由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法
阅读：810发布：2020-09-13
专利汇可以提供由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种用于从多能干细胞产生 肝细胞 和/或胆管细胞谱系细胞的方法，该方法包括(a)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基 接触 来特化延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群以获得包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包括FGF激动剂和BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或 片段 ；(b)诱导细胞群的肝祖细胞和/或胆管祖细胞的成熟和任选地进一步谱系特化和/或扩增以获得包括诸如成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞的肝细胞谱系细胞的种群，诱导成熟步骤包括生成细胞群的聚集体。任选地，该方法也包括激活聚集体内的cAMP通路和形成共聚集体。，下面是由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法专利的具体信息内容。
1.一种从延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群产生肝细胞和/或胆管细胞谱系细胞的方法，所述方法包括：
(a)通过使所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触，特化所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群，以获得包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，所述特化培养基包括FGF激动剂和BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段；
(b)诱导所述细胞群的肝祖细胞和/或胆管祖细胞的成熟和任选的进一步谱系特化和/或扩增，以获得包括肝细胞谱系细胞的种群，所述肝细胞谱系细胞诸如成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞，诱导成熟步骤包括生成所述细胞群的聚集体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过诱导胚状体(EB)中的内胚层细胞或通过诱导单层的内胚层细胞来获得所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群，并且其中，在例如激活素的nodal激动剂的存在下培养诱导的内胚层种群，并持续延长的时期以产生延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，成熟、进一步谱系特化和/或扩增可以包括一个或多个额外的步骤，任选地，其中，在肝细胞生长因子(HGF)、地塞米松(DEX)和/或抑瘤素M(OSM)和/或它们的活性缀合物和/或片段的存在下培养包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞和/或聚集体的细胞群。
4.一种从多能干细胞群产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，所述方法包括：
a)使作为单层培养的所述多能干细胞与诱导培养基接触以提供诱导的内胚层细胞群，所述诱导培养基包括诸如ActA的nodal激动剂和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂，Wnt/β-连环蛋白激动剂诸如i)Wnt3a和/或ii)诸如CHIR-99021的GSK-3选择性抑制剂；
b)使所述诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
c)根据权利要求1的步骤a)特化所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
d)任选地使包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群与成熟培养基接触，所述成熟培养基包括HGF、地塞米松和/或抑瘤素M和/或它们的活性缀合物和/或片段；以及e)诱导所述细胞群的肝祖细胞和胆管祖细胞成熟、和任选地进一步谱系特化和/或扩增为肝细胞和/或胆管细胞，诱导成熟步骤包括生成所述细胞群的聚集体。
5.一种从多能干细胞群产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，所述方法包括：
a)任选地通过使所述多能干细胞与BMP4激动剂接触，从而形成所述多能干细胞的胚状体(EB)；
b)使所述EB与诱导培养基接触以提供诱导的内胚层细胞群，所述诱导培养基包括诸如ActA的nodal激动剂和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂，Wnt/β-连环蛋白激动剂诸如i)Wnt3a和/或ii)诸如CHIR-99021的GSK-3选择性抑制剂；
c)解离所述诱导的内胚层细胞群，以提供解离的诱导的内胚层细胞群；
d)使所述解离的诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
e)根据权利要求1的步骤a)特化所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
f)任选地使包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群与成熟培养基接触，所述成熟培养基包括HGF、地塞米松和/或抑瘤素M和/或它们的活性缀合物和/或片段；以及g)诱导所述细胞群的肝祖细胞和/或胆管祖细胞成熟、和任选地进一步谱系特化和/或扩增为扩增的成肝细胞种群和/或肝细胞和/或胆管细胞，诱导成熟包括生成所述细胞群的聚集体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群包括至少80％、85％、90％、95％的CXCR4+和CKIT+阳性细胞和/或至少
70％、75％、80％的SOX17+细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述特化步骤包括使延长的nodal激动剂处理的(例如，激活素处理的)诱导的内胚层种群与特化培养基接触，所述特化培养基包括FGF和BMP4，任选地，其中，所述FGF是bFGF、FGF10、FGF2或FGF4或它们的组合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，从包括至少70％、80％、85％或
90％的白蛋白阳性细胞的细胞群生成所述聚集体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，诱导成熟和任选地进一步谱系特化和/或扩增还包括：激活所述聚集体的细胞内的cAMP通路以诱导所述肝祖细胞和所述胆管祖细胞成熟为肝细胞和/或胆管细胞，任选地，其中，激活所述cAMP通路包括使所述聚集体与诸如8-溴腺苷-3’5”-环单磷酸的cAMP类似物接触。
10.一种从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，所述方法包括：
a)使作为单层培养或形成为胚状体的所述多能干细胞与诱导培养基接触以提供诱导的内胚层细胞群，所述诱导培养基包括诸如ActA的nodal激动剂和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂，Wnt/β-连环蛋白激动剂诸如i)Wnt3a和/或ii)诸如CHIR-99021的GSK-3选择性抑制剂；
b)使所述诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；和
c)根据权利要求1的步骤a)特化所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；以及
d)诱导肝祖细胞和/或胆管祖细胞成熟、和任选地进一步谱系特化和/或扩增为成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞，诱导成熟、和任选地进一步谱系特化和/或扩增包括：
(i)用包括HGF、OSM和DEX的成熟培养基培养包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群；
(ii)任选地当所述细胞群包括至少70％、80％、85％或90％的白蛋白阳性细胞时，或在培养约20天至约40天之后，例如，在培养约24天至约28天之后，生成所述细胞群的聚集体；
(iii)在聚集细胞的成熟培养基中培养聚集细胞：和
(iv)任选地，在聚集的约1天至约10天内，例如，在聚集的6天内，任选地，在培养约
27天至约36天之后，任选地激活所述聚集细胞中的cAMP通路。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述聚集细胞的成熟培养基包括促进成熟、进一步谱系特化和/或扩增的一种或多种因子，任选地：
a.促进白蛋白+/HNF4+祖细胞种群的扩增的诸如CIHR 99021的Wnt激动剂，任选地与诸如SB431542的TGFβ拮抗剂组合；或
b.在cAMP激活步骤期间添加的诸如XAV939的Wnt拮抗剂和/或例如PD0325901的Mek/Erk拮抗剂，在cAMP激活步骤期间添加诸如XAV939的Wnt拮抗剂和/或例如PD0325901的Mek/Erk拮抗剂增强CYP酶的表达并且促进肝细胞前体的成熟。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述聚集细胞的成熟培养基包括促进成熟、进一步谱系特化和/或扩增的一种或多种因子，任选地：
a.促进胆管细胞谱系特化的Notch激动剂；
b.促进肝细胞谱系特化的诸如γ-分泌酶抑制剂(GSI)L695,458的Notch拮抗剂。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，用Wnt激动剂和任选的TGFβ拮抗剂(诸如SB431542)处理所述聚集细胞约6天至约12天，优选地，约8天至约10天，任选地，约9天。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述成熟培养基和/或聚集体特化培养基包括notch激动剂，省略了cAMP激活。
15.一种从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，包括：
a)使作为单层培养或形成为胚状体的所述多能干细胞与诱导培养基接触，任选地约4天至约8天，以提供诱导的内胚层细胞群，所述诱导培养基包括诸如ActA的nodal激动剂和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂，Wnt/β-连环蛋白激动剂诸如i)Wnt3a和/或ii)诸如CHIR-99021的GSK-3选择性抑制剂；
b)使所述诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，任选地约1天、2天、3天或约4天，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
c)根据权利要求1的步骤a)特化所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群，任选地约4天至约10天，以获得包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群；以及d)诱导肝祖细胞或胆管祖细胞成熟、和任选地进一步谱系特化和/或扩增为肝细胞或胆管细胞，诱导成熟和任选地进一步谱系特化和/或扩增包括：
(i)用包括HGF、Dex和/或OSM的成熟培养基培养包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的所述细胞群，任选地约10天至14天；
(ii)任选地当所述细胞群包括至少70％、80％、85％或90％的白蛋白阳性细胞时，或在培养约20天至约40天之后，例如，在培养约24天至约28天之后，生成所述细胞群的聚集体；
(iii)在包括Dex的成熟培养基中培养所述聚集体约1天至10天；
iv)
a)在包括Dex和任选的cAMP激动剂、任选的cAMP类似物的肝细胞成熟培养基中培养所述聚集体约6天至约10天，任选地在生成所述聚集体的步骤的约1天至约10天内，例如，在生成所述聚集体的步骤的6天内，任选地，在培养约27天至约36天之后，添加所述cAMP激动剂；或
b)在包括notch激动剂、任选的诸如OP-9细胞的notch信号供体和任选的cAMP激动剂、任选的EGF、TGFbl、HGF和EGF和/或EGF、TGFbl和HGF的胆管细胞成熟/特化培养基中培养所述聚集体约5天至约90天，任选地，在生成所述聚集体的步骤的约1天至约10天内，例如，在生成聚集体的步骤的6天内，任选地，在培养约20天至40天之后，添加所述notch激动剂和/或当所述notch激动剂是notch信号供体细胞时，共培养所述聚集体。
16.根据权利要求1至13和15中任一项所述的方法，其中，产生的肝细胞是功能性肝细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，与包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群的细胞相比，所述功能性肝细胞包括选自由ALB、CPS1、G6P、TDO、CYP7A1、CYP3A7、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、NAT2和UGT1A1组成的组的至少一种基因或蛋白质的增加的表达和/或活性。
18.根据权利要求1至13和15至17中任一项所述的方法，其中，至少40％、50％、
60％、70％、80％或90％的所述肝细胞、任选地所述功能性肝细胞是ASGPR-1+细胞。
19.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，通过用notch激动剂在诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增步骤期间处理所述细胞群的聚集体来特化胆管细胞命运。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述notch激动剂包括结合到诸如细胞、塑料、ECM或珠子的表面的notch配体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述notch激动剂包括诸如OP9、OP9delta和/或OP9Jagged1细胞的notch信号供体。
22.根据权利要求19或20所述的方法，其中，所述notch激动剂包括选自notch配体delta、Jagged-1Jagged1肽或Pref-1/DLK-1/FA1的notch配体。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中，所述方法包括使包括胆管祖细胞的细胞群与诸如notch信号供体的notch激动剂接触，任选地在EGF、TGFβ1、HGF和EGF和/或HGF、TGFβ1和EGF的存在下接触至少或约5天至约14天，以诱导胆管祖细胞进一步谱系特化和/或成熟为胆管细胞、任选地功能性胆管细胞，所述notch信号供体诸如OP9、OP9delta和/或OP9Jagged1细胞。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中，产生的胆管细胞的种群是功能性胆管细胞的种群，任选地，其中，与包括肝祖细胞和胆管祖细胞的细胞群的细胞相比和/或与从未用notch激动剂处理的聚集体产生的细胞群相比，所述功能性胆管细胞包括例如选自Sox9、CK19和CFTR(囊性纤维化跨膜转导调节蛋白)的至少1种、至少2种或3种基因或蛋白质的增加的表达，任选地，其中，至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的胆管细胞的种群是CK19+胆管细胞和/或CFTR+胆管细胞。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)诱导所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群，所述多能干细胞任选地是人ESC(hESC)或人iPSC(hiPSC)。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中，诱导成熟和任选地进一步谱系特化和/或扩增包括共培养包括胆管祖细胞的细胞群与诸如OP9、OP9delta和/或OP9Jagged1细胞的notch信号供体并且任选地在EGF、TGFβ1、HGF和EGF，和/或HGF、TGFβ1和EGF的存在下，共培养至少5天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天，以诱导至少一种胆管祖细胞成熟为功能性胆管细胞。
27.一种用于生成功能性肝细胞和/或胆管细胞的方法，包括：
a.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，产生包括成肝细胞、任选地第25天阶段的成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞的细胞的种群；以及
b.
i.共培养所述细胞的种群，任选地，其中，所述细胞的种群包括成肝细胞，与：
1.内皮细胞，任选地CD34+内皮细胞，任选地胚胎CD34+内皮细胞，任选地在嵌合聚集体中培养，任选地其中，聚集体嵌入在凝胶/基质中以产生包括功能性肝细胞的细胞的种群，或
2.notch激动剂，任选地notch信号供体细胞，任选地OP9细胞、OP-9-Jagged 1细胞和/或OP9delta1细胞，任选地为嵌合的聚集体，任选地其中，所述聚集体嵌入在凝胶/基质中并且用EGF、TGFbl、EGF和HGF，或者EGF、TGFbl和HGF培养以产生包括功能性胆管细胞的细胞的种群，和/或
ii.将来自a)或b i)的细胞的种群或者从所述细胞的种群富集或分离的功能性肝细胞和/或胆管细胞引入至受试者。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述细胞的种群与：i)内皮细胞共培养至少约
4天、约6天、约8天、约10天、约12天或更多天，多达例如15天、20天、30天、40天、50天、
60天或90天，或ii)notch激动剂，任选地OP9细胞、OP9-Jagged 1细胞和/或OP9delta1细胞，共培养至少约4天、约6天、约8天、约10天、约12天或更多天，多达例如约90天或约60天。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中，所述聚集体嵌入在凝胶/基质中并且进行3D培养。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，还包括：富集或分离细胞的肝细胞和/或胆管细胞谱系种群，任选地细胞的功能性肝细胞种群。
31.根据权利要求30所述的方法，包括至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或多达约95％的肝细胞和/或胆管细胞，任选地功能性肝细胞。
32.一种根据权利要求1至31中任一项所述的方法产生的细胞的种群。
33.根据权利要求1至29中任一项所述的方法产生的细胞的种群或权利要求32的细胞的种群的用于药物发现、药物代谢分析、生物人工肝装置的开发的用途和/或作为用于肝脏和/或胆道疾病的治疗的细胞替代疗法的用途。
34.一种试剂盒，包括：
例如以上描述的激动剂、拮抗剂、成熟因子的一种或多种；可以在本文中描述的方法中使用的用于生长细胞等的一种或多种培养基、容器，和/或根据本文中描述的方法扩增和/或制备的细胞或在本文中描述的方法中使用的细胞；以及任选地根据本文中的方法使用的说明书。
由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及用于由人多能干细胞生成功能性肝细胞的方法。
背景技术
[0002] 由人多能干细胞(hPSC；包括胚胎干细胞；hESC和诱导多能干细胞；hiPSs)生成功能性肝细胞的能力将提供肝细胞源，以用于药物代谢研究和用于处理肝脏疾病的基于细胞的疗法。肝细胞是特别重要的，因为它们是负责药物代谢的细胞，并且因此用于身体的异1-3 4
型生物质的消除 。鉴于这一作用和个体在他们的代谢特定药物的能力方面可能不同 这一事实，从代表性的人群样本获得功能性肝细胞会对制药工业内的药物发现和测试具有巨大的影响。除了提供药物测试的新平台，hPSC源性肝细胞可以为肝病患者提供潜在的新疗法。虽然肝移植为终末期肝病提供了有效的处理，但是可行供体器官的短缺限制了可用此
5-7
方法处理的患者群 。肝细胞移植与用hPSC源性肝细胞开发的生物人工肝的设备代表了用于具有特定类型的肝病的患者的挽救生命的疗法。然而，这些应用依赖于由hPSC生成成熟代谢功能的细胞的能力。由于这样的事实：对控制肝细胞成熟的调节通路了解甚少，所以重现性和有效地生成这种细胞迄今为止具有挑战性。
型生物质的消除 。鉴于这一作用和个体在他们的代谢特定药物的能力方面可能不同 这一事实，从代表性的人群样本获得功能性肝细胞会对制药工业内的药物发现和测试具有巨大的影响。除了提供药物测试的新平台，hPSC源性肝细胞可以为肝病患者提供潜在的新疗法。虽然肝移植为终末期肝病提供了有效的处理，但是可行供体器官的短缺限制了可用此
5-7
方法处理的患者群 。肝细胞移植与用hPSC源性肝细胞开发的生物人工肝的设备代表了用于具有特定类型的肝病的患者的挽救生命的疗法。然而，这些应用依赖于由hPSC生成成熟代谢功能的细胞的能力。由于这样的事实：对控制肝细胞成熟的调节通路了解甚少，所以重现性和有效地生成这种细胞迄今为止具有挑战性。
[0003] 鉴于功能性人肝细胞的潜在处理和商业上的重要性，已经针对优化由hPSC生成8-16
这些细胞作出了显著努力 。几乎所有的方法都试图概括分化培养物中的肝发育的关键阶段，包括定形内胚层的诱导，内胚层至肝的命运的特定性，被称为肝细胞的肝祖细胞的生
17
成和成肝细胞至成熟肝细胞的分化 。在大多数研究中，以单层格式诱导分化，其中顺序加入已知的通路激动剂和拮抗剂以调节发育的早期阶段，包括内胚层的诱导和肝特化。通过这个策略，已经有可能优化这些早期分化的阶段和生成在定形内胚层、成肝细胞和未成熟肝细胞中高度富集的种群，定形内胚层、成肝细胞和未成熟肝细胞由诸如Hex、甲胎蛋白和
17
白蛋白的标记的表达所限定 。虽然这些早期分化阶段合理地良好地建立，但是没有描述条件：例如促进肝细胞的成熟至功能性细胞，功能性细胞由阶段I和阶段II药物代谢酶的活性所限定。用不同的方案生成的种群在它们的成熟状态上有很大的不同并且在大多数情况下表示未成熟肝细胞。
这些细胞作出了显著努力 。几乎所有的方法都试图概括分化培养物中的肝发育的关键阶段，包括定形内胚层的诱导，内胚层至肝的命运的特定性，被称为肝细胞的肝祖细胞的生
17
成和成肝细胞至成熟肝细胞的分化 。在大多数研究中，以单层格式诱导分化，其中顺序加入已知的通路激动剂和拮抗剂以调节发育的早期阶段，包括内胚层的诱导和肝特化。通过这个策略，已经有可能优化这些早期分化的阶段和生成在定形内胚层、成肝细胞和未成熟肝细胞中高度富集的种群，定形内胚层、成肝细胞和未成熟肝细胞由诸如Hex、甲胎蛋白和
17
白蛋白的标记的表达所限定 。虽然这些早期分化阶段合理地良好地建立，但是没有描述条件：例如促进肝细胞的成熟至功能性细胞，功能性细胞由阶段I和阶段II药物代谢酶的活性所限定。用不同的方案生成的种群在它们的成熟状态上有很大的不同并且在大多数情况下表示未成熟肝细胞。
发明内容
[0004] 本发明的一个方面包括从延长的nodal激动剂(extended nodal agonist)处理的诱导的内胚层细胞群产生肝细胞谱系细胞的方法，该方法包括：
