技术领域
[0001] 本实用新型涉及一种医学实验装置，尤其涉及一种体外肝灌流装置。
背景技术
[0002] 原代猪
肝细胞是BAL
治疗中最合适的异种肝细胞源，现有成熟的肝细胞分离所采用的方法是酶消化法，该方法是将胶原酶等注入肝脏血管，作用于肝组织，使肝细胞间复杂的
纤维连接溶解，从而获得完整的个体肝细胞。对于大动物，如猪，狗和人的肝脏等，由于体积大，灌流液用量大，时间长，无论原位还是体外灌流都无法采用传统的人工
注射器注入式灌流，只能选用灌流
泵。而使用灌流泵灌流时，由于缺乏专用的成套设备，致使灌流分离过程中极易造成细菌等污染。由于胶原酶对
温度要求很高，37℃为其最佳作用温度，没有专
门的灌流设备很难控制灌流液温度，因此，往往由于
温度控制不好，而影响了最终的细胞消化效果，不能达到所需细胞数量和
质量要求，而且造成昂贵胶原酶的浪费，增加分离培养肝细胞的成本。
[0003] 因此，目前需要一种适于消化分离大动物肝脏肝细胞的体外肝灌流装置。实用新型内容
[0004] 为解决上述问题，本实用新型提供了一种体外肝灌流装置，种体外肝灌流装置，其特征在于：包括灌流液储存容器组、四通管、灌流泵、热交换系统、
氧合器、去泡器、灌流
导管、三通管和回流泵；所述灌流液储存容器组包括容器A、容器B和容器C，所述容器A、容器B、容器C均设有进液口和带有
截止阀的出液口，所述容器C还设有回流口；所述灌流泵、
热交换器、氧合器、去泡器、灌流导管和回流泵均设有进液口和出液口；所述四通管的四个管口分别与容器A的出液口、容器B的出液口、容器C的出液口和灌流泵的进液口通过软管相连；灌流泵的出液口与热交换系统的进液口、热交换系统的出液口与氧合器的进液口、氧合器的出液口与去泡器的进液口、去泡器的进液口与灌流导管的进液口、回流泵的出液口与容器C的回流口均通过软管相连；所述灌流导管的出液口伸入装肝脏容器中，所述装肝脏容器的底部还设有出液口；所述三通管位于装肝脏容器的下方，三通管的其中两个管口分别通过软管连接装肝脏容器的出液口、回流泵的进液口，三通管的第三个管口连接废液管，所述废液管上设有
截止阀。
[0005] 进一步优选地，所述容器A的进液口、容器B的进液口和容器C的进液口均为带液体灭菌滤膜的进液漏斗，分别位于相应容器的顶部；所述容器A的出液口、容器B的出液口和容器C的出液口均位于底部；所述容器A、容器B和容器C的顶部均设有带空气滤膜的透气孔；所述容器A、容器B和容器C均设有液位计。
[0006] 进一步优选地，所述热交换系统由热交换器、热
循环泵和恒温
水浴锅组成。
[0007] 进一步优选地，所述容器A的容积为4-10L，容器B的容积为1-2L，容器C的容积为2-4L。
[0008] 进一步优选地，所述装肝脏容器带有帽盖。
[0009] 进一步优选地，所述软管的内径为6mm-10mm。
[0010] 本实用新型利用热循环泵将水浴锅中37-42℃的热
循环水以100-200mL/min的速度注入热交换器中加热灌流液，使灌流液在整个灌流过程中保持37℃恒温。
[0011] 利用氧合器向灌流液中进行加氧处理，使灌流液中溶解氧分压保持在180-260mmHg，降低了肝细胞的缺氧时间，减少肝细胞内
空泡，提高肝细胞的活
力。
[0012] 利用去泡器在灌流液进入肝脏前去除灌流液中大小气泡，避免气泡在肝脏血管中形成气体栓子，使肝脏灌流更加充分均匀。
[0013] 由于采用了上述技术方案，本实用新型的装置具有如下的优点：
[0014] 1.使用方便，运行可靠，灌流过程连续进行，单人只需在一小时内就可以完成操作，节约人力、物力和时间。
[0015] 2.通
过热交换器，灌流液在整个灌流过程中始终保持37℃恒温，满足了肝细胞分离及胶原酶所需的恒定温定，保证了消化和分离肝细胞的活性。
[0016] 3.通过氧合器对灌流液进行了加氧处理，降低了肝细胞的缺氧时间，减少肝细胞内空泡，提高肝细胞的活力。
