技术领域
[0001] 本
发明属于核酸分子的扩增及克隆技术领域，具体涉及一种高效扩增核酸分子的方法。
背景技术
[0002] PCR是一种在体外模拟DNA复制的核酸扩增技术。Mullis于1985年发明该技术，并于1995年获得了诺贝尔化学奖。PCR技术模拟了体内DNA的天然复制过程。PCR扩增产物的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物设计。PCR主要由循环进行的高温变性、低温
退火和适温延伸三个步骤构成。具体而言，即在高温下将待扩增的靶DNA双链解链成为两条单链DNA模板；而后在低温情况下，寡核苷酸引物与单链DNA模板结合，退火形成部分双链；在DNA聚合酶的最适
温度下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿5’→3’方向延伸，合成DNA新链。每经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环，就成了两条新的双链DNA分子。如此反复进行，PCR产物得以指数形式迅速扩增，经过25～30个
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循环后，理论上可使基因扩增10 倍以上。
[0003] 因PCR技术具有特异性高、灵敏度高、简单快速、对样本的纯度要求低、可对模板数定量等优点，在
生物科学众多领域的应用日趋广泛。在分子生物学研究中，PCR是必备的
基础技术之一；在医学临床诊断方面，实时定量PCR技术已应用于乙肝病毒等病原体的检测；PCR技术在农业、法医鉴定、古生物学研究等方面也有不可替代的作用。
[0004] 在实际应用中，PCR技术仍存在一些需要改进的问题，如特异性、灵敏度、反应速度等问题，最突出的问题就是存在不同程度的非特异性PCR扩增产物。其原因可能是引物模板错配、引物结合形成二聚体等引起的扩增等等。科学家们从不同的
角度来尝试解决这个2
问题，如从模板、引物、Mg+浓度、退火温度等角度改善其特异性，或者将增效剂如聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐(Dextran)、聚
蔗糖(Ficoll)、树状大分子等引入PCR体系。这些增效剂在一定程度上可以实现增加PCR扩增效率的目的。但在实际应用过程中，有时效果仍不尽如人意。高分子增效剂在加入反应体系后，在提高PCR目标产物灵敏度的同时，也增加了PCR非特异性产物的强度。如何提高PCR扩增的特异性是必须解决的问题。
[0005] 经对
现有技术文献的检索发现，美国
专利US PATENT 5,646,019公开了“一种利于引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白(SSB，single-stranded nucleic acid binding protein)，SSB蛋白只结合单链DNA，但不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性
片段的扩增，从而实现了PCR扩增的优化。
[0006] 单链DNA结合蛋白(single-strand DNA blinding protein，SSB)，即结合在单链DNA上的一类蛋白，它参与所有生物中的大部分的细胞途径。SSB(单链DNA结合蛋白)在DNA进行复制、转录及修复等生理过程中起着重要的角色，主要表现在于dsDNA(双链DNA)解旋时结合在ssDNA(单链DNA)上，保障ssDNA的稳定，以防ssDNA重新
配对成双链或被核酸酶降解，从中对ssDNA起到相应的保护作用。除了对ssDNA二级结构的作用之外，SSB还促进同源的核苷酸链进行配对。在PCR体系里加入耐热的SSB，SSB蛋白只结合单链DNA，但不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，可以实现PCR扩增的优化。美国专利5,646,019公开了“一种利于引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法就是在PCR体系里加入了耐热的SSB。
[0007] 大肠杆菌菌株U93来源的组蛋白样蛋白(HU)是一种与双链DNA非特异性结合的蛋白。细菌
染色体的有效高度压缩并有序排列，需要许多蛋白的参与。其中HU是一种主要蛋白，除了维持DNA的超螺旋和压缩状态外，对DNA的结构也起到具体的作用，例如DNA的弯曲，基因转录调控，核蛋白复合物的装配所需的位点特异性重组反应，和起始于复制原点的复制，和通过