[0005] (a)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触，特化延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群，以获得包括肝祖细胞的细胞群，特化培养基包括FGF激动剂和BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段；
[0006] (b)诱导细胞群的肝祖细胞的成熟、任选的进一步谱系特化和/或扩增，以获得包括肝细胞谱系细胞的种群，肝细胞谱系细胞诸如成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞，诱导成熟步骤包括生成细胞群的聚集体。
[0007] 在实施例中，肝细胞和/或胆管细胞谱系细胞是成肝细胞。在实施例中，该方法产生成肝细胞的扩增种群。在另一实施例中，肝细胞谱系细胞是成熟肝细胞，或者胆管细胞谱系细胞是成熟的胆管细胞。
[0008] 在一些实施例中，从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)诱导延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群。多能干细胞任选地是人ESC(hESC)或人iPSC(hiPSC)。
[0009] 在实施例中，通过在胚状体(EB)中诱导内胚层细胞获得延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群。在另一实施例中，通过诱导单层的内胚层细胞获得延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群。在每种情况下，在nodal激动剂(例如，激活素)的存在下培养诱导的内胚层种群并持续延长的时间，以产生延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群。
[0010] 在实施例中，延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群包括至少80％、85％、90％、95％的CXCR4+和CKIT+阳性细胞和/或至少70％、75％、80％的SOX17+细胞。
[0011] 在实施例中，特化步骤包括使延长的nodal激动剂处理的(例如，激活素处理的)诱导的内胚层种群与特化培养基接触，特化培养基包括FGF和BMP4。例如，FGF可以是bFGF、FGF10、FGF2或FGF4或它们的组合。例如，可以依次添加该组合。
[0012] 在实施例中，特化步骤包括：首先使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群与包括FGF10和BMP4的特化培养基接触约40小时至60小时，任选地约40小时、42小时、44小时、46小时、48小时、50小时、52小时、54小时、56小时、58小时或60小时，以及然后使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群与包括bFGF和BMP4的特化培养基接触约4天至7天，任选地约4天、5天、6天或7天。
[0013] 在另一实施例中，从包括至少70％、80％、85％或90％的白蛋白阳性细胞的细胞群生成聚集体。在另一实施例中，在培养24天、25天、26天、27天或28天之后生成聚集体。
[0014] 在一些实施例中，通过酶处理和/或人工解离从包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群的单层生成聚集体。
[0015] 诱导成熟和任选地进一步谱系特化和/或扩增可以包括一个或多个额外的步骤。在进一步的实施例中，在肝细胞生长因子(HGF)、地塞米松(DEX)和/或抑瘤素M(OSM)和/或它们的活性缀合物和/或片段的存在下培养包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞和/或聚集体的细胞群。
[0016] 在一个实施例中，诱导成熟和任选地进一步谱系特化和/或扩增还包括激活聚集体的细胞内的cAMP通路以诱导肝祖细胞和胆管祖细胞成熟为肝细胞和/或胆管细胞。在另一实施例中，激活cAMP通路包括使聚集体与cAMP和/或cAMP类似物(例如，诸如8-溴腺苷-3’5”-环单磷酸、丁酰-cAMP、腺苷3’,5’-环单硫代磷酸、Sp-异构体(SP-cAMP)和/或8-溴腺苷-3’,5’-环单硫代磷酸、Sp-异构体(Sp-8-Br-cAMP))和/或任何其他cAMP激动剂。
[0017] 例如，在实施例中，在包括HGF、DEX和OSM的成熟培养基中培养预聚集体种群例如约10天、11天、12天、13天或14天之后，将包括cAMP激动剂和DEX和任选的HGF的成熟培养基添加到聚集体。
[0018] 在实施例中，产生的肝细胞的种群是包括功能性肝细胞的种群。
[0019] 在实施例中，与包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群和/或从非延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群(例如，从未用nodal激动剂(诸如激活素)处理延长的时间周期的诱导的内胚层种群)产生、没有聚集和/或cAMP信号传导诱导产生的肝细胞相比，肝细胞、任选地功能性肝细胞包括选自由ALB、CPS1、G6P、TDO、CYP2C9、CYP2D6、CYP7A1、CYP3A7、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、NAT2和UGT1A1组成的组的至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种基因或蛋白质的增加的表达。在其他实施例中，至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的肝细胞、任选地功能性肝细胞是ASGPR-1+细胞。
[0020] 在实施例中，通过用nodal激动剂处理细胞群的聚集体特化胆管细胞命运。
[0021] 在实施例中，产生的胆管细胞的种群是功能性胆管细胞的种群。与包括肝祖细胞和胆管祖细胞的细胞群的细胞相比和/或与从未用nodal激动剂处理的聚集体产生的细胞群相比，功能性胆管细胞包括例如选自Sox9、CK19和CFTR(囊性纤维化跨膜转导调节蛋白)的至少1种、至少2种或3种基因或蛋白质的增加的表达。在其他实施例中，至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的胆管细胞的种群是CK19+胆管细胞。在其他实施例中，至少
40％、50％、60％、70％、80％或90％的功能性胆管细胞是CFTR+胆管细胞。
40％、50％、60％、70％、80％或90％的功能性胆管细胞是CFTR+胆管细胞。
[0022] 如所提到的，该方法可以应用于在单层中生长的内胚层细胞群。
[0023] 因此，另一个方面包括从多能干细胞群产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，该方法包括：
[0024] a)使作为单层培养的多能干细胞与诱导培养基接触以提供诱导的内胚层细胞群，诱导培养基包括nodal激动剂(诸如ActA)和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂(诸如i)Wnt3a和/或ii)GSK-3的选择性抑制剂，诸如CHIR-99021)；
[0025] b)使诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
[0026] c)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触来特化延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群，以获得包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包括FGF激动剂和BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段；
[0027] d)任选地使包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群与成熟培养基接触，成熟培养基包括HGF、地塞米松和/或抑瘤素M和/或它们的活性缀合物和/或片段；和
[0028] e)诱导细胞群的肝祖细胞和胆管祖细胞成熟、任选地进一步谱系特化和/或扩增为扩增的成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞，诱导成熟包括生成细胞群的聚集体。
[0029] 此外，内胚层种群也可以包括在胚状体中。
[0030] 因此，本发明的又一方面提供了一种从多能干细胞群产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，该方法包括：
[0031] a)任选地通过使多能干细胞与BMP4激动剂接触，形成多能干细胞的胚状体(EB)；
[0032] b)使EB与诱导培养基接触以提供诱导的内胚层细胞群，诱导培养基包括nodal激动剂(诸如ActA)和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂(诸如i)Wnt3a和/或ii)GSK-3的选择性抑制剂，诸如CHIR-99021)；
[0033] c)解离诱导的内胚层细胞群，以提供解离的诱导的内胚层细胞群；
[0034] d)使解离的诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
[0035] e)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触来特化延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群，以获得包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包括FGF激动剂和BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段，
[0036] f)任选地使包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群与成熟培养基接触，成熟培养基包括HGF、地塞米松和/或抑瘤素M和/或它们的活性缀合物和/或片段；和
[0037] g)诱导细胞群的肝祖细胞和/或胆管祖细胞成熟、进一步谱系特化和/或扩增为肝细胞和胆管细胞，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括生成细胞群的聚集体。
[0038] 在一些实施例中，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增步骤还包括激活聚集体内的cAMP通路以诱导细胞群的肝祖细胞和/或胆管祖细胞成熟为包括肝细胞和/或胆管细胞的种群。在实施例中，该方法包括使聚集体与cAMP类似物和/或cAMP激动剂接触。
[0039] 在实施例中，单层或EB与诱导培养基中的nodal激动剂接触至少约1天、2天、3天或约4天。
[0040] 在实施例中，在内胚层种群的解离之前的步骤(例如，胚状体(EB)阶段)中，用nodal激动剂培养EB至少36小时、38小时、42小时、44小时、46小时、48小时、50小时、52小时、56小时、58小时或60小时，或培养至少约1天、2天、3天或约4天。
[0041] 因此，本发明的另一个方面涉及一种从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，该方法包括：
[0042] a)使作为单层培养或形成为胚状体的多能干细胞与诱导培养基接触以提供诱导的内胚层细胞群，诱导培养基包括nodal激动剂(诸如ActA)和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂(诸如i)Wnt3a和/或ii)GSK-3的选择性抑制剂，诸如CHIR-99021)；
[0043] b)使诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；和
[0044] c)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触来特化延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群，以获得包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包括至少一种FGF激动剂和一种BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段，和
[0045] d)诱导肝祖细胞和/或胆管祖细胞成熟、进一步谱系特化和/或扩增为肝细胞和/或胆管细胞，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括：
[0046] (i)用包括HGF、OSM和DEX的成熟培养基培养包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群；
[0047] (ii)任选地，当细胞群包括至少70％、80％、85％或90％的白蛋白阳性细胞时，或在培养约20至约40天之后，例如，在培养约24天至约28天之后，生成细胞群的聚集体；
[0048] (iii)在聚集细胞的成熟培养基中培养聚集细胞：和
[0049] (ⅳ)任选地，在聚集的约1天至约10天内，例如，在聚集的6天内，任选地，在培养约27天至约36天之后，激活聚集细胞中的cAMP通路。
[0050] 在实施例中，聚集细胞的成熟培养基可以包括促进肝细胞成熟的因子或促进胆管细胞发育的因子或这两种因子。
[0051] 在另一实施例中，聚集细胞是基于用诸如CIHR99021的Wnt激动剂处理的聚集，任选地，在诸如SB431542的TGFβ拮抗剂的存在下。如本文中展示的，在例如第26天(在使用EB的实施例中，或任选地之后一天或两天，例如，第27天)激活Wnt通路和SMAD通路，促进扩增白蛋白+/HNF4+祖细胞种群的表达。例如，证明了，当添加Wnt激动剂时，可以获得所述种群的高达10倍的扩增。
[0052] 在实施例中，用Wnt激动剂和任选的TGFβ拮抗剂(诸如SB431542)处理聚集细胞约6天至约12天，优选地，约8天至约10天，任选地，约9天。
[0053] 在又进一步的实施例中，在cAMP激活步骤的期间添加诸如XAV939(也简称为XAV)的Wnt拮抗剂和/或例如PD0325901(也简称为PD)的Mek/Erk拮抗剂。在cAMP信号传导的激活期间添加Wnt拮抗剂和/或MEK/Erk拮抗剂增强CYP酶的表达，例如，高达或大于见于成人肝细胞的水平。例如，将在cAMP的存在下添加的MEK/Erk的抑制剂加入到约第28天至约第32天的培养物产生具有增加的CYP3A4水平的肝细胞。添加MEK/Erk拮抗剂与Wnt拮抗剂的组合示出为也增加CYP1A2的水平。在实施例中，Wnt拮抗剂是XAV939。在另一实施例中，MEK/Erk拮抗剂是PD0325901。
[0054] 在实施例中，在聚集之后约1天至约4天，用nodal激动剂处理细胞。在这个阶段添加nodal激动剂促进胆管细胞的成熟。在一些实施例中，例如其中胆管细胞成熟是优选的，省略诱导cAMP信号传导。
[0055] 例如用诸如γ-分泌酶抑制剂(GSI)L695,458的Notch拮抗剂进一步抑制Notch信号传导在本文中展示为抑制胆管细胞发育，并且产生的细胞保持肝细胞的特性。在实施例中，例如其中肝细胞分化是期望的实施例中，该方法包括在聚集之后约1天至约4天，用nodal拮抗剂处理细胞。
[0056] 在另一实施例中，从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，包括：
[0057] a)使作为单层培养或形成为胚状体的多能干细胞与诱导培养基接触，任选地约4天至约8天，以提供诱导的内胚层细胞群，诱导培养基包括诸如ActA的nodal激动剂和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂(诸如ⅰ)Wnt3a和/或ii)GSK-3的选择性抑制剂，诸如CHIR-99021)；
[0058] b)使诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，任选地约1天、2天、3天或约4天，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
[0059] c)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触，任选地约4天至约10天，特化延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群，以获得包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包括至少一种FGF激动剂和至少一种BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段，和
[0060] d)诱导肝祖细胞和/或胆管祖细胞成熟、进一步谱系特化和/或扩增为肝细胞或胆管细胞，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括：
[0061] (i)用包括HGF、Dex和/或OSM的成熟培养基培养包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，任选地约10天至14天；
[0062] (ⅱ)任选地，当细胞群包括至少70％、80％、85％或90％的白蛋白阳性细胞时，或在培养约20天至约40天之后，例如，在培养约24天至约28天之后，生成细胞群的聚集体；
[0063] (ⅲ)在包括Dex的成熟培养基中培养聚集体约1天至10天；
[0064] ⅳ)a)在包括Dex和cAMP类似物和/或cAMP激动剂的成熟培养基中培养聚集体约6天至约10天，任选地在生成聚集体的步骤的约1天至约10天内添加cAMP类似物和/或cAMP激动剂，例如，在生成聚集体的步骤的6天内，任选地，在培养约27天至约36天之后；或
[0065] b)在包括nodal激动剂和任选的cAMP激动剂、HGF和/或EGF的成熟培养基中培养聚集体约6天至约20天，任选地，在生成聚集体的步骤的约1天至约10天内添加nodal激动剂，例如，在生成聚集体的步骤的6天内，任选地，在培养约20天至40天之后。
[0066] 在实施例中，该方法包括例如在培养约20天之后和/或在培养40天之前聚集。
[0067] 本发明也提供了诱导胆管祖细胞成熟、进一步谱系特化和/或扩增为胆管细胞的方法，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括：
[0068] (ⅰ)用Notch激动剂培养包括胆管祖细胞的细胞群，以诱导至少一种胆管祖细胞成熟为胆管细胞，任选地，功能性胆管细胞。
[0069] notch激动剂可以例如是结合到诸如细胞、塑料、ECM或珠子的表面的任何notch配体。在一个实施例中，notch配体是notch配体delta。在一个实施例中，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括使包括胆管祖细胞的细胞群与诸如OP9、OP9delta和/或OP9 Jagged1细胞的notch信号供体(例如，notch激动剂)并且任选地在EGF、TGFβ1、HGF和EGF和/或HGF、TGFβ1和EGF的存在下接触至少或约5天至约90天，以诱导胆管祖细胞成熟为功能性胆管细胞。
[0070] 任选地，使包括胆管祖细胞的细胞群与notch激动剂(例如，notch信号供体)接触包括共培养包括胆管祖细的细胞群与诸如OP9、OP9delta和/或OP9 Jagged1细胞的notch信号供体并且任选地在包括EGF、TGFβ1、HGF和EGF和/或HGF、TGFβ1和EGF的成熟培养基中，共培养至少或约5天至至少或约90天，任选地，至少或约5天至至少或约60天，至少或约30天，至少或约25天，至少或约21天，和/或至少或约14天，以诱导胆管祖细胞成熟为胆管细胞，任选地功能性胆管细胞，任选地，其中功能性胆管细胞形成分支、包囊、管状或球型结构。
[0071] 在另一实施例中，本申请提供一种方法，包括：
[0072] (a)根据本文描述的任何方法产生包括肝细胞和/或胆管细胞的细胞的种群；和[0073] (b)将细胞的种群或任选的肝细胞和/或胆管细胞富集或分离的种群引入受试者。
[0074] 在一些实施例中，该方法还包括富集或分离细胞的肝细胞和/或胆管细胞种群。任选地，细胞的肝细胞和/或胆管细胞种群包括至少10％、至少15％、至少20％、至少
25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或多达约
95％的肝细胞和/或胆管细胞(例如，任选地，功能性肝细胞和/或胆管细胞)。
25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或多达约
95％的肝细胞和/或胆管细胞(例如，任选地，功能性肝细胞和/或胆管细胞)。
[0075] 本发明也提供了肝细胞和/或胆管细胞的种群用于药物发现、药物代谢分析、生物人工肝装置的发展的用途和/或作为用于肝脏状况和疾病的治疗的细胞替代疗法的用途。
[0076] 从下面的详细描述中本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，仅通过说明给出详细描述和具体实例，同时详细描述和具体实例指示本发明的优选实施例，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员从该详细描述将变得显而易见。附图说明
[0077] 现在将关于附图描述本发明的实施例，其中：
[0078] 图1示出了在hESC来源的胚状体的内胚层的诱导。图1(a)是分化方案的示意图。EB在第六天用胰蛋白酶消化并且在激活素的存在下作为单层铺板两天，以生成适当分期的定形内胚层。在BMP4和FGF存在下通过培养从该内胚层种群特化为(specified into)肝细胞系。肝成熟是通过分步过程诱导的：首先通过加入HGF、地塞米松(Dex)和抑瘤素M(OSM)并持续12天，随后生成3D聚集体，3D聚集体在补充有Dex的肝细胞培养基中培养8天，随后在添加cAMP类似物、8-br-cAMP的该培养基中再培养12天(第32-44天)。图1(b)示出了流式细胞分析，流式细胞分析示出了在第6天激活素和激活素/Wnt3a诱导的种群中的CXCR4+、CKIT+(CD1 17)和EPCAM+细胞的比例。图1(c)示出细胞内流式细胞分析，细胞内流式细胞分析示出在第6天激活素和激活素/Wnt3a诱导的种群中的SOX17+和FOXA2+细胞的比例。与单独用激活素诱导的EB(SOX17：91+/-1.8％，FOXA2：80.3±2.5％)相比,激活素/Wnt3a诱导的EB中的SOX17+和FOXA2+种群的大小显著更大(SOX17：96.2±1.1％，FOXA2：88.5±2.9％)，*P<0.05(P＝0.002)，**P<0.01(P＝0.005)；学者的t检验中，n＝4。图1(d)示出了激活素和激活素/Wnt3a诱导的EB中的T、SOX17、GSC和FOXA2的表达的基于RT-qPCR的分析。在指定的时间点分析EB。柱代表三次独立实验的平均值的SD。
图1(e)是流式细胞分析，流式细胞分析示出了在激活素/Wnt3a诱导的EB中的CXCR4+、CKIT+、SOX17+和FOXA2+种群的发育的动力学。图1(f)是流式细胞分析，流式细胞分析示出了在第六天用神经基培养基中的激活素诱导的EB中的CXCR4+、CKIT+、EPCAM+、Sox17+和FOXA2+细胞的比例。