[0017] 4.去泡器避免了肝脏血管中气体栓子的形成，保证了肝脏中所有细胞能获得均匀的灌流。
[0018] 5.装置中采用大容量的灌流液储存容器，和高流速的
蠕动泵匀速灌注，保证了大动物肝脏灌流的压力和灌流液体积需求。
[0019] 6.整个灌注过程中，肝脏都处于有盖的无菌容器中，灌流液也处于无菌的管路和容器中，避免了细菌、
真菌的污染。
[0020] 综上所述，本实用新型提供了一种成套的，操作方便的用于消化分离大动物肝脏肝细胞的体外肝灌流装置，它可以对离体肝脏进行三步肝灌流，最大限度地快速、连续进行前灌流液和消化液的有效灌注，最大程度地质控消化肝组织过程，节约成本，恒定温度，减少污染，从而保质保量的获得实验与临床所用的肝细胞，尤其是肝细胞移植、
生物人工肝等所需的大量肝细胞。
[0021] 根据本实用新型的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本实用新型上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的
修改、替换或变更。
[0022] 以下通过
实施例形式的具体实施方式，对本实用新型的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本实用新型上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本实用新型上述内容所实现的技术均属于本实用新型的范围。
附图说明
[0023] 图1为本实用新型的结构示意图。图中：1.灌流液Ⅰ储存容器，容积10L；2.灌流液Ⅱ储存容器，容积2L；3.灌流液Ⅲ储存容器，容积4L；4.灌流泵；5.热交换器；6.氧合器；7.去泡器；8.带盖容器；9.回流泵；10.废液容器；11.进液口漏斗；12.进液口漏斗；13.进液口漏斗；14.液体灭菌滤膜；15.液体灭菌滤膜；16.液体灭菌滤膜；17.通气孔；
18.空气滤膜；19.通气孔；20.空气滤膜；21.通气孔；22.空气滤膜；23.液位计；24.液位计；25.液位计；26.液体流出口；27.液体流出口；28.液体流出口；29.截止阀；30.截止阀；31.截止阀；32.液体回流口；33.液体流出口；34.截止阀；35.恒温水浴锅；36.热循环泵；37.灌流导管；38.四通管；39.三通管。
具体实施方式
[0024] 实施例1
[0025] 如图1所示的体外肝灌流装置，包含一个灌流液Ⅰ储存容器1，容积10L，储存容器1上端有进液口漏斗11，漏斗11底端安置有一个液体灭菌滤膜14，储存容器1上端有一个通气孔17，其上接有一个空气滤膜18，在储存容器1
侧壁上有一个液位计23，储存容器1下端有一个液体流出口26，出口处有一个截止阀29。本装置还包含一个灌流液Ⅱ储存容器2，容积2L，储存容器2上端有进液口漏斗12，漏斗12底端安置有一个液体灭菌滤膜15，储存器2上端有一个通气孔19，其上接有一个空气滤膜20，在储存容器2侧壁上有一个液位计
2)，储存容器2下端有一个液体流出口27，出口处有一个截止阀30。本装置还包含一个灌流液Ⅲ储存容器3，容积4L，储存容器3上端有进液口漏斗13，漏斗13底端安置有一个液体灭菌滤膜16，储存容器3上端有一个通气孔21，其上接有一个空气滤膜22，在储存容器3侧壁上部有一个液体回流口32，另一侧侧壁上有一个液位计25，储存容器3下端有一个液体流出口28，出口处有一个截止阀31。本装置还包括灌流泵4；热交换器5，与热交换器5配合使用恒温水浴锅35及热循环泵36；氧合器6，可通入氧气；去泡器7；带盖装肝脏容器8，其上盖上可安置灌流导管37，底部有液体流出口33，流出口接有三通管39，三通管下面接截止阀34；回流泵9和废液容器10。