蛋白质-RNA相互作用控制翻译起始等。HU由两个同源亚基(α和β)组成，可非特异性结合双链DNA，也有发现其对于缺口和弯曲的DNA有特定偏好。HU蛋白不但能像结合单链DNA的SSB蛋白一样与单链DNA结合，同时还能结合双链的DNA。目前从没有人报道双链DNA结合蛋白对PCR扩增影响的结果。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种高效扩增核酸分子的方法，该方法能够特异性地、高效地扩增目标核酸序列。在该核酸扩增方法中，通过在PCR反应体系中，添加一定浓度的HU蛋白，就能够成功地只对目标核酸序列特异性地进行高效扩增。
[0009] 本发明所采用的技术方案是，一种高效扩增核酸分子的方法，在PCR反应体系中加入HU蛋白、HUα或β亚基同源二聚体。
[0010] 本发明的特点还在于，所述HU蛋白、HUα或β亚基同源二聚体和模板DNA的摩尔比例在1-200区间。
[0011] 引物的核苷酸序列如下：上游引物为5’-ATGACCAAGTCAGAATTGATAG-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；下游引物为5’-ACCGTAAATATTGGCGCGATCG-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
[0012] HU蛋白具体按照以下步骤制备：
[0013] 步骤1、将来源于大肠杆菌U93的HU的2个亚基的基因片段，插入p ETDuet载体中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pETDuet-HU，其中，HU的2个亚基为HUα和HUβ，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
[0014] 步骤2、将构建好的重组载体pETDuet-HU转化大肠杆菌DH5α，取含重组质粒的阳性菌株经培养过夜，菌液按1％比例接种到30ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为1.0；将菌液放入42℃诱导表达6小时；
[0015] 步骤3、取诱导表达后的菌液，离心，收集菌体；
[0016] 菌体重选于溶液A中；离心30分钟；上清中加入PEG6000至终浓度15％；混合物在4度搅拌2小时，混匀；离心30分钟；上清液4度
透析24小时，
透析液为溶液B；离心20分钟；上清过肝素Sepharose色谱柱，以溶液B为洗脱溶液，用0.2M至1M的NaCl盐浓度梯度洗脱；合并含HU的洗脱液，以溶液B为透析液透析过夜；透析后经
磷酸纤维素柱纯化，以溶液B为洗脱溶液，NaCl盐浓度梯度洗脱，得到HU蛋白。
[0017] HUα或β亚基同源二聚体具体按照以下步骤制备：
[0018] 步骤1、将来源于大肠杆菌U93的HUα或HUβ亚基分别插入pET22表达载体中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET22-HUα或者pET22-HUβ；
[0019] 步骤2、将构建好的重组载体pET22-HUα或者pET22-HUβ转化大肠杆菌DH5α，取含重组质粒的阳性菌株经培养过夜，菌液按1％比例接种到30ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为1.0；将菌液放入42℃诱导表达6小时；
[0020] 步骤3、取诱导表达后的菌液，离心，收集菌体；
[0021] 菌体重选于溶液A中；离心30分钟；上清中加入PEG6000至终浓度15％。混合物在4度搅拌2小时，混匀；离心30分钟；上清液4度透析24小时，透析液为溶液B；离心20分钟；上清过肝素Sepharose色谱柱，以溶液B为洗脱溶液，用0.2M至1M的NaCl盐浓度梯度洗脱；合并含HU的洗脱液，以溶液B为透析液透析过夜；透析后经磷酸
纤维素柱纯化，以溶液B为洗脱溶液，NaCl盐浓度梯度洗脱，得到HUα或者蛋白β同源二聚体。
[0022] 溶液A为20mM Tris-HCl,1.7M NaCl,1mM EDTA，1mM巯基
乙醇，pH7.8。
[0023] 溶液B为20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.8。
[0024] 本发明的有益效果是：大肠杆菌菌株U93来源的组蛋白样蛋白(HU)是一种与DNA非特异性结合的蛋白。细菌染色体的有效高度压缩并有序排列，需要许多蛋白的参与。其中HU是一种主要蛋白，除了维持DNA的超螺旋和压缩状态外，对DNA的结构也起到具体的作用，例如DNA的弯曲，基因转录调控，核蛋白复合物的装配所需的位点特异性重组反应，和起始于复制原点的复制，和通过蛋白质-RNA相互作用控制翻译起始等。HU由两个同源亚基(α和β)组成，可非特异性结合双链DNA，也有发现其对于缺口和弯曲的DNA有特定偏好。HU蛋白不但能像结合单链DNA的SSB蛋白一样与单链DNA结合，同时还能结合双链的DNA。