图1(e)是流式细胞分析，流式细胞分析示出了在激活素/Wnt3a诱导的EB中的CXCR4+、CKIT+、SOX17+和FOXA2+种群的发育的动力学。图1(f)是流式细胞分析，流式细胞分析示出了在第六天用神经基培养基中的激活素诱导的EB中的CXCR4+、CKIT+、EPCAM+、Sox17+和FOXA2+细胞的比例。
[0079] 图2(a)是指示的细胞因子指定的单层培养物中的白蛋白表达的RT-qPCR分析。从第6天至第12天用不同的因子(10ng/ml的bFGF；50ng/ml的BMP4；20ng/ml的HGF；或
20ng/ml的bFGF加50ng/ml的BMP4)处理细胞，然后用DEX、HGF和OSM培养细胞并且在第
24天进行分析。柱代表三次独立实验的平均值的标准偏差(SD)。相对于TBP确定值并且相对于bFGF(20ng/ml)培养物中的表达(值设置为1)来呈现值。与bFGF处理的培养物相比，***P<0.001。学者的t检验中，n＝3。(b)在存在和不存在FGF10时特定的种群中的白蛋白表达的RT-qPCR分析。在第6天和第8天之间用FGF10(50ng/ml)加BMP4(50ng/ml)处理(或不处理)培养物。在这个阶段，去除FGF10，并且在第8天和第12天之间在bFGF/BMP中培养细胞。柱代表三次独立实验的平均值的标准偏差(SD)。相对于TBP确定值并且相对于FGF10(-)培养物中的表达(值设置为1)来呈现值。*P<0.05，学者的t检验中，n＝
3。
20ng/ml的bFGF加50ng/ml的BMP4)处理细胞，然后用DEX、HGF和OSM培养细胞并且在第
24天进行分析。柱代表三次独立实验的平均值的标准偏差(SD)。相对于TBP确定值并且相对于bFGF(20ng/ml)培养物中的表达(值设置为1)来呈现值。与bFGF处理的培养物相比，***P<0.001。学者的t检验中，n＝3。(b)在存在和不存在FGF10时特定的种群中的白蛋白表达的RT-qPCR分析。在第6天和第8天之间用FGF10(50ng/ml)加BMP4(50ng/ml)处理(或不处理)培养物。在这个阶段，去除FGF10，并且在第8天和第12天之间在bFGF/BMP中培养细胞。柱代表三次独立实验的平均值的标准偏差(SD)。相对于TBP确定值并且相对于FGF10(-)培养物中的表达(值设置为1)来呈现值。*P<0.05，学者的t检验中，n＝
3。
[0080] 图3示出，激活素信号传导的持续时间影响肝发育。图3(a)是细胞内流式细胞分析，细胞内流式细胞分析示出第6天激活素/Wnt3A诱导的EB以及由EB获得的单层种群中的SOX17+和FOXA2+细胞的比例。单层种群直接在指定的培养基(-激活素)中培养，或在激活素(50ng/ml)中培养两天并且然后在指定的培养基(+激活素)中培养。在指定的培养基中培养两天或四天后(-激活素组共8天和10天以及+激活组10天和12天)对种群进行分析。柱代表三次独立实验的平均值的标准偏差(SD)。与未处理的种群(73.3+/-7.5％相对于45.9±3.7％)相比，激活素处理的第10/12天的SOX17+的比例显著更高。类似地，与未处理的种群(第8天：96.1+/-0.9％相对于76.5+/-10.1％，第12天：92.7±2.5％相对于50.2+/-6.3％)相比，激活素处理的第8/10天和第10/12天的FOXA2+细胞的比例显著更高。图3(b)示出了激活素处理和非处理的单层培养物中的细胞总数。第6天EB源性细胞直接在肝分化培养基中培养，或者在激活素的存在下培养两天，然后在肝分化培养基中培养。图3(c)是流式细胞分析，流式细胞分析示出从非处理的细胞和激活素处理的内胚层生成在第8、10和12天培养的种群中的CXCR4和CKIT阳性细胞的比例。图3(d)示出了从激活素处理的(黑色柱)和非处理的(灰色柱)内胚层生成的肝单层种群的基于RT-qPCR的表达分析。分析种群以用于指定的内胚层(HEX、AFP、ALB和HNF4a)和中胚层(MEOX1、MESP1、CD31和CD90)基因的表达。在总培养的第12、18和26天分析激活素处理的种群(灰色柱)，而在培养的第10、16和24天分析未处理的种群(黑色柱)。指示的表达水平是相对于TBP。柱代表三次独立实验的平均值的标准偏差(SD)。图3(e)是流式细胞分析，流式细胞分析示出来源于激活素处理(第26天)和非处理(第24天)的内胚层的单层种群中的CD31+、CD90+和EPCAM+细胞的比例。与处理过的培养物(CD31：13.6±2.3％相对于0.49±0.11％，P<0.001；CD90：41.2+/-4.7％相对于8.5±/-1.19％，P<0.001，学者的t检验中，n＝3)相比，未处理的CD31+和CD90+种群显著更大。与此相反，与从非处理的细胞(EPCAM：90.7±2.7％相对于56.8+/-7.3％，P<0.01，n＝3)生成的种群相比，在来源于激活素处理的内胚层的种群中检测到更高部分的EPCAM+细胞。图3(f)示出了免疫染色分析，免疫染色分析示出从激活素处理(第26天)和非处理(第24天)的内胚层生成的培养物中的白蛋白阳性细胞的比例。用Alexa 488使白蛋白可视化。比例尺：200μm。(g)细胞内流式细胞分析，示出从激活素处理(灰色柱；第26天)和非处理(黑色柱；第24天)的内胚层生成的单层培养物中的白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)细胞的比例。图中的柱代表三次独立实验的平均值的标准偏差(SD)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(学者的t检验；n＝3)。AL：成人肝脏，FL：胎儿肝脏。
[0081] 图4示出，聚集体促进肝成熟。图4(a)是在培养的第28天时的肝聚集体的相差图像。比例尺，200μm。图4(b)示出在分化的第32天时的单层(黑色柱)和3D聚集体培养物(灰色柱)中的ALB、CPS1、TAT、G6P和TDO表达的基于RT-qPCR的分析。相对于TBP确定值，并且相对于成人肝脏中的表达(值设置为1)呈现值。图4(c)是用于单层(黑色柱)和3D聚集体培养物(灰色柱)中的在分化的第32天的CYP7A1、CYP3A7和CYP3A4表达的基于RT-qPCR的分析。表达水平是相对于TBP。图4(d)是流式细胞分析，流式细胞分析示出第36天的单层(2D)和聚集体(3D)培养物中的无唾液酸糖蛋白受体-1+(ASGPR-1)细胞的比例。ASGPR-1+细胞的频率在3D聚集体培养物(2D：28.8±3.1％，3D：64.7+/-4.26％，P<0.001，n＝3)显著更高。所有图中的柱代表三个独立的实验中的样本的平均值的标准偏差(SD)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，学者的t检验，AL：成人肝脏，FL：胎肝，pH；原代肝细胞培养2天。
[0082] 图5示出，cAMP信号传导诱导hESC源性肝细胞样细胞的成熟。图5(a)是在存在和不存在8-Br-cAMP下培养的肝聚集体中的PGC1-a、HNF4a、AFP、ALB、G6P和TAT表达的RT-qPCR分析。表达水平是相对于TBP。图5(b)是细胞内流式细胞分析，细胞内流式细胞分析示出在存在和不存在8-Br-cAMP下培养的肝聚集体中的甲胎蛋白(AFP)+和白蛋白(ALB)+细胞(第44天)的比例。与非诱导的种群(34.5+/-12.4％相对于56.9+/-3.6％，P<0.05，平均值±SD，n＝3)相比，AFP+细胞的频率在用cAMP诱导的种群中显著更低。另一方面，ALB阳性细胞的比例在cAMP处理的种群中更高(89.5+/-5.6％相对于82.3+/-3.0％，P<0.05(平均值±SD，n＝3)。图5(c)是cAMP处理的胰聚集体和从HES2、H9和38-2细胞生成的肝聚集体中的PGC1-α表达的RT-qPCR分析。相对于TBP确定值，并且值呈现为相对于非处理的细胞中的表达(值设置为1)的倍数变化。图5(d)示出在未处理和cAMP处理的聚集体中的第44天的ICG摄取。所有图中的柱表示来自三个独立实验的值的平均值的标准偏差(SD)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，学者的t检验，AL：成人肝脏，FL：胎儿肝脏。
[0083] 图6示出，cAMP信号传导增加hESC源性肝细胞的代谢酶活性。图6(a)示出了在存在和不存在8-Br-cAMP下培养的肝聚集体(第44天)中的CYP3A7、CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6和UGT1A1的表达。原代肝细胞(PH)的水平示出为对照。相对于TBP确定值并且相对于非处理的细胞中的表达(值设置为1)呈现为倍数变化。图6(b)示出RT-qPCR分析，RT-qPCR分析示出未处理(-)和cAMP处理(+)的单层种群(第44天)中的PGC1a、TAT、HNF4a、CYP1A2的和CYP3A4的表达。相对于TBP确定值并且相对于非处理的细胞中的表达(值设置为1)呈现为倍数变化。图6(c)示出了从非处理(-Act)或扩增激活素处理的(+Act)内胚层生成的cAMP处理的聚集体中的CYP1A2和ALB表达的RT-qPCR分析。图6(d)示出了(cAMP+/-)培养6天或在8-Br-cAMP(cAMP+)中培养12天的聚集体中的CYP1A2表达的RT-qPCR分析。图6(e)示出，hESC源性肝细胞在体外显示出CYP1A2活性。未处理和cAMP处理的聚集体和原代肝细胞用非那西丁(200μM)孵育24小时。通过HPLC监测从非那西丁的邻去乙基化代谢物对乙酰氨基酚的生成。每10,000个细胞呈现活性。(*P<0.05，n＝5)。图6(f)示出，hESC源性肝细胞在体外显示出CYP2B6活性。cAMP处理的聚集体和原代肝细胞用安非他酮(1μM)孵育48小时。通过HPLC测量从安非他酮的代谢物邻羟基安非他酮的形成。每50,000个细胞呈现出活性，(n＝3)。图6(g)示出，磺胺二甲嘧啶(SMZ)到N-乙酰化SMZ的代谢表明存在第二阶段的酶NAT1和/或NAT2。cAMP处理的聚集体和原代肝细胞用SMZ(500μM)培养48小时，并且通过HPLC测量N-乙酰化的SMZ。每10,000个细胞呈现出活性(n＝3)。图6(h)为HPLC分析，HPLC分析示出总UGT活性的通过cAMP处理的聚集体由4-甲基伞形酮(4-MU)生成4-MU葡糖苷酸(4-MUG)。cAMP处理的聚集体和原代肝细胞用4-MU培养48小时。通过HPLC测量4MUG的形成。每10,000细胞呈现出活性，(n＝3)。所有图中柱代表三个独立的实验中的样本的平均值的标准偏差(SD)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，学者的t检验，PH；原代肝细胞。
[0084] 图7示出了来自不同的多能干细胞系的肝分化。图7(a)是流式细胞分析，流式细胞分析示出从H9 hESC、H1 hESC和38-2 iPSC生成的激活素/Wnt3a诱导的第6天的EB中的CXCR4+、CKIT+、EPCAM+、SOX17+和FOXA2+细胞的比例。图7(b)示出用激活素处理不同时间的从H9、H1和与38-2源性内胚层生成的单层培养物中的白蛋白表达的RT-qPCR分析。不同的种群在下列时间进行分析：没有激活素：第24天，2天激活素：第26天，4天激活素：
分化的第28天。图7(c)示出了细胞内流式细胞分析，细胞内流式细胞分析示出了从不同HPSC系生成的ALB和AFP阳性细胞的频率(没有激活素(-)：第24天，2天激活素：第26天，4天激活素：分化的第28天)。图7(d)是示出在培养的第26天的H9源性肝细胞的形态的相位对比图像。比例尺：200μm。图7(e)示出RT-qPCR分析，RT-qPCR分析示出在存在和不存在8-Br-cAMP下培养的H9-和iPSC(38-2)源性肝聚集体(第44天)中的CYP3A7、CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6和UGT1A1。相对于TBP确定值并且相对于非处理的细胞中的表达(值设置为1)呈现为倍数变化。所有图中的柱代表来自三个独立实验的值的平均值的标准偏差(SD)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，学者的t检验，AL：成人肝脏，FL：胎肝，PH：原代肝细胞。
分化的第28天。图7(c)示出了细胞内流式细胞分析，细胞内流式细胞分析示出了从不同HPSC系生成的ALB和AFP阳性细胞的频率(没有激活素(-)：第24天，2天激活素：第26天，4天激活素：分化的第28天)。图7(d)是示出在培养的第26天的H9源性肝细胞的形态的相位对比图像。比例尺：200μm。图7(e)示出RT-qPCR分析，RT-qPCR分析示出在存在和不存在8-Br-cAMP下培养的H9-和iPSC(38-2)源性肝聚集体(第44天)中的CYP3A7、CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6和UGT1A1。相对于TBP确定值并且相对于非处理的细胞中的表达(值设置为1)呈现为倍数变化。所有图中的柱代表来自三个独立实验的值的平均值的标准偏差(SD)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，学者的t检验，AL：成人肝脏，FL：胎肝，PH：原代肝细胞。
[0085] 图8(a)(b)(c)表明，CHIR99021可以诱导定形内胚层细胞。流式细胞分析示出在用(a)激活素/wnt3a或(b)激活素/CHIR99021诱导的内胚体的第6天或在用(c)激活素/wnt3a或(d)激活素/CHIR99021诱导的单层的第7天的CXCR4+、CKIT+和EPCAM+细胞的比例。(e)、(f)和(g)NSG鼠中的异位肝组织。肠系膜的H&E染色部分的显微照片示出移植两个月后的hESC源性肝细胞(箭头)的集群。放大倍数为5X。肠(箭头)、移植细胞(箭头的头)。(f)来自图8(c)的H&E染色部分的高倍率(10X)显微照片。(g)(h)免疫组织化学染色示出移植两个月后的肠系膜区域中的hESC源性细胞的存在。人白蛋白的双染(Alexa488：绿色示出为箭头和CK19(Cy3标记：红色)示出为箭头的头)示出，移植的细胞具有分化成肝细胞和胆管细胞谱系的潜力。hESC源性肝细胞样细胞作为白蛋白阳性细胞(箭头)观察，而胆管上皮样细胞表达CK19和发现于管状结构(箭头的头)。
[0086] 图9示出了影响肝祖细胞增殖和成熟的因子。图9(a)示出通过Wnt信号传导和Smad信号传导的肝祖种群的扩增。示出了在不同浓度的CHIR99021(0.3μM、1μM和3μM)和TGFβ抑制剂SB431542(6μM)中的H9源性第27天肝祖细胞培养9天后的ALB+AFP+细胞的数目的成倍增加。图9(b)和图9(c)示出了免疫荧光染色，免疫荧光染色示出H9源性第27天肝祖细胞培养9天后(第36天)的ALB阳性细胞(b)和双阳性ALB和HNF4α(c)的存在。图9(d)和图9(e)示出,Wnt/p-连环蛋白和MEK/ErkK信号传导的抑制增加第44天聚集体(所有三个)中的CYP3A4(erkinhib+足够的营地)和CYP1A2的表达。Wnt抑制剂XAV939(1μM)和MEK/Erk抑制剂PD0325901(1μM)单独或一起连同8-Br-cAMP加入到分化第30天的聚集体培养物。示出了相对于成人肝脏中发现的水平的CYP3A4(d)和CYP1A2(e)的表达。与成人肝脏中发现的那些相比，与cAMP一起加入MEK/ErK抑制剂诱导CYP3A4表达的水平，而与cAMP一起加入Wnt和MEK/ErK抑制剂诱导最高水平的CYP1A2表达。图9(f)示出在不同细胞外基质(ECM)上培养的第26天肝细胞样细胞中的ALB的表达。所示值是相对于明胶上培养的细胞(值设置为1)。
[0087] 图10示出，肝祖细胞中的Notch信号传导通路影响胆管谱系的分化。(a)在胶原/基质胶中生成的三维(3D)组织的H&E染色切片的高倍率(20X)显微照片。H9源性第25天肝祖细胞以5：1的比率与OP9-delta1基质细胞混合(聚集)，在低集群培养皿48小时。嵌合聚集体包埋在1型胶原(80％)和基质胶(20％)的混合物中，以建立3D共培养物。将培养物保持在含有HGF 20ng/ml和EGF 50ng/ml的培养基中并且在存在或不存在GSI下持续9天。在用GSI处理的培养物中保持聚集体形态。包含肝细胞样细胞的这些聚集体表达白蛋白。在不存在GSI下，聚集体广泛地发展分支结构。分支内的细胞示出上皮的形态并组织为围绕内腔。这些细胞表达CK19，这表明它们是胆管细胞，并且该分支结构可以代表发育胆管。图10(b)示出，激活Notch信号传导上调CK19的表达和导管结构中的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)。示出的值是相对于GSI存在下培养的细胞。Notch(-)共培养(即，用GSI处理)中的细胞保持肝细胞的特征，如通过白蛋白的表达表明。图10(c)示出，
3D共培养中的CFTR的表达的诱导高于单层培养中发现的那些。示出的值相对于单层状态下培养的细胞。
3D共培养中的CFTR的表达的诱导高于单层培养中发现的那些。示出的值相对于单层状态下培养的细胞。
[0088] 图11是肝细胞/胆管细胞分化方案的示意图。(a)也在激活素与wnt3a或CHIR99021的存在下生成单层培养物以生成定形内胚层。在第5天单层诱导中的内胚层细胞等同于EB中的第6天的细胞。超出5天的额外激活素处理在单层中也是必要的，培养物用于肝祖细胞和成熟肝细胞的生成。(b)EB培养物用于生成定形内胚层。(c)方案的示意图用于生成胆管细胞。在单层培养物中生成的定形内胚层针对导致培养25天的肝祖细胞(肝细胞)的生成的肝的命运。肝祖细胞解离和在低集群皿中与OP9/OP9 delta细胞聚集两天。嵌合聚集物包埋在胶原/基质胶凝胶中并且在存在或不存在泛Notch信号传导(pan Notch signaling)的抑制剂(例如，notch拮抗剂)γ-分泌酶抑制剂(GSI)L-685、458下的补充有HGF(20ng/ml)和EGF(50ng/ml)的培养基中培养。
[0089] 图12表明，hESC源性内皮细胞增强肝成熟。(a)用于生成嵌合聚集体的方案由hESC源性内皮细胞(RFP阳性)和成肝细胞组成。通过用BMP4诱导4天以及然后用VEGF和bFGF诱导另外的2天来生成RFP(+)/CD34(+)内皮细胞。FACS分离的RFP(+)/CD34(+)内皮细胞接种在I型胶原包被的孔上，并且在VEGF和bFGF的存在下用EGM-2培养基培养6天。为了生成嵌合聚集体，将培养的RFP(+)/CD34(+)细胞进行胰蛋白酶处理、解离并且以每孔100个细胞的细胞密度置于Aggrewell板内。在培养2天后，将第25天的肝细胞以每孔1000个细胞的细胞密度放置到RFP(+)/CD34(+)内皮聚集体上。比例尺100μm。(b)相差和荧光图像示出第33天的内皮/肝聚集体内的RFP阳性细胞。在没有内皮细胞的情况下生成的肝聚集体中未检测到RFP。比例尺100尺皮。(c)流式细胞分析示出了第33天的内皮/肝细胞聚集体中的RFP阳性细胞的比例。(d)RT-qPCR分析示出了第44天的具有和没有内皮细胞的聚集体中的CYP3A4的表达。相对于TBP确定值并且值呈现为相对于成人肝脏样品的表达(值设置为1)的倍数变化。
[0090] 图13展示了3D凝胶培养对hPSC源性肝细胞的成熟的影响。由成肝细胞或肝细胞和内皮细胞(端)组成的聚集体在培养的第25天生成，然后在补充VEGF和bFGF的肝细胞液体培养基中培养额外的7天，随后在补充有cAMP、PD0325901(PD)和XAV939的相同培养基培养12天。为了测试胶原对成熟的影响，将第32天嵌合聚集体包埋在胶原1型凝胶中并且在cAMP、PD0325901和XAV939的存在下培养12天。在第44天收集所有培养物，并且通过qRT-PCR分析指定的基因的表达。相对于TBP确定值。ALB和CYP3A4的表达被呈现为相对于它们在成人肝脏中的水平的倍数变化。AFP和CYP3A7的表达被呈现为相对于它们在胎儿肝脏中的水平的倍数变化。AL：成人肝脏，FL：胎儿肝脏。
[0091] 图14.hPSC分化培养中的肝细胞发育阶段的表征。(a)分化方案的示意图。(b)流式细胞分析示出单层诱导格式的第7天的CXCR4+、CKIT+和EPCAM+种群的发育。(c)RT-qPCR示出了保持在图14a指定的培养条件下的H9源性成肝细胞中的指定基因的表达。在培养的第7、13、19和25天分析指定基因的表达。相对于TBP确定值并且值呈现为相对于胎儿肝脏中的表达(值设置为1)的倍数变化。AL：成人肝脏，FL：胎儿肝脏。
[0092] 图15.Notch信号传导促进从hPSC源性肝细胞样种群的胆管细胞发育。在存在或不存在γ-分泌酶抑制剂(GSI)、Notch通路的拮抗剂的情况下，在补充有HGF(20ng/ml)、EGF(50ng/ml)和TGFbl(5ng/ml)的培养基中与OP9共培养之后的肝细胞源性细胞中的ALB和CK19的基于RT-qPCR的表达分析。在培养的第30、33和36天收集和分析细胞。相对于TBP确定值并且值呈现为相对于第27天肝细胞聚集体中的表达水平(值设置为1)的倍数变化。(b)在具有或没有OP9的情况下培养之后的肝细胞源性细胞中的Notch靶基因HES1、HES5和HEY1的基于RT-qPCR的表达分析。在培养的第36天测定细胞。对于这种分析，将第27天肝细胞聚集体铺板在OP9(OP9+)基质细胞上或者在存在或不存在Notch信号传导拮抗剂γ-分泌酶抑制剂(GSI)的含有HGF、EGF和TGFb1(5ng/ml)的培养基中的基质胶(OP9-)上。相对于TBP确定值并且值呈现为相对于在基质胶上培养的第36天的细胞中的表达水平(值设置为1)的倍数变化。所有图中的柱代表三次独立实验的平均值的标准偏差(SD)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(学者的t检验；n＝3)。
[0093] 图16.三维培养促进胆管细胞成熟：由第25天hESC源性细胞和OP9基质细胞(GFP+)组成的嵌合聚集体的形态。H9源性第25天成肝细胞以4：1的比率与与OP9基质细胞混合(聚集)，在低集群培养皿中混合48小时。嵌合聚集体包埋在1型胶原(1.2mg/ml)和基质胶(40％)的混合物中以建立3D凝胶培养。培养物在存在或不存在GSI的含有HGF、EGF和TGFb1的培养基中保持2周。(b)结构的比例在3D培养物中显示出管、包囊或球体的形态。值呈现为存在或不存在GSI下发育的总结构的比例。值代表3个独立实验。(c)在3D凝胶中发育的合并结构的基于RT-qPCR的表达分析。在第44天收集培养物，并且为基因表达而分析的细胞指示肝细胞(ALB、AFP和CYP3A7)和胆管细胞(CK19、Sox9和CFTR)谱系。相对于TBP确定值并且值呈现为相对于用GSI处理的种群中的表达水平(值设置为1)的倍数变化。
[0094] 图17.hPSC源性胆管细胞在体内形成导管状结构。(a-b)在含有HGF、EGF和TGFb1的培养基中与OP9基质细胞共培养9天的第25天肝细胞源性细胞的移植之后8周的基质e胶塞中的胆管接枝的组织学分析。共培养之后，将细胞解离和移植(每个受体10)入免疫缺陷NOD/SCID/IL2rg-/-(NSG)小鼠的乳腺脂肪垫内。以低(a)和高放大倍率的图像(b)(H&E染色)在乳腺脂肪垫中观察到了多管结构。(c-d)免疫染色，以检测移植之后在乳腺脂肪垫中发育的hESC源性导管结构中的RFP阳性细胞。对于这些研究，从HES2-RFP hESC生成胆管细胞，HES2-RFP hESC表达来自ROSA基因座的RFP。将与OP9基质细胞共培养9天后生成的胆管细胞移植到NSG小鼠的乳腺脂肪垫内。由于存在RFP+细胞，通过免疫组织化学分析移植之后8周发育的移植物。在所有的导管结构内检测到RFP-阳性细胞，证实了细胞是人类来源的，并且源自HES2-RFP细胞。RFP+结构在低(c)和高(d)放大率在图像中可见。
[0095] 图18.3D凝胶中生成的hPSC源性包囊结构包含功能CFTR蛋白(a)从H9(hESC)-和Y2-1(IPSC)源性胆管细胞生成的钙绿标记和毛喉素/IBMX(F/I)刺激的包囊结构的代表共聚焦显微镜图像。在F/I刺激24小时后拍摄图像。比例尺为500μm。(b)在存在或不存在CFTR抑制剂下的F/I刺激之后24小时的包囊肿胀的程度的定量。使用速度成像软件对F/I刺激的包囊肿胀进行定量。包囊的总大小标准化至F/I刺激之前。数值来自三个独立的实验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(学者的t检验；n＝3)。
