一种肝细胞的体外组织化培养方法
阅读：256发布：2020-07-23
专利汇可以提供一种肝细胞的体外组织化培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种原代 肝细胞 的体外组织化培养方法，它是将肝细胞与添加了胶原的培养基混合后，注入中空 纤维 内腔进行培养，使悬浮肝细胞在内腔中自动形成肝细胞聚球体。通过调节培养基中的胶原浓度，可以得到组织化肝细胞聚球体。该方法简化了肝细胞聚球体的形成途径，方便了其在 生物 人工肝 反应器中的应用，同时也适用于肝细胞培养的其它应用研究如药物肝毒性研究，是一种更有效的肝细胞体外培养方法。，下面是一种肝细胞的体外组织化培养方法专利的具体信息内容。
技术领域
本发明涉及一种动物细胞的体外培养方法，特别地，涉及一种肝细胞的体 外组织化培养方法。
背景技术
肝脏是人体中的重要器官，具有合成、代谢、解毒等功能。用体外培养的 原代动物肝细胞模型来模拟肝脏在体内的生物学功能是目前的重要研究方向之 一。现有的肝细胞体外培养方式大都采用二维的单层培养，肝细胞需要在培养 容器的表面上才能贴壁生长，细胞呈岛状，而且蛋白尿素以及各种药物代谢功 能往往在数天内显著下降甚至完全丧失，存活期通常在一周左右。因此单层培 养的细胞表型、功能与体内肝细胞有很大差异，还无法代替体内肝细胞完成肝 功能。为了更好地研究实现肝细胞在体内的重要功能，目前已发展出若干三维 培养技术，如通过胶原凝胶包埋或者形成肝细胞聚球体，使肝细胞在体外培养 过程中采用与体内生理状态更接近的方式进行培养。其中肝细胞聚球体培养是 目前研究最受关注的培养方法。
目前常见的形成肝细胞聚球体方式有：转瓶培养、培养基中添加高分子物 质、培养容器表面高分子涂层等。其中大多聚球体形成缓慢，形成率也较低。 若将形成的聚球体应用到生物人工肝反应器上还需经过聚球体收集、包埋、固 定等步骤，实际应用过程比较复杂。
目前常见的形成肝细胞聚球体方式有：转瓶培养、培养基中添加高分子物 质、培养容器表面高分子涂层等。其中大多聚球体形成缓慢，形成率也较低。 若将形成的聚球体应用到生物人工肝反应器上还需经过聚球体收集、包埋、固 定等步骤，实际应用过程比较复杂。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能使肝细胞在体外快速、 高效地形成聚球体，且无需经过聚球体的收集步骤就能直接应用于生物人工肝 反应器的组织化培养方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种肝细胞的体外组织化培养方法， 其特征在于，包括：
(1)培养基添加胶原，把I型胶原溶液加入含胎牛血清的Williams’E 培养基，混匀。
(2)调节溶液pH值及渗透压。
(3)与原代肝细胞混匀，将肝细胞接种于混合溶液，混匀。
(4)注入聚砜中空纤维丝内腔培养。
本发明具有以下技术效果：通过简单的操作，使肝细胞在体外迅速高效地 形成聚球体，可以长期保持其生物学活性及特异性功能；同时通过控制培养基 中的胶原浓度，可以得到不同的组织化形态聚球体；并且此种形成聚球体方法 可以直接在中空纤维式生物人工肝反应器内原位进行，无需额外的聚球体转移 等操作步骤，大大简化了该反应器的操作步骤，方便了聚球体在生物人工肝反 应器中的应用。
附图说明
图1是实施例1的大鼠肝细胞聚球体的扫描电镜图，其中，a为400倍扫描 电镜图片，b为10000倍扫描电镜图片；
图2是不同培养时间大鼠肝细胞聚球体光学显微镜照片，其中，a为肝细胞 在0小时的形态，b、c、d分别代表实施例1中24小时，48小时以及144小 时大鼠肝细胞的形态；e、f分别代表实施例2、3中144小时大鼠肝细胞的形态； g、h、i分别代表实施例4中24小时、48小时以及144小时大鼠肝细胞的形态。 j为不添加胶原的对照组肝细胞在144小时的形态。
图3、图4、图5、图6分别是实施例1、2、3、4的尿素合成随时间变化曲 线，其中，“□”代表聚球体组，“◇”代表平板单层培养组，“△”代表不添加 胶原的对照组，每组均重复三次，图中误差线代表三组之间的标准误差。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种肝细胞的体外组织化培养方法， 其特征在于，包括：
(1)培养基添加胶原，把I型胶原溶液加入含胎牛血清的Williams’E 培养基，混匀。
(2)调节溶液pH值及渗透压。
(3)与原代肝细胞混匀，将肝细胞接种于混合溶液，混匀。
(4)注入聚砜中空纤维丝内腔培养。
本发明具有以下技术效果：通过简单的操作，使肝细胞在体外迅速高效地 形成聚球体，可以长期保持其生物学活性及特异性功能；同时通过控制培养基 中的胶原浓度，可以得到不同的组织化形态聚球体；并且此种形成聚球体方法 可以直接在中空纤维式生物人工肝反应器内原位进行，无需额外的聚球体转移 等操作步骤，大大简化了该反应器的操作步骤，方便了聚球体在生物人工肝反 应器中的应用。