[0025] 本发明在研究HU的功能时，发现在一定条件下，其可以显著地促进PCR扩增的效率。也就是说：在PCR反应的过程中，HU不但比SSB蛋白的更优，还能抑制非特异性片段的扩增。这与之前人们认为只有单链DNA结合蛋白能促进PCR效率，而双链DNA结合蛋白会抑制PCR效率的认识不一致。本发明的应用，将有助于解决现有PCR技术所存在的扩增效率低，存在非特异性产物污染等问题。
附图说明
[0026] 图1是HU蛋白对PCR扩增产物影响的
电泳图；
[0027] M：DNA分子量Marker；1：市售PCR
试剂盒的扩增产物；2：PCR反应体系内加入0.1pmol HU蛋白；3：PCR反应体系内加入0.2pmol HU蛋白；4：PCR反应体系内加入0.5pmol HU蛋白；5：PCR反应体系内加入1pmol HU蛋白；6：PCR反应体系内加入5pmol HU蛋白；7：
PCR反应体系内加入10pmol HU蛋白；
[0028] 图2是HU蛋白同源二聚体对PCR扩增产物影响的电泳图；
[0029] M：DNA分子量Marker；1：市售PCR试剂盒的扩增产物；2-5：PCR反应体系内分别加入0.1，0.5，1，2pmol HUα亚基同源二聚体蛋白；6-9：PCR反应体系内加入0.1，0.5，1，2pmol HUβ亚基同源二聚体蛋白；
[0030] 图3是HU的表达质粒载体；采用双表达载体pETDuet，同时表达HU的两个亚基；
[0031] 图4是HUα或β亚基的表达质粒载体；采用表达载体pET22，表达HU的α或β亚基。
[0032] 图5是HU蛋白对PCR扩增效率影响的量效关系。M：DNA分子量Marker；泳道1-13：HU与模板DNA的摩尔比例分别为0.2,0.5，1，2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000。
[0033] 图6是HUα亚基的同源二聚体对PCR扩增效率影响的量效关系。M：DNA分子量Marker；泳道1-8：HUα亚基的同源二聚体与模板DNA的摩尔比例分别为1，2，5，10，20，50，100，200。
[0034] 图7是HUβ亚基的同源二聚体对PCR扩增效率影响的量效关系。M：DNA分子量Marker；泳道1-9：HUβ亚基的同源二聚体与模板的摩尔比例分别为0.001，0.05，0.5，1，2，5，10，20，50。
具体实施方式
[0035] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。但本发明保护范围不局限于所述内容，
实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
[0036] 实施例1：HU蛋白、HUα或β亚基同源二聚体的制备
[0037] ①将来源于大肠杆菌U93的HU的2个亚基的基因片段(HUα和β亚基，其核苷酸序列如SEQ ID：1和SEQ ID：2所示)插入pETDuet-1载体中(如图3所示)，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pETDuet-1-HU。
[0038] ②将构建好的重组载体pET22-HU转化大肠杆菌DH5α。取含重组质粒的阳性菌株经培养过夜，菌液按1％比例接种到30ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为1.0；将菌液放入42℃诱导表达6小时。
[0039] ③取诱导表达后的菌液，离心。菌体重悬于溶液A(4度)中。溶液A为：20mM Tris-HCl,1.7M NaCl,1mM EDTA,1mM巯基乙醇，pH7.8。
[0040] 将细胞重悬液离心(6000g)30分钟，上清中加入PEG6000至终浓度15％。混合物在4度搅拌混匀2小时后，离心(12000g)30分钟。
[0041] 上清加入饱和
硫酸铵溶液至80％，4度离心(13000g)20分钟。收集沉淀，以溶液B(20mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH7.8)溶解。然后在4度透析24小时，透析液为溶液B，离心(12000g)20分钟。
[0042] 上清过肝素Sepharose色谱柱，以溶液B为洗脱溶液，NaCl盐浓度梯度洗脱。合并含HU的洗脱液，以溶液B为透析液透析过夜。