[0096] 图19.从囊性纤维化患者的iPSC生成胆管细胞。(a)在存在或不存在毛喉素下的源自3D凝胶培养的第44天的删除CFTR的F508iPS细胞(CF-iPS)的胆管细胞样细胞的相差图像。使用图14A中所示的方案生成CF-iPS细胞源性肝细胞和嵌合肝细胞/OP9聚集体。在嵌入胶原/基质胶培养物之后，通过在两周培养期的第一周加入毛喉素从聚集体诱导包囊形成(左)。在没有毛喉素刺激的情况下，CF-iPSC源性胆管细胞形成支导管结构，而不是中空包囊(右)。(b)从培养7和14天的CF-iPSC和正常的iPSC(Y2-1)源性胆管细胞发育的包囊结构的数量的量化。CF-iPSC源性胆管细胞在两周培养周期的第一周保持在存在或不存在毛喉素的3D凝胶条件下(左图)。正常的iPS细胞-源性胆管细胞在存在或不存在CFTR抑制剂下保持两周培养周期的第一周(右图)。添加毛喉素增加包囊结构的数量，包囊结构在培养7天和14天从CF-iPSC源性胆管细胞发育(左图)。添加CFTR抑制剂至正常iPSC源性胆管细胞延迟包囊的形成(右图)。(c)在第44天来自于正常iPSC-(上板)和CF-iPSC-(下板)胆管细胞的包囊的组织学分析。在两周培养的第一周在毛喉素存在的情况下培养胆管细胞种群。将毛喉素添加到正常iPSC源性胆管细胞诱导形成大的中空包囊(上板)。CF-iiPSC源性包囊较小，通常含有内部隔膜(下板)。
[0097] 图20.通过用小分子校正器VX-809和C4处理恢复CF-iPSC源性胆管细胞中的CFTR功能。免疫印迹分析示出用VX-809和C4处理的CF-iPSC源性胆管细胞中的CFTR(带C)的成熟复合糖基化形式的累积。蛋白(带B)的突变体形式主要是在未校正的细胞中。人支气管上皮细胞(HBE)用作阳性对照。(b)由来自两个个体患者(997CFTR del和C1CFTRdel-这两者携带delta F508突变)的CF-iPSC生成的钙绿标记和毛喉素/IBMX(F/I)刺激的包囊结构的代表性共聚焦显微镜图像。在F/I刺激后24小时拍摄图像。比例尺为500μm。(c)在存在或不存在CFTR抑制剂下F/I刺激后24小时在hPSC-包囊中观察的肿胀的程度的定量。使用速度成像软件量化F/I刺激的包囊肿胀。包囊的总大小标准化为在每三个单独的实验F/I刺激之前。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(学者的t检验；n＝3)。
[0098] 图21.细胞内流式细胞分析示出与OP9共培养9天后的肝细胞源性种群中的ALB+和CK19+细胞的比例。细胞在存在或不存在GSI的含有HGF、EGF和TGFb1的培养基中培养。Ctrl示出同型对照。
[0099] 图22肝特化和来自其他hPSC的成肝细胞的分化。RT-qPCR分析示出了保持在如图14a所指示的HES2和Y2-1iPS细胞源性成肝细胞中的指定基因的表达。在培养的第7、13、19和25天分析指定基因的表达。相对于TBP确定值并且值呈现为相对于胎儿肝脏中的表达(值设置为1)的倍数变化。AL：成人肝脏，FL：胎儿肝脏。
[0100] 图23.3D凝胶用于从hPSC源性胆管细胞生成囊性结构。(a)用于生成嵌合聚集体的分化方案的示意图，嵌合聚集体由第25天hPSC源性成肝细胞和OP9细胞(GFP+)组成。在低集群培养皿中，第25天成肝细胞解离并且以4：1的比率与OP9细胞共培养。嵌合聚集体包埋在由I型胶原(1.2mg/ml)和基质胶(20％)的混合物组成的凝胶中。(b)在含有HGF、EGF和TGFb1的培养基中培养的第44天的在存在或不存在OP9的凝胶中发育的结构的基于RT-qPCR的表达分析。在OP9的存在下，Notch靶基因的表达显著上调。相对于TBP确定值并且值呈现为相对于不存在OP9的情况下培养的细胞中的表达(值设置为1)的倍数变化。(c)在第44天培养的存在(右板)或不存在(左)GSI的情况下从与OP9细胞培养的H9源性胆管细胞发育的包囊结构的组织学分析(H&E染色)。(d)免疫印迹分析示出从在存在或不存在OP9的情况下培养的正常iPSC源性胆管细胞生成的结构中的CFTR蛋白(带C)的成熟复合糖基化形式的存在。未分化的正常的iPSC用作阴性对照。(e)从存在或不存在OP9的情况下培养的正常iPSC源性胆管细胞生成的结构中的CFTR的基于RT-qPCR的表达分析。在培养的第44天分析细胞。相对于TBP确定值并且值呈现为相对于Caco-2细胞(肠结肠癌细胞系)中检测的表达值(值设置为1)的倍数变化。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(学者得t检验；n＝3)。
[0101] 图24.从囊性纤维化患者的iPSC生成定形内胚层和成肝细胞。流式细胞分析示出了来自单层培养的第7天的CF-iPS细胞(C1 del CFTR)的CXCR4+、CKIT+和EPCAM+种群的发育。(b)RT-qPCR分析示出保持在图14a概述的培养条件下的CF-iPSC源性成肝细胞种群中的指定基因的表达。在培养的第7、13、19和25天分析指定基因的表达。相对于TBP确定值并且值呈现为相对于胎儿肝脏中的表达(值设置为1)的倍数变化。AL：成人肝脏，FL：胎儿肝脏。
具体实施方式
[0102] 本文描述了通过本文中描述的一系列步骤从多能干细胞(PSC)高效地生成肝细胞和胆管细胞以及用于生成代谢功能肝细胞和/或胆管细胞的强健和可靠的平台。例如，它证明了，一个或多个延长的nodal(例如，激活素)的信号传导处理(extended nodal(e.g.activin)singaling treatment)，诱导聚集并且例如与FGF激动剂诱导和BMP4激动剂诱导组合激活cAMP信号传导，任选地，与增加特定的细胞群的扩增和/或特定的命运一个或多个步骤组合,从而允许可再现地生成肝细胞和胆管细胞谱系细胞，包括例如扩增成的肝细胞和/或利用另外的操纵，从胚状体诱导的定形内胚层或从单层的功能和成熟肝细胞和胆管细胞。
[0103] 本发明的一个方面包括制备肝细胞或胆管细胞谱系细胞的方法，诸如来自延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群的成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞，该方法包括：(a)指定延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群，以通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触来获得包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包括FGF激动剂和BMP4激动剂的组合和/或它们的活性的缀合物和/或片段；和(b)诱导成熟化，进一步谱系特化和/或扩增细胞群的肝细胞和/或胆管祖细胞，以获得肝细胞的扩增种群和/或包括肝细胞和/或胆管细胞的种群，诱导成熟步骤包括生成细胞群的聚集体。
[0104] 聚集本文中证明对于促进成熟是重要的。
[0105] 在实施例中，肝细胞和/或胆管祖细胞包括成肝细胞和/或未成熟的肝细胞和/或未成熟的胆管细胞。
[0106] 术语“接触”(例如，使内胚层细胞群与一种或多种组分接触)旨在包括在体外一起孵育组分(或多种组分)和细胞(例如，将化合物添加到培养的细胞)和接触的步骤可以以任何合适的方式进行。例如，可以在贴壁培养或在悬浮培养中处理细胞，组分可以在时间上基本上同时加入(例如，以混合物方式一起)或顺序(例如，离添加第一组分在1小时内、1天或以上)。细胞也可以与诸如生长因子或其他分化剂的另一种试剂或环境接触以稳定细胞，或进一步分化细胞，以及包括在本领域中已知的条件下培养细胞，例如用于培养例如在实施例中进一步描述的多能(和/或分化的)种群。
[0107] 如本文所用的术语“内胚层”和“定形内胚层”指的是非常早期的胚胎中的三个主要生殖细胞层中的一个(另外两个生殖细胞层是中胚层和外胚层)。内胚层是三层的最内层。内胚层细胞分化，以首先产生胚胎肠，然后产生衍生组织，包括食道、胃、肠、直肠、结肠、咽囊衍生扁桃体、甲状腺、胸腺、甲状旁腺、肺、肝、胆囊和胰腺。
[0108] 本文所用的“诱导的内胚层细胞群”指的是对应于如图1a所示的“定形内胚层诱导”阶段的内胚层细胞的种群。该种群例如可以从暴露于诸如激活素的nodal激动剂的胚状体(EB)制备，或任选地从已经暴露于nodal激动剂和wnt/β-连环蛋白激动TM剂(诸如Wnt3a)或GSK-3选择性抑制剂(诸如CHIR-99021(Stemolecule CHIR99021
Stemgent)、6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)(开曼化工(cat：13123))或来自Stemgent的TM
Stemolecule BIO(cat：04003))的EB制备。可选地，诱导的内胚层细胞群可以从单层生长的细胞制备。诱导的内胚层细胞群可以例如通过用于一个或多个标记的流式细胞和分子分析来识别，标记诸如表面标记CXCR4、CKIT和EPCAM和转录因子SOX17和FOXA2。诱导的内胚层细胞群也可以例如通过至少或大于共表达CXCR4和CKIT或CXCR4和EPCAM的种群的
70％、80％、90％或95％来识别。诱导的内胚层细胞群也可以例如通过大于表达SOX17和/或FOXA2的种群的70％、80％、90％或95％来识别。诱导的内胚层细胞群例如可以在2D(单层)或3D(胚状体或其他形式的聚集体)格式中。诱导的内胚种群可以源自例如hESC以及实例1中展示的诱导的多能干细胞(iPSC)。
Stemgent)、6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)(开曼化工(cat：13123))或来自Stemgent的TM
Stemolecule BIO(cat：04003))的EB制备。可选地，诱导的内胚层细胞群可以从单层生长的细胞制备。诱导的内胚层细胞群可以例如通过用于一个或多个标记的流式细胞和分子分析来识别，标记诸如表面标记CXCR4、CKIT和EPCAM和转录因子SOX17和FOXA2。诱导的内胚层细胞群也可以例如通过至少或大于共表达CXCR4和CKIT或CXCR4和EPCAM的种群的
70％、80％、90％或95％来识别。诱导的内胚层细胞群也可以例如通过大于表达SOX17和/或FOXA2的种群的70％、80％、90％或95％来识别。诱导的内胚层细胞群例如可以在2D(单层)或3D(胚状体或其他形式的聚集体)格式中。诱导的内胚种群可以源自例如hESC以及实例1中展示的诱导的多能干细胞(iPSC)。
[0109] 诱导的内胚层细胞群例如用nodal激动剂处理延长的一段时间以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的定形内胚层细胞群。
[0110] 如实例1所描述和图3a所示的，与未在激活素中培养额外2天的细胞(例如，nodal激动剂的实例)相比，在用FGF/BMP4指定之前在激活素中将第6天(当方法包括单层诱导时，第5天)的细胞额外培养2天导致在第12天测量的SOX17+FOXA2+细胞的比例更高。该步骤在本文中也称为“延长的激活素”处理，并且是“延长的nodal激动剂”处理的实例。
[0111] 本文所用的“延长nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群”指的是已经用诸如激活素的nodal激动剂处理延长的时间(例如，从约1至约4天或额外的约1、2、3或4天(例如，“延长的时间”，除了可以包括用nodal激动剂处理的内胚层诱导阶段之外))的诱导内胚层细胞群。如本文所示的延长的nodal激动剂处理导致成肝细胞(成肝细胞)发育指定的基因的更高水平的表达，包括培养的第26天的HEX、AFP、ALB和HNF4a(如图3d所示)。通过诱导胚状体(EB)中的内胚层细胞或通过诱导单层的内胚层细胞获得延长的nodal激动剂处理的诱导内胚层种群，并且其中，在nodal激动剂(例如，激活素)存在下培养诱导内胚层种群延长的时间，以产生延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群。
[0112] 在实施例中，通过诱导胚状体(EB)中的内胚层细胞获得延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群。在另一实施例中，通过诱导单层的内胚层细胞获得延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群。在每种情况下，均在nodal激动剂(例如，激活素)的存在下培养诱导的内胚层种群延长的时间。
[0113] 任选地，例如，在诱导的内胚层细胞群源自EB的实施例中，诱导的内胚层种群随后解离。如本文所用的，“解离的细胞”或“解离的细胞群”是指不处于3D聚集体中的细胞，例如，彼此物理地分离。解离的细胞与“细胞聚集体”不同，细胞聚集体指的是集群或细胞的团块。
[0114] 在实施例中，诱导的内胚层种群包括至少80％、85％、90％的CXCR4+和CKIT+阳性细胞和/或至少70％、75％、80％的SOX17+细胞。
[0115] 在一些实施例中，诱导的内胚层细胞群(和/或延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群)从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)产生。多能干细胞任选地为人ESC(hESC)或人iPSC(hiPSC)。
[0116] 如本文使用的术语“多能”指的是在不同的条件下具有以分化成多于一种的分化的细胞类型的能力的细胞，以及例如分化为三个生殖细胞层的特性的细胞类型的能力。多能细胞的特征在于它们分化成多于一种细胞类型的能力，例如，使用裸鼠畸胎瘤形成测定。多能也体现在胚胎干(ES)细胞标记的表达。
[0117] 术语“祖细胞”是指具有沿着发育通路或进展的处于比相对于可以通过分化产生的细胞的完全分化的细胞更早的阶段的细胞表型的细胞。祖细胞可以产生多个不同的分化的细胞类型或单个分化的细胞类型，这取决于发育通路以及细胞发育和分化的环境。
[0118] 本文所用的术语“干细胞”是指未分化的细胞，其能够增殖、自我更新和产生更多的祖细胞，祖细胞能够生成大量的母细胞，母细胞进而可以产生分化的或可分化的子细胞。子细胞可以例如诱导增殖和产生后代，后代随后分化成一种或多种成熟的细胞类型，同时也保留了具有父母的发育潜能的一种或多种细胞。
[0119] 术语“胚胎干细胞”用于指胚胎囊胚的内细胞团的多能干细胞(见，例如，美国专利号5843780、6200806)。这样的细胞也可以从源自体细胞核转移的囊胚的内细胞团获得(见，例如，美国专利号5945577、5994619、6235970)。胚胎干细胞的区别特征限定了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有胚胎干细胞的一个或多个独特特征，使得细胞可以与其他细胞区别开来，则细胞具有胚胎干细胞的表型。示例性区别胚胎干细胞的特征包括但不限于基因表达谱、增殖能力、分化能力、核型、对特定的培养条件的响应等。
[0120] 在一个实施例中，从延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群产生肝细胞和/或胆管细胞的方法包括：(a)通过使诱导的内胚层细胞群与包括FGF激动剂和BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段的特化培养基接触来将延长的nodal激动剂处理的内胚层细胞群特化至包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群。
[0121] 在实施例中，特化步骤包括使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群与包括FGF激动剂和BMP4的特化培养基接触。例如，FGF激动剂可以是bFGF、FGF10、FGF2或FGF4、它们的活性片段和/或它们的组合。例如，组合可以依次加入到细胞中。
[0122] 在实施例中，特化步骤包括：首先使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群与包括FGF10和BMP4的特化培养基接触约40小时至约60小时，例如约40小时、42小时、44小时、46小时、48小时、50小时、52小时、54小时、56小时、58小时或约60小时，然后使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群与包括bFGF和BMP4的特化培养基接触约4天至约7天，例如，约4天、5天、6天或约7天。
[0123] 在一个实施例中，特化培养基包括Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)，IMDM补充有1％体积/体积B27添加物(Invitrogen：A11576SA)、抗坏血酸、MTG、FGF10(50ng/ml)(例如，从第8天至第10天)、bFGF(20ng/ml)(例如，从第10天至第14天)和BMP4(50ng/ml)。
[0124] 任选地，内胚层细胞群与FGF10和BMP4接触1至3天，任选地，2天，并且随后与bFGF和BMP4接触2至6天，任选地，3至5天，任选地，4天。在一些实施例中，内胚层细胞群在包括BMP4和FGF10或bFGF的细胞培养基中孵育。任选地，内胚层细胞群在包括Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)的细胞培养基中孵育，IMDM补充有1％体积/体积B27、抗坏血酸、硫代甘油、BMP4和FGF10或bFGF。
[0125] 在一些实施例中，内胚层细胞群解离，并且然后单层细胞与FGF和BMP4激动剂接触。
[0126] 在其他实施例中，在与FGF和诸如BMP4的BMP4激动剂接触之前，单层细胞与激活素接触1至4天，任选地，1天、2天、3天或4天。任选地，单层细胞在包括激活素A的细胞培养基中孵育，任选地，培养基包括补充有bFGF、激活素A和BMP4的StemPRO-34。
[0127] 在进一步的实施例中，特化步骤包括使细胞与包括促进成熟、进一步谱系特化和/或扩增的一种或多种因子的特化培养基接触。
[0128] 如本文所使用的术语“特化培养基”指的是用于促进或便于细胞或细胞群的特化的培养基。肝特化培养基的一个实例包括Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)，IMDM补充有1％体积/体积B27(Invitrogen：A11576SA)和抗坏血酸、MTG、BMP4激动剂和选自FGF10、bFGF、FGF4和FGF2的至少一种FGF激动剂。对于一些阶段和在一些实施例中，例如，相同的特化培养基可以用于特化肝细胞和胆管细胞谱系。在其他阶段和在其他实施例中，特化培养基包括促进肝细胞的特化和/或胆管细胞发育的一种或多种因子，例如，notch拮抗剂或notch激动剂。本文使用的术语“特化”是指细胞向特定细胞命运演化的过程，在此之前，细胞类型尚未确定，并且朝着特定命运的细胞的任何偏置可以颠倒或转换成另一种命运。特化导致细胞的命运状态无法在典型的条件下改变。
[0129] 例如，可以通过测量肝和/或胆管细胞表达的基因来确认沿着肝命运的诱导的内胚层的特化，例如，肝和/或胆管细胞表达的基因包括如实例9中展示的Tbx3ALB、AFP、CK19、Sox9、NHF6β和Notch2。例如，它证明了Notch2的表达在HGF/DEX/OSM处理的成肝细胞中上调。Notch2蛋白的检测和/或表达可以用于确认，细胞群特化至胆管细胞，例如，如实例9所述的，可以检测Notch2。
[0130] 在细胞的上下文中，术语“分化的”或“分化”是相对术语，并且“分化细胞”是比与它比较的细胞已进一步向下进展至发育通路的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制性前体细胞(诸如诱导的内胚层祖细胞)，其进而可以分化成其他类型的前体细胞，沿着通路进一步向下，然后成熟到最终阶段功能性细胞，功能性细胞在特定的组织类型中起着关键作用，并且可以或可以不保留进一步增殖的能力。本文所用的术语“分化”包括用于产生诱导的胚层种群和特化的细胞群(例如，肝细胞或胆管细胞特化的细胞群)的步骤。
[0131] 在另一实施例中，从包括至少70％、80％、85％或至少90％的白蛋白阳性细胞的细胞群生成聚集体。在另一实施例中，在培养24天、25天、26天、27天或28天之后生成聚集体(例如，获得PSC的那天被认为是0天)。
[0132] 任选地，通过酶处理和/或人工解离生成聚集体。在一些实施例中，通过用胶原酶和/或TrypleLE解离细胞来生成聚集体。在一些实施例中，细胞随后在超低集群皿中进行培养。在其他实施例中，单层培养物可以通过移液管机械地分开，或可酶促离解并聚集在低附着板中孵育，或通过摇动细胞群机械地分开。可以任选地使用Aggrewells。
[0133] 在实施例中，细胞(例如，单层和聚集之前的细胞)生长在基质包被的板上，任选地生长在基质胶包被的板上。也可以使用支持成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞的附着的其他基质包被的板，例如，层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原包被的板。例如，图9f示出使用若干不同的基质包被的基板的在诱导第26天的ALB表达。
[0134] 诱导成熟化、进一步的谱系特化和/或扩增可以包括一个或多个子步骤。
[0135] 在进一步的实施例中，在肝细胞生长因子(HGF)、地塞米松(DEX)和/或抑瘤素M(OSM)和/或它们的活性缀合物和/或片段的存在下培养包括肝细胞和/或胆管祖细胞和/或聚集体的细胞群。例如，在聚集之前，可以在包括HGF、DEX和/或OSM的成熟培养基中培养包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群约10天、11天、12天、13天或14天，和/或聚集之后，可以在包括HGF、DEX和/或OSM的成熟培养基中培养聚集体约6天、7天、8天、9天或10天。例如，加入约10ng/mL的HGF促进聚集体的存活。
[0136] 在一个实施例中，诱导成熟和任选地诱导进一步的谱系特化和/或扩增还包括激活聚集体的细胞内的cAMP通路以诱导肝细胞和胆管祖细胞分化和/或成熟为肝细胞和/或胆管细胞。
[0137] 延长的nodal激动剂处理和细胞(例如第25天的单层诱导细胞和第26天的EB诱导细胞)的聚集体产生种群，例如，该种群能够响应cAMP信号传导。如本文所示的，cAMP的激活增加CYP表达和肝细胞成熟。
[0138] 在另一实施例中，激活cAMP通路包括使聚集体与cAMP激动剂类似物接触，cAMP激动剂类似物诸如8-溴腺苷-3’5”-环单磷酸酯(8-Br-cAMP)、二丁酰-cAMP、腺苷-3’,5’-环状单硫代磷酸、Sp-异构体(SP-cAMPS)和/或8-溴腺苷-3’,5’-环状单硫代磷酸、Sp-异构体(Sp-8-Br-cAMPS))和/或任何其他的cAMP激动剂，诸如霍乱毒素、毛喉素、咖啡因、茶碱和百日咳毒素。例如，已经使用SP-8-Br-cAMP(Biolog：Cat.No.：B002CAS No.：[127634-20-2])、8-Br-cAMP和毛喉素(FSK)(Sigma：66575-29-9)进行实验。例如，包括毛喉素(FSK)(Sigma：66575-29-9)+XAV939+PD0325901的组合有效地增加CYP表达以及诱导肝祖细胞成熟为肝细胞。本文所用的“cAMP激动剂”包括cAMP、激活cAMP的cAMP类似物以及激活cAMP的分子，诸如霍乱毒素、毛喉素、咖啡因、茶碱和百日咳毒素。在一些实施例中，也可以使用为磷酸二酯酶抑制剂的IBMX(磷酸二酯酶是cAMP的抑制剂)，例如，与毛喉素组合使用。
[0139] 已经发现，也例如，添加10ng/ml的HGF(从20ng/ml减少)促进聚集体的存活，而维持OSM对阶段1CYP酶(特别是CYP 3A4)的表达的诱导具有抑制效果。因此，在一些实施例中，聚集体在不存在OSM的情况下与cAMP类似物和/或激动剂进行培养。
[0140] 本文所用的术语“成熟”是指细胞(例如，成肝细胞)成为更专门和/或实现全功能的状态(例如，它在体内的功能状态)所需的过程。在一个实施例中，通过该过程，未成熟的肝细胞或肝祖细胞变成熟，功能肝细胞称为成熟。