[0026] 根据灌流速度不同，用内径为6-10mm的软管首先分别将灌流液储存器1,2,3与四通管38连接，然后将四通管38剩余的一端与灌流泵4连接，然后依次连接热交换器5，氧合器6和去泡器7，最后连接灌流导管37，连接到带盖装肝脏容器8。之后，带盖装肝脏容器8下方三通管33，带截止阀34端用内径为6-10mm的软管连接废液容器10，三通管33另一段连接回流泵9，最后连接灌流液Ⅲ储存容器3上液体回流口32。用内径为6mm的软管连接热交换器5上热循环水出入口与恒温水浴锅35和热循环泵36。
[0027] 本实用新型装置的使用方法是这样的：
[0028] 以外科方式获取正常巴
马猪完整肝脏，全肝脏重300克为例分离制备原代猪肝细胞的灌流过程为例，说明本装置使用方法。
[0029] 首先将全套设备分拆后灭菌，之后进行无菌组装。在三个灌流液储存容器中分别加入过滤灭菌灌流液Ⅰ 4-10L,灌流液Ⅱ 1-2L和灌流液Ⅲ 2-4L。将管路连接后，用灌流液Ⅰ预灌注整个管路至去泡器出口。然后外科无菌条件下摘取完整的大动物肝脏或人供肝组织，置于有盖无菌容器中，将灌流导管与肝脏门静脉系统联通，之后灌流导管另一端与灌流装置联通。然后，开启灌流泵以400-1000mL/min的速度将37℃加氧的灌流液Ⅰ灌入肝脏，灌入肝脏的灌流液Ⅰ从肝上下腔静脉处溢出，最终流入废液容器内，弃去，灌流时间为10-12分钟。此为第一步灌流，通过灌流液Ⅰ冲洗肝内血液，是残留肝细胞尽可能冲洗干净，同时初步松解肝细胞之间的连接。
[0030] 其次，以400-1000mL/min的速度将37℃加氧的灌流液Ⅱ灌入肝脏，灌入肝脏的灌流液Ⅱ从肝上下腔静脉处溢出，最终流入废液容器内，弃去，灌流时间为1-2分钟。此为第二步灌流，通过灌流液Ⅱ冲洗肝内残留灌流液Ⅰ，去除灌流液Ⅰ中胶原酶活性的
抑制剂EGTA等成分，为酶消化做准备。
[0031] 最后，以500-1100mL/min的速度将37℃加氧的含有胶原酶的灌流液Ⅲ灌入肝脏，灌入肝脏的灌流液Ⅲ从肝上下腔静脉处溢出，保存在装有肝脏的无菌容器中，开启回流泵以与灌流泵相同的速度将灌流液Ⅲ抽回其原有储存容器中，形成匀速循环灌流肝脏，25-40分钟后，直至肝包膜与肝细胞分离，结束灌流。灌流液Ⅲ流入废液容器内，弃去。此为第三步肝灌流，主要通过向肝内循环灌注胶原酶，消化分解肝细胞之间的纤维连接，分离肝细胞。
[0032] 之后将装有肝脏的带盖容器从灌流装置中取出，移入超净
工作台中，进入后续的肝细胞悬液收集及洗涤过程。所述肝细胞洗涤的过程为：首先，将预冷至4℃的Williams'Medium E洗涤培养基，300-1000mL加入无菌盆中，用手术剪划开肝包膜，分离未消化的肝组织和结缔组织，收集肝细胞悬液。上述肝细胞悬液经四层
脱脂纱布过滤后，4℃条件下，
离心力50-55×g离心10分钟。之后，弃去离心上清液，用4℃的Williams'Medium E洗涤培养基重悬沉淀的肝细胞，4℃条件下，离心力50-55×g离心10分钟。将上述过程重复一次。最后，弃去离心上清液，沉淀肝细胞用无血清肝细胞培养基重悬，调节细胞浓度为2-5×107个每毫升，置
冰浴中备用。
[0033] 以上所述的灌流液Ⅰ每升含有：8.3克
氯化钠，0.5克氯化
钾，2.4克HEPES，3-6g NAC,0.9-1.1g EGTA,余量为去离子水；
[0034] 灌流液Ⅱ每升含有：8.3克氯化钠，0.5克
氯化钾，2.4克HEPES，余量为去离子水；
[0035] 灌流液Ⅲ每升含有：3.9克氯化钠，0.5克氯化钾，24克HEPES，0.07克二水氯化
钙(CaCl2·2H2O)，4克
白蛋白，68-130PZ活性单位胶原酶，余量为去离子水。
[0036] Williams'Medium E洗涤培养基每升中含有：9.5-10.8克Williams'Medium E粉末，2.2克
碳酸氢钠，2.6克HEPES，0.1g
链霉素，100000单位青霉素，余量为去离子水。