附图说明
图1是实施例1的大鼠肝细胞聚球体的扫描电镜图，其中，a为400倍扫描 电镜图片，b为10000倍扫描电镜图片；
图2是不同培养时间大鼠肝细胞聚球体光学显微镜照片，其中，a为肝细胞 在0小时的形态，b、c、d分别代表实施例1中24小时，48小时以及144小 时大鼠肝细胞的形态；e、f分别代表实施例2、3中144小时大鼠肝细胞的形态； g、h、i分别代表实施例4中24小时、48小时以及144小时大鼠肝细胞的形态。 j为不添加胶原的对照组肝细胞在144小时的形态。
图3、图4、图5、图6分别是实施例1、2、3、4的尿素合成随时间变化曲 线，其中，“□”代表聚球体组，“◇”代表平板单层培养组，“△”代表不添加 胶原的对照组，每组均重复三次，图中误差线代表三组之间的标准误差。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明具体实施例。
实施例1
取0.07mg/mL的I型鼠尾胶原溶液(鼠尾胶原制备方法参考文献G. Michalopoulos，H.C.Pitot.，Primary Culture of Parenchymal Liver Cells on Collagen Membranes，Exp Cell Res，1975，94，p.70)60μL加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛 血清的Williams’E培养基，混匀后调节溶液pH值至7.4±0.2，渗透压至 260-320mOsm/kg，溶液中胶原浓度为1μg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝 细胞按106cells/mL密度接种于此混合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶 液中后，注入截留分子量为100kDa的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将 16根长度为4cm的中空丝放入直径为5cm的塑料培养皿内，加入5ml含5％胎牛 血清的Williams’E培养基，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养，每48小时 更换培养基。
作为空白对照组，用同样的方法将同批大鼠肝细胞包埋入中空纤维丝内， 但内腔培养基中不添加任何胶原。培养方法同上。
同时，再将同批大鼠肝细胞按0.16×106cells/mL接入5mL含5％胎牛血清 的Williams’E培养基，在铺有鼠尾胶原的平皿上贴壁培养，每48小时更换 培养基。
各重复三组，测定肝功能指标：尿素合成量，观察细胞形态。
结果如附图1、2(b，c，d，j)及附图3所示；图中，箭头所指为正在形 成或已经形成的大鼠肝细胞聚球体；另外，各图放大倍数均相同。
由附图1(a)可见，由大鼠肝细胞所形成的聚球体结构完整，细胞间结合 紧密，由附图1(b)可见，在较高放大倍数下可见聚球体表面密布微胆管结构， 并有一些直径2μm左右的小孔；由附图2(b，c，d)可见，肝细胞在24小时 内就开始聚集，48小时已基本形成聚球体，聚球体表面黏附较多单个死细胞， 144小时后聚球体形态良好，显微镜下观察表面光滑，鲜有单个死细胞吸附；由 附图2(j)可见，不添加胶原的对照组肝细胞在144小时后未形成任何聚球体， 肝细胞有一定程度的聚集，但细胞间结合不紧密，可以明显分辨出单个细胞， 细胞活率也较低，死细胞大多已开始胞裂，样品中可见大量细胞碎片；由附图3 可见聚球体形式培养的肝细胞尿素合成功能要优于单层贴壁培养，不添加胶原 的对照组尿素合成量最低，说明以此种聚球体形式培养的肝细胞保持了较高的 生物学功能。
实施例2
取7mg/mL的I型鼠尾胶原溶液60μL加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛血清 的Williams’E培养基，混匀后调节溶液pH值及渗透压，溶液中胶原浓度为 0.1mg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/mL密度接种于此混 合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶液中后，注入截留分子量为1000kDa 的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将16×4cm中空丝放入5cm塑料培养 皿内，培养条件及对照组同具体实例1。
各重复三组，测定尿素合成量，观察细胞形态。
