一种诱导干细胞向肝细胞定向分化的方法及肝细胞的用途
阅读：351发布：2020-08-05
专利汇可以提供一种诱导干细胞向肝细胞定向分化的方法及肝细胞的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 医学领域，具体地说是涉及一种体外诱导干细胞向 肝细胞 定向分化的方法及其用途。本发明将基因工程与干细胞工程相结合，利用干细胞多向分化的潜能，以稳定表达人肝细胞生长因子的肝基质细胞作为饲养层细胞，诱导干细胞向肝细胞定向分化，并对诱导前后的干细胞进行比较鉴定。该体外诱导体系的建立不仅为“成体干细胞可塑性”的理论提供佐证，而且可作为 种子 细胞用于肝细胞移植、 生物人工肝 及微囊化肝细胞制剂等的制备，同时诱导分化的肝细胞可作为体外的药代动 力 学模型用于细胞药物筛选。此方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为 基础 的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。，下面是一种诱导干细胞向肝细胞定向分化的方法及肝细胞的用途专利的具体信息内容。
1.一种人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞向肝细胞定向诱导分化的方法，其特征是利用干细胞 具有多向分化潜能的特点，在饲养层细胞的支持下诱导人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞向 成熟的、有功能的肝细胞分化。
2.根据权利要求1所述的定向诱导分化方法，其特征是利用稳定、高效表达人肝细胞生长因子 的肝星状细胞株作为饲养层细胞，支持人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞向成熟的肝细胞定 向分化。
3.根据权利要求1或2所述的定向诱导分化方法，其特征在于，所述饲养层细胞是以表达人肝 细胞生长因子的重组逆转录病毒MSCV-HGF感染肝星状细胞，建立的稳定表达人肝细胞生 长因子的饲养层细胞。
4.根据权利要求1所述的定向诱导分化方法，其特征是利用间接免疫磁珠分选方法分离、富集 和纯化人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞。
5.权利要求1所述的定向诱导分化方法获得的肝细胞的应用，其特征在于获得的诱导分化的肝 细胞为肝细胞移植或生物人工肝的制备提供种子细胞。
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种体外诱导干细胞向肝细胞定向分化的方 法及其用途。
背景技术
对于各种原因(包括病毒感染、毒物、药物中毒、肿瘤、遗传代谢性疾病、肝癌术后等) 引发的终末期肝衰竭，原位肝移植是目前唯一有效的治疗手段。然而，由于供肝的极度短缺、 手术及移植本身相关的较高死亡率、终生服用免疫抑制剂及其所带来的严重甚至致命的并发 症使得肝移植在临床的广泛应用受到极大限制。随着干细胞生物学研究的不断深入，以干细 胞为种子细胞的细胞治疗、以干细胞为转运载体的基因治疗将为终末期肝衰竭患者带来新的 希望。
干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我更新和多向分化潜能及可植入 性、重建能力等特征。即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，又可以进一步 分化成为各种组织细胞，构成机体各种复杂的组织器官。干细胞分为全能干细胞(如胚胎干 细胞，可以分化为机体所有组织细胞)、多能干细胞(具有多向分化潜能，可以分化为多种组 织细胞，如间充质干细胞等)和专能干细胞(维持某一特定组织细胞的单一方向自我更新， 如肠上皮干细胞等)。干细胞技术的不断突破及干细胞本身所具有的特性使人类有可能在体外 培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织 工程以供临床所需，以此为目的的干细胞工程涉及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的 大多数医学难题，如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森 病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于人脐带血、外周血和骨髓中的多能干细胞， 具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、 自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的作用。
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是在体内广泛分布的可使多种组织再生的 实效分子。HGF对肝细胞增殖、分化、成熟的支持作用是通过特异性地与细胞膜表面受体 c-Met结合而发挥作用的。HGF作为具有重要生物学功能的细胞因子已被广泛应用于临床疾 病(如急性肝损伤、进行性肝纤维化等)的治疗，其来源主要是从人血浆和胎盘中提取纯化， 该方法制备HGF费时、费力、活性差且成本昂贵。而利用基因工程表达人HGF是大量获取 具有生物学活性HGF的有效途径之一。我们已经建立了能稳定、高效表达HGF的重组逆转 录病毒载体MSCV-HGF，期望能够使HGF得到更广泛的、科学的应用。
肝枯否氏细胞、肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)均为肝脏基质细胞，可以通过产生 可溶性细胞因子、胶原、胶原酶等创造一个对肝实质细胞的再生、增殖起到重要支持作用的 微环境。有研究表明，将肝实质细胞与基质细胞按照一定的比例混合培养会增强其生物学活 性，延长其体外生长的寿命。
