生物人工肝用细胞源的培养液
阅读：295发布：2020-05-27
专利汇可以提供生物人工肝用细胞源的培养液专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 生物 人工肝 用细胞源的培养液，包括由低糖型DMEM培养液和胎 牛 血清按照体积比8～12:1的比例组成的 混合液 ，所述混合液中还含有60～140U/L的胰岛素、3～9μg/L的 肝细胞 生长因子、0.5～2g/L的异 甘 草酸 镁、3～10mg/L的牛磺熊去 氧 胆酸、50～100U/mL的青链双抗。本发明的生物人工肝用细胞源的培养液通过改进现有的DMEM培养基，添加保护肝细胞的胰岛素、肝细胞生长因子、异 甘草酸 镁、牛磺熊去氧胆酸，达到促进肝细胞或类肝细胞的生长，并有利于细胞向更好发挥肝功能的方向发展，特别能有效提高细胞在高胆红素血症环境时的成活率和存活时间，提高疗效。适用于各类肝细胞和类肝细胞的培养，特别适合L‑02细胞的培养。，下面是生物人工肝用细胞源的培养液专利的具体信息内容。
1.一种生物人工肝用细胞源的培养液，其特征在于：包括由低糖型DMEM培养液和胎牛血清按照体积比8～12:1的比例组成的混合液，所述混合液中还含有60～140U/L的胰岛素、
3～9μg/L的肝细胞生长因子、0.5～2g/L的异甘草酸镁、3～10mg/L的牛磺熊去氧胆酸、50～
100U/mL的青链双抗。
2.根据权利要求1所述生物人工肝用细胞源的培养液，其特征在于：所述混合液由低糖型DMEM培养液和胎牛血清按照体积比10:1的比例组成。
3.根据权利要求1或2所述生物人工肝用细胞源的培养液，其特征在于：所述混合液中含有80～120U/L的胰岛素、4～6μg/L的肝细胞生长因子、0.8～1.2g/L的异甘草酸镁、5～
8mg/L的牛磺熊去氧胆酸、60～90U/mL的青链双抗。
4.根据权利要求1或2所述生物人工肝用细胞源的培养液，其特征在于：所述混合液中含有100U/L的胰岛素、5μg/L的肝细胞生长因子、1g/L的异甘草酸镁、6mg/L的牛磺熊去氧胆酸、80U/mL的青链双抗。
5.根据权利要求1或2所述生物人工肝用细胞源的培养液，其特征在于：所述混合液中还含有8.5～9.5mg/L的L-丙氨酸、13～14mg/L的L-天冬酰胺、11～12mg/L的L-脯氨酸、14～
15mg/L的L-谷氨酸。
6.根据权利要求3所述生物人工肝用细胞源的培养液，其特征在于：所述混合液中还含有8.5～9.5mg/L的L-丙氨酸、13～14mg/L的L-天冬酰胺、11～12mg/L的L-脯氨酸、14～
15mg/L的L-谷氨酸。
7.根据权利要求4所述生物人工肝用细胞源的培养液，其特征在于：所述混合液中还含有8.5～9.5mg/L的L-丙氨酸、13～14mg/L的L-天冬酰胺、11～12mg/L的L-脯氨酸、14～
15mg/L的L-谷氨酸。
8.根据权利要求4所述生物人工肝用细胞源的培养液，其特征在于：所述混合液中还含有8.9mg/L的L-丙氨酸、13.2mg/L的L-天冬酰胺、11.5mg/L的L-脯氨酸、14.7mg/L的L-谷氨酸。
生物人工肝用细胞源的培养液
技术领域
背景技术
[0002] 我国是世界上肝病最严重的国家，每年肝衰竭新发病人数超过100万，每年约50万肝功衰竭患者因得不到有效治疗而死亡。治愈机会只有一种，即肝移植，但由于肝脏来源困难，等待时间长，或根本没有机会得到供肝，因此绝大多数病人根本没有生存机会。因此，急需人工肝系统维持病人生命，等待肝移植机会，或病人自身肝恢复的机会。
[0003] 但由于传统的人工肝(即物理人工肝)成本极高，大多数病人都无法承担，疗效非常有限，不能明显减少肝功能衰竭的死亡率，故临床应用受到限制。近年来，将活性肝细胞或类肝细胞加入到人工肝系统内以改进疗效，已成为世界研发热点，这种以肝细胞充填反应器为基础的人工肝称为生物人工肝(bio-artificial liver，BAL)，大量研究证明其疗效明显优于物理人工肝，能明显减少肝功能衰竭病死率，明显延长生存期，为急性肝功能衰竭病患的自身肝脏恢复和慢性肝功能衰竭病患等待肝移植创造了条件。
