05%的胶原酶A(Roche)、 0.005%的DNA酶I(Roche)、0.0125%的透明质酸酶(hylaronidase) 和0.025%的分散酶II的无钙离子的Hank’s平衡盐溶液,并在溶液中 添加5mM的
氯化钙。将解离的肝脏用无菌尼龙筛过滤并收集于+4℃的培 养基B中。为除去一些较小的血细胞和其他细胞,将细胞在50g条件下 离心3次,每次弃去上清液。用
血细胞计数器进行细胞计数和存活率计 数。一些细胞可用免疫
磁性分离法进一步纯化。将细胞铺于早先用胶原 包被过的组织培养塑料板上,用培养基B培养4小时使其贴壁。然后将 细胞用37℃的不含氯化钙和氯化镁、pH7.4的
磷酸盐缓冲溶液(PBS) (Gibco)洗涤一次,以除去碎片和未贴壁的细胞,然后加入培养基A。
免疫磁性分离
免疫磁性分离是作为从解离的肝脏中筛选肝细胞和成肝细胞的正 向筛选步骤和作为用于除去非上皮细胞的进一步纯化步骤而进行的。将 大约107个来自解离的肝脏的细胞加入到装有450μl PBS和50μl抗 HEA-125(人类上皮
抗原)小鼠单克隆IgG1
抗体(Progen 61004)的 falcon管中,37℃培养30分钟。抗HEA-125抗体识别上皮细胞表面的 糖蛋白,抗体可标记包括肝细胞和成肝细胞在内的大多数种类的上皮细 胞,但似乎不标记非上皮组织19。然后将管在500g条件下离心2分钟 以沉淀细胞,弃去上清液以除去未结合的抗体。将细胞重悬于500μl+4 ℃的PBS和10μl的已用
绵羊抗小鼠IgG抗体包被的M-450
磁珠中 (Dynal),在+4℃培养30分钟使得磁珠附着到被抗HEA-125抗体标记 的细胞上。向falcon管中加入4.5ml PBS并将管置于
磁铁上 (polyATtract system 1000,Promega)+4℃放置3分钟。小心地弃去 上清液以除去未附着到磁珠上的细胞。这一步骤重复3次。最后将细胞 重悬于培养基B中并铺于被胶原预包被的组织培养塑料板上。
传代
每次传代细胞或将细胞从瓶中移出时都用37℃的PBS洗涤瓶子一 次。然后加入37℃的1×胰蛋白酶和
乙二胺四乙酸的
混合液(Bio Whittaker),10分钟后细胞从塑料上脱离。将等体积的培养基加至胰 蛋白酶和乙二胺四乙酸的混合液中以中和胰蛋白酶,在falcon管中以 500g离心细胞5分钟。吸出上清液,在1ml培养基中重悬细胞,并在 血细胞计数器上进行细胞计数。将细胞按1∶3的比例在新的瓶中传代。
冷冻/解冻
在冷冻细胞时,在可冷冻(cryo-safe)管(Nunc)中用900μl培 养基和100μl的cryosure-二甲亚砜(DMSO)(Quest biomedical)重 悬细胞沉淀。将细胞在“Mister Frosty”深低温保藏
冰箱(Nalgene) 中以-80℃放置24小时,其中
温度的下降大约为5℃/分钟。在24小时 后将细胞移至液氮中长期保存。在解冻细胞时,将细胞从液氮中取出置 于37℃水浴中直至解冻,然后将细胞与10ml的37℃培养基混合,并以 500g离心细胞5分钟。弃去上清液,并在新鲜培养基中通过轻轻抽吸 重悬沉淀,铺于新的瓶中。
收获病毒
将源于Fly-C042克隆的产生病毒的细胞在几个T-175瓶中培养至 会合。所用的培养基为DMEM glutamax(Gibco),添加10%的FBS、2mM 的L-谷氨酰胺和100IU/ml的青霉素-链霉素。当细胞会合时将瓶用PBS 洗涤三遍,向产生病毒的细胞中加入培养基A,每个T175瓶中加18ml, 培养8小时。收获培养基并用0.45μm的滤器(Sartorius)过滤并按 每个falcon管5ml培养基分成等份,在液氮中快速冷冻并储存于-80 ℃。
感染
在人类胎儿肝脏解离3天后吸出培养基,将细胞用PBS洗涤一次, 加入含有病毒和8μg/ml溴化己二甲胺的解冻的培养基,培养8小时。 在感染8小时后加入普通的培养基,然后在第二天重复感染一次。感染 在10cm培养皿中进行,细胞
密度的范围为200细胞/皿至100%会合。 在第二轮感染后将细胞传代至不同的培养基中,放置2天后开始筛选。 在感染后向所有培养基中都加入100nM的4-OHT。
筛选
使用新霉素以除去全部或多数的未感染细胞而保留感染的细胞,为 确定新霉素的使用浓度进行了新霉素的滴定。将从未暴露于永生化病毒 的来源于解离肝脏的人类胎儿肝脏细胞铺于6孔板上,并使其暴露于浓 度范围为0-900μg/ml的新霉素,培养12天,同时设三个平行样本。 按100、500和2000细胞/孔的细胞密度铺板,将细胞放置2天后加入 新霉素。使用TMS-F
显微镜(Nikon)通过观察研究细胞的生长和增殖。 基于新霉素滴定的结果,对暴露于永生化病毒的肝脏细胞使用浓度为 250μg/ml的新霉素,培养2周。
免疫细胞化学
使用免疫细胞化学对细胞进行早期评估。虽然不可
能量化表达水 平,但是使用免疫细胞化学方法的好处是,仅需要很少的细胞就能观察 在细胞群中有多少细胞表达了特异的标志物,还可以观察是否有些细胞 的表达水平比其他细胞高。这对于选择将哪些细胞和细胞系用于进行下 一步研究以及放弃哪些细胞/细胞系的过程是有很大价值的。
根据Sigma公司的
说明书,抗清蛋白抗体与牛血清清蛋白没有交叉 反应活性,交叉反应活性在培养基中可能导致与FBS的非特异性结合。 抗