[0043] 透析后经磷酸纤维素柱纯化，以溶液B为洗脱溶液，NaCl盐浓度梯度洗脱。得到HU蛋白。保存在4℃待用。
[0044] 若制备HUα或β亚基同源二聚体，只需要HUα或HUβ亚基插入pET22表达载体(如图4所示)中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET22-HUα或者pET22-HUβ，其余步骤同上，即可制备得到HUα或β亚基同源二聚体。
[0045] 实施例2：HU蛋白对PCR反应的影响
[0046] ①PCR反应体系
[0047] 每10μl体系包含：
[0048]
[0050] 其中，上游引物为5’-ATGACCAAGTCAGAATTGATAG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID：3所示；下游引物为5’-ACCGTAAATATTGGCGCGATCG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID：4所示；
[0051] 以上体系内加入不同量的HU蛋白，观察对结果的影响。
[0052] ②PCR反应条件
[0053] 95℃1min.，共34个循环，每个循环：95℃30s,57℃30s,72℃30s。最后72℃5min。
[0054] ③琼脂糖凝胶电泳
[0055] 分别取5μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图1。可见在加入HU蛋白后，DNA扩增效率逐渐增加。在扩增效率提高的同时，非特异性条带明显减少。但HU蛋白的量增加到一定程度，扩增效率反而下降。
[0056] 实施例3：同源二聚体对DNA扩增及连接效率的影响
[0057] 参照实施例1-2方法，分别制备HUα或β亚基的同源二聚体，观察HU同源二聚体对DNA扩增效率的影响。如图2所示，结果HUα或β亚基同源二聚体仍然具有较好的促进DNA扩增效率的作用。从图2可见，加入HUα或β亚基同源二聚体后，PCR产物条带明显
亮度增加，在试验浓度范围内，扩增效率可增加20倍左右(条带亮度分析)。在相同用量下，HUβ亚基同源二聚体的扩增效率优于HUα亚基同源二聚体。
[0058] 实施例4：量效关系
[0059] 本发现进一步研究了在PCR反应体系内，HU促进DNA扩增效率的量效关系。
[0060] 参照实施例2进行PCR反应，体系内加入不同量的HU同源或异源二聚体，考察扩增效率及扩增特异性。HU蛋白的结果见图5，可见HU对DNA扩增的促进存在最佳的浓度区间，非特异性条带的减少与扩增效果的增加并不同步，需要根据目的产物对HU的用量进行合理选择。对于HU蛋白，最佳扩增效率的用量范围为：与模板DNA的摩尔比例为1-100。
[0061] HUα亚基同源二聚体及HUβ亚基同源二聚体的结果与HU蛋白基本类似(图6，7)。HUα亚基同源二聚体的最佳用量为：与模板DNA的摩尔比例为5-200。HUβ亚基同源二聚体的最佳用量为：与模板DNA的摩尔比例为1-50。
[0062] 根据HU同源二聚体和HU蛋白对DNA扩增效率的影响结果，本发明发现在PCR反应体系内，当HU同源二聚体或HU蛋白与模板DNA的摩尔比例在1-200区间内时，具有较好的DNA扩增效果。
[0063] 细菌染色体，与真核染色质类似，需要与许多蛋白结合，才能被有效高度压缩，并有序排列。在大肠杆菌中发现两种含量丰富核酸结合蛋白(NAP)，IHF(整合宿主因子)和HU，是DNA结合蛋白DNABII家族的两个成员。除了维持DNA的超螺旋和压缩状态外，这些蛋白对DNA的结构也起到其它更具体的作用，例如DNA的弯曲，基因转录调控，核蛋白复合物的装配所需的位点特异性重组反应，和起始于复制原点的复制，和通过蛋白质-RNA相互作用控制翻译起始等。IHF和HU，均由两个同源亚基(α和β)组成，彼此在序列和结构折叠方式上惊人地相似，但与DNA相互作用不同。IHF是DNA序列特异性DNA结合蛋白，可以将DNA弯曲160度以上。HU是最保守的NAP，可非特异性结合双链DNA，也有发现其对于缺口和弯曲的DNA有特定偏好。HU蛋白不但能像结合单链DNA的SSB蛋白一样与单链DNA结合，同时还能结合双链的DNA。
[0064] 本发明在研究HU的功能时，发现在一定条件下，其可以显著地促进PCR扩增的效率。也就是说：在PCR反应的过程中，HU不但比SSB蛋白的更优，还能抑制非特异性片段的扩增。这与之前人们认为只有单链DNA结合蛋白能促进PCR效率，而双链DNA结合蛋白会抑制PCR效率的认识不一致。本发明的应用，将有助于解决现有PCR技术所存在的扩增效率低，存在非特异性产物污染等问题。
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