[0004] 现有生物人工肝采用的细胞有多种，包括猪肝细胞、永生化人肝细胞、人肝癌细胞系、C3A细胞、L-02永生化肝细胞等细胞源，这些细胞多采用DMEM培养液来培养，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。分为高糖型(糖分在1000～4500mg/L)和低糖型(糖分低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。现有技术中还存在DMEM培养液的改进型，针对不同的细胞，添加肝细胞生长因子、胰岛素等。
[0005] 由于生物人工肝在临床实际应用中，肝功能衰竭患者血液中的胆红素很高，生物人工肝系统中的肝细胞或类肝细胞有可能无法耐受高胆红素带来的毒性而凋亡，从而降低治疗效果，最终降低患者的生存率。
发明内容
[0007] 为实现上述目的，本发明所设计的生物人工肝用细胞源的培养液，包括由低糖型DMEM培养液和胎牛血清按照体积比8～12:1的比例组成的混合液，所述混合液中还含有60～140U/L的胰岛素、3～9μg/L的肝细胞生长因子、0.5～2g/L的异甘草酸镁、3～10mg/L的牛磺熊去氧胆酸、50～100U/mL的青链双抗。
[0008] 优选地，所述混合液由低糖型DMEM培养液和胎牛血清按照体积比10:1的比例组成。
[0009] 优选地，所述混合液中含有80～120U/L的胰岛素、4～6μg/L的肝细胞生长因子、0.8～1.2g/L的异甘草酸镁、5～8mg/L的牛磺熊去氧胆酸、60～90U/mL的青链双抗。
[0010] 更优选地，所述混合液中含有100U/L的胰岛素、5μg/L的肝细胞生长因子、1g/L的异甘草酸镁、6mg/L的牛磺熊去氧胆酸、80U/mL的青链双抗。
[0011] 优选地，所述混合液中还含有8.5～9.5mg/L的L-丙氨酸、13.2mg/L的L-天冬酰胺、11.5mg/L的L-脯氨酸、14.7mg/L的L-谷氨酸。。
[0012] 更优选地，所述混合液中还含有8.9mg/L的L-丙氨酸、13.2mg/L的L-天冬酰胺、11.5mg/L的L-脯氨酸、14.7mg/L的L-谷氨酸。
[0013] 本发明培养液中添加的部分组分功能如下：
[0014] 胰岛素作用：改善细胞糖利用，促进生长。
[0015] 肝细胞生长因子作用：刺激肝细胞生长、防治肝细胞凋亡。
[0017] 牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的作用：利胆、细胞保护、拮抗疏水性胆汁酸的细胞毒性、抗凋亡、抗氧化和免疫调节功能等。
[0018] 通过上述四种添加物质的协同作用，是培养的肝细胞达到抗凋亡、抗氧化、抗细胞毒性的效果。
[0019] 本发明的有益效果：生物人工肝用细胞源的培养液通过改进现有的DMEM培养基，添加保护肝细胞的胰岛素、肝细胞生长因子、异甘草酸镁、牛磺熊去氧胆酸，达到促进肝细胞生长，并有利于细胞向更好发挥肝功能方向发展，有效提高肝细胞或类肝细胞在高胆红素血症应用时的成活率和存活时间，有利于提高疗效。适用于各类肝细胞及类肝细胞的培养，特别适合L-02细胞的培养。
具体实施方式
[0020] 以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0021] 本实施例中采用两种DMEM低糖型培养液，配方如下：
[0022] 1)DMEM(A)培养液(以下添加物为粉末型)成分表
[0023]序号 化合物名称 含量(mg/L) 序号 化合物名称 含量(mg/L)
1 无水氯化钙 265.00 18 L-丝氨酸 42.00
2 九水硝酸铁 0.10 19 L-苏氨酸 95.00
3 氯化钾 400.00 20 L-色氨酸 16.00
4 无水硫酸镁 97.67 21 L-酪氨酸 72.00
5 氯化钠 6400.00 22 L-缬氨酸 94.00
6 无水磷酸二氢钠 109.00 23 D-泛酸钙 4.00
7 丁二酸 75.00 24 酒石酸胆碱 7.20
8 丁二酸钠 100.00 25 叶酸 4.00
9 L-盐酸精氨酸 84.00 26 肌醇 7.20
1 无水氯化钙 265.00 18 L-丝氨酸 42.00