β2M是哺乳动物体内广泛表达于有核细胞表面、最具保守性的蛋白，而在一些具有永生 性生长特性的肿瘤细胞及囊胚期的胚胎干细胞表面则不表达该蛋白，因此，β2M-细胞亚群被 认为是具有很强的增殖能力的细胞；c-Met是HGF的受体，HGF和c-Met之间相互作用介导 一系列信号转导在哺乳动物的肝脏形成和发育阶段发挥重要的作用，因此我们认为，在骨髓 中c-Met+细胞是一群具有向成熟肝细胞分化潜能的细胞。综上所述，c-Met+β2M-细胞是一群 存在于骨髓或脐带血中的肝干/祖细胞。
目前，国内外对于肝干细胞的研究仅证实了它的存在及可能的组成，发现了它的强大再 生和转化能力，但将其真正应用于临床尚有待时日，因此，分离不同组织来源的成体干细胞， 将其在体外诱导分化为肝细胞作为种子细胞用于肝细胞移植、生物人工肝及微囊化肝细胞制 剂等的制备，同时诱导分化的肝细胞可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物的筛选。此 方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用 前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我更新和多向分化潜能及可植入 性、重建能力等特征。即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，又可以进一步 分化成为各种组织细胞，构成机体各种复杂的组织器官。干细胞分为全能干细胞(如胚胎干 细胞，可以分化为机体所有组织细胞)、多能干细胞(具有多向分化潜能，可以分化为多种组 织细胞，如间充质干细胞等)和专能干细胞(维持某一特定组织细胞的单一方向自我更新， 如肠上皮干细胞等)。干细胞技术的不断突破及干细胞本身所具有的特性使人类有可能在体外 培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织 工程以供临床所需，以此为目的的干细胞工程涉及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的 大多数医学难题，如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森 病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于人脐带血、外周血和骨髓中的多能干细胞， 具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、 自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的作用。
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是在体内广泛分布的可使多种组织再生的 实效分子。HGF对肝细胞增殖、分化、成熟的支持作用是通过特异性地与细胞膜表面受体 c-Met结合而发挥作用的。HGF作为具有重要生物学功能的细胞因子已被广泛应用于临床疾 病(如急性肝损伤、进行性肝纤维化等)的治疗，其来源主要是从人血浆和胎盘中提取纯化， 该方法制备HGF费时、费力、活性差且成本昂贵。而利用基因工程表达人HGF是大量获取 具有生物学活性HGF的有效途径之一。我们已经建立了能稳定、高效表达HGF的重组逆转 录病毒载体MSCV-HGF，期望能够使HGF得到更广泛的、科学的应用。
肝枯否氏细胞、肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)均为肝脏基质细胞，可以通过产生 可溶性细胞因子、胶原、胶原酶等创造一个对肝实质细胞的再生、增殖起到重要支持作用的 微环境。有研究表明，将肝实质细胞与基质细胞按照一定的比例混合培养会增强其生物学活 性，延长其体外生长的寿命。
β2M是哺乳动物体内广泛表达于有核细胞表面、最具保守性的蛋白，而在一些具有永生 性生长特性的肿瘤细胞及囊胚期的胚胎干细胞表面则不表达该蛋白，因此，β2M-细胞亚群被 认为是具有很强的增殖能力的细胞；c-Met是HGF的受体，HGF和c-Met之间相互作用介导 一系列信号转导在哺乳动物的肝脏形成和发育阶段发挥重要的作用，因此我们认为，在骨髓 中c-Met+细胞是一群具有向成熟肝细胞分化潜能的细胞。综上所述，c-Met+β2M-细胞是一群 存在于骨髓或脐带血中的肝干/祖细胞。
目前，国内外对于肝干细胞的研究仅证实了它的存在及可能的组成，发现了它的强大再 生和转化能力，但将其真正应用于临床尚有待时日，因此，分离不同组织来源的成体干细胞， 将其在体外诱导分化为肝细胞作为种子细胞用于肝细胞移植、生物人工肝及微囊化肝细胞制 剂等的制备，同时诱导分化的肝细胞可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物的筛选。此 方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用 前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立一种体外诱导脐带血c-Met+β2M-细胞分化为肝细胞的 方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
利用干细胞具有多向分化的潜能，体外诱导脐带血c-Met+β2M-细胞向成熟的、有功能的 肝细胞定向分化，定向诱导分化后的肝细胞，可为肝细胞移植或体外生物人工肝的制备提供 种子细胞。
本发明中运用的体外诱导方法，是利用稳定表达人肝细胞生长因子的饲养层细胞，支持 脐带血c-Met+β2M-细胞向成熟的、有功能的肝细胞定向分化。
本发明中运用的饲养层细胞是以表达人肝细胞生长因子的重组逆转录病毒MSCV-HGF感 染肝星状细胞，建立的稳定表达人肝细胞生长因子的饲养层细胞。
本发明中的c-Met+β2M-细胞是用间接免疫磁珠分选方法分离、富集和纯化的人脐带血来 源的干细胞。