聚球体144小时时的形态见附图2-h，其形成过程及聚球体形态与具体实施 例1基本相同。尿素合成量随培养时间变化曲线如附图4所示，同样优于单层 贴壁培养以及空白对照组。
实施例3
取7mg/L的I型牛跟腱胶原(购自Worthington Biochemical Co.)60μL 加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛血清的Williams’E培养基，混匀后调节溶液 pH值及渗透压，溶液中胶原浓度为0.1mg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝细 胞按106cells/mL密度接种于此混合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶液 中后，注入截留分子量为600kDa的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将16 ×4cm中空丝放入5cm塑料培养皿内，培养条件及对照组同具体实例1。
各重复三组，测定尿素合成量，观察细胞形态。
聚球体144小时时的形态见附图2-f，虽然使用了不同来源的胶原，但是聚 球体的形成过程及最终形态与具体实施例1非常类似。可见胶原的来源对于聚 球体的形成并无重要影响。其尿素合成量随培养时间变化曲线如附图5所示， 亦同样优于单层贴壁培养以及空白对照组。
实施例4
取7mg/mL的I型鼠尾胶原溶液650μL加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛血 清的Williams’E培养基，混匀后调节溶液pH值及渗透压，溶液中胶原浓度 为0.98mg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/mL密度接种于此 混合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶液中后，注入截留分子量为100kDa 的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将16×4cm中空丝放入5cm塑料培养 皿内，培养条件及对照组同具体实例1。
各重复三组，测定尿素合成量，观察细胞形态。
肝细胞聚集过程及形态变化如附图2-g、h、i所示，由于胶原浓度较大， 对肝细胞的移动产生较大的阻力，使得肝细胞在144小时左右才形成聚集程度 较高的柱状聚球体。此种形式聚球体的尿素合成量随培养时间变化曲线如附图6 所示，并优于单层贴壁培养以及空白对照组。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的 精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发 明的保护范围。
实施例1
取0.07mg/mL的I型鼠尾胶原溶液(鼠尾胶原制备方法参考文献G. Michalopoulos，H.C.Pitot.，Primary Culture of Parenchymal Liver Cells on Collagen Membranes，Exp Cell Res，1975，94，p.70)60μL加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛 血清的Williams’E培养基，混匀后调节溶液pH值至7.4±0.2，渗透压至 260-320mOsm/kg，溶液中胶原浓度为1μg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝 细胞按106cells/mL密度接种于此混合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶 液中后，注入截留分子量为100kDa的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将 16根长度为4cm的中空丝放入直径为5cm的塑料培养皿内，加入5ml含5％胎牛 血清的Williams’E培养基，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养，每48小时 更换培养基。
作为空白对照组，用同样的方法将同批大鼠肝细胞包埋入中空纤维丝内， 但内腔培养基中不添加任何胶原。培养方法同上。
同时，再将同批大鼠肝细胞按0.16×106cells/mL接入5mL含5％胎牛血清 的Williams’E培养基，在铺有鼠尾胶原的平皿上贴壁培养，每48小时更换 培养基。
各重复三组，测定肝功能指标：尿素合成量，观察细胞形态。
结果如附图1、2(b，c，d，j)及附图3所示；图中，箭头所指为正在形 成或已经形成的大鼠肝细胞聚球体；另外，各图放大倍数均相同。