成纤维细胞抗体与脯氨酰-4-羟化酶的b亚基和二硫异构酶 (disulphideisomerase)反应。使用了2种肝细胞瘤细胞系HepG2和 HuH7来优化染色,并在肝细胞标志物的实验中用作阳性对照,将人脑 细胞系CTX-08用作阴性对照。所有染色实验都在多孔板上进行并使用 下列步骤。吸出培养基并将细胞用PBS洗涤一次,并在含4%多聚甲醛 的PBS中在室温(RT)下固定15分钟。吸出4%多聚甲醛,将细胞用PBS 洗涤三次。对于ck-18、成纤维细胞和Ki67的染色,细胞在含0.1%triton x-100的PBS中透化20分钟。对于清蛋白和AFP染色,细胞在冰冻的 甲醇中透化5分钟。然后将细胞用PBS洗涤一次,并在含10%的正常 山羊血清(NGS)(Vector)的PBS中封闭30分钟。加入用含1%NGS的 PBS稀释的一抗,室温放置1小时,但是对Ki-67例外,其条件是放置 2小时。将各孔用PBS洗涤3次,每次5分钟,然后加入用PBS稀释的 二抗,室温放置1小时。二抗被~488nm的
波长激发,发出~525nm的 光(绿光)。在培养1小时后,将各孔用PBS洗涤3次,每次5分钟, 加入用PBS以1∶25000稀释的烟酸己可碱(染色DNA的化学物质)并在 室温下放置2分钟。烟酸己可碱被~350nm的波长激发,发出~425nm 的光(蓝光)。最后将各孔用PBS洗涤3次,每次5分钟,并将其保留 在最后一次的洗涤液中。对于抗c-myc的染色,如前所述对细胞进行固 定、封闭和用triton x-100透化。加入一抗后放置过夜,加入二抗后 放置1.5小时。使用Leica DMRA
荧光显微镜和C4742-95
数码相机 (Hamamatsu)和Hamamatsu图像PRO计算机
软件进行所有分析。
总RNA提取
使用RNeasy mini kit(Qiagen 74104)进行总RNA提取。每次提 取使用最多为5×106个细胞的细胞沉淀。用含10μl/ml2-巯基乙醇的 350μl的RLT缓冲液破坏细胞,将样品在20号
注射器中通过10次使 其均匀化。将无水乙醇(Joseph Mills有限公司)稀释至70%,并向 样品中加入350μl,并用滴管将其混合。将样品转移至RNeasy mini 柱上,并以8000g旋转15秒。加入350μl RW1洗涤缓冲液,并以8000g 离心15秒。向RNeasy mini柱膜上加入用70μl RDD缓冲液(Qiagen) 稀释的10μl无RNA酶的DNA酶1(Qiagen 79254),放置15分钟。加 入350μl RW1洗涤缓冲液,并以8000g离心15秒,加入500μl的RPE 缓冲液,将样品以8000g离心15秒,再加入500μl的RPE缓冲液,将 样品以8000g离心2分钟。最后在柱上加入50μl无RNA酶的水,以 8000g离心1分钟。用无RNA酶的管收集50μl含RNA的水,并用 GeneQuant pro分光光度计(Amersham pharmaceutical biotech AB)检 验其纯度和数量。将样品储存于-80℃。
制备cDNA
为了制备cDNA,将提取的总RNA在冰上解冻,并取出50ng与下述 成分在无DNA酶/RNA酶的管中在冰上混合:0.25μl的RNasin RNA酶
抑制剂10.000u(Promega N2115)、0.067μl的3μg/μl的随机引物 (Invitrogen 48190-011)、2μl的10×缓冲液RT、2μl的dNTP混合 物(每种为5mM)、1μl的Sensiscript RT和无RNA酶的水(全部来自 Quiagen
试剂盒205213),混合后终体积为20μl。将管置于37℃水浴 中60分钟,转移至93℃热击5分钟,并迅速在冰上冷却。将cDNA储 存于-20℃冰箱中。
c-myc-ER的PCR
使用titanium taq PCR试剂盒(Clontech laboratories)进行 c-myc-ER的PCR,所使用的引物见表2。PCR反应条件为标准条件。使 用的PCR仪为GeneAmp PCR system 2700。在分析时,将15μl的PCR 产物与5μl的6×上样染色缓冲液(MBI R0611)混合上样至凝胶。还加 入了6μl的含有3μg DNA的100bp DNA分子量标记(MBI SM0241)。凝 胶为2%的琼脂糖凝胶,由TAE缓冲液(Invitrogen 15558-034)、2%的 琼脂糖和267μg/ml的溴化乙锭组成。使用E835
电泳电源(Consort) 和HU13电泳槽(Jencons)进行电泳,最后用Flour-Smultimager(Biorad) 进行扫描并用Quantity One(Biorad)软件进行分析。
表2 c-myc-ER构建体的扩增中所使用的引物对。 引物对 序列 产物大小(bp) c-myc 1235S/ M-ER 1131AS 1235S:5’-CTCCTGGCAAAAGGTCAGAG M-ER 1131AS:5’-AAGGACAAGGCAGGGCTATT 590 c-myc 1585S/ M-ER 1131AS c-myc 1585S:5’-AAAGGCCCCCAAGGTAGTTA M-ER 1131AS:5’-AAGGACAAGGCAGGGCTATT 240
TaqMan
在96孔光学反应板(AB Applied biosystems)上进行标准的TaqMan 步骤。所使用的所有探针和引物均来自MWG-Biotech AG公司,并且所 有探针都用3’TAMRA和5’FAM标记,参见表3。所有的反应板均用光学 粘性封膜(AB Applied biosystems)密封。在装到TaqMan仪(ABI prism 7000序列检测系统)上之前,将TaqMan板在500g离心1分钟。最后 TaqMan所得结果用ABI prism 7000 SDS软件进行分析。