本发明利用稳定、高效表达人肝细胞生长因子的肝星状细胞株作为饲养层细胞，可支持 人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞向成熟的、有功能的肝细胞定向分化。
本发明中体外诱导干细胞向肝细胞定向分化后肝细胞可作为种子细胞用于体外生物人工 肝的制备或肝细胞移植。
具体实施方案如下：
1.分离脐带血c-Met+β2M-细胞，制备方法是：
(1)脐带血单个核细胞的分离：无菌及ACD抗凝液抗凝条件下经脐静脉穿刺取血，采集健 康足月顺产新生儿脐带血，依次经过0.5％甲基纤维素(美国，Sigma公司产品)沉降及 Ficoll(美国，Sigma公司产品，相对密度1.077g/ml)密度梯度离心后收集人脐带血 单个核细胞，洗涤后重悬于PBS中。
(2)脐带血c-Met+β2M-细胞的分离：取重悬于PBS中的人脐带血单个核细胞，先后与兔抗人 β2M抗体(美国，Santa Cruz公司产品)及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG(德国，Miltenyi 公司产品)孵育后，经MACS高梯度磁场(德国，Miltenyi公司产品)分离纯化，得到 β2M-细胞群；再将该群细胞先后与兔抗人c-Met抗体(美国，Santa Cruz公司产品) 及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG(德国，Miltenyi公司产品)孵育后，经MACS高梯度 磁场分离纯化，最终得到c-Met+β2M-细胞。
2.建立高效、稳定表达HGF的肝星状细胞株，制备方法包括以下步骤：肝星状细胞常规培 养于含10％胎牛血清的DMEM培养液(完全培养液)中，长至40％汇合后，以经0.45μm 尼龙滤膜过滤收集的重组逆转录病毒pMSCV-HGF毒液(含8μg/ml的polybrene)感染细 胞，反复感染3次(每次间隔24h)后，更换新鲜含700μg/ml G418的培养基进行筛选， 每3d换液一次，培养14d后挑出单个抗性克隆扩大培养，细胞长满60mm培养皿后收集 细胞培养上清，用ELISA方法检测每个克隆分泌HGF的水平(具体方法参见hHGF的ELISA 检测试剂盒说明书)，筛选出高效、稳定表达HGF的肝星状细胞株，同时以空载体MSCV-neo 转染肝星状细胞，建立阴性对照细胞株。
3.RT-PCR检测表达HGF的肝星状细胞株中hHGF mRNA的表达，包括以下步骤：用TRIzol试 剂提取感染HGF的肝星状细胞株、阴性对照细胞和产毒包装细胞系PT/HGF的总RNA，分 别用hHGF特异性引物和大鼠β-actin特异性引物进行RT-PCR，扩增产物经1％琼脂糖凝 胶电泳，观察hHGF mRNA的转录情况。
4.体外扩大培养表达HGF的肝星状细胞，待细胞长至90％以上汇合时接受60Co γ射线18Gy 照射，建立饲养层细胞。
5.将分离的人脐带血c-Met+β2M-细胞接种于饲养层细胞上，培养于含有烟酰胺、地塞米松、 胰岛素等的条件培养基中进行常规培养。
6.倒置显微镜下对体外诱导的干细胞从形态学上进行比较鉴定。
7.分别用RT-PCR、免疫细胞化学方法从基因转录及蛋白翻译水平鉴定肝细胞特异性基因及 蛋白的表达，包括以下步骤：用TRIzol试剂提取诱导分化前后的细胞总RNA，分别用不 同引物(见表1)进行RT-PCR及1％琼脂糖凝胶电泳，观察mRNA的转录情况；将诱导分 化后的干细胞及作为饲养层的细胞用PBS冲洗后，以丙酮于4℃固定20min后，分别与相 应的一抗及荧光素标记的二抗孵育，PBS冲洗后于荧光显微镜下观察细胞染色情况。
8.分别通过检测靛青绿吸收、排泌功能，白蛋白、尿素分泌功能等指标对诱导分化后的细胞 从功能上进行比较鉴定，包括以下步骤：将诱导分化后的细胞用PBS冲洗后，加入1mg/ml ICG于37℃孵育15min后，显微镜下观察；用PBS冲洗2遍后，换回完全培养基常规培养 4h后，再次观察；诱导分化后的细胞经PBS冲洗换用无血清的DMEM培养基，加入0.15mol/L 的NH4Cl，常规培养8h后收集细胞培养上清，在全自动生化分析仪上检测培养上清中尿素 和白蛋白的分泌量。
本发明的有益效果是；
1.按照本发明提供的技术方法，可以将人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞在体外定向诱导分化 为成熟的、有功能的肝细胞；
2.按照本发明技术方法得到的体外诱导分化的肝细胞，可作为种子细胞应用于体外生物人工 肝的制备或肝细胞移植；
3.本发明中诱导分化方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医 学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1 RT-PCR检测CFSC/HGF和CFSC/neo细胞中hHGF mRNA的表达。
M：DL2000Marker；1：高表达HGF的CFSC/HGF细胞；2：低表达HGF的CFSC/HGF 细胞；3；包装细胞系PT/HGF 4：CFSC/neo细胞。
①HGF 396bp；②β-actin 516bp。
图2 体外培养的CFSC/HGF细胞和诱导前后的hCBDCC。
2a CFSC/HGF细胞单克隆；2b扩大培养的CFSC/HGF细胞；
2c 接种于CFSC/HGF细胞饲养层上的hCBDCC；2d hCBDCC诱导第8天。
图3 RT-PCR方法检测hCBDCC诱导前后肝细胞特异性基因mRNA的表达。
M：DL2000Marker；1：HepG2细胞系；2：人胎肝细胞；
3：hCBDCC诱导前；4：hCBDCC诱导后。
①CYP1B1；②AFP；③Alb；④CK18；⑤α-tubulin
图4 免疫荧光化学检测结果
4a-d为hCBDCC诱导第8天甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(Alb)免疫荧光检测结果；
4e-h为CFSC/HGF细胞GFAP和Desmin免疫荧光检测结果。
图5 靛青绿摄取实验。