[0141] 图1a指的是“肝成熟A”和图14a指的是成肝细胞的分化。这两种情况下提到的细胞群均是成肝细胞的细胞群，如果例如在DEX(任选地，与HGF和OSM和/或cAMP组合)存在下继续培养，则可以产生肝细胞，或者如果在EGF、TGB1、HGF和EGF的存在下与Notch激动剂(例如，Notch信号供体)(诸如OP9、OP9delta和/或OP9 Jagged1细胞)组合培养，则产生胆管细胞。
[0142] 本文所用的术语“成熟培养基”指的是用于促进或便于细胞或细胞群的成熟的培养基，并且其可以包括成熟因子以及细胞扩增诱导物和谱系诱导物。用于诱导肝细胞成熟的成熟培养基的一个实例包括Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)，IMDM补充有1％体积/体积B27(Invitrogen：A11576SA)以及抗坏血酸、谷氨酰胺、MTG和任选的肝细胞生长因子(HGF)、地塞米松(Dex)和/或抑瘤素M。用于诱导肝细胞的成熟培养基的另一实例包括没有EGF的肝细胞培养基(HCM)(Lonza：CC-4182)。成熟培养基任选地也包括cAMP类似物和/或cAMP激动剂，cAMP类似物和/或cAMP激动剂例如诱导肝细胞谱系的扩增和肝细胞谱系的成熟。成熟培养基可以包括因子，因子促进肝细胞和/或胆管细胞发育，进一步谱系特化和/或扩增和/或进一步谱系选择。例如，单独的Wnt拮抗剂或与TGFβ拮抗剂和/或MEK/Erk拮抗剂的组合促进肝细胞成熟。例如，Notch激动剂在本文中展示出诱导胆管细胞谱系发育并且当期望胆管细胞时添加。类似地，Notch拮抗剂促进肝细胞谱系并且可以当期望肝细胞时添加，例如，以抑制胆管细胞发育。
[0143] 不同的成熟培养基可以依次使用(例如，单层成熟培养基(例如，聚集前使用)，聚集体成熟培养基(聚集后使用)；例如，肝细胞成熟培养基包括促进肝细胞发育的因子，而胆管细胞成熟培养基例如促进胆管细胞发育。
[0144] 例如，在实施例中，成熟培养基包括cAMP类似物和/或cAMP激动剂和DEX，和任选地将HGF加入到聚集体，随后在包括HGF、DEX和OSM的成熟培养基中培养聚集前的种群例如约10天、11天、12天、13天或14天。
[0145] 如本文所使用的术语“肝细胞”指的是实质肝细胞。肝细胞组成大多数肝脏的细胞质团，并且参与蛋白质的合成和储存、碳水化合物的代谢、胆固醇、胆汁盐和磷脂的合成以及外源性和内源性物质的解毒、修改和排泄。
[0146] 如本文所用的术语“原代肝细胞”是直接从活组织(例如，活检材料)获取并且在体外建立生长的肝细胞。
[0147] 如本文所使用的术语“成肝细胞”指的是具有分化成肝细胞和胆管细胞谱系(例如，肝细胞或胆管细胞)的细胞的能力的祖细胞。成肝细胞是例如肝细胞和胆管细胞的祖细胞的子集，成肝细胞可以包括未成熟的肝细胞和未成熟的胆管细胞(例如，具有特定细胞命运并且可以仅成熟为肝细胞或仅成熟为胆管细胞的细胞)。在一些实施例中，成肝细胞由标记物的表达限定，标记物诸如Hex、HNF4、甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)。例如，当在包含第28天成肝细胞的培养物中激活Notch信号传导时，成肝细胞可以产生胆管细胞(例如，CK19+细胞)。如本文所用的术语“肝祖细胞”意指具有分化成功能肝细胞的能力的细胞，功能肝细胞例如为白蛋白阳性的和/或表达CYP酶。
[0148] 如本文所用的术语“胆管祖细胞”意指具有分化成功能胆管细胞的能力的细胞，功能胆管细胞例如为CK19阳性的和/或表达CFTR。
[0149] 如本文使用的术语“未成熟的肝细胞”是指表达白蛋白但是不表达明显水平的功能性CYP3A4和/或CYP1A2酶的肝细胞谱系细胞。在一些实施例中，未成熟的肝细胞必须经过熟化以获得成熟肝细胞的功能。在一些实施例中，未成熟的肝细胞通过诸如Hex、甲胎蛋白和白蛋白的标记物的表达来限定。
[0150] 如本文所用的“成熟肝细胞”是指表达CYP酶(例如，CYP3A4和CYP1A2)和白蛋白的肝细胞谱系细胞。任选地，成熟肝细胞包括功能性或可测量水平的代谢酶，诸如相当于成年细胞的I阶段和II阶段药物代谢酶。I阶段药物代谢酶的实例包括但不限于：细胞色素P450CYP1A2、CYP3A4和CYP2B6。II阶段药物代谢酶的实例包括但不限于：芳基胺N-乙酰转移酶NAT1和NAT2以及UDP葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1。例如，成熟肝细胞可以是代谢活29
性肝细胞。吲哚花青绿(ICG)的细胞摄取被认为是成人肝细胞 的特征并且在临床上用作
30
测试基片以评价肝功 。例如，成熟肝细胞是ICG阳性染色肝细胞。在肝细胞的种群中，肝细胞的50％、60％、70％、80％、90％或更多是ICG，肝细胞种群可以被认为是成熟的。与“未成熟的肝细胞”相比，成熟肝细胞表达增加的白蛋白，例如，比未成熟的肝细胞多至少5％、
10％、25％、50％、75％、100％或200％的白蛋白。
性肝细胞。吲哚花青绿(ICG)的细胞摄取被认为是成人肝细胞 的特征并且在临床上用作
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测试基片以评价肝功 。例如，成熟肝细胞是ICG阳性染色肝细胞。在肝细胞的种群中，肝细胞的50％、60％、70％、80％、90％或更多是ICG，肝细胞种群可以被认为是成熟的。与“未成熟的肝细胞”相比，成熟肝细胞表达增加的白蛋白，例如，比未成熟的肝细胞多至少5％、
10％、25％、50％、75％、100％或200％的白蛋白。
[0151] 在实施例中，肝细胞是功能性肝细胞。
[0152] 如本文所使用的术语“功能性肝细胞”指的是显示出成人肝细胞(例如，成熟肝细胞)的一个或多个特征的肝细胞和/或致力于肝命运且比起始细胞更分化的未成熟的肝细胞(例如，相比于内胚层细胞群、肝细胞前体或未成熟的肝细胞)，相比于起始细胞，未成熟的肝细胞例如表达白蛋白和/或增加的白蛋白。任选地，功能性肝细胞是成熟肝细胞，并且包括相当于成年细胞的功能性或可测量水平的代谢酶，诸如I阶段和II阶段药物代谢酶。例如，功能性肝细胞可以是代谢活性肝细胞。吲哚花青绿(ICG)的细胞摄取被认为是29 30
成年肝细胞的特征 并且在临床上用作测试基片以评价肝功 。功能性肝细胞例如是ICG阳性染色肝细胞。在肝细胞的种群中，例如，至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、
70％、80％、90％或以上的肝细胞是ICG阳性的，则可以认为肝细胞的种群是肝细胞的功能性种群。在另一实例中，功能性肝细胞是白蛋白分泌肝细胞，并且如果例如至少25％、30％、
35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％，90％或更多的肝细胞是白蛋白分泌的，则肝细胞的种群可以被认为是肝细胞的功能性种群。
成年肝细胞的特征 并且在临床上用作测试基片以评价肝功 。功能性肝细胞例如是ICG阳性染色肝细胞。在肝细胞的种群中，例如，至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、
70％、80％、90％或以上的肝细胞是ICG阳性的，则可以认为肝细胞的种群是肝细胞的功能性种群。在另一实例中，功能性肝细胞是白蛋白分泌肝细胞，并且如果例如至少25％、30％、
35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％，90％或更多的肝细胞是白蛋白分泌的，则肝细胞的种群可以被认为是肝细胞的功能性种群。
[0153] 在实施例中，与包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞种群、和/或从非延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群产生的肝细胞、没有聚集和/或cAMP信号传导诱导产生的肝细胞相比，肝细胞、任选地功能性肝细胞包括选自由ALB、CPS1、G6P、TDO、CYP2C9、CYP2D6、CYP7A1、CYP3A7、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、NAT2和UGT1A1组成的组的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个基因或蛋白的增加的表达。在其他实施例中，至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的肝细胞、任选地功能性肝细胞是ASGPR-1+细胞。
[0154] 在一些实施例中，功能性肝细胞显示相当于或高于原代成熟肝细胞中发现的那些的核酸或蛋白水平的CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP2C9和/或CYP2D6，任选地，至少1.1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或者介于1.1倍和5倍之间的任何0.1增量的增加的水平，任选地，至少增加50％至100％、75％至125％、85％至115％、90％至110％或95％至105％。例如，是在原代肝细胞中发现的1.15倍至6.1倍的增加的表达，(例如，CYP1A2 6.1倍(610％)，CYP3A4 13.2倍(1320％)，CYP 2B6 2倍(200％)，CYP2C9 1.52倍152％，UGT1A1 2倍(200％)，CYP2D6 1.15倍(115％))。在一些实施例中，肝细胞显示出相当于或高于类似阶段的原代肝细胞中发现的那些的核酸或蛋白质水平的ALB、HNF4、AFP、CPS1、G6P、TDO1、NAT1、NAT2和/或UGT1A1，任选地，是原代肝细胞中发现的那些的至少50％至100％、75％至125％、85％至115％、90％至110％或95％至105％的水平。
[0155] 在其他实施例中，功能性肝细胞显示出高于成肝细胞和/或未成熟的肝细胞中的那些的核酸或蛋白质水平的CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP2C9和/或CYP2D6，任选地，原代肝细胞中发现的那些的至少110％、125％、150％、175％、200％、300％、400％或500％的水平。在一些实施例中，功能性肝细胞显示出高于成肝细胞和/或未成熟的肝细胞中的那些的核酸或蛋白质水平的ALB、CPS1、G6P、TDO1、NAT1、NAT2和/或UGT1A1，任选地，原代肝细胞中发现的那些的至少110％、125％、150％、175％、200％、300％、400％或500％的水平。
[0156] 在其他实施例中，功能性肝细胞表达受体无唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR1)。在其他实施例中，至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的肝细胞、任选地功能性肝细胞，是ASGPR-1+细胞。
[0157] 在进一步的实施例中，功能性肝细胞在体外显示出CYP1A2活性。任选地，功能性肝细胞显示出相当于或高于原代肝细胞中发现的那些的CYP1A2活性，任选地，原代肝细胞中发现的那些的至少50％至100％、75％至125％、85％至115％、90％至110％或95％至105％的水平。在一些实施例中，CYP1A2活性通过用非那西丁孵育细胞和监测细胞中的邻二乙基化代谢物累积的生成来测量。
[0158] 在进一步的实施例中，功能性肝细胞在体外显示出CYP2B6活性。任选地，功能性肝细胞显示出相当于或高于原代肝细胞中发现的那些的CYP2B6活性，任选地，原代肝细胞中发现的那些的至少50％至100％、75％至125％、85％至115％、90％至110％或95％至105％的水平。在一些实施例中，CYP2B6活性通过用安非他酮孵育细胞和监测细胞中的代谢物邻羟基安非他酮的形成来测量。
[0159] 在进一步的实施例中，肝细胞在体外显示出NAT1和/或NAT2活性。任选地，肝细胞显示出相当于或高于原代肝细胞中发现的那些的NAT1和/或NAT2活性，任选地，原代肝细胞中发现的那些的至少1.1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍或约50％至100％、75％至125％、85％至115％、90％至110％或95％至105％的水平。在一些实施例中，NAT1和/或NAT2活性通过磺胺二甲嘧啶(SMZ)至N-乙酰SMZ的代谢来指示。
[0160] 在进一步的实施例中，肝细胞在体外显示出UGT活性。任选地，肝细胞显示出相当于或高于原代肝细胞中发现的那些的UGT活性，任选地，原代肝细胞中发现的那些的至少50％至100％、75％至125％、85％至115％、90％至110％或95％至105％的水平。在一些实施例中，UGT活性通过在细胞中从4-甲基伞形酮(4-MU)生成4-MU葡糖苷酸(4-MUG)来指示。
[0161] 在实施例中，与包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞种群、和/或从非延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群产生的肝细胞、没有聚集和/或cAMP信号传导诱导产生的肝细胞相比，肝细胞、任选的功能性肝细胞包括选自由ALB、CPS1、G6P、TDO、CYP2C9、CYP2D6、CYP7A1、CYP3A7、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、NAT2和UGT1A1组成的组的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个基因或蛋白质的增加的表达。
在其他实施例中，肝细胞、任选的功能性肝细胞的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％是ASGPR-1+细胞。
在其他实施例中，肝细胞、任选的功能性肝细胞的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％是ASGPR-1+细胞。
[0162] 在又另一实施例中，功能性肝细胞显示出表明肝细胞成熟的全局基因表达谱。任选地，功能性肝细胞显示出比成肝细胞和/或未成熟的肝细胞的全局基因表达谱更类似于原代肝细胞的全局基因表达谱。全局基因表达谱通过本领域中已知的任何方法获得，例如，微阵列分析。
[0163] 在实施例中，通过用notch激动剂处理细胞群的聚集体来特化胆管细胞的命运。
[0164] 如本文所使用的术语“胆管细胞”指的是形成胆管的细胞。
[0165] 如本文所使用的术语“胆管细胞前体”指的是具有分化成胆管细胞(例如，成肝细胞)的能力的细胞以及能够成熟为功能性胆管细胞的未成熟的胆管细胞。在一些实施例中，胆管细胞谱系的细胞由诸如CK19、胰液受体(SR)、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)和碳酸氢氯阴离子交换剂2(Cl(-)/HCO(3)(-)AEs)的标记物的表达限定。
[0166] 如本文所使用的术语“未成熟的胆管细胞”指的是必须经历成熟以获得成熟胆管细胞的功能的胆管细胞谱系细胞。在一些实施例中，未成熟的胆管细胞表达CK19和/或Sox9，任选地包括早期的Notch激动剂处理的细胞，任选地处理至少1天、至少2天、至少3天或至少4天。
[0167] 在实施例中，胆管细胞是功能性胆管细胞。
[0168] 如本文所用的术语“功能性胆管细胞”指的是显示出成人胆管细胞的一个或多个特征(例如，成熟胆管细胞)的胆管细胞和/或是表达CK-19、MDR1和/或CFTR的胆管细胞谱系细胞。例如，功能性胆管细胞表达MDR1转运蛋白，并且当位于囊性结构中时可以将诸如罗丹明123的示踪染料转运至结构腔空间内。作为另一实例，如图18所示，可以例如使用囊性结构上的毛喉素诱导的肿胀测定来评价CFTR的功能活性。在胆管细胞的种群中，如果例如至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的细胞表达促胰液受体(SR)、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、CK-19和/或碳酸氢氯阴离子交换剂2(Cl(-)/HCO(3)(-)AEs)，则可以认为该种群是功能性种群。
[0169] 如本文所用的术语“成熟胆管细胞”是表达特定的转运蛋白或细胞膜受体活性的胆管细胞，诸如促胰液受体(SR)、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)和任选的碳酸氢氯阴离子交换器剂2(Cl(-)/HCO(3)(-)AEs)。
[0170] 在实施例中，产生的胆管细胞的种群是功能性胆管细胞的种群。与包括肝细胞和胆管祖细胞的细胞群的细胞相比和/或与从未用notch激动剂处理的聚集体产生的种群细胞相比，功能性胆管细胞包括例如选自Sox9、CK19和CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)的至少1个、至少2个或3个基因或蛋白质的增加的表达。在其他实施例中，胆管细胞的种群的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％是CK19+胆管细胞。在其他实施例中，功能性胆管细胞的至少40％、50％、60％、70％、80％或90％是CFTR+胆管细胞。
[0171] 术语“表达”指的是参与产生RNA和蛋白质和适当的分泌蛋白的细胞进程，包括适用的但不限于，例如转录、翻译、折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过从基因转录的mRNA的翻译获得的多肽。
[0172] 术语“细胞培养基”(本文中也称为“培养基”或“介质”)在本文中称为含有营养素的用于培养细胞的培养基，营养素维持细胞生存力和支持增殖和任选的分化。细胞培养基可以包含下列任何适当的组合：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代物以及诸如肽生长因子、维生素等的其他成分。通常用于特定细胞类型的细胞培养基为本领域技术人员所熟知。
[0173] 合适的培养基可以包括合适的基础培养基，基础培养基包括例如DMEM(Life Technologies公司)、IMDM、RPMI、CMRL和/或支持内胚层细胞的生长以提供例如基础培养基组分的任何其他培养基，在基础培养基中可以添加成分和任选的其他试剂。
[0174] 本文中涉及培养的各种天数。本领域技术人员将认识到，培养期可以改变。
[0175] 在一些实施例中，如本文所用的“第5天”通常是指源自例如PSC单层的诱导的内胚层细胞群。源自EB的诱导的内胚层细胞群培养约6天，以到达与它们需要处理约24小时以诱导EB形成类似的培养点。因此，第7天单层诱导培养相当于第8天胚状体诱导培养等。在这个阶段，诱导的内胚层种群可以包括表达例如Foxa2的和SOX17的细胞。类似地，“第7天”通常是指已被延长nodal激动剂处理两天(例如，这将是EB方法的第8天)的诱导的内胚层种群。“第25天”通常是指细胞聚集的阶段(如果源自单层，或者如果源自EB的第26天)。其中，使用单层细胞，利用EB可以使用等同的方法，培养期通常延迟1天。图11提供了使用单层细胞的时间表的实例(图11A)和使用EB的实例(图11B)。图11C和图14A中提供了用于生成胆管细胞的示例时间表。
[0176] 如本文所使用的术语“FGF激动剂”是指诸如细胞因子的分子，包括例如FGF或激活FGF信号传导通路(例如，结合和激活FGF受体)的小分子。例如，FGF受体激活可以通过由免疫检测测量MEK/ERK、AKT和/或PI3K的活性来评估。
[0177] 如本文所使用的术语“FGF”是指任何成纤维细胞生长因子，例如，人FGF1(基因ID：2246)、FGF2(也称为bFGF；基因ID：2247)、FGF3(基因ID：2248)、FGF4(基因ID：2249)、FGF5(基因ID：2250)、FGF6(基因ID：2251)、FGF7(基因ID：2252)、FGF8(基因ID：2253)、FGF9(基因ID：2254)和FGF10(基因ID：2255)，任选地包括它们的活性缀合物和片段，包括天然存在的活性缀合物和片段。在特定实施例中，FGF是FGF10、FGF4和/或FGF2。
[0178] 如本文所使用的，“FGF的活性缀合物和片段”包括结合和激活FGF受体和任选地激活FGF信号传导的成纤维细胞生长因子的缀合物和片段。
[0179] FGF的浓度可以例如为从约1ng至约500ng/ml的范围内，例如从约1ng至约250ng/ml，从约10ng至约250ng/ml，从约10ng至约100ng/ml。在另一实施例中，FGF的浓度为约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约150ng/ml、约200ng/ml、约300ng/ml、约400ng/ml或约500ng/ml。
[0180] FGF10的浓度可以例如为从约1ng至约500ng/ml的范围内，例如从约1ng至约250ng/ml，从约10ng至约250ng/ml，从约10ng至约100ng/ml。在另一实施例中，FGF的浓度为约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约150ng/ml、约200ng/ml、约300ng/ml、约400ng/ml或约500ng/ml。
[0181] bFGF的浓度可以例如为从约1ng至约500ng/ml的范围内，例如从约1ng至约250ng/ml，从约10ng至约250ng/ml，从约10ng至约100ng/ml。在另一实施例中，FGF的浓度为约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约150ng/ml、约200ng/ml、约300ng/ml、约400ng/ml或约500ng/ml。
[0182] 在实施例中，BMP4激动剂选自组BMP4、BMP2和BMP7。例如，BMP4、BMP7和BMP2在胚胎发育中共享相同的受体。
[0183] 如本文所用的术语“BMP4”(例如，基因ID：652)是指骨形态发生蛋白4，例如，人BMP4以及它们的活性缀合物和片段，任选地包括例如可以激活BMP4受体信号传导的天然存在的活性缀合物和片段。BMP(例如，BMP4)的浓度可以例如为从约1ng至约500ng/ml的范围内，例如从约1ng至约250ng/ml，从约10ng至约250ng/ml，从约10ng至约100ng/ml。在另一实施例中，BMP的浓度(例如，BMP4的浓度)为约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约
150ng/ml、约200ng/ml、约300ng/ml、约400ng/ml或约500ng/ml。
150ng/ml、约200ng/ml、约300ng/ml、约400ng/ml或约500ng/ml。
[0184] 如所提到的，该方法可以适用于在单层中生长的内胚层细胞群。
[0185] 因此，进一步的方面包括从多能干细胞群产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，该方法包括：
[0186] a)使作为单层培养的多能干细胞与诱导培养基接触以提供诱导的内胚层细胞群，诱导培养基包括诸如ActA的nodal激动剂和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂(诸如ⅰ)Wnt3a和/或ii)GSK-3选择性抑制剂，诸如CHIR-99021)；
[0187] b)使诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；和
[0188] c)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触来特化以获得包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包含FGF激动剂和BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段，
[0189] d)任选地使包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群与成熟培养基接触，熟培养基包括HGF、地塞米松和/或抑瘤素M和/或它们的活性缀合物和/或片段；