表3 TaqMan所用的引物和探针 靶基因 探针/引物 序 列 人血清 清蛋白 探针: 正向引物: 反向引物: 5’-ACATTCAAGCAGATCTCCATGGCAGCA-3’ 5’-AGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTG-3’ 5’-AGGTCCGCCCTGTCATCAG-3’ 人类 cyp3A4 探针: 正向引物: 反向引物: 5’-CGGTGCCATCCCTTGACTCAACCT-3’ 5’-TCTGGTGTTCTCAGGCACAGA-3’ 5’-CAACCAGAAAAACCCGTTGTTC-3’ 人类 cyp3A7 探针: 正向引物: 反向引物: 5’-CCGTAAGTGGAGCCTGATTTCCCTAAGGA-3’ 5’-AAAGGCTGAGTCAAGGGATGAG-3’ 5’-AGCTTTCTTAAAGAGCAAACCAGAA-3’ GAPDH (多个物种) 探针: 正向引物: 反向引物: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCACTGCCA-3’ 5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’ 5’-GGGCCATCCACAGTCTTCTG-3’
端粒末端转移酶分析
来源于克隆20,p2的细胞在T25瓶中用含有0、100nM、1μM和 10μM 4-OHT的培养基培养一周。将细胞置于培养物中2个月。将来自 于相同肝脏的未感染肝细胞也用于分析。这些细胞在培养物中放置3 周。根据Telo TAGGG端粒末端转移酶PCR ELISAPLUS(Roche)的说明书进 行分析。使用GENios(Tecan)板读数器分析结果。由于一些荧光值对于 板读数器的
光谱过高,因此对实验方法做了一些改变,仅用最终体积的 1/3进行荧光测量。
结果
人类原代胎儿肝脏细胞的结果
解离的人类胎儿肝脏和细胞在96孔板中培养一天后,对肝细胞标 志物清蛋白和ck-18进行染色。几乎有所的细胞都对清蛋白和ck-18的 染色呈现出阳性结果,表明肝脏的解离是成功的,并且在早期培养物中 的大多数细胞都是肝细胞或类肝细胞。在细胞铺板和对一些细胞固定和 染色之前,进行了对表达能被HEA-125抗体识别的上皮表面抗原的细胞 的富集。HEA-125阳性细胞也对清蛋白呈阳性。通过对Ki67的染色, 进行了对培养物中不同天数时人类胎儿肝细胞增殖速度的评估。在不同 的4天中,对随机区域内的Ki67阳性细胞和总细胞数进行了计数。Ki67 染色的结果显示在第一周中在无精氨酸Williams培养基中细胞增殖很 快,但在更长的时间后增殖速度下降,这与胎儿肝脏细胞不能在无精氨 酸Williams培养基中长时间存活的观察结果是一致的。这说明在感染 发生后细胞增殖很快,并且大多数细胞为肝细胞或类肝细胞。无精氨酸 培养基抑制了成纤维细胞和其他非实质肝脏细胞的增殖,使得肝细胞被 转基因成功地感染。为筛选感染的大群细胞,按照材料和方法中所述的, 对未感染的人类胎儿肝脏细胞进行了新霉素滴定。将细胞在新霉素浓度 范围为0-900μg/ml的培养基中暴露12天,在6孔板中同时设三个平 行样。再用250μg/ml的浓度进行两周筛选,肝细胞仍然存活。所有转 基因的PCR结果均为阳性,在筛选中大多数未感染细胞死亡。
对人类肝细胞克隆的结果
在将细胞以分散的细胞个数铺于组织培养塑料板及筛选之后,获得 了人类胎儿肝细胞的克隆。产生了50个以上的克隆。早期传代所得的 肝细胞在液氮中冷冻,得到了20个以上的克隆。将一些冷冻管解冻并 用于进一步的组织培养,锥虫蓝排除法显示在冷冻/解冻后存活率为 70-95%。PCR证实c-myc-ER构建体已经整合至所有被检测的克隆中。 所有已进行了对清蛋白染色的克隆(19个克隆)均显示阳性染色结果。 对19个克隆进行了AFP染色,但是没有染色为阳性。用TaqMan对8个 克隆进行了cyp3A7和cyp3A4表达的分析。在培养85天后,收集来源 于这些克隆的细胞沉淀。将结果对人类基因组DNA和内部看家基因 GAPDH进行了标准化。在培养85天后,cyp3A7仍存在于所有克隆中。 c-myc染色显示,c-myc在被PCR确认的永生化构建体整合的细胞系中 表达。端粒末端转移酶表达分析显示了0.5-10μM 4-OHT的条件下培养 肝细胞上调了端粒末端转移酶的表达,因此适用于永生化。
实施例2
材料和方法
除另外指明的以外,所有的化学物质均购自Sigma(Dorset,UK)。
组织培养
细胞在37℃、5%CO2的millennium培养箱中生长。每周更换三次 培养基,当会合率大约90%时进行细胞传代。
培养基
在肝脏组织和克隆的培养中使用了下列种类的培养基。培养基使用 1L的过滤单元(Nalgene,NY,USA)进行过滤灭菌,并在使用前预热 至37℃。
培养基A:Dulbecco改良eagle培养基(DMEM)(Invitrogen, Paisley,UK)、10%的胎牛血清(FBS)(Hyclone Perbio Science,UT, USA)、艮他霉素(50mg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)和表皮生长因子 (EGF)(20ng/ml)。
培养基B:无精氨酸Williams E标准培养基(Invitrogen,Paisley, UK)∶DMEM(Invitrogen,Paisley,UK)(1∶1)、10%FBS、EGF(20ng/ml)。