图6 细胞培养上清中白蛋白、尿素的产量
1：正常肝细胞；2：hCBDCC诱导第8天；3：hCBDCC诱导第4天；
4：hCBDCC诱导第0天；5：CFSC/HGF细胞。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
利用干细胞具有多向分化的潜能，体外诱导脐带血c-Met+β2M-细胞向成熟的、有功能的 肝细胞定向分化，定向诱导分化后的肝细胞，可为肝细胞移植或体外生物人工肝的制备提供 种子细胞。
本发明中运用的体外诱导方法，是利用稳定表达人肝细胞生长因子的饲养层细胞，支持 脐带血c-Met+β2M-细胞向成熟的、有功能的肝细胞定向分化。
本发明中运用的饲养层细胞是以表达人肝细胞生长因子的重组逆转录病毒MSCV-HGF感 染肝星状细胞，建立的稳定表达人肝细胞生长因子的饲养层细胞。
本发明中的c-Met+β2M-细胞是用间接免疫磁珠分选方法分离、富集和纯化的人脐带血来 源的干细胞。
本发明利用稳定、高效表达人肝细胞生长因子的肝星状细胞株作为饲养层细胞，可支持 人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞向成熟的、有功能的肝细胞定向分化。
本发明中体外诱导干细胞向肝细胞定向分化后肝细胞可作为种子细胞用于体外生物人工 肝的制备或肝细胞移植。
具体实施方案如下：
1.分离脐带血c-Met+β2M-细胞，制备方法是：
(1)脐带血单个核细胞的分离：无菌及ACD抗凝液抗凝条件下经脐静脉穿刺取血，采集健 康足月顺产新生儿脐带血，依次经过0.5％甲基纤维素(美国，Sigma公司产品)沉降及 Ficoll(美国，Sigma公司产品，相对密度1.077g/ml)密度梯度离心后收集人脐带血 单个核细胞，洗涤后重悬于PBS中。
(2)脐带血c-Met+β2M-细胞的分离：取重悬于PBS中的人脐带血单个核细胞，先后与兔抗人 β2M抗体(美国，Santa Cruz公司产品)及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG(德国，Miltenyi 公司产品)孵育后，经MACS高梯度磁场(德国，Miltenyi公司产品)分离纯化，得到 β2M-细胞群；再将该群细胞先后与兔抗人c-Met抗体(美国，Santa Cruz公司产品) 及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG(德国，Miltenyi公司产品)孵育后，经MACS高梯度 磁场分离纯化，最终得到c-Met+β2M-细胞。
2.建立高效、稳定表达HGF的肝星状细胞株，制备方法包括以下步骤：肝星状细胞常规培 养于含10％胎牛血清的DMEM培养液(完全培养液)中，长至40％汇合后，以经0.45μm 尼龙滤膜过滤收集的重组逆转录病毒pMSCV-HGF毒液(含8μg/ml的polybrene)感染细 胞，反复感染3次(每次间隔24h)后，更换新鲜含700μg/ml G418的培养基进行筛选， 每3d换液一次，培养14d后挑出单个抗性克隆扩大培养，细胞长满60mm培养皿后收集 细胞培养上清，用ELISA方法检测每个克隆分泌HGF的水平(具体方法参见hHGF的ELISA 检测试剂盒说明书)，筛选出高效、稳定表达HGF的肝星状细胞株，同时以空载体MSCV-neo 转染肝星状细胞，建立阴性对照细胞株。
3.RT-PCR检测表达HGF的肝星状细胞株中hHGF mRNA的表达，包括以下步骤：用TRIzol试 剂提取感染HGF的肝星状细胞株、阴性对照细胞和产毒包装细胞系PT/HGF的总RNA，分 别用hHGF特异性引物和大鼠β-actin特异性引物进行RT-PCR，扩增产物经1％琼脂糖凝 胶电泳，观察hHGF mRNA的转录情况。
4.体外扩大培养表达HGF的肝星状细胞，待细胞长至90％以上汇合时接受60Co γ射线18Gy 照射，建立饲养层细胞。
5.将分离的人脐带血c-Met+β2M-细胞接种于饲养层细胞上，培养于含有烟酰胺、地塞米松、 胰岛素等的条件培养基中进行常规培养。
6.倒置显微镜下对体外诱导的干细胞从形态学上进行比较鉴定。
7.分别用RT-PCR、免疫细胞化学方法从基因转录及蛋白翻译水平鉴定肝细胞特异性基因及 蛋白的表达，包括以下步骤：用TRIzol试剂提取诱导分化前后的细胞总RNA，分别用不 同引物(见表1)进行RT-PCR及1％琼脂糖凝胶电泳，观察mRNA的转录情况；将诱导分 化后的干细胞及作为饲养层的细胞用PBS冲洗后，以丙酮于4℃固定20min后，分别与相 应的一抗及荧光素标记的二抗孵育，PBS冲洗后于荧光显微镜下观察细胞染色情况。
8.分别通过检测靛青绿吸收、排泌功能，白蛋白、尿素分泌功能等指标对诱导分化后的细胞 从功能上进行比较鉴定，包括以下步骤：将诱导分化后的细胞用PBS冲洗后，加入1mg/ml ICG于37℃孵育15min后，显微镜下观察；用PBS冲洗2遍后，换回完全培养基常规培养 4h后，再次观察；诱导分化后的细胞经PBS冲洗换用无血清的DMEM培养基，加入0.15mol/L 的NH4Cl，常规培养8h后收集细胞培养上清，在全自动生化分析仪上检测培养上清中尿素 和白蛋白的分泌量。
本发明的有益效果是；
1.按照本发明提供的技术方法，可以将人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞在体外定向诱导分化 为成熟的、有功能的肝细胞；
2.按照本发明技术方法得到的体外诱导分化的肝细胞，可作为种子细胞应用于体外生物人工 肝的制备或肝细胞移植；
3.本发明中诱导分化方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医 学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1 RT-PCR检测CFSC/HGF和CFSC/neo细胞中hHGF mRNA的表达。
M：DL2000Marker；1：高表达HGF的CFSC/HGF细胞；2：低表达HGF的CFSC/HGF 细胞；3；包装细胞系PT/HGF 4：CFSC/neo细胞。