2 九水硝酸铁 0.10 19 L-苏氨酸 95.00
3 氯化钾 400.00 20 L-色氨酸 16.00
4 无水硫酸镁 97.67 21 L-酪氨酸 72.00
5 氯化钠 6400.00 22 L-缬氨酸 94.00
6 无水磷酸二氢钠 109.00 23 D-泛酸钙 4.00
7 丁二酸 75.00 24 酒石酸胆碱 7.20
8 丁二酸钠 100.00 25 叶酸 4.00
9 L-盐酸精氨酸 84.00 26 肌醇 7.20
[0024]10 L-盐酸胱氨酸 63.00 27 烟酰胺 4.00
11 甘氨酸 30.00 28 核黄素 0.40
12 L-盐酸组氨酸 42.00 29 盐酸硫胺 4.00
13 L-异亮氨酸 105.00 30 盐酸吡哆辛 4.00
14 L-亮氨酸 105.00 31 葡萄糖 1000.00
15 L-盐酸赖氨酸 146.00 32 丙酮酸钠 110.00
16 L-甲硫氨酸 30.00 33 酚红 30.00
17 L-苯丙氨酸 66.00
11 甘氨酸 30.00 28 核黄素 0.40
12 L-盐酸组氨酸 42.00 29 盐酸硫胺 4.00
13 L-异亮氨酸 105.00 30 盐酸吡哆辛 4.00
14 L-亮氨酸 105.00 31 葡萄糖 1000.00
15 L-盐酸赖氨酸 146.00 32 丙酮酸钠 110.00
16 L-甲硫氨酸 30.00 33 酚红 30.00
17 L-苯丙氨酸 66.00
[0025] 2)DMEM(L)培养液(以下添加物为粉末型)成分表
[0026]序号 化合物名称 含量(mg/L) 序号 化合物名称 含量(mg/L)
1 无水氯化钙 200.00 17 L-丝氨酸 42.00
2 九水硝酸铁 0.10 18 L-苏氨酸 95.00
3 氯化钾 400.00 19 L-色氨酸 16.00
4 无水硫酸镁 97.67 20 L-酪氨酸钠盐 104.00
5 氯化钠 6400.00 21 L-缬氨酸 94.00
6 无水磷酸二氢钠 125.00 22 D-泛酸钙 4.00
7 L-谷氨酰胺 584.00 23 氯化胆碱 4.00
8 L-盐酸精氨酸 84.00 24 叶酸 4.00
9 L-盐酸胱氨酸 63.00 25 肌醇 7.20
10 甘氨酸 30.00 26 烟酰胺 4.00
11 L-盐酸组氨酸 42.00 27 核黄素 0.40
12 L-异亮氨酸 105.00 28 盐酸硫胺 4.00
13 L-亮氨酸 105.00 29 盐酸吡哆辛 4.00
14 L-盐酸赖氨酸 146.00 30 葡萄糖 1000.00
15 L-甲硫氨酸 30.00 31 丙酮酸钠 110.00
16 L-苯丙氨酸 66.00 32 酚红 15.00
1 无水氯化钙 200.00 17 L-丝氨酸 42.00
2 九水硝酸铁 0.10 18 L-苏氨酸 95.00
3 氯化钾 400.00 19 L-色氨酸 16.00
4 无水硫酸镁 97.67 20 L-酪氨酸钠盐 104.00
5 氯化钠 6400.00 21 L-缬氨酸 94.00
6 无水磷酸二氢钠 125.00 22 D-泛酸钙 4.00
7 L-谷氨酰胺 584.00 23 氯化胆碱 4.00
8 L-盐酸精氨酸 84.00 24 叶酸 4.00
9 L-盐酸胱氨酸 63.00 25 肌醇 7.20
10 甘氨酸 30.00 26 烟酰胺 4.00
11 L-盐酸组氨酸 42.00 27 核黄素 0.40
12 L-异亮氨酸 105.00 28 盐酸硫胺 4.00
13 L-亮氨酸 105.00 29 盐酸吡哆辛 4.00
14 L-盐酸赖氨酸 146.00 30 葡萄糖 1000.00
15 L-甲硫氨酸 30.00 31 丙酮酸钠 110.00
16 L-苯丙氨酸 66.00 32 酚红 15.00
[0027] 实施例1
[0028] 配制1L生物人工肝用细胞源的培养液1，配方如下：
[0029] 899mL低糖型DMEM(L)培养液
[0030] 111mL胎牛血清(Hyclone公司)
[0031] 60U胰岛素
[0032] 9μg肝细胞生长因子