培养基C:DMEM(+Glutamax)(Invitrogen,Paisley,UK)、10% FBS、1X非必需氨基酸。
培养基D:DMEM(+Glutamax)、10%FBS、2mM的L-谷氨酰胺、和 青霉素-链霉素(100IU/ml)(Invitrogen,Paisley,UK)。
培养基E:无精氨酸Williams E标准培养基、
碳酸氢钠(2.2g/l)、 经透析的FBS(10%)(Gibco 26400-044)、L-谷氨酰胺(2mM)、胰岛 素(100nM)、100IU/ml的青霉素-链霉素、L-鸟氨酸(0.4mM)、氢化 可的松(5.5mM)、EGF(20ng/ml)。
胶原包被
将肝脏组织和克隆保留在胶原包被的组织培养塑料板上。来自
小牛 皮的胶原溶液用无菌水稀释至终浓度为8mg/cm2。在用胶原溶液培养至 少2小时后,用无菌的hanks平衡盐溶液(HBSS)(Invitrogen,Paisley, UK)洗涤瓶两次。
肝脏来源和处理
获得了本地NHS伦理委员会的
许可,在中止妊娠后收集人类胎儿肝 脏。
收到在湿冰上的RPMI培养基中保存而运到的肝脏组织。将肝脏用 +4℃、pH7.2的无钙离子HEPES液(Invitrogen,Paisley,UK)洗涤 两次,用+4℃、pH7.2、无钙离子、含有乙二醇-双(2-氨基乙醚) -N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA)(0.5mM)的HEPES液洗涤一次。将肝脏用 解剖刀切碎并置于37℃的酶溶液中20分钟,所述酶溶液为含有0.05% 的胶原酶A(Roche,East Sussex,UK)、0.005%的DNA酶I(Roche, East Sussex,UK)、0.0125%的透明质酸酶(hylaronidase)和0.025% 的分散酶II(Roche,East Sussex,UK)的无钙离子的HBSS,并在溶 液中添加5mM的氯化钙。将解离的肝脏用无菌尼龙筛过滤并收集于+4 ℃的培养基A中。为除去一些较小的血细胞和其他细胞,将细胞在50g 条件下离心3次,每次弃去上清液。用血细胞计数器进行细胞计数和存 活率计数。然后将细胞铺于早先包被过的组织培养塑料板上,用培养基 A在37℃培养4小时使其贴壁。然后将细胞用37℃的磷酸盐缓冲溶液 (PBS)(Invitrogen,Paisley,UK)洗涤一次,以除去碎片和未贴壁 的细胞,然后加入培养基B。
传代
将细胞用37℃的PBS洗涤一次,为了使细胞从塑料上脱离,加入1 ×胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(BioWhittaker,ME,USA),培养10分钟。 加入等体积的培养基以中和胰蛋白酶,然后将细胞悬液转移至falcon 管中,以500g离心5分钟。除去上清液,在培养基中重悬细胞并用血 细胞计数器进行细胞计数。将细胞按每平方厘米8000细胞的密度接种 于被胶原包被的塑料板上。
冷冻和解冻细胞
为了冷冻细胞,在可冷冻管(Nunc,NY,USA)中用900ml培养基 和100ml的cryosure-二甲亚砜(DMSO)(Quest biomedical,West Midlands,UK)重悬细胞沉淀。将细胞在“Mister Frosty”深低温保 藏冰箱(Nalgene,NY,USA)中以-80℃放置24小时,其中温度的下降 大约为5℃/分钟。在24小时后将管移至液氮中长期保存。
为了解冻细胞,将选择的管从液氮中取出置于37℃水浴中直至解 冻。然后将细胞悬液与10ml培养基混合,并以500g离心细胞5分钟并 回收沉淀。将沉淀在新鲜培养基中重悬,进行细胞计数和存活率计数, 并将细胞接种于被胶原包被的塑料板上。
收获病毒
将来源于Fly-C042克隆的产生病毒的细胞在175cm2瓶中用培养基 D培养至会合。当细胞会合时将瓶用PBS洗涤三遍,然后向瓶中加入培 养基E(每个175cm2瓶中加18ml),培养8小时。收获培养基并用0.45mm 的滤器(Sartorius,Surrey,UK)过滤并分成5ml的等份,在液氮中 快速冷冻并储存于-80℃。
感染和筛选
将细胞按200细胞/皿至100%会合的密度范围接种于10cm培养皿 中。在人类胎儿肝脏解离3天后将细胞用PBS洗涤一次,加入5ml含有 病毒和8mg/ml溴化己二甲胺的培养基,培养8小时。在培养之后加入 培养基B培养过夜,并在第二天重复感染一次。感染后在所有培养基中 都加入0.1-1.0mM的4-羟基他莫昔芬(OHT)。
在感染两天后将细胞传代至15cm的培养皿中,并按每皿1000细胞 的密度接种以准备48小时后的筛选。被成功感染的细胞表达c-mycER 构建体,能抵抗新霉素(也被称为遗传霉素和G418)。进行了新霉素的 滴定以确定新霉素的正确的使用浓度,以便除去未感染细胞而保留感染 的细胞。基于滴定的结果,将细胞暴露含250mg/ml的新霉素的培养基 B中,筛选2周。
Cvquant增殖分析
使用Cyquant细胞增殖分析(Molecular Probes,Paisley,UK)来 评估生长速度。细胞在多孔板上或25cm2的瓶中生长,根据厂商说明书 进行实验。
免疫细胞化学
使用免疫细胞化学对细胞系进行早期评估。这种方法不可能进行定 量的分析但是它可以对肝脏标志物是否存在提供有用的信息。使用人类 肝细胞瘤细胞系HuH7作为肝脏标志物的阳性对照,而使用myc永生化 神经干细胞系(197VM)作为阴性对照。