①HGF 396bp；②β-actin 516bp。
图2 体外培养的CFSC/HGF细胞和诱导前后的hCBDCC。
2a CFSC/HGF细胞单克隆；2b扩大培养的CFSC/HGF细胞；
2c 接种于CFSC/HGF细胞饲养层上的hCBDCC；2d hCBDCC诱导第8天。
图3 RT-PCR方法检测hCBDCC诱导前后肝细胞特异性基因mRNA的表达。
M：DL2000Marker；1：HepG2细胞系；2：人胎肝细胞；
3：hCBDCC诱导前；4：hCBDCC诱导后。
①CYP1B1；②AFP；③Alb；④CK18；⑤α-tubulin
图4 免疫荧光化学检测结果
4a-d为hCBDCC诱导第8天甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(Alb)免疫荧光检测结果；
4e-h为CFSC/HGF细胞GFAP和Desmin免疫荧光检测结果。
图5 靛青绿摄取实验。
图6 细胞培养上清中白蛋白、尿素的产量
1：正常肝细胞；2：hCBDCC诱导第8天；3：hCBDCC诱导第4天；
4：hCBDCC诱导第0天；5：CFSC/HGF细胞。
具体实施方式
实施例1、脐带血单个核细胞的分离
无菌及ACD抗凝液抗凝条件下经脐静脉穿刺取血，采集健康足月顺产新生儿脐带血， 按4∶1与0.5％甲基纤维素(美国，Sigma公司产品)混匀，沉降红细胞；吸出上清部分置离 心管中离心，弃上清后，以PBS重悬细胞，加入Ficoll(美国，Sigma公司产品，相对密度 1.077g/ml)密度梯度离心后收集人脐带血单个核细胞，洗涤后重悬于PBS中。
实施例2、人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞(hCBDCC)的分离
取重悬于PBS中的人脐带血单个核细胞，先后与兔抗人β2M抗体(美国，Santa Cruz公 司产品)及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG(德国，Miltenyi公司产品)孵育后，经MACS高 梯度磁场(德国，Miltenyi公司产品)分离纯化，得到β2M-细胞群；再将该群细胞先后与兔 抗人c-Met抗体(美国，Santa Cruz公司产品)及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG(德国，Miltenyi 公司产品)孵育后，经MACS高梯度磁场分离纯化，最终得到c-Met+β2M-细胞(hCBDCC)。
实施例3、大鼠骨髓Thy-1+β2M-细胞的分离
雄性F344大鼠经腹剖开后取出股骨，用完全培养液反复冲洗出骨髓细胞，经200目筛网 过滤后，重悬于PBS中，经Ficoll(ρ＝1.083g/ml)密度梯度离心获得大鼠骨髓单个核细胞，先 后与兔抗大鼠β2M抗体(美国，Santa Cruz公司产品)及免疫磁珠标记的羊抗兔IgG(德国， Miltenyi公司产品)孵育后，经MACS高梯度磁场(德国，Miltenyi公司产品)分离纯化， 得到β2M-细胞；再将收集到的β2M-细胞与兔抗大鼠Thy-1抗体(美国，Santa Cruz公司产品) 和免疫磁珠标记的羊抗兔IgG(德国，Miltenyi公司产品)孵育后，经MACS高梯度磁场(德 国，Miltenyi公司产品)分选，最终得到大鼠骨髓来源的Thy-1+β2M-细胞(BDTCs)。
实施例4、人肝细胞生长因子基因重组逆转录病毒载体(MSCV-HGF)的构建
步骤如下：
(1)根据hHGF-cDNA编码区的序列并分别引入Hpa I和BamH I酶切位点合成引物，以 pcDNA3-HGF质粒为模板克隆到HGF质粒。
(2)将带有Hpa I和BamH I酶切位点的HGF质粒插入到pMSCVneo载体的多克隆位点上， 获得携带目的基因的逆转录病毒载体pMSCV-HGF。
(3)经限制性内切酶消化及DNA序列测定证实克隆的目的基因序列正确，重组逆转录病毒 载体pMSCV-HGF构建成功。
实施例5、高效、稳定表达HGF的肝基质细胞株的筛选和建立
以肝星状细胞系CFSC为例，将CFSC常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液(完 全培养液)中，长至40％汇合后，以经0.45μm尼龙滤膜过滤收集的重组逆转录病毒 pMSCV-HGF毒液(含8μg/ml的polybrene)感染CFSC，反复感染3次(每次间隔24h)后， 更换新鲜含700μg/ml G418的培养基进行筛选，每3d换液一次，培养14d后挑出单个抗性克 隆扩大培养，细胞长满60mm培养皿后收集细胞培养上清，用ELISA方法检测每个克隆分泌 HGF的水平(具体方法参见hHGF的ELISA检测试剂盒说明书)，筛选出高效、稳定表达HGF (达到11.79ng/ml)的CFSC细胞株，命名为CFSC/HGF。同时以空载体MSCV-neo转染CFSC， 建立阴性对照细胞株CFSC/neo。
实施例6、RT-PCR检测CFSC/HGF中hHGF mRNA的表达
用TRIzol试剂提取感染HGF的CFSC、阴性对照细胞CFSC/neo和产毒包装细胞系 PT/HGF的总RNA，分别用hHGF特异性引物P1、P2和大鼠β-actin特异性引物P3、P4进行 RT-PCR，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，观察hHGF mRNA的转录情况。
P1：5′-GTTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′；P2：5′-GAGCCAGGGCAGTAATCTC-3′；
P3：5′-GTTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′；P4：5′-GAGCCAGGGCAGTAATCTC-3′。