[0033] 0.5g异甘草酸镁
[0034] 10mg牛磺熊去氧胆酸
[0035] 50000U青链双抗(penicillin-streptomycin/Gibco公司)。
[0036] 配制时，可以先添加部分低糖型DMEM(L)培养液，待其他物质全部加入后，再添加余下的低糖型DMEM(L)培养液定容至1L。
[0037] 实施例2
[0038] 配制1L生物人工肝用细胞源的培养液2，配方如下：
[0039] 923mL低糖型DMEM(A)培养液
[0040] 77mL胎牛血清(Hyclone公司)
[0041] 140U胰岛素
[0042] 3μg肝细胞生长因子
[0043] 2g异甘草酸镁
[0044] 3mg牛磺熊去氧胆酸
[0045] 100000U青链双抗(penicillin-streptomycin/Gibco公司)。
[0046] 配制时，可以先添加部分低糖型DMEM(L)培养液，待其他物质全部加入后，再添加余下的低糖型DMEM(L)培养液定容至1L。
[0047] 实施例3
[0048] 配制1L生物人工肝用细胞源的培养液3，配方如下：
[0049] 909mL低糖型DMEM(L)培养液
[0050] 91mL胎牛血清(Hyclone公司)
[0051] 80U胰岛素
[0052] 6μg肝细胞生长因子
[0053] 1.2g异甘草酸镁
[0054] 5mg牛磺熊去氧胆酸
[0055] 60000U青链双抗(penicillin-streptomycin/Gibco公司)。
[0056] 配制时，可以先添加部分低糖型DMEM(L)培养液，待其他物质全部加入后，再添加余下的低糖型DMEM(L)培养液定容至1L。
[0057] 实施例4
[0058] 配制1L生物人工肝用细胞源的培养液4，配方如下：
[0059] 909mL低糖型DMEM(L)培养液
[0060] 91mL胎牛血清(Hyclone公司)
[0061] 120U胰岛素
[0062] 4μg肝细胞生长因子
[0063] 0.8g异甘草酸镁
[0064] 8mg牛磺熊去氧胆酸
[0065] 90000U青链双抗(penicillin-streptomycin/Gibco公司)。
[0066] 配制时，可以先添加部分低糖型DMEM(L)培养液，待其他物质全部加入后，再添加余下的低糖型DMEM(L)培养液定容至1L。
[0067] 实施例5
[0068] 配制1L生物人工肝用细胞源的培养液5，配方如下：
[0069] 909mL低糖型DMEM(A)培养液
[0070] 91mL胎牛血清(Hyclone公司)
[0071] 120U胰岛素
[0072] 4μg肝细胞生长因子
[0073] 0.8g异甘草酸镁
[0074] 8mg牛磺熊去氧胆酸
[0075] 90000U青链双抗(penicillin-streptomycin/Gibco公司)。
[0076] 8.5mg L-丙氨酸
[0077] 14mg L-天冬酰胺
[0078] 11mg L-脯氨酸
[0079] 14mg L-谷氨酸。
[0080] 配制时，可以先添加部分低糖型DMEM(L)培养液，待其他物质全部加入后，再添加余下的低糖型DMEM(L)培养液定容至1L。
[0081] 实施例6
[0082] 配制1L生物人工肝用细胞源的培养液6，配方如下：
[0083] 909mL低糖型DMEM(L)培养液
[0084] 91mL胎牛血清(Hyclone公司)
[0085] 100U胰岛素
[0086] 5μg肝细胞生长因子
[0087] 1g异甘草酸镁
[0088] 6mg牛磺熊去氧胆酸
[0089] 80000U青链双抗(penicillin-streptomycin/Gibco公司)。
[0090] 配制时，可以先添加部分低糖型DMEM(L)培养液，待其他物质全部加入后，再添加余下的低糖型DMEM(L)培养液定容至1L。
[0091] 实施例7
[0092] 配制1L生物人工肝用细胞源的培养液7，配方如下：
[0093] 909mL低糖型DMEM(A)培养液
[0094] 91mL胎牛血清(Hyclone公司)
[0095] 100U胰岛素
[0096] 5μg肝细胞生长因子
[0097] 1g异甘草酸镁