所有染色实验都使用下列步骤在多孔板上进行。吸出培养基并将细 胞用PBS洗涤一次,然后用4%多聚甲醛在室温下固定15分钟。然后将 细胞用PBS洗涤三次,再用含0.1%triton x-100的PBS中透化15分钟。 然后再将细胞用PBS洗涤一次,并在含10%的正常山羊血清(NGS) (Vector Laboratories,CA,USA)的PBS中封闭1小时。加入用 1%NGS/PBS稀释的一抗,室温放置1小时。将细胞用PBS洗涤3次,然 后是细胞暴露于用1%NGS/PBS稀释的二抗,室温放置1小时。将细胞用 PBS洗涤3次,加入染色DNA的染料烟酸己可碱(用PBS以1∶25000稀 释)并在室温下放置2分钟。将细胞再用PBS洗涤3次,并将其保留在 最后一次的洗涤液中。使用荧光显微镜(Leica DMRA)进行分析。二抗 被~488nm的波长激发,并发出~525nm的光(绿光),而烟酸己可碱 被~350nm的波长激发,并发出~425nm的光(蓝光)。
TaqMan
在96孔光学反应板(Applied Biosystems,CA,USA)上进行标准的 TaqMan步骤。所有探针和引物均来自MWG-Biotech,Ebersberg,Germany (见表3)。所有探针都用3’TAMRA和5’FAM标记。反应板用光学粘性封 膜(Applied Biosystems,CA,USA)密封,并在装到TaqMan仪(ABI prism 7000序列检测系统)上之前以500g离心1分钟,所得结果用ABI prism 7000 SDS软件进行分析。
表4:用于TaqMan的引物和探针 靶基因 探针/引物 序列 人类 CYP3A4 探针: 正向引物: 反向引物: 5’-CGG TGC CAT CCC TTG ACT CAA CCT-3’ 5’-TCT GGT GTT CTC AGG CAC AGA-3’ 5’-CAA CCA GAA AAA CCC GTT GTT C-3’ 人类 CYP3A7 探针: 正向引物: 反向引物: 5’-CCG TAA GTG GAG CCT GAT TTC CCT AAG GA-3’ 5’-AAA GGC TGA GTC AAG GGA TGA G-3’ 5’-AGC TTT CTT AAA GAG CAA ACC AGA A-3’ b-肌动蛋白 探针: 正向引物: 反向引物: 5’-CAT CAC TAT CGG CAA TGA GCG GTT CC-3’ 5’-GAG CTA TGA GCT GCC TGA C-3’ 5’-AGT TTC ATG GAT GCC ACA GGA-3’
结果
解离、感染和克隆筛选
在妊娠15周时获得组织,按上述方法解离和感染。在2周的筛选 之后,选出个别的克隆并扩增。命名为LIV0A07的克隆显示出有希望的 特征,将其用于进一步的表征。它在长期培养(传代30次以上)后存 活而且未显衰老。
在筛选过程和早期克隆生长过程中一直将组织保持在添加了0.1 mM 4-OHT的培养基B中,在克隆传到第三代后将LIV0A07置于添加了 0.1mM 4-OHT的培养基C中。
Cvquant增殖分析
使用Cyquant细胞增殖分析来评估生长速度,以比较LIV0A07在5 天的时间里在0-1.0mM 4-OHT中的生长。
细胞在0和0.1mM的4-OHT中生长时,仅观察到少量的增殖。在 进行分析的5天中,在存在0.5和1.0mM的4-OHT的条件下生长的细胞 有很大程度的增长,但是1.0mM的4-OHT可能对细胞有轻微的毒性(通 过在接种后初期增殖缓慢而观察到)。因此,LIV0A07显示出依赖于 4-OHT的生长,培养基中4-OHT的最佳浓度为0.5-1.0mM。
免疫细胞化学
阳性对照细胞系HuH7对清蛋白和细胞角蛋白-18(CK-18)呈阳性 反应,而197VM细胞对这些标志物呈阴性。
对于含有c-mycER构建体的细胞,加入4-OHT促进增殖,而除去 4-OHT则促进细胞的分化而表现成熟表型。LIV0A07对于肝细胞标志物 清蛋白和CK-18的染色呈阳性。分化的培养物(在不存在4-OHT的条件 下生长48小时)中的染色似乎要稍强一些。
对任何细胞类型使用抗成纤维细胞抗体染色时都没有观察到阳性 结果。这种抗体与脯氨酰-4-羟化酶的b亚基和二硫异构酶有交叉反应。
c-mycER的PCR
使用引物对c-myc 1585S和M-ER 1131AS进行的c-mycER的PCR证 实c-mycER构建体在LIV0A07中表达。
TagMan
使用TapMan对LIV0A07的mRNA进行分析,证实细胞色素P4503A4 和3A7酶的表达,但在这些条件下它们的表达比在对照细胞系HuH7中 所观察到的水平要低。HuH7的水平比LIV0A07中观察到的最高水平还 要高大约10倍。
在LIV0A07的分化培养物(在不存在4-OHT的条件下生长72小时) 中观察到CYP3A4 mRNA的表达有特别的增加。分化的LIV0A07中的水平 大约比未分化的培养物高了15倍,而在来自HuH7细胞的样本中没有观 察到4-OHT的效果。
在LIV0A07样本中,CYP3A7的水平并没有像CYP3A4一样显示出有 分化诱导的提高,但是这种酶的水平在接种以后并没有随时间下降。在 接种后72h检测到最低水平,在接种1周后检测到最高水平。这一结果 显示本发明的细胞具有提高的细胞色素P450水平,因此更接近正常的 肝细胞。本实施例表明可以从人类肝细胞开发出克隆的、有条件地永生 化的、表达肝细胞功能性标志物的细胞系,它可在多次细胞传代(传代 30次以上)后存活。还开发了其他具有不同表型特征的细胞系。
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MYCER永生化肝细胞<130>JWJ01129WO