[0190] e)诱导成熟，和任选地诱导细胞群的肝细胞和胆管祖细胞至肝细胞和/或胆管细胞的进一步的谱系特化和/或扩增，诱导成熟步骤包括生成细胞群的聚集体。
[0191] 此外，内胚层种群也可以包含在胚状体中。因此，进一步的方面包括从多能干细胞群产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，该方法包括：
[0192] a)任选地通过使多能干细胞与BMP4激动剂接触，形成多能干细胞的胚状体(EB)；
[0193] b)使EB与诱导培养基接触以提供诱导的内胚层细胞群，诱导培养基包括诸如ActA的nodal激动剂和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂(诸如ⅰ)Wnt3a和/或ii)GSK-3选择性抑制剂，诸如CHIR-99021)；
[0194] c)解离诱导的内胚层细胞群，以提供解离的诱导内胚层细胞群；
[0195] d)使解离的诱导内胚层细胞群与nodal激动剂接触，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
[0196] e)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触来特化以获得包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包含FGF激动剂和BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段，
[0197] f)任选地使包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群与成熟培养基接触，熟培养基包括HGF、地塞米松和/或抑瘤素M和/或它们的活性缀合物和/或片段；和
[0198] g)诱导细胞群的肝细胞和/或胆管祖细胞至肝细胞和/或胆管细胞的成熟、进一步谱系特化和/或扩增，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括生成细胞群的聚集体。在一些实施例中，诱导成熟和任选地诱导进一步谱系特化和/或扩增步骤还包括激活聚集体内的cAMP通路以诱导细胞群的肝细胞和/或胆管祖细胞成熟为包括肝细胞和/或胆管细胞的种群。在实施例中，该方法包括使聚集体与cAMP类似物和/或cAMP激动剂接触。
[0199] 另一个方面包括从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)产生功能性肝细胞和/或胆管细胞的方法，该方法包括：
[0200] a)使用于形成胚状体的作为单层培养的多能干细胞与诱导培养基接触以提供诱导的内胚层细胞群，诱导培养基包括诸如ActA的nodal激动剂和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂(诸如ⅰ)Wnt3a和/或ii)GSK-3选择性抑制剂，诸如CHIR-99021)；
[0201] b)使诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
[0202] c)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触来特化以获得包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包含至少一种FGF激动剂和一种BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段，和
[0203] d)诱导肝细胞和/或胆管祖细胞至肝细胞和/或胆管细胞的成熟、进一步谱系特化和/或扩增，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括：
[0204] (i)利用包括HGF、OSM和DEX的成熟/特化培养基培养包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群；
[0205] (ⅱ)任选地，当细胞群包括至少70％、80％、85％或90％的白蛋白阳性细胞时，或在培养约20天至约40天之后，例如，在培养约24天至约28天之后，生成细胞群的聚集体；
[0206] (iii)在聚集细胞的成熟培养基中培养聚集的细胞：和
[0207] (iv)任选地激活聚集的细胞中的cAMP通路，任选地在聚集的约1天至约10天内，例如，在聚集的6天内，任选地，在培养约27天至约36天之后。
[0208] 在一个实施例中，通过在BMP4(任选地，1-5ng/ml的BMP4或约5ng/ml的BMP4)的存在下培养多能干细胞12小时至36小时(任选地，约24小时)来形成多能干细胞的胚状体(EB)。
[0209] 在形成EB之后，它们可以在补充有nodal激动剂的诱导培养基中再培养3天至10天(任选地，4天至8天或约天5或6天)以诱导内胚层细胞群。任选地，nodal激动剂是激活素A。EB也任选地与Wnt/β-连环蛋白激动剂(诸如Wnt3a或GSK-3选择性抑制剂，诸如CHIR-99021)以诱导内胚层细胞群。
[0210] 在一些实施例中，在诸如激活素A的nodal激动剂的存在下对EB培养额外的1天至4天(例如，延长的nodal激动剂处理)(即，在内胚层细胞群与至少一种FGF激动剂和一种BMP4激动剂接触之前)。
[0211] 如所提到的，然后处理细胞以诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括例如聚集和用各种成熟因子处理。这些步骤例如可以生成响应cAMP激活的细胞群。延长的nodal激动剂处理和聚集是生成响应cAMP激活的细胞的步骤。
[0212] 对于基于单层的方法，响应cAMP激活的细胞是例如培养26天后的细胞。
[0213] 在实施例中，聚集细胞的成熟/特化培养基可以包括促进肝细胞成熟的因子或促进胆管细胞发育的因子或两者和/或增加前体种群的扩增的因子。
[0214] 例如，聚集体包括成肝细胞，如展示的，成肝细胞可以特化为肝细胞或胆管细胞。
[0215] 任选地，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增还包括：使细胞聚集体与i)cAMP信号传导激活剂(例如，cAMP类似物和/或激动剂)和/或ⅱ)Wnt/β-连环蛋白信号传导的拮抗剂(例如，Wnt抑制剂XAV 939)和/或MEK/Erk信号传导的抑制剂(例如，MEK/Erk抑制剂PD0325901)接触。在cAMP信号传导的激活期间加入Wnt拮抗剂和/或MEK/Erk拮抗剂增强CYP酶的表达，例如，高达成人肝细胞中的水平或高于成人肝细胞中的水平。例如，在cAMP的存在下，将MEK/Erk的抑制剂例如加入到约第28天至约第32天的培养物，导致肝细胞具有增加的水平的CYP3A4。加入MEK/Erk拮抗剂与Wnt拮抗剂的组合示出为也增加CYP1A2的水平。在实施例中，Wnt拮抗剂包括例如XAV939、IWP2、DKK1、XXX(IWP2(STEMGENT04-0034)、Dkk-1(R&D，5439-DK-010)、IWR-1 endo(Calbiochem 681699-10)。Wnt信号传导的已知拮抗剂包括Dickkopf(Dkk)蛋白、Wnt抑制因子-1(WIF-1)和分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)并且可以在实施例中使用。在另一实施例中，MEK/Erk拮抗剂选自PD0325901、U0126(Promega V1121)、PD 098059(Sigma-Aldrich P215-1MG)。
[0216] 任选地，细胞聚集体与0.1μM至10μM(任选地，0.5μM至2μM或约1μM)的XAV939和/或PD0325901接触。
[0217] 其他抑制剂/激活剂的浓度是例如给予与本文中所描述的抑制剂/激活剂类似的激活/抑制的浓度。
[0218] 在另一实施例中，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增还包括使细胞聚集体与cAMP类似物和/或cAMP激动剂和Wnt激动剂(诸如GSK3的选择性抑制剂(例如，CHIR99021)或TGF-β拮抗剂(例如，抑制剂SB431542))接触。任选地，细胞聚集体与
0.1μM至10μM(任选地，0.2μM至4μM)的CHIR99021和/或约2μM约至10μM或
约6μM的SB431542接触。TGF-β抑制剂包括SB431542(Sigma-Aldrich S4317-5MG)、SB525334(Sigma-Aldrich S8822-5MG)和A83-01(Tocris，2929)。
0.1μM至10μM(任选地，0.2μM至4μM)的CHIR99021和/或约2μM约至10μM或
约6μM的SB431542接触。TGF-β抑制剂包括SB431542(Sigma-Aldrich S4317-5MG)、SB525334(Sigma-Aldrich S8822-5MG)和A83-01(Tocris，2929)。
[0219] 如本文所证明的，在例如第27天的Wnt通路的激活和TGF-p/SMAD通路的抑制促进了白蛋白+/HNF4+祖种群的扩增。它证明，例如，当添加Wnt激动剂时，可以获得高达10倍的所述种群的扩增。
[0220] 在实施例中，用wnt激动剂和任选的TGFβ拮抗剂(诸如SB431542)处理聚集的细胞约6天至约12天，优选地，约8天至约10天，任选地9天。例如，这种处理导致成肝细胞的扩增。在实施例中，该方法包括产生成肝细胞的扩增的种群。这些细胞可以用于产生包括成熟肝细胞和/或胆管细胞的细胞的更加分化的种群。
[0221] 在实 施 例中，TGF-β 拮抗 剂 选自 SB431542(Sigma-Aldrich S4317-5MG)、SB525334(Sigma-Aldrich S8822-5MG)、A83-01(Tocris，2929)。
[0222] 在实施例中，聚集细胞的成熟培养基包括促进成熟、进一步谱系特化和/或扩增的一种或多种因子，任选地：
[0223] 诸如CIHR99021的Wnt激动剂，任选地与促进白蛋白+/HNF4+种群的扩增的诸如SB431542的TGF-β拮抗剂组合；或
[0224] 诸如XAV939的Wnt拮抗剂和/或MEK/Erk拮抗剂，例如，在cAMP激活步骤期间加入的PD0325901，PD0325901增强CYP酶的表达并且促进肝细胞前体的成熟；
[0225] 在另一实施例中，聚集细胞的成熟培养基包括促进成熟、进一步谱系特化和/或扩增的一种或多种因子，任选地：
[0226] 促进胆管细胞谱系特化的Notch激动剂。
[0227] 促进肝细胞谱系特化的诸如γ-分泌酶抑制剂(GSI)L695,458的Notch拮抗剂。
[0228] 如下所述，cAMP类似物8-Br-cAMP的添加诱导CYP3A4(16倍)、CYP1A2(100倍)和CYP2B6(10倍)以及H9源性聚集体中的II阶段酶UGT1A1(16倍)的显著水平的表达(图7e)。
[0229] 在另一实施例中，通过酶处理和/或人工解离从包括肝细胞和胆管祖细胞的细胞群的单层生成细胞聚集体。
[0230] 在实施例中，细胞群包括已在包含HGF、OSM和DEX的成熟/特化培养基中培养的肝细胞和/或胆管祖细胞，任选地，在细胞聚集之前，该细胞群与内皮细胞(任选地，CD34+阳性内皮细胞)共培养。在实施例中，内皮细胞源自胚胎ESC，优选人源的。在实施例中，内皮细胞是成熟的内皮细胞，任选地为人源的，和/或源自成熟的内皮细胞。
[0231] 例如，如实例8所述，可以从hESC生成CD34+内皮细胞。如实例8所述，内皮细胞可以通过用BMP4、bFGF和VEGF的组合诱导约6天来生成，此时，可以通过FACS隔离CD34+细胞(与CD31+和KDR+)。挑选的CD34+细胞可以在内皮细胞生长培养基(任选地，EMG2培养基)中进一步培养例如6天，然后用于嵌合聚集体的生成。
[0232] 在实施例中，细胞群包括已在包含HGF、OSM和DEX的成熟/特化培养基中培养的肝细胞和/或胆管祖细胞，该细胞群与CD34+阳性内皮细胞共培养，以形成嵌合聚集体，任TM选地，使用诸如Aggrewells 的聚集容器(例如，促进单一细胞类型或混合细胞类型的聚集的容器)，直到获得嵌合聚集体，当使用Aggrewells时，例如约1天、约2天或约3天。也可以使用本文所述或本领域中已知的方法实施聚集。如实例8所述，内皮细胞可以在肝细胞群之前添加到容器以包被孔的底部。肝细胞群可以作为单细胞悬浮液添加，例如，可以在内皮细胞的顶部上和在Aggrewells中培养的混合物中添加第25/26天的成肝细胞。在合适的聚集之后，随后可以从Aggrewells去除嵌合肝/内皮聚集体并培养嵌合肝/内皮聚集体。如图12b所示，与内皮细胞一起培养的聚集体包含内皮细胞并且比单独培养的那些大。
也通过qRT-PCR分析表明，培养额外的12天的嵌合肝/内皮聚集体比没有内皮细胞生成的肝聚集体表达基本上更高水平的CYP3A4信息(图12d)。由于这些水平在不添加cAMP的情况下实现，内皮细胞可以促进hPSC源性肝细胞的成熟。在实施例中，培养肝/内皮嵌合聚集体至少或约6天、至少或约8天、至少或约10天、至少或约12天、或直至获得期望或预选水平的CYP3A4信息。
也通过qRT-PCR分析表明，培养额外的12天的嵌合肝/内皮聚集体比没有内皮细胞生成的肝聚集体表达基本上更高水平的CYP3A4信息(图12d)。由于这些水平在不添加cAMP的情况下实现，内皮细胞可以促进hPSC源性肝细胞的成熟。在实施例中，培养肝/内皮嵌合聚集体至少或约6天、至少或约8天、至少或约10天、至少或约12天、或直至获得期望或预选水平的CYP3A4信息。
[0233] 在进一步的实施例中，在凝胶状基质中培养肝内皮嵌合聚集体，任选地，在包括基质的胶原中培养，任选地，在凝胶中培养。在实施例中，胶原是胶原蛋白I或IV。在实施例中，凝胶状基质包括基质胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、提取的ECM(例如，从肝组织提取细胞外基质)和/或它们的组合。
[0234] 在实施例中，在包括基质的胶原中培养的聚集体在cAMP、PD0325901和XAV939的存在下进行培养。
[0235] 3D聚集、cAMP和PD/XAV的组合示出为促进人多能干细胞源性肝细胞的显著分化(图9)，(图9d和图9e)。保持AFP和胎儿CYP3A7的一些表达。在实例8中证明，处理肝内皮嵌合聚集体与胶原凝胶中的cAMP、PD和XAV的组合以提供细胞外基质蛋白的来源，促进了种群的进一步成熟。如图13所示，当聚集体保持为液体培养时，将内皮细胞添加至聚集体(末端)没有显著影响ALB、CYP3A4、AFP或CYP3A7的表达水平。与此相反，在胶原凝胶中培养聚集体对AFP和CYP3A7的表达有显着影响，因为两者都降低至几乎检测不到的水平，类似于在成人肝脏中发现的那些。
[0236] 在实施例中，例如在聚集之后的大约1天至大约4天内，用notch激动剂处理细胞。在这样的阶段添加激动剂促进胆管细胞的成熟。在一些实施例中，例如其中胆管细胞成熟是优选的，诱导cAMP信号传导被省略。
[0237] 因此，本发明也提供了诱导胆管祖细胞成熟为胆管细胞的方法，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括：
[0238] (ⅰ)用notch激动剂培养包括胆管祖细胞的细胞群以诱导胆管祖细胞成熟为胆管细胞，任选地，功能性胆管细胞。
[0239] 在实施例中，从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)产生功能性胆管细胞的方法：
[0240] a)使作为单层培养或形成胚状体的多能干细胞与诱导培养基接触以提供诱导的内胚层细胞群，诱导培养基包括诸如ActA的nodal激动剂和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂(诸如ⅰ)Wnt3a和/或ii)GSK-3选择性抑制剂，诸如CHIR-99021；
[0241] b)使诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；
[0242] c)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触以获得包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包括FGF激动剂和BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段；和
[0243] d)诱导胆管祖细胞成熟和诱导胆管祖细胞进一步谱系特化和/或扩增至胆管细胞，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括：
[0244] (i)任选地，当细胞群包括至少70％、80％、85％、90％或95％的白蛋白阳性细胞时，或在培养约20天至约40天之后，例如，在培养约24天至约28天之后，生成细胞群的聚集体；
[0245] (ii)用包括Notch激动剂的成熟培养基培养包括胆管祖细胞的细胞群，
[0246] 其中，当Notch激动剂是Notch信号供体细胞(任选地，OP-9、OP-Jagged1和/或OP-9delta1细胞)时，Notch信号供体细胞与细胞群共聚合。
[0247] 在进一步的实施例中，聚集体在凝胶状基质(任选地，包含基质的胶原，任选地，凝胶)中培养(或当包括Notch信号供体细胞时，共培养)。在实施例中，胶原是胶原I或IV。在实施例中，凝胶状基质包括基质胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、提取的ECM(例如，从肝组织提取细胞外基质)和/或它们的组合。
[0248] 此 外，例 如，用 诸 如 γ-分 泌 酶 抑 制 剂 (GSI)L695,458(Tocris#2627)、DAPT(Sigma-Aldrich D5942)、LY411575(Stemgent 04-0054)和L-685458的Notch拮抗剂抑制Notch信号传导在本文中示出为抑制胆管细胞发育，并且产生的细胞保持肝细胞的特性。
[0249] 在另一实施例中，从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)产生诸如成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞的肝细胞谱系细胞的方法，该方法包括：
[0250] a)使作为单层培养用于形成胚状体的多能干细胞与诱导培养基接触，任选地，接触约4天至8天，以提供诱导的内胚层细胞群，诱导培养基包括诸如ActA的nodal激动剂和任选的Wnt/β-连环蛋白激动剂(诸如i)Wnt3a和/或ii)GSK-3选择性抑制剂，诸如CHIR-99021)；
[0251] b)使诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触(任选地，约2天、3天或约4天)，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；和
[0252] c)通过使延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触(任选地，为约4天至约10天)以获得包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群，特化培养基包括至少一种FGF激动剂和一种BMP4激动剂和/或它们的活性缀合物和/或片段，和
[0253] d)诱导肝细胞或胆管祖细胞至任选的扩增的成肝细胞种群和/或肝细胞和/或胆管细胞的成熟、进一步谱系特化和/或扩增，诱导成熟和任选的进一步谱系特化和/或扩增包括：
[0254] (i)用包括HGF、Dex和OSM的成熟培养基培养包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群任选地约10天至14天；
[0255] (ii)任选地当细胞群包括至少70％、80％、85％或90％的白蛋白阳性细胞时，或在培养约20天至约40天之后，例如，在培养约24天至约28天之后，生成细胞群的聚集体；
[0256] (iii)在任选包括Dex的成熟培养基中培养聚集体1天至10天；
[0257] IV)
[0258] a)在包括Dex和任选的cAMP类似物和/或cAMP激动剂的成熟培养基(例如，聚集成熟培养基)中培养聚集体约6天至约10天，任选地在生成聚集体的约1天至约10天内，例如，在聚集的6天内，任选地在培养约27天至约36天之后；或
[0259] b)在包括notch激动剂和任选的cAMP激动剂、HGF和/或EGF的成熟培养基中培养聚集体约6天至约20天，任选地，在生成聚集体的步骤的约1天至约10天内添加notch激动剂，例如，在生成聚集体的步骤的6天内，任选地，在培养约20天至40天之后。
[0260] 例如，Notch激动剂可以是结合到诸如细胞、塑料、ECM或珠子的表面的任何notch配体。在一个实施例中，notch配体是notch配体delta Jagged-1(EUROGENTEC 188-204)、Jagged1肽(Abcam，ab94375)、重组人Pref-1/DLK-1/FA1(R&D 1144-PR)。在一个实施例中，诱导成熟和进一步谱系特化和/或扩增包括使包含胆管祖细胞的细胞群与诸如OP9、OP9delta和/或OP9 Jagged1细胞的notch信号供体接触，并且任选地，在EGF、TGFβ、HGF和EGF和/或HGF、TGFβ和EGF的存在下，接触至少或约5天至约10天，约14天或更长时间，例如，90天，任选地至少或约5天至至少或约60天，至少或约30天，至少或约25天，至少或约1天，和/或至少或约14天，以诱导胆管祖细胞成熟为功能性胆管细胞。它已被证明，产生的结构可以保持培养60天以上。因此，在实施例中，包括胆管祖细胞的细胞群与诸如OP9、OP9delta和/或OP9 Jagged1的细胞的notch信号供体(notch激动剂)接触，并且任选地在EGF、TGFβ、HGF和EGF和/或HGF、TGFβ、和EGF的存在下，接触至少5天和任选地多达5天至90天之间或5天至60天之间的任何天数。
[0261] 任选地，使包括胆管祖细胞的细胞群与notch信号供体接触包括共同培养包含胆管祖细胞的细胞群与诸如OP9、OP9delta和/或OP9 Jagged1的细胞的notch信号供体，并且任选地在包括EGF、TGFβ、HGF和EGF和/或HGF、TGFβ和EGF的成熟培养基中，共同培养至少或约5天至至少或约90天，任选地至少或约5天至至少或约60天，至少或约30天，至少或约25天，至少或约1天，和/或至少或约14天，以诱导胆管祖细胞成熟为胆管细胞，任选地，功能性胆管细胞。
[0262] 在一个实施例中，诱导成熟和任选的进一步谱系特化和/或扩增包括共培养包含胆管祖细胞的细胞群与OP9、OP9delta和/或OP9 Jagged1的细胞，并且任选地在EGF、TGFβ、HGF和EGF和/或HGF、TGFβ和EGF的存在下，共培养至少5天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天以上，90天，任选地，共培养至少或约5天至至少或约60天，至少或约30天，至少或约25天，至少或约1天和/或至少或约14天。
[0263] 如本文使用的，术语“Notch信号传导的激活剂”或“notch激动剂”是指如本文所用的任何分子或细胞，该任何分子或细胞激活肝细胞和/或胆管细胞中的Notch信号传导的以及诱导包括但不限于诸如OP9细胞的notch信号供体、骨髓来源的小鼠基质细胞系和notch配体。OP-9细胞内源性地表达并已被设计为过表达一种或多种notch配体。OP-9-Jagged1设计为过表达重组/外源性Jagged1notch配体，并且OP9-delta1设计为过表达重组delta1notch配体。在实施例中，OP9 notch信号供体选自OP9、OP9-Jagged1或OP-delta1细胞。OP9细胞表达notch配体delta。当它们表达Notch配体时，它们从而可以用作Notch信号传导的激活剂。也包括表达Jagged-1(EUROGENTEC 188-204)、Jagged1肽(Abcam，ab94375)以及重组人Pref-1/DLK-1/FA1(R&D 1144-PR)的分子和/或细胞。例如，“notch激动剂”可以结合到诸如细胞、塑料、ECM或珠子的表面。