[0098] 6mg牛磺熊去氧胆酸
[0099] 80000U青链双抗(penicillin-streptomycin/Gibco公司)。
[0100] 9.5mg L-丙氨酸
[0101] 13mg L-天冬酰胺
[0102] 12mg L-脯氨酸
[0103] 15mg L-谷氨酸
[0104] 配制时，可以先添加部分低糖型DMEM(L)培养液，待其他物质全部加入后，再添加余下的低糖型DMEM(L)培养液定容至1L。
[0105] 实施例8
[0106] 配制1L生物人工肝用细胞源的培养液8，配方如下：
[0107] 909mL低糖型DMEM(A)培养液
[0108] 91mL胎牛血清(Hyclone公司)
[0109] 100U胰岛素
[0110] 5μg肝细胞生长因子
[0111] 1g异甘草酸镁
[0112] 6mg牛磺熊去氧胆酸
[0113] 80000U青链双抗(penicillin-streptomycin/Gibco公司)。
[0114] 8.9mg L-丙氨酸
[0115] 13.2mg L-天冬酰胺
[0116] 11.5mg L-脯氨酸
[0117] 14.7mg L-谷氨酸
[0118] 配制时，可以先添加部分低糖型DMEM(L)培养液，待其他物质全部加入后，再添加余下的低糖型DMEM(L)培养液定容至1L。
[0119] 实施例9
[0120] 配制1L生物人工肝用细胞源的培养液9，配方如下：
[0121] 909mL低糖型DMEM(A)培养液
[0122] 91mL胎牛血清(Hyclone公司)
[0123] 100U胰岛素
[0124] 5μg肝细胞生长因子
[0125] 80000U青链双抗(penicillin-streptomycin/Gibco公司)。
[0126] 8.9mg L-丙氨酸
[0127] 13.2mg L-天冬酰胺
[0128] 11.5mg L-脯氨酸
[0129] 14.7mg L-谷氨酸
[0130] 配制时，可以先添加部分低糖型DMEM(L)培养液，待其他物质全部加入后，再添加余下的低糖型DMEM(L)培养液定容至1L。
[0131] 试验例：胆红素毒性试验
[0132] 本试验例选用的细胞为L-02细胞，分为14组，第一组在高浓度胆红素(200mg/mL或342umol/L)的DMEM(L)培养液中培养；第二、三、四组分别在高浓度胆红素(200mg/mL或
342umol/L)的DMEM(L)培养液中培养，且培养液中分别添加肝细胞生长因子(5ng/mL)、异甘草酸镁(1mg/mL)，牛磺熊去氧胆酸(TUDCA6mg/L)，第五～十三组分别以生物人工肝用细胞源的培养液1～9来培养L-02细胞，且每组中均添加胆红素(200mg/mL或342umol/L)，还有一组L-02细胞在DMEM(L)培养液中培养，作为无胆红素对照，试验结果见下表。
342umol/L)的DMEM(L)培养液中培养，且培养液中分别添加肝细胞生长因子(5ng/mL)、异甘草酸镁(1mg/mL)，牛磺熊去氧胆酸(TUDCA6mg/L)，第五～十三组分别以生物人工肝用细胞源的培养液1～9来培养L-02细胞，且每组中均添加胆红素(200mg/mL或342umol/L)，还有一组L-02细胞在DMEM(L)培养液中培养，作为无胆红素对照，试验结果见下表。
[0133]组别 凋亡率 存活率
无胆红素对照组 1％ 99％
高胆红素对照组 31％ 69％
肝细胞生长因子组 22％ 78％
异甘草酸镁组 29％ 71％
牛磺熊去氧胆酸组 24％ 76％
生物人工肝用细胞源的培养液1 14％ 86％
生物人工肝用细胞源的培养液2 15％ 85％
生物人工肝用细胞源的培养液3 13％ 87％
无胆红素对照组 1％ 99％
高胆红素对照组 31％ 69％
肝细胞生长因子组 22％ 78％
异甘草酸镁组 29％ 71％
牛磺熊去氧胆酸组 24％ 76％
生物人工肝用细胞源的培养液1 14％ 86％
生物人工肝用细胞源的培养液2 15％ 85％
生物人工肝用细胞源的培养液3 13％ 87％
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