由附图1(a)可见，由大鼠肝细胞所形成的聚球体结构完整，细胞间结合 紧密，由附图1(b)可见，在较高放大倍数下可见聚球体表面密布微胆管结构， 并有一些直径2μm左右的小孔；由附图2(b，c，d)可见，肝细胞在24小时 内就开始聚集，48小时已基本形成聚球体，聚球体表面黏附较多单个死细胞， 144小时后聚球体形态良好，显微镜下观察表面光滑，鲜有单个死细胞吸附；由 附图2(j)可见，不添加胶原的对照组肝细胞在144小时后未形成任何聚球体， 肝细胞有一定程度的聚集，但细胞间结合不紧密，可以明显分辨出单个细胞， 细胞活率也较低，死细胞大多已开始胞裂，样品中可见大量细胞碎片；由附图3 可见聚球体形式培养的肝细胞尿素合成功能要优于单层贴壁培养，不添加胶原 的对照组尿素合成量最低，说明以此种聚球体形式培养的肝细胞保持了较高的 生物学功能。
实施例2
取7mg/mL的I型鼠尾胶原溶液60μL加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛血清 的Williams’E培养基，混匀后调节溶液pH值及渗透压，溶液中胶原浓度为 0.1mg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/mL密度接种于此混 合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶液中后，注入截留分子量为1000kDa 的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将16×4cm中空丝放入5cm塑料培养 皿内，培养条件及对照组同具体实例1。
各重复三组，测定尿素合成量，观察细胞形态。
聚球体144小时时的形态见附图2-h，其形成过程及聚球体形态与具体实施 例1基本相同。尿素合成量随培养时间变化曲线如附图4所示，同样优于单层 贴壁培养以及空白对照组。
实施例3
取7mg/L的I型牛跟腱胶原(购自Worthington Biochemical Co.)60μL 加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛血清的Williams’E培养基，混匀后调节溶液 pH值及渗透压，溶液中胶原浓度为0.1mg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝细 胞按106cells/mL密度接种于此混合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶液 中后，注入截留分子量为600kDa的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将16 ×4cm中空丝放入5cm塑料培养皿内，培养条件及对照组同具体实例1。
各重复三组，测定尿素合成量，观察细胞形态。
聚球体144小时时的形态见附图2-f，虽然使用了不同来源的胶原，但是聚 球体的形成过程及最终形态与具体实施例1非常类似。可见胶原的来源对于聚 球体的形成并无重要影响。其尿素合成量随培养时间变化曲线如附图5所示， 亦同样优于单层贴壁培养以及空白对照组。
实施例4
取7mg/mL的I型鼠尾胶原溶液650μL加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛血 清的Williams’E培养基，混匀后调节溶液pH值及渗透压，溶液中胶原浓度 为0.98mg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/mL密度接种于此 混合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶液中后，注入截留分子量为100kDa 的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将16×4cm中空丝放入5cm塑料培养 皿内，培养条件及对照组同具体实例1。
各重复三组，测定尿素合成量，观察细胞形态。
肝细胞聚集过程及形态变化如附图2-g、h、i所示，由于胶原浓度较大， 对肝细胞的移动产生较大的阻力，使得肝细胞在144小时左右才形成聚集程度 较高的柱状聚球体。此种形式聚球体的尿素合成量随培养时间变化曲线如附图6 所示，并优于单层贴壁培养以及空白对照组。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的 精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发 明的保护范围。
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