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<150>GB0420963.1
<151>2004-09-21
<160>21
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2282
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人类c-myc/小鼠雌激素受体的融合体c-mycERTam
<400>1
gacgatgccc ctcaacgtta gcttcaccaa caggaactat gacctcgact acgactcggt 60
gcagccgtat ttctactgcg acgaggagga gaacttctac cagcagcagc agcagagcga 120
gctgcagccc ccggcgccca gcgaggatat ctggaagaaa ttcgagctgc tgcccacccc 180
gcccctgtcc cctagccgcc gctccgggct ctgctcgccc tcctacgttg cggtcacacc 240
cttctccctt cggggagaca acgacggcgg tggcgggagc ttctccacgg ccgaccagct 300
ggagatggtg accgagctgc tgggaggaga catggtgaac cagagtttca tctgcgaccc 360
ggacgacgag accttcatca aaaacatcat catccaggac tgtatgtgga gcggcttctc 420
ggccgccgcc aagctcgtct cagagaagct ggcctcctac caggctgcgc gcaaagacag 480
cggcagcccg aaccccgccc gcggccacag cgtctgctcc acctccagct tgtacctgca 540
ggatctgagc gccgccgcct cagagtgcat cgacccctcg gtggtcttcc cctaccctct 600
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ggaaggcatg gtggagatct ttgacatgtt gcttgctacg tcaagtcggt tccgcatgat 1800
gaacctgcag ggtgaagagt ttgtgtgcct caaatccatc attttgctta attccggagt 1860
gtacacgttt ctgtccagca ccttgaagtc tctggaagag aaggaccaca tccaccgtgt 1920
cctggacaag atcacagaca ctttgatcca cctgatggcc aaagctggcc tgactctgca 1980
gcagcagcat cgccgcctag ctcagctcct tctcattctt tcccatatcc ggcatatgag 2040
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cctgctcctg gagatgttgg atgcccaccg ccttcatgcc ccagccagtc gcatgggagt 2160
gcccccagag gagcccagcc agacccagct ggccaccacc agctccactt cagcacattc 2220
cttacaaacc tactacatac ccccggaagc agagggcttc cccaacacga tctgagagct 2280
cc 2282
<210>2
<211>754
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人类c-myc/小鼠雌激素受体的融合体c-mycERTam
<400>2
Met Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr
1 5 10 15
Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr
20 25 30
Gln Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp
35 40 45
Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser
50 55 60
Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala
85 90 95
Asp Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn
100 105 110
Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile
115 120 125
Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu
130 135 140
Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly
145 150 155 160