结果发现，表达HGF的CFSC和PT/HGF细胞出现396bp的扩增条带，而感染空载体的 细胞CFSC/neo未见阳性条带，证实hHGF基因在目的细胞中有转录(见图1)。
实施例7、将hCBDCC在饲养细胞层上进行常规培养及形态学观察
将CFSC/HGF细胞按5×105/ml接种于60mm培养板中常规培养，20h后以60Coγ射线 18Gy照射。将分离纯化的hCBDCC按3×105/ml接种于其上，培养于含有烟酰胺、地塞米松、 胰岛素等的诱导培养基中。常规培养4～8d后于倒置相差显微镜下观察，发现部分hCBDCC 体积明显增大，出现大而圆的单个甚至多个细胞核，胞质丰富，分裂相多见。
实施例8、对体外诱导分化的hCBDCC从表型和功能上进行鉴定
4.1.RT-PCR方法检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(albumin，Alb)、细胞角蛋白18(CK18)、 细胞色素P4501B1(CYP1B1)的表达
用TRIzol试剂提取诱导分化前后的细胞总RNA，分别用下述引物(见表1)进行RT-PCR 及1％琼脂糖凝胶电泳，观察mRNA的转录情况。结果发现，诱导分化前细胞不表达CK18 和CYP1B1，弱表达AFP和Alb，分化后细胞均表达上述4个基因(见图3)。
表1 RT-PCR引物名称、序列及扩增片段长度 基因名称 引物序列 扩增片段长度(bp) AFP Albumin CK19 CYP1B1 α-tubulin S：5′-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3′ A：5′-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3′ S：5′-TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGG-3′ A：5′-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3′ S：5′-ATGGCCGAGCAGAACCGGAA-3′ A：5′-CCATGAGCCGCTGGTACTCC-3′ S：5′-GAGAACGTACCGGCCACTATCACT-3′ A：5′-GTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT-3′ S：5′-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3′ A：5′-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGCTC-3′ 217 162 328 357 528
4.2.免疫细胞化学方法检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(Alb)、神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)及结蛋白(Desmin)的表达
将诱导分化8d的hCBDCC及作为饲养层的CFSC/HGF细胞用PBS冲洗后，以丙酮于4℃ 固定20min后，分别与相应的一抗及荧光素标记的二抗孵育，PBS冲洗后于荧光显微镜下观 察细胞染色情况。结果发现，c-Met+β2M-细胞诱导分化后表达AFP和Alb而饲养层细胞表达 GFAP及Desmin(见图4)。
4.3.靛青绿(ICG)吸收、排泌功能的检测
将诱导分化8d的hCBDCC用PBS冲洗后，加入1mg/ml ICG于37℃孵育15min后，显 微镜下观察到体积增大的hCBDCC被染成深绿色，而形态无变化的hCBDCC及饲养层细胞 颜色无变化。用PBS冲洗2遍后，换回完全培养基常规培养4h后，着色细胞的颜色褪去(见 图5)。
4.4.细胞培养上清中尿素和白蛋白的产量
诱导分化8d的hCBDCC经PBS冲洗换用无血清的DMEM培养基，加入0.15mol/L的 NH4Cl，常规培养8h后收集细胞培养上清，在全自动生化分析仪上检测培养上清中尿素和白 蛋白的分泌量。结果发现c-Met+β2M-细胞随着诱导时间的延长，白蛋白和尿素产量逐渐增加 (见图6)。
实施例9、将大鼠BDTCs在饲养细胞层上进行常规培养及形态学观察
将CFSC/HGF细胞按5×105/ml接种于60mm培养板中常规培养，20h后以60Co γ射线 18Gy照射。将BDTCs按5×104/cm2接种于其上，培养于含有烟酰胺、地塞米松、胰岛素等 的条件培养基中。常规培养4～8d后于倒置相差显微镜下观察，发现自培养第4天起，部分细 胞体积增大，至第7天体积明显增大，出现大而圆的单个、双个甚至多个细胞核，胞浆丰富， 部分细胞处于分裂相。
实施例10、对体外诱导分化的BDTCs从表型和功能上进行鉴定
4.1.RT-PCR方法检测肝细胞核因子(HNF)3β、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(albumin， Alb)、细胞角蛋白18(CK18)、细胞角蛋白19(CK19)、细胞色素P4501B1(CYP1B1) 的表达
用TRIzol试剂提取诱导分化前后的细胞总RNA，进行RT-PCR及2％琼脂糖凝胶电泳，观 察mRNA的转录情况。结果发现，诱导分化前细胞不表达HNF3β，CK18，CK19和CYP1B1， 弱表达AFP和Alb，分化后细胞均表达上述6个基因。
4.2.免疫细胞化学方法检测白蛋白(Alb)和角蛋白(CK18)的表达
将诱导分化7d的BDTCs及作为饲养层的CFSC/HGF细胞用PBS冲洗后，以丙酮于4℃ 固定30min和0.1％Triton X-100/PBS孵育20min后，先后与抗白蛋白抗血清和FITC标记的 二抗以及与抗CK18抗体和TRITC标记的二抗孵育，PBS冲洗后于荧光显微镜下观察细胞染 色情况。结果发现，细胞诱导分化后表达Alb和CK18。
4.3.靛青绿(ICG)吸收、排泌功能的检测