[0264] 在一个实施例中，在10ng/m到20ng/ml(任选地，约20ng/ml)的HGF和/或25ng/ml至75ng/ml(任选地，约50ng/ml)的EGF的存在下，包括胆管祖细胞的细胞群与OP9、OP9delta和/或OP9Jagged1细胞共培养以诱导至少一种胆管祖细胞分化成功能性胆管细胞。
[0265] 如所提到的，成肝细胞(例如，如图1a和图14a所示的第25或26天阶段)可以如步骤g)中描述的聚集(也称为3D聚集)，步骤g)包括诱导细胞群的肝细胞和胆管祖细胞至肝细胞和/或胆管细胞的成熟、进一步谱系特化和/或扩增，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增包括生成细胞群的聚集体。这些3D聚集体包括可以成熟/分化为肝细胞或进一步特化为胆管细胞的成肝细胞。在期望胆管细胞的实施例中，任选地当嵌合聚集体包括成肝细胞和Notch信号供体细胞时，通过共培养聚集体与诸如OP9、OP9delta和/或OP9 Jagged1细胞的Notch信号供体来实现进一步谱系特化。
[0266] 在实施例中，在包括基质胶和/或胶原的基质/凝胶中，包括胆管祖细胞的成肝细胞的细胞群与OP9、OP9delta和/或OP9Jagged1细胞共培养，任选地作为嵌合聚集体。
[0267] 在实施例中，基质/凝胶包括至少20％、至少30％、至少或高达40％、至少或高达50％、至少或高达60％、至少或高达70％、至少或高达80％、至少或高达90％和/或高达
100％的基质胶。
100％的基质胶。
[0268] 在实施例中，胶原包括胶原I和/或胶原IV。在实施例中，基质/凝胶包含从约0mg/mL至约5mg/mL的胶原I，任选地，约1.0mg/mL、约2mg/mL、约3.0mg/mL或约4.0mg/mL的胶原I。在实施例中，基质/凝胶包括约1.0mg/mL、约1.2mg/mL、约1.4mg/mL、约1.6mg/mL、约1.8mg/mL、约2.0mg/mL、约2.25mg/mL、约2.5mg/mL、约2.75mg/mL或约3.0mg/mL的胶原I。
[0269] 如实例9中展示的，包囊结构是可获得的，其中，共培养物包括至少30％以上的基质胶组合物。如果期望增加的分支结构，基质胶浓度可以降低至例如约20％。
[0270] 如实例9中展示的，可以使用本文所述的方法产生表达CFTR的胆管细胞分支和包囊结构。如使用膨胀测定法显示的，CFTR是功能性的。因此，在实施例中，产生和/或分离的胆管细胞是表达CFTR的胆管细胞。
[0271] 如本文所用的术语“nodal激动剂”是指激活诸如“nodal”(例如，诸如基因ID：4338的人nodal)的nodal信号转导的任何分子或肝细胞谱系细胞中的“激活素”。
[0272] 如本文所使用的术语“激活素”或“ActA”是指“激活素A”(例如，基因ID：3624)，例如，人激活素以及它们的活性缀合物和片段，任选地包括例如可以激活nodal信号转导的天然存在的活性缀合物和片段，以及它们的活性缀合物和片段，包括天然存在的活性缀合物和片段。激活素的浓度可以例如在从约1ng至约500ng/ml的范围内，例如，从约1ng至约250ng/ml，从约10ng至约250ng/ml，从约10ng至约100ng/ml。在另一实施例中，激活素的浓度为约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约150ng/ml、约200ng/ml、约300ng/ml、约
400ng/ml或约500ng/ml。
400ng/ml或约500ng/ml。
[0273] 如本文所使用的术语“HGF”是指肝细胞生长因子(基因ID：3082)，例如，人HGF以及它们的活性缀合物和片段，包括天然存在的活性缀合物和片段。HGF的浓度可以例如在从约1ng至约500ng/ml的范围内，例如，从约1ng至约250ng/ml，从约10ng至约250ng/ml，从约10ng至约100ng/ml。在另一实施例中，HGF的浓度为约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约150ng/ml、约200ng/ml、约300ng/ml、约400ng/ml或约500ng/ml。
[0274] 如本文所使用的术语“TGFβ”指TGFb1、TGFb2和TGFb3中的任一种，例如，人TGFb1、TGFb2和TGFb3以及它们的活性缀合物和片段，包括天然存在的活性缀合物和片段。如下所述，当成肝细胞与OP9共培养时，TGFb1促进胆管细胞分支。也已经测试TGFb2和TGFb3并且在类似条件下TGFb2和TGFb3促进分支结构。
[0275] 如本文所使用的术语“TGFβ1”是指转化生长因子β1，例如，人TGFβ1(基因ID7040)以及它们的活性缀合物和片段，包括天然存在的活性缀合物和片段。用于胆管细胞特化的TGFβ1的浓度可以例如在从约5ng/ml至约10ng/mL的范围内。
[0276] 如本文所使用的术语“wnt/β-连环蛋白激动剂”是指激活肝细胞中的wnt/β-连环蛋白受体信号传导的任何分子并且包括例如Wnt3a以及GSK3选择性抑制剂，GSK3选择TM性抑制剂诸如CHIR99021(Stemolecule CHIR99021Stemgent)、6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)TM
(Cayman Chemical(cat：13123)) 或 来 自 Stemgent的 Stemolecule BIO(cat：04003)。
CHIR99021是GSK3的选择性抑制剂。预期的GSK3的选择性抑制剂是例如Wnt信号通路中的用于GSK-30/β的选择性抑制剂。例如，使用来自Qiagen的Cignal TCF/LEF报告基因(Cignal TCF/LEF报告基因(luc)试剂盒：CCS-018L)，可以例如通过由qPCR测量Axin2基因表达的增加和/或测量β连环蛋白磷酸化来确定肝细胞中的Wnt/β受体信号传导。
(Cayman Chemical(cat：13123)) 或 来 自 Stemgent的 Stemolecule BIO(cat：04003)。
CHIR99021是GSK3的选择性抑制剂。预期的GSK3的选择性抑制剂是例如Wnt信号通路中的用于GSK-30/β的选择性抑制剂。例如，使用来自Qiagen的Cignal TCF/LEF报告基因(Cignal TCF/LEF报告基因(luc)试剂盒：CCS-018L)，可以例如通过由qPCR测量Axin2基因表达的增加和/或测量β连环蛋白磷酸化来确定肝细胞中的Wnt/β受体信号传导。
[0277] 如本文所使用的术语“Wnt3a”指的是无翅型MMTV整合位点家族，成员3A因子(例如，基因ID：89780)，例如人Wnt3a以及它们的活性缀合物和片段，包括天然存在的活性缀合物和片段。Wnt3a的浓度可以例如在从约1ng至约500ng/ml的范围内，例如，从约1ng至约250ng/ml，从约10ng至约250ng/ml，从约10ng至约100ng/ml。在另一实施例中，Wnt3a的浓度为约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约150ng/ml、约200ng/ml、约300ng/ml、约400ng/ml或约500ng/ml。
[0278] 如本文所使用的术语“激动剂”是指例如通路或信号传导分子的激活剂。例如，nodal激动剂是指选择性激活nodal信号传导的分子。
[0279] 如本文所使用的术语“拮抗剂”是指例如通路或信号传导分子的选择性抑制剂。例如，TGFβ拮抗剂是选择性地抑制TGFβ信号传导的分子，例如，通过测量Smad的磷酸化。A83-01是比SB431542更有效的Smad2的抑制剂。
[0280] 如本文所使用的术语“选择性抑制剂”是指比相关分子至少1.5X、2X、3X、4X或10X更有效地抑制选择性实体或通路的抑制剂。例如，GSK-3的选择性抑制剂比由例如LiCl抑制的至少1.5X、2X、3X、4X或10X更有效地抑制Wnt通路中的GSK-3，或者比GSK-3的选择性抑制剂抑制其他通路中的其他激酶、其他GSKs和/或GSK3至少1.5X、2X、3X、4X或10X更有效地抑制Wnt通路中的GSK-3。例如，CHIR99021已在体外激酶测定中示出为在对其他激酶影响不大的情况下以约5nM的IC 50特定地抑制GSK3B和以10nM的IC50特定地抑制GSK3a。因此，选择性抑制剂可以表现出比其他无关激酶(例如，其他2种、其他3种等)低至少1.5X、2X、3X、4X或10X的IC 50。类似地，术语“选择性激活剂”是指比相关分子至少1.5X、2X、3X、4X或10X更有效地激活选择性实体或通路的激活剂。如本文所用的术语“活性片段”是具有比全长多肽更小尺寸的氨基酸序列的多肽，但与全长多肽基本同源，是全长多肽的片段，并且其中，与全长多肽相比，活性片段具有至少50％、或至少60、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％的有效的生物作用，活性片段是全长多肽的片段，或任选地，与为全长多肽的片段的多肽相比，活性片段具有大于100％(例如，1.5倍、2倍、
3倍、4倍或大于4倍)的有效的生物作用。
3倍、4倍或大于4倍)的有效的生物作用。
[0281] 如本文中所使用的术语“活性缀合物”是指连接至诸如荧光标签的标签或稳定实体的多肽(或其他分子)，例如，用于改进在延长储存、热、酶、低pH、搅拌等的条件下的稳定性，活性缀合物根本不或基本上不干扰分子的活性部分的活性。例如，与未连接的多肽或其他分子相比，缀合物可以具有约至少50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％或大于100％的有效的生物作用，例如，1.5倍、2倍、3倍、4倍或大于4倍的有效的生物作用(例如，受体激活活性)。
[0282] 在一个实施例中，术语“活性片段和缀合物”指的是保留激活分子的同源受体的能力的分子的片段和缀合物。任选地，活性片段和缀合物具有全长和/或未连接的分子的至少60％、70％、80％、90％或95％的活性。
[0283] 也可以使用诸如保守突变变异体的变异体和每种多肽的激活突变变异体。
[0284] 如本文所用的术语“Dex”指的是地塞米松(Dex)。地塞米松的浓度可以例如在从约1ng至约500ng/ml的范围内，例如，从约1ng至约250ng/ml，从约10ng至约250ng/ml，从约10ng至约100ng/ml。在另一实施例中，Dex的浓度为约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约150ng/ml、约200ng/ml、约300ng/ml、约400ng/ml或约500ng/ml。
[0285] 如本文所使用的术语“OSM”指的是抑瘤素M。OSM的浓度可以例如在从约1ng至约500ng/ml的范围内，例如，从约1ng至约250ng/ml，从约10ng至约250ng/ml，从约10ng至约100ng/ml。在另一实施例中，OSM的浓度为约10ng/ml、约20ng/ml、约30ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约150ng/ml、约200ng/ml、约300ng/ml、约400ng/ml或约500ng/ml。
[0286] 如所提到的，本发明的一些实施例包括激活聚集体内的cAMP通路以诱导肝细胞和/或胆管细胞成熟。
[0287] 如本文所使用的术语“cAMP通路”指的是腺苷酸环化酶通路，在细胞通信中使用的G蛋白偶联受体触发的信号传导级联。任选地，cAMP通路是人cAMP通路。
[0288] 如本文所使用的术语“激活cAMP通路”指的是诱导通路以将ATP转化为cAMP，例如，增加cAMP的水平。当cAMP通路被激活时，激活的GPCR引起附着的G蛋白复合物的构象变化，这导致Gα亚基将GDP变换为GTP并且从β和γ亚基分离。Gα亚基进而激活腺苷酸环化酶，腺苷酸环化酶将ATP转化为cAMP。cAMP通路也可以通过直接激活腺苷酸环化酶或PKA下游激活。激活cAMP通路的分子包括但不限于cAMP，诸如8-溴腺苷-3’,5’-环单磷酸(8-Br-cAMP)、丁酰-cAMP、腺苷-3’,5’-环单硫代磷酸、Sp-异构体(SP-aAMPS)和/或8-溴腺苷-3’,5’-环单硫代磷酸、Sp-异构体(Sp-8-Br-cAMPS))的cAMP类似物。8-Br-cAMP、丁酰-cAMP和Sp-cAMPS是cAMP的细胞渗透性类似物的实例。激活cAMP信号传导的多个其他cAMP类似物在本领域也是已知的，并且可以使用。激活cAMP通路的其他化合物(例如，cAMP激动剂)包括但不限于霍乱毒素、毛喉素、咖啡因、茶碱和百日咳毒素。
例如，已经使用Sp-8-Br-cAMP(Biolog：目录号：B002CAS No.：[127634-20-2])、8-Br-cAMP和毛喉素(FSK)(Sigma：66575-29-9)进行试验，试验表明，这些化合物可以互换。
例如，已经使用Sp-8-Br-cAMP(Biolog：目录号：B002CAS No.：[127634-20-2])、8-Br-cAMP和毛喉素(FSK)(Sigma：66575-29-9)进行试验，试验表明，这些化合物可以互换。
[0289] 在本方法的一些实施例中，通过使肝聚集体与0.5mM至50mM的诸如8-Br-cAMP(任选地，1-40mM、1-30mM、1-20mM、5-15mM、8-12mM或约10mM的8-Br-cAMP)的细胞渗透性cAMP类似物接触来任选地激活cAMP通路。肝聚集体任选地与例如8-Br-cAMP的细胞渗透性cAMP类似物接触1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。
[0290] 诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增可以包括一系列步骤。
[0291] 在一些实施例中，在包括HGF、地塞米松和抑瘤素M的细胞培养基中培养包括肝细胞和/或胆管祖细胞和/或聚集体的细胞群。在其他实施例中，聚集体在包括Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)的细胞培养基中培养，IMDM补充有B27、抗坏血酸、谷酰胺、MTG、HGF、地塞米松和抑瘤素M。在其他实施例中，在聚集之前和/或在聚集期间，在包括HGF、地塞米松和抑瘤素M、任选地Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)的细胞培养基中培养细胞，IMDM补充有B27、抗坏血酸、谷酰胺、MTG、HGF、地塞米松和抑瘤素M。细胞培养基任选地也补充有Rho激酶抑制剂和BSA。例如，可以在包括HGF、DEX和OSM的成熟培养基中培养包括肝细胞和/或胆管祖细胞的细胞群10天、11天、12天、13天或14天，及/或在包括HGF、DEX和OSM的成熟培养基中培养聚集体6天、7天、8天、9天、10天。
[0292] 在另一实施例中，诱导成熟、进一步谱系特化和/或扩增步骤还包括激活聚集体内的cAMP通路以诱导至少一种肝细胞或胆管祖细胞成熟为功能肝细胞和/或胆管细胞。在另一实施例中，激活cAMP通路包括使聚集体与cAMP类似物和/或cAMP激动剂(例如，与以上描述的cAMP类似物或cAMP激动剂)接触。
[0293] 例如，在实施例中，聚集体在包括HGF、DEX和OSM的成熟培养基中培养例如约10天、11天、12天、13天或14天之后，将包括cAMP类似物和/或cAMP激动剂和DEX和任选的HGF的成熟培养基加入到聚集体。
[0294] 在一个实施例中，在包括HGF、Dex和OSM的细胞培养基中培养聚集体，直到激活cAMP通路。在一个实施例中，在包含cAMP类似物和/或cAMP激动剂和Dex的培养基中培养聚集体。当添加cAMP类似物和/或cAMP激动剂时，从培养基中去除OSM。在一些实施例中，当添加cAMP类似物和/或cAMP激动剂时，也从培养基中去除HGF。在另一实施例中，在添加cAMP类似物和/或cAMP激动剂之后，减少培养基中的HGF的量(例如，从20ng/ml的HGF减小至10ng/ml的HGF)。
[0295] 在另一实施例中，在HGF、Dex和OSM中培养聚集体约6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天，此时，添加cAMP类似物和/或cAMP激动剂。在一个实施例中，当添加cAMP类似物和/或cAMP激动剂时，去除OSM和任选的HGF。在其他实施例中，当添加cAMP类似物和/或cAMP激动剂时，减小培养基中的HGF的浓度(例如，从约20ng/ml减小至约10ng/ml)。
[0296] 在一些实施例中，诱导的内胚层细胞群的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％、或至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％分化/成熟为功能性肝细胞和/或胆管细胞。
[0297] 因此，在实施例中，该方法诱导从nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞的种群产生大于约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或约95％的功能性肝细胞和/或胆管细胞。
[0298] 例如，可以通过确定成熟肝细胞标记物的水平来检测成熟。例如，CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP3A4、CYP7A1、CYP2C9、ALB、CPS1、G6P、TAT、TDO1、NAT2、UGT1A1和/或ASGPR1是成熟肝细胞或功能性肝细胞的标记物，例如，通过RT-PCR可以检测它们的表达。也可以使用识别成熟肝细胞的抗体(例如，检测ASGPR-1的抗体)检测分化。
[0299] 在实施例中，内胚层细胞群是从诸如胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)的多能干细胞(PSC)分化的。
[0301] 如本文所使用的，术语“iPSC”和“诱导的多能干细胞”可互换使用并且指的是由非多能细胞(通常为成人体细胞)人工源性多能干细胞(例如，诱导或通过完全逆转)，例如，通过诱导与但不限于SOX2(基因ID；6657)、KLF4(基因ID；9314)、cMYC(基因ID；4609)、NANOG(基因ID；79923)、LIN28/LIN28A(基因ID；79727))的组合的一种或多种基因(包括POU4F1/OCT4(基因ID；5460)的表达。
[0302] 在实施例中，该方法包括用于获得内胚层细胞群的步骤。例如，本文提供了用于在诸如ESC或iPSC的多能干细胞中诱导定形内胚层的方法。
[0303] 在一个实施例中，获得内胚层细胞群包括从多能干细胞培养物形成胚状体。通过18
本领域已知的任何方法形成EB，例如，Nostro,M.C.et at. 中描述的方法，其中，从在低水平的BMP4激动剂中培养24小时的小聚集体形成EB。
本领域已知的任何方法形成EB，例如，Nostro,M.C.et at. 中描述的方法，其中，从在低水平的BMP4激动剂中培养24小时的小聚集体形成EB。
[0304] 在另一实施例中，获得内胚层细胞群包括获得和/或生长单层的多能干细胞培养物。
[0305] EB和/或单层细胞随后与高浓度的激活素A接触以诱导定形内胚层。任选地，EB和/或单层暴露于80ng/ml至120ng/ml或90ng/ml至110ng/ml的激活素(任选地，约100ng/ml激活素A)约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或14天。
[0306] 在另一实施例中，EB和/或单层细胞与诸如Wnt3a或GSK-3的选择性抑制剂的wnt/β-连环蛋白激动剂接触，GSK-3的选择性抑制剂诸如CHIR-99021、6-溴靛玉TM红-3’-肟(BIO)或除了激活素A之外的Stemolecule BIO。例如，GSK-3的特异性抑制剂
53
BIO证实通过激活Wnt信号传导 而维持人和小鼠ESC的多能性。
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BIO证实通过激活Wnt信号传导 而维持人和小鼠ESC的多能性。
[0307] 任选地，EB和/或单层细胞暴露于从10ng/ml至40ng/ml的Wnt3a或20ng/ml至30ng/ml的Wnt3A、任选地，约25ng/ml的Wnt3a约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在另一实施例中，EB和/或单层细胞暴露于从约0.03μM至约30μM的CHIR-99021、或从约0.1μM至约3μM、任选地约0.3μM至约1μM的CHIR-99021。在实施例中，EB暴露于从约0.1μM至约2μM的CHIR-99021。在另一实施例中，单层细胞暴露于从约1μM至约30μM的CHIR-99021，例如，从约约1μM至约3μM的CHIR-99021。本领域的技术人员将能够确定其他GSK-3抑制剂的等效有用的量。
[0308] 在一些实施例中，在与80ng/ml至120ng/ml的激活素、或90ng/ml至110ng/ml的激活素、任选地约100ng/ml的激活素A以及10ng/ml至40ng/ml的Wnt3a、或20ng/ml至30ng/ml的Wnt3A、任选地约25ng/ml的Wnt3a接触约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或约10天之前，EB和/或单层细胞首先与80ng/ml至120ng/ml的激活素、或90ng/ml至110ng/ml的激活素、任选地约100ng/ml的激活素A接触约1天、2天、3天、4天、5天、
6天、7天、8天、9天或约10天，以产生诱导的内胚层细胞群。
6天、7天、8天、9天或约10天，以产生诱导的内胚层细胞群。
[0309] 在实施例中和其他地方描述的，用诸如ActA的nodal激动剂培养诱导的内胚层细胞群至少36小时、38小时、42小时、44小时、46小时、48小时、50小时、52小时、56小时、58小时或60小时或约1天至约4天，以产生延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群。
[0310] 任选地，用于诱导定形内胚层的基础培养基是本领域中已知的用于诱导定形内胚层的任何培养基，任选地为神经基础培养基或StemPro34。在一些实施例中，细胞培养基补充有激活素A、谷氨酰胺、抗坏血酸、MTG、bFGF和BMP4。在其他实施例中，细胞培养基还补充有Wnt/β-连环蛋白激动剂，诸如Wnt3a或GSK-3的选择性抑制剂(诸如CHIR-99021)。
[0311] 也可以使用分化细胞的其他方法以获得诱导的内胚层细胞群。
[0312] 定形内胚层或诱导的内胚层细胞群任选地由表面标记物CXCR4、CKIT和EPCAM的表达和转录因子SOX17和FOXA2或它们的任意组合限定。在一些实施例中，在激活素诱导之后，大于50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的内胚层细胞群表达CXCR4、CKIT和EPCAM。在另一实施例中，在激活素诱导之后，大于50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的内胚层细胞群表达SOX17和/或FOXA2。
[0313] 在某些实施例中，该方法还包括富集和/或分离功能性肝细胞和/或胆管细胞，以任选地生成功能性肝细胞和/或胆管细胞的分离种群。
[0314] 在实施例中，分离步骤包括使细胞群与结合功能性肝细胞和/或胆管细胞的特定试剂接触。
[0315] 如本文所使用的相对于细胞的分离种群的术语“分离种群”指的是已被从细胞的混合或异质种群去除并且分离的细胞的种群。在一些实施例中，与细胞从中分离或富集的异质种群相比，分离种群是细胞的基本上纯的种群。细胞可以是例如单细胞悬浮液、单层和/或聚集体。在例如包括胆管细胞的一些实施例中，分离种群也可以包括诸如OP9、OP9delta和/或OP9Jagged1细胞的表达notch配体的细胞。在例如包括肝细胞的一些实施例中，分离种群也可以包括内皮细胞。分离种群(任选地在解离的细胞悬浮液和/或聚集体中)可以用于筛选应用、疾病建模应用和/或包括例如支架等的移植应用。