Ser Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu
165 170 175
Tyr Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser
180 185 190
Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys
195 200 205
Ala Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu
210 215 220
Ser Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu
225 230 235 240
His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln
245 250 255
Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala
260 265 270
Pro Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser
275 280 285
Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr
290 295 300
His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro
305 310 315 320
Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile
325 330 335
Ser Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu
340 345 350
Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn
355 360 365
Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu
370 375 380
Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr
385 390 395 400
Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
405 410 415
Glu Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu
420 425 430
Gln Leu Arg Asp Pro Arg Asn Glu Met Gly Ala Ser Gly Asp Met Arg
435 440 445
Ala Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Ile Lys His Thr Lys Lys Asn
450 455 460
Ser Pro Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu
465 470 475 480
Asp Ala Glu Pro Pro Met Ile Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Ser Arg Pro
485 490 495
Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg
500 505 510
Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Gly
515 520 525
Asp Leu Asn Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu
530 535 540
Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly
545 550 555 560
Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys
565 570 575
Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser
580 585 590
Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu
595 600 605
Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser
610 615 620
Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp
625 630 635 640
Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr
645 650 655
Leu Gln Gln Gln His Arg Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser
660 665 670
His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Asn Met
675 680 685
Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp
690 695 700
Ala His Arg Leu His Ala Pro Ala Ser Arg Met Gly Val Pro Pro Glu
705 710 715 720
Glu Pro Ser Gln Thr Gln Leu Ala Thr Thr Ser Ser Thr Ser Ala His
725 730 735
Ser Leu Gln Thr Tyr Tyr Ile Pro Pro Glu Ala Glu Gly Phe Pro Asn
740 745 750
Thr Ile
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
<400>3
ctcctggcaa aaggtcagag 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
<400>4
aaggacaagg cagggctatt 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
<400>5
aaaggccccc aaggtagtta 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
<400>6
aaggacaagg cagggctatt 20
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针寡核苷酸
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acattcaagc agatctccat ggcagca 27
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
<400>8
agtttgcaga agtttccaag ttagtg 26
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
<400>9
aggtccgccc tgtcatcag 19
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针寡核苷酸
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cggtgccatc ccttgactca acct 24
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
<400>11
tctggtgttc tcaggcacag a 21
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
<400>12
caaccagaaa aacccgttgt tc 22
<210>13
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针寡核苷酸
<400>13
ccgtaagtgg agcctgattt ccctaagga 29
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
<400>14
aaaggctgag tcaagggatg ag 22
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
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agctttctta aagagcaaac cagaa 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针寡核苷酸
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accacagtcc atgccatcac tgcca 25
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物寡核苷酸
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gggccatcca cagtcttctg 20
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针寡核苷酸
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catcactatc ggcaatgagc ggttcc 26
<210>20
<211>19
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<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
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gagctatgag ctgcctgac 19
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物寡核苷酸
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agtttcatgg atgccacagg a 21