向诱导体系中加入1mg/ml ICG于37℃孵育15min后，显微镜下观察到体积增大的BDTCs 被染成深绿色，而形态无变化的BDTCs及饲养层细胞颜色无变化。用PBS冲洗2遍后，换 回完全培养基常规培养4h后，着色细胞的颜色褪去。
4.4.细胞培养上清中尿素和白蛋白的产量
诱导分化7d的BDTCs经PBS冲洗换用无血清的DMEM培养基，加入0.15mol/L的 NH4Cl，常规培养8h后收集细胞培养上清，在全自动生化分析仪上检测培养上清中尿素和白 蛋白的分泌量。结果发现在CFSC/HGF的支持下，BDTCs诱导分化后具有与正常肝细胞类似 的氨基代谢产生尿素和分泌白蛋白的功能。
无菌及ACD抗凝液抗凝条件下经脐静脉穿刺取血，采集健康足月顺产新生儿脐带血， 按4∶1与0.5％甲基纤维素(美国，Sigma公司产品)混匀，沉降红细胞；吸出上清部分置离 心管中离心，弃上清后，以PBS重悬细胞，加入Ficoll(美国，Sigma公司产品，相对密度 1.077g/ml)密度梯度离心后收集人脐带血单个核细胞，洗涤后重悬于PBS中。
实施例2、人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞(hCBDCC)的分离
取重悬于PBS中的人脐带血单个核细胞，先后与兔抗人β2M抗体(美国，Santa Cruz公 司产品)及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG(德国，Miltenyi公司产品)孵育后，经MACS高 梯度磁场(德国，Miltenyi公司产品)分离纯化，得到β2M-细胞群；再将该群细胞先后与兔 抗人c-Met抗体(美国，Santa Cruz公司产品)及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG(德国，Miltenyi 公司产品)孵育后，经MACS高梯度磁场分离纯化，最终得到c-Met+β2M-细胞(hCBDCC)。
实施例3、大鼠骨髓Thy-1+β2M-细胞的分离
雄性F344大鼠经腹剖开后取出股骨，用完全培养液反复冲洗出骨髓细胞，经200目筛网 过滤后，重悬于PBS中，经Ficoll(ρ＝1.083g/ml)密度梯度离心获得大鼠骨髓单个核细胞，先 后与兔抗大鼠β2M抗体(美国，Santa Cruz公司产品)及免疫磁珠标记的羊抗兔IgG(德国， Miltenyi公司产品)孵育后，经MACS高梯度磁场(德国，Miltenyi公司产品)分离纯化， 得到β2M-细胞；再将收集到的β2M-细胞与兔抗大鼠Thy-1抗体(美国，Santa Cruz公司产品) 和免疫磁珠标记的羊抗兔IgG(德国，Miltenyi公司产品)孵育后，经MACS高梯度磁场(德 国，Miltenyi公司产品)分选，最终得到大鼠骨髓来源的Thy-1+β2M-细胞(BDTCs)。
实施例4、人肝细胞生长因子基因重组逆转录病毒载体(MSCV-HGF)的构建
步骤如下：
(1)根据hHGF-cDNA编码区的序列并分别引入Hpa I和BamH I酶切位点合成引物，以 pcDNA3-HGF质粒为模板克隆到HGF质粒。
(2)将带有Hpa I和BamH I酶切位点的HGF质粒插入到pMSCVneo载体的多克隆位点上， 获得携带目的基因的逆转录病毒载体pMSCV-HGF。
(3)经限制性内切酶消化及DNA序列测定证实克隆的目的基因序列正确，重组逆转录病毒 载体pMSCV-HGF构建成功。
实施例5、高效、稳定表达HGF的肝基质细胞株的筛选和建立
以肝星状细胞系CFSC为例，将CFSC常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液(完 全培养液)中，长至40％汇合后，以经0.45μm尼龙滤膜过滤收集的重组逆转录病毒 pMSCV-HGF毒液(含8μg/ml的polybrene)感染CFSC，反复感染3次(每次间隔24h)后， 更换新鲜含700μg/ml G418的培养基进行筛选，每3d换液一次，培养14d后挑出单个抗性克 隆扩大培养，细胞长满60mm培养皿后收集细胞培养上清，用ELISA方法检测每个克隆分泌 HGF的水平(具体方法参见hHGF的ELISA检测试剂盒说明书)，筛选出高效、稳定表达HGF (达到11.79ng/ml)的CFSC细胞株，命名为CFSC/HGF。同时以空载体MSCV-neo转染CFSC， 建立阴性对照细胞株CFSC/neo。
实施例6、RT-PCR检测CFSC/HGF中hHGF mRNA的表达
用TRIzol试剂提取感染HGF的CFSC、阴性对照细胞CFSC/neo和产毒包装细胞系 PT/HGF的总RNA，分别用hHGF特异性引物P1、P2和大鼠β-actin特异性引物P3、P4进行 RT-PCR，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，观察hHGF mRNA的转录情况。
P1：5′-GTTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′；P2：5′-GAGCCAGGGCAGTAATCTC-3′；
P3：5′-GTTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′；P4：5′-GAGCCAGGGCAGTAATCTC-3′。
结果发现，表达HGF的CFSC和PT/HGF细胞出现396bp的扩增条带，而感染空载体的 细胞CFSC/neo未见阳性条带，证实hHGF基因在目的细胞中有转录(见图1)。
实施例7、将hCBDCC在饲养细胞层上进行常规培养及形态学观察
将CFSC/HGF细胞按5×105/ml接种于60mm培养板中常规培养，20h后以60Coγ射线 18Gy照射。将分离纯化的hCBDCC按3×105/ml接种于其上，培养于含有烟酰胺、地塞米松、 胰岛素等的诱导培养基中。常规培养4～8d后于倒置相差显微镜下观察，发现部分hCBDCC 体积明显增大，出现大而圆的单个甚至多个细胞核，胞质丰富，分裂相多见。
实施例8、对体外诱导分化的hCBDCC从表型和功能上进行鉴定
4.1.RT-PCR方法检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(albumin，Alb)、细胞角蛋白18(CK18)、 细胞色素P4501B1(CYP1B1)的表达
用TRIzol试剂提取诱导分化前后的细胞总RNA，分别用下述引物(见表1)进行RT-PCR 及1％琼脂糖凝胶电泳，观察mRNA的转录情况。结果发现，诱导分化前细胞不表达CK18 和CYP1B1，弱表达AFP和Alb，分化后细胞均表达上述4个基因(见图3)。
表1 RT-PCR引物名称、序列及扩增片段长度 基因名称 引物序列 扩增片段长度(bp) AFP Albumin CK19 CYP1B1 α-tubulin S：5′-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3′ A：5′-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3′ S：5′-TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGG-3′ A：5′-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3′ S：5′-ATGGCCGAGCAGAACCGGAA-3′ A：5′-CCATGAGCCGCTGGTACTCC-3′ S：5′-GAGAACGTACCGGCCACTATCACT-3′ A：5′-GTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT-3′ S：5′-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3′ A：5′-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGCTC-3′ 217 162 328 357 528
4.2.免疫细胞化学方法检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(Alb)、神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)及结蛋白(Desmin)的表达
将诱导分化8d的hCBDCC及作为饲养层的CFSC/HGF细胞用PBS冲洗后，以丙酮于4℃ 固定20min后，分别与相应的一抗及荧光素标记的二抗孵育，PBS冲洗后于荧光显微镜下观 察细胞染色情况。结果发现，c-Met+β2M-细胞诱导分化后表达AFP和Alb而饲养层细胞表达 GFAP及Desmin(见图4)。
4.3.靛青绿(ICG)吸收、排泌功能的检测
将诱导分化8d的hCBDCC用PBS冲洗后，加入1mg/ml ICG于37℃孵育15min后，显 微镜下观察到体积增大的hCBDCC被染成深绿色，而形态无变化的hCBDCC及饲养层细胞 颜色无变化。用PBS冲洗2遍后，换回完全培养基常规培养4h后，着色细胞的颜色褪去(见 图5)。
4.4.细胞培养上清中尿素和白蛋白的产量
诱导分化8d的hCBDCC经PBS冲洗换用无血清的DMEM培养基，加入0.15mol/L的 NH4Cl，常规培养8h后收集细胞培养上清，在全自动生化分析仪上检测培养上清中尿素和白 蛋白的分泌量。结果发现c-Met+β2M-细胞随着诱导时间的延长，白蛋白和尿素产量逐渐增加 (见图6)。
实施例9、将大鼠BDTCs在饲养细胞层上进行常规培养及形态学观察
将CFSC/HGF细胞按5×105/ml接种于60mm培养板中常规培养，20h后以60Co γ射线 18Gy照射。将BDTCs按5×104/cm2接种于其上，培养于含有烟酰胺、地塞米松、胰岛素等 的条件培养基中。常规培养4～8d后于倒置相差显微镜下观察，发现自培养第4天起，部分细 胞体积增大，至第7天体积明显增大，出现大而圆的单个、双个甚至多个细胞核，胞浆丰富， 部分细胞处于分裂相。
实施例10、对体外诱导分化的BDTCs从表型和功能上进行鉴定
4.1.RT-PCR方法检测肝细胞核因子(HNF)3β、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(albumin， Alb)、细胞角蛋白18(CK18)、细胞角蛋白19(CK19)、细胞色素P4501B1(CYP1B1) 的表达
用TRIzol试剂提取诱导分化前后的细胞总RNA，进行RT-PCR及2％琼脂糖凝胶电泳，观 察mRNA的转录情况。结果发现，诱导分化前细胞不表达HNF3β，CK18，CK19和CYP1B1， 弱表达AFP和Alb，分化后细胞均表达上述6个基因。
4.2.免疫细胞化学方法检测白蛋白(Alb)和角蛋白(CK18)的表达
将诱导分化7d的BDTCs及作为饲养层的CFSC/HGF细胞用PBS冲洗后，以丙酮于4℃ 固定30min和0.1％Triton X-100/PBS孵育20min后，先后与抗白蛋白抗血清和FITC标记的 二抗以及与抗CK18抗体和TRITC标记的二抗孵育，PBS冲洗后于荧光显微镜下观察细胞染 色情况。结果发现，细胞诱导分化后表达Alb和CK18。
4.3.靛青绿(ICG)吸收、排泌功能的检测
向诱导体系中加入1mg/ml ICG于37℃孵育15min后，显微镜下观察到体积增大的BDTCs 被染成深绿色，而形态无变化的BDTCs及饲养层细胞颜色无变化。用PBS冲洗2遍后，换 回完全培养基常规培养4h后，着色细胞的颜色褪去。
4.4.细胞培养上清中尿素和白蛋白的产量
诱导分化7d的BDTCs经PBS冲洗换用无血清的DMEM培养基，加入0.15mol/L的 NH4Cl，常规培养8h后收集细胞培养上清，在全自动生化分析仪上检测培养上清中尿素和白 蛋白的分泌量。结果发现在CFSC/HGF的支持下，BDTCs诱导分化后具有与正常肝细胞类似 的氨基代谢产生尿素和分泌白蛋白的功能。
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