[0316] 相对于特定细胞群的术语“基本上纯”指的是相对于构成总细胞群的细胞，至少约65％、优选至少约75％、至少约85％、更优选至少约90％和最优选至少约95％纯的细胞的种群。类似地，对于功能性肝细胞和/或胆管细胞的“基本上纯”的种群指的是含有少于约30％、少于约20％、更优选少于约15％、10％、8％、7％、最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％、或小于1％的非功能性肝细胞和/或胆管细胞的细胞的种群或由本文中的术语限定的它们的后代。在一些实施例中，本发明包括扩增功能性肝细胞和/或胆管细胞的种群的方法，其中，功能性肝细胞和/或胆管细胞的扩增种群是功能性肝细胞和/或胆管细胞的基本上纯的种群。
[0317] 术语“富集”或“富集的”在本文可互换使用，并且是指相对于制备的起始培养物中的类型的细胞的部分，一种类型的细胞的产率(部分)增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％。富集和部分地纯化可以互换使用。
[0318] 细胞的种群可以使用不同的方法来富集，诸如基于标记物的方法，标记物诸如细胞表面标记物(例如，FACS分选等)。
[0319] 细胞与组分
[0320] 如上所讨论的，功能性肝细胞和/或胆管细胞可以使用本文描述的方法分离。因此，本申请的进一步的方面包括根据本文所述的方法产生的细胞的种群。在实施例中，细胞的种群是例如根据本文描述的方法产生的例如成熟和/或功能性细胞的标记物的成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞，任选地成熟和/或功能性肝细胞和/或胆管细胞的富集、纯化或分离的细胞群。富集、纯化或分离的任选地为单细胞悬浮液、聚集体、嵌合聚集体和/或结构，包括分支结构和/或包囊。
[0321] 在实施例中，成熟和/或功能性肝细胞缺乏AFP和/或胎儿CYP3A7的表达。
[0322] 在实施例中，成熟和/或功能性胆管细胞表达MDR转运体基因、水通道蛋白，CFTR和/或它们的突变体。
[0323] 在实施例中，细胞群是成肝细胞的细胞群，任选地，表达Notch2。
[0324] 在实施例中，在体外产生分离、纯化和/或富集的种群。
[0325] 在实施例中，细胞的种群包括在具有合适的稀释液的组分中。
[0326] 合适的稀释液包括例如合适的培养基、或含有例如血清、血清替代物或血清补充物和/或合适的冷冻保护剂(诸如二甲基亚砜(DMSO)、甘油甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)的冻存培养基。另一方面包括任选地包含FGF和/或BMP4激动剂的培养基补充组分，FGF和/或BMP4激动剂可以用作细胞培养的基本培养基的补充物。补充物也可以包括本文中讨论的其他组分，诸如激活素A、Wnt3A、GSK-3的选择性抑制剂(诸如CHIR-99021)、HGF、地塞米松、抑瘤素M、抗坏血酸、谷酰胺和B27补充物。
[0327] 在实施例中，功能肝细胞和/或胆管细胞来源于与肝和/或胆道疾病作用的受试者的iPS。在实施例中，疾病是单基因疾病，例如，囊性纤维化、Alagille综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC型1、2和3)。
[0328] 在实施例中，疾病是囊性纤维化。在实施例中，受试者携带突变，例如，在囊性纤维化基因中，例如，deltaF508、997CFTR del和/或C1CFTR突变。如图9所示，所描述的方法可以从iPSC生成成肝细胞种群，iPSC从囊性纤维化患者生成/衍生。
[0329] 在实施例中，疾病是一种复杂的胆道疾病，任选地，原发性硬化性胆管炎或胆道闭锁。
[0330] 另一个方面包括根据本文中描述的方法制备的可植入构建体或体外的生物人工肝装置(BAL)(包括本文中描述的细胞的种群)。
[0331] 用途
[0332] 本文描述的功能肝细胞和/或胆管细胞和它们的衍生物可以在一个或多个应用中使用。例如，该方法可以用于从iPSC产生肝细胞谱系细胞的种群，iPSC源自或从受肝脏和/或胆道疾病影响的受试者获得。
[0333] 因此，另一个方面是用于生成肝和/或胆道疾病的细胞模型的方法，包括：
[0334] ⅰ)从源自或从受到肝和/或胆道疾病侵袭的受试者获得的细胞生成iPSC；和[0335] ⅱ)根据本文描述的方法生成肝细胞谱系细胞和/或包括聚集体和/或结构(任选地，分支结构)和/或包囊的肝细胞谱系细胞。
[0336] 在实施例中，疾病是单基因疾病，例如，囊性纤维化、Alagille综合征、进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC型1、2和3)。在实施例中，疾病是复杂胆道疾病，任选地，原发性硬化性胆管炎或胆道闭锁。
[0337] 另一个方面是用于生成囊性纤维化的细胞模型的方法，包括：
[0338] ⅰ)从源自或从受到囊性纤维化侵袭的受试者获得的细胞生成iPSC；和
[0339] ⅱ)根据本文描述的方法生成胆管细胞谱系细胞和/或包括结构(任选地，分支结构)和/或包囊的胆管细胞谱系细胞。
[0340] 例如，功能性肝细胞和/或胆管细胞可以用于预测药物毒理学、药筛选和药物发现。
[0341] 因此，在实施例中提供的是一种测定法，包括：使采用本文描述的方法生成的功能性肝细胞和/或胆管细胞种群与测试化合物接触，以及测量：1)细胞扩增，2)肝细胞的成熟和/或胆管细胞特化，3)一种或多种成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞的性质；和/或4)一种或多种肝和/或胆道疾病的细胞模型缺陷的恢复和/或改善以及在不存在测试化合物的情况下与野生型细胞群和/或测试的其他对照比较。
[0342] 在实施例中，该方法还包括测量一种或多种成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞的性质，包括例如如实例9中测量的。
[0343] 在实施例中，一个或多个胆管细胞的性质包括：
[0344] a)与野生型iPSC相比的成肝细胞/胆管细胞谱系分化能力，任选地，评估I)分支结构和/或包囊的存在和/或数量；Ⅱ)胆管细胞标记物表达水平、形式(成熟和/或不成熟的形式)和/或表达模式；
[0345] b)与野生型iPSC相比的胆管细胞谱系的形成的动力学；和/或
[0346] c)转运蛋白活性，任选地CFTR活性。
[0347] 例如，使用诸如毛喉素的cAMP激动剂来评估CFTR活性可以例如通过测量包囊肿胀。实例9提供了可以用来测量CFTR活性的方法的实例。
[0348] 例如，它表明，化学校正剂VX809及其Corr-4a能够恢复/增强胆管包囊中的突变体CFTR活性，如通过毛喉素刺激试验中的包囊肿胀进行测量(实例9)。当用推定或已知的CFTR处理进行测试时，例如，提供用于新的药物/生物制品的评估和/或用于评估患者特异性响应，可以评估这个或另一特性的恢复和/或改善。
[0349] 另一个方面包括功能性CFTR测定，包括：
[0350] i)使胆管细胞谱系细胞与cAMP激活剂接触，胆管细胞谱系细胞任选地在包囊中、从源自具有CF和/或CF相关疾病的患者的iPSC分化的，cAMP激活剂任选地为毛喉素和IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)
[0351] ii)测量肿胀，任选地在测试试剂的存在下，和
[0352] ⅲ)与野生型细胞或其他对照比较，任选地在存在或不存在测试试剂下。
[0353] 例如，测试试剂可以在诸如VX-770的CFTR通道增效剂的存在下进行比较和/或测试。VX-770是FDA批准的药物(也称为Kalydeco)，其用于携带特定的CF基因突变G551D的患者。
[0354] 描述的细胞也可以用于细胞移植。例如，细胞的混合种群、富集和/或分离的功能性肝细胞和/或胆管细胞可以被引入到有需要的受试者内，例如，用于治疗肝脏疾病。
[0355] 因此，一个方面包括根据本文描述的方法获得细胞和/或制备分离的肝细胞和/或胆管细胞，任选地功能性肝细胞和/或胆管细胞，以及施用所述细胞给有需要的受试者，例如，具有肝和/或胆道疾病的受试者。
[0356] 例如，Yusa等人(55)描述了校正iPSC源性肝细胞中的已知的基因缺陷并且重新移植它们。校正后的细胞重新移植回小鼠内并且显示出先前在疾病状态中不存在的功能。Yusa等人发现用于他们的目的的最合适的转座子为piggyBac、蛾来源的DNA转座子，其可以有效地转置入包括人类胚胎干(ES)细胞的哺乳动物细胞中。可动因子能够去除piggyBac反向重复序列两侧的转基因而不留下任何残余序列。所生成的iPSC-3-G5-A7具有校正的A1AT，相比于亲代成纤维细胞的完整的基因组并且当分化为肝细胞样细胞时表达正常的A1AT蛋白。
[0357] 任选地使用转座子。引入表达构建体的其他方法包括基于慢病毒、腺病毒的方法。用于将基因转入体外和体内的细胞的有效的系统是基于病毒的载体，包括单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和慢病毒载体。用于人类基因递送的可选方法包括使用裸质粒DNA以及脂质体-DNA复合物(Ulrich等人，1996；Gao和Huang，1995)。应当理解，一个以上的转基因可以由递送的载体构建体来表达。可选地，单独的载体(每个均表达一种或多种不同的转基因)也可以递送到细胞。
[0358] 任选地采用共转染(DNA和单独的分子上的标记)(见例如US5,928,914和US5,817,492)。还有，标记物(诸如绿色荧光蛋白标记物或衍生物)在载体本身(优选病毒载体)内是有用的。
[0359] 用于人多能干细胞中的基因组编辑的通常使用的系统是转录激活剂样效应核酸酶(TALENS)和CRISPR-Cas9系统，例如，如分别在Joung和Sander 2013(56)和Ran等人2013(57)中描述的。
[0360] 另一种方法包括：ZFN(锌指核酸酶)，任选地与TALEN(转录激活样效应核酸酶)结合以用于基因编辑和突变的基因的校正。例如，见Gaj等人(58)。
[0361] 因此，在实施例中，方法包括从受肝脏和/或胆道疾病侵袭的患者获得细胞(任选地，血细胞)，基因组编辑和/或插入编码功能性和/或治疗性蛋白质的构建体；和在插入构建体之前和/或之后，根据本文描述的方法诱导成肝细胞、肝细胞和/或胆管细胞。
[0362] 在实施例中，施用的细胞的种群是细胞的第25/26天的种群。在实施例中，细胞特化至肝细胞或胆管细胞的命运。
[0363] 也包括所述细胞的用途和包含所述细胞的组合物，所述细胞用于移植和/或治疗有需要的受试者，例如，具有肝脏疾病的受试者。
[0364] 在例如图8c)至图8e)中展示和在实例3中描述的，源自ESC移植的肝细胞植入和能够分化成肝细胞和胆管细胞谱系的细胞。类似地，实例9展示出，CFTR功能性胆管细胞可以在体外和/或体内产生。
[0365] 因此，在实施例中提供了一种利用根据本文描述的方法生成的肝细胞移植或治疗有需要的受试者的方法。在实施例中，本发明包括根据本文描述的方法生成的细胞的用途，用于治疗有需要的受试者，例如，有肝脏疾病和/或胆道疾病的受试者。
[0366] 在实施例中，施用治疗有效量。
[0367] Takebe等人已经通过体外建立的肝芽的移植证明了来自人类iPSC的血管化和功能性人类肝脏的生成。
[0368] 在实施例中，获得的细胞源自自体细胞，例如，从受试者的血液和/或皮肤细胞生成的iPSC。在实施例中，PSC可以例如是从活检、血细胞、皮肤细胞、毛囊和/或成纤维细胞得到的iPSC。
[0369] 在另一实施例中，使用本文描述的方法生成的肝细胞和/或胆管细胞与毒性筛选中的测试试剂接触。CYP是参与药物代谢和生物激活的主要酶。可以实施各种测定，包括药物-药物相互作用测定、CYP抑制测定和CYP诱导测定。
[0370] 例如，药物可以通过诱导CYP同工酶(CYP诱导)或者通过直接抑制给定CYP(CYP抑制)的活性增加或降低各种CYP同工酶的活性。CYP酶的活性的变化会影响各种药物的代谢和/或清除。例如，如果一种药物抑制另一种药物的CYP介导的代谢，则第二种药物可能在体内积聚至毒性水平。
[0371] 在其他实施例中，可以进行CYP抑制筛选。因为表明使用本文描述的方法生成的肝细胞示出为表达CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6和/或CYP7A1，可以例如使用LC-MS/MS或荧光测定法对一种或多种这些同工酶的抑制进行筛选。可以确定CYP IC 50和/或Ki。
[0372] 在又其他实施例中，可以评估CYP酶的诱导。例如，一些化合物诱导CYP酶，导致共同施用的药物的代谢增加，共同施用的药物是诱导的CYP酶的底物。这种共同施用的药物因此可能失去功效。诸如CYP1A2、CYP2B6、CYP2C和CYP3A4的CYP酶易受诱导。可以相对于对照测量CYP的催化活性和mRNA水平，其中结果表示为倍数诱导。
[0373] 此外，在其他实施例中，可以评估药物代谢物，例如，可以确定药物的代谢物谱。
[0374] 在实施例中，将不同浓度的测试试剂添加至使用本文描述的方法获得的细胞，并且评估细胞的存活、CYP 450同工酶活性、CYP 450同工酶mRNA水平和/或代谢物图谱。该方法通常可以用于例如筛选药物或评估药物对患者的特定毒性。
[0375] 在实施例中，功能性肝细胞和/或胆管细胞用于组织工程。例如，获得功能性肝细胞和/或胆管细胞的纯化的种群允许生成具有明确数量的功能性肝细胞和/或胆管细胞的工程化构建体。在其他实例中，获得功能性肝细胞和/或胆管细胞的纯化的种群允许生成生物人工肝装置。
[0376] 调查的全器官肝移植的替代物包括使用分离细胞的移植、可植入构造的组织工程和体外的生物人工肝装置(BAL)(51中提到)。如这篇参考文献的451页上示出的，“他们的未来用途将取决于细胞组分的选择和稳定化”。虽然已经评估了细胞系和非人类细胞，但是在临床使用上存在困难。人功能性肝细胞和/或胆管细胞来源的限制也妨碍这样的装置的发展。
[0377] 如52中提到的，肝脏是血浆蛋白(包括白蛋白、补体系统和凝血的组分以及纤溶因子)的主要来源。肝衰竭导致不能处理低分子量物质，其中有一些是水溶性的(氨、苯丙氨酸、酪氨酸)，但其中有许多是水溶性差并且在血液中结合至转运蛋白进行运输，主要是白蛋白(中链脂肪酸、色氨酸和它的代谢物、内源性苯二氮卓和其他神经活性物质、硫醇、有毒的胆汁酸、胆红素、重金属和内源性血管扩张剂)。这导致内源性毒素的累积，内源性毒素的累积通过直接的细胞毒性引起多个辅助器官功能障碍(例如，由于黄疸引起的急性肾小管坏死)、功能自我平衡的改变(例如，由于血液动力学失调引起的肝肾综合征)或两者的组合(例如，肝性脑病和彗差)。综合透析和血浆置换、选择性血浆滤过和吸附27或选择性血浆置换治疗技术已被开发用于肝脏支持疗法。血浆置换技术利用例如高选择性膜和白蛋白透析以增加白蛋白结合的毒素与水溶性毒素的清除。
[0378] 获得功能性肝细胞和/或产生白蛋白的肝细胞可以以BAL的方式使用。例如，如果获得功能性肝细胞，它可能没有必要实施白蛋白透析。ES/iPS源性肝细胞能够生成白蛋白蛋白质，白蛋白蛋白质是从肝脏分泌的主要蛋白质，ES/iPS源性肝细胞也可以以BAL和白蛋白透析的方式使用。例如，来自人源的白蛋白的产生在BAL中是重要的。白蛋白运输激素、脂肪酸和包括毒性试剂的其他化合物。白蛋白透析的好处在于，结合白蛋白的毒性化合物可以从血流中消除。临床上用于肝脏和肾脏疾病的人血清白蛋白目前只从捐献的血液获得。生成白蛋白分泌细胞和/或与较高肝功能活性一起将有利于建立BAL系统。
[0379] 在实施例中，该方法应用于患者特定疾病hiPSC和用于例如模拟肝脏疾病。例如，可以分离、处理来自具有肝脏疾病的患者的肝或其他细胞以获得hiPSC，然后hiPSC可以被培养和诱导以分化成功能性肝细胞和/或胆管细胞。这些细胞可以用于评估疾病的特征，诸如疾病涉及或响应于患者的免疫细胞的基因。
[0380] 例如，正常细胞和患者特定疾病hiPSC可以被诱导为功能性肝细胞和/或胆管细胞并且比较正常细胞和患者特定疾病hiPSC。例如，可以进行来自正常和患者特定hiPSC的胰腺祖细胞和β细胞的基因、外遗传和蛋白质组分析。这样详细的分析可以导致信号通路、转录调控网络和/或细胞表面标记物的发现，信号通路、转录调控网络和/或细胞表面标记物调节正常人肝发育以及在疾病中发挥作用的那些。
[0381] 如本文所用的术语“受试者”包括动物界的所有成员，包括哺乳动物，并且适当地指的是人类。
[0382] 当应用于分离的细胞时，术语“处理”、“正在处理”、“处理”等包括使细胞经受任何种类的工艺或条件，或者对细胞实施任何种类的操纵或工序。当应用于受试者时，该术语指的是给个体提供医疗或外科护理、保健或管理。
[0383] 当应用于受试者时，如本本文所用的术语“治疗”指的是旨在获得有益或期望的结果的方法(包括临床结果)并且包括医疗过程和应用，医疗过程和应用包括例如药物干预、手术、放疗和自然疗法干预以及测试治疗。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于一种或多种症状或状况的减轻或改善、疾病的程度的减小、疾病的稳定的(即不恶化)状态、预防疾病的扩散、延缓或减慢疾病进展、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分还是全部)，无论可检测还是不可检测的。“治疗”也可以指与不接受治疗的预期存活相比延长了存活。
[0384] 如本文所使用的，术语“施用”、“引入”和“移植”在通过使得在期望的位点至少部分地定位引入的细胞的方法或路径将细胞(例如，功能性肝细胞和/或胆管细胞)递送至受试者的情况下可以互换使用。细胞可以直接植入到肝脏，或可选地通过使得递送到受试者中的期望的位置的任何适当的路径施用细胞，其中，植入的细胞或细胞的组分的至少一部分保持存活。
[0385] 试剂盒
[0386] 另一方面包括试剂盒。试剂盒可以包括例如以上描述的激动剂、拮抗剂、成熟因子等的一种或多种、一种或多种培养基、用于生长细胞的容器等，它们可以用于本文中描述的方法和/或根据本文描述的方法扩增和/或制备的细胞。在实施例中，试剂盒包括用于根据本文的方法使用的说明书。在实施例中，试剂盒包括本文产生的细胞的种群、可选地具有说明书、例如以上描述的激动剂、拮抗剂、成熟因子等的一种或多种，包括例如一种或多种培养基、用于生长细胞的容器等。
[0387] 在理解本发明的范围中，如本文所用的术语“包括”和它的衍生词旨在为开放术语，开放术语指定所陈述的特征、元素、组分、组、整体和/或步骤的存在，但并不排除其他未陈述的特征、元素、组分、组、整体和/或步骤的存在。前述内容也适用于具有类似含义的词语，诸如术语“包含”、“具有”和它们的衍生词。最后，如本文所用的诸如“基本上”、“约”和“近似”的程度术语是指修饰术语的使得最终结果不会显著改变的合理偏差量。如果偏差不会否定修饰术语所修饰的词的含义，这些程度术语应该被解释为包括修饰术语的至少±5％的偏差。
[0388] 在理解本发明的范围中，如本文所用的术语“由......组成”及其衍生词旨在为开放术语，开放术语指定所陈述的特征、元素、组分、组、整体和/或步骤的存在，但并不排除其他未陈述的特征、元素、组分、组、整体和/或步骤的存在。
[0389] 本文中由端点表述的数值范围包括在该范围内包含的所有数字和分数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。也应该理解，所有数字和它们的分数假定为被术语“约”修饰。此外，应该理解，“一”、“一个”和“该”包括复数对象，除非内容另有明确说明。术语“约”是指参考的数字加或减0.1％至50％、5％-50％或10％-40％，优选10-20％，更优选10％或15％。
[0390] 此外，在特定部分中描述的定义和实施例旨在适用于本文中描述的其他实施例，本领域技术人员将理解它们是合适的。例如，在下面的段落中，本发明的不同方面进行更详细的限定。这样限定的每个方面可以与任何其他一个或多个方面组合，除非有明确的相反指示。特别地，指示的优选或有利的任何特征可以与指示的优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。
[0391] 以上公开内容概括地描述了本申请。更完整的理解可以通过参考下列具体实例获得。这些实例仅仅描述为用于说明的目的，而不是意在限制本申请的范围。由于情况可能暗示或使权宜之计，等同的形式和替换的变化是预期的。尽管本文中采用了特定术语，这样的术语旨在是描述意义的，而不是为了限制的目的。
[0392] 下面的非限制性实例用于说明本发明：
[0393] 实例
[0394] 实例1
[0395] EB中的内胚层诱导
[0396] 图1a中示出了用于使用胚状体(EB)从hESC生成肝细胞的策略。类似于使用单16
层培养物的方案 ，它涉及特化步骤，特化步骤重现早期胚胎中的肝脏发育的关键阶段。如
18
先前描述的 ，EB由在低水平的BMP4中培养24小时的小聚集体形成。EB随后暴露于高浓度的激活素A(以下称为激活素)五天以诱导定形内胚层，通过表面标记物CXCR4、CKIT和EPCAM以及转录因子SOX17和FOXA2的表达来限定种群。如图1b所示，在激活素诱导五天(共培养6天)之后，大于90％的诱导EB种群共表达CXCR4和CKIT或CXCR4和EPCAM。细胞内流式细胞分析表明，90％以上的种群表达SOX17，和大于80％的种群表达FOXA2+。
层培养物的方案 ，它涉及特化步骤，特化步骤重现早期胚胎中的肝脏发育的关键阶段。如
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先前描述的 ，EB由在低水平的BMP4中培养24小时的小聚集体形成。EB随后暴露于高浓度的激活素A(以下称为激活素)五天以诱导定形内胚层，通过表面标记物CXCR4、CKIT和EPCAM以及转录因子SOX17和FOXA2的表达来限定种群。如图1b所示，在激活素诱导五天(共培养6天)之后，大于90％的诱导EB种群共表达CXCR4和CKIT或CXCR4和EPCAM。细胞内流式细胞分析表明，90％以上的种群表达SOX17，和大于80％的种群表达FOXA2+。
[0397] 使用单层诱导方案的研究表明，Wnt信号传导增强激活素诱导的内胚层的发育，可10
能是由于增强前原条的形成 。将Wnt3A添加到激活素诱导的EB培养物导致可再现地增加CXCR4+、SOX17+和FOXA2+细胞在EB内的比例(图1c)。由于CXCR4表达增加，CKIT+CXCR4+和CXCR4+EPCAM+细胞的比例增加至大于种群的95％。分子分析表明，Wnt诱导的EB中的SOX17和FOXA2表达的升高的水平证实了流式细胞数据(图1d)。添加Wnt没有加速Oct3/4的表达的下降，但确实导致第三天的T(短尾)表达的增加和第四天和第五天的
19 10
Goosecoid(GSC)表达的增加(图1d)。如小鼠ESC模型 和单层hESC源性培养物 中展示的，Wnt增强原条的形成。动力学分析示出在分化的第3天和第6天之间的CKIT+CXCR4+、SOX17+和FOXA2+阳性细胞的比例的快速和动态增加(图1e)。EB中的内胚层诱导受到使用的基础培养基的影响。StemPro34比我们先前使用的神经基础培养基支持更有效的内胚层诱导(图1f)。高度富集的内胚层的诱导是在从hPSC高效率和可重复地生成肝细胞样细胞的重要的第一步。例如，发现至少90％的CXCR4+CKIT+和80％的SOX17+细胞的诱导水平导致最佳肝谱系的发育。
能是由于增强前原条的形成 。将Wnt3A添加到激活素诱导的EB培养物导致可再现地增加CXCR4+、SOX17+和FOXA2+细胞在EB内的比例(图1c)。由于CXCR4表达增加，CKIT+CXCR4+和CXCR4+EPCAM+细胞的比例增加至大于种群的95％。分子分析表明，Wnt诱导的EB中的SOX17和FOXA2表达的升高的水平证实了流式细胞数据(图1d)。添加Wnt没有加速Oct3/4的表达的下降，但确实导致第三天的T(短尾)表达的增加和第四天和第五天的
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Goosecoid(GSC)表达的增加(图1d)。如小鼠ESC模型 和单层hESC源性培养物 中展示的，Wnt增强原条的形成。动力学分析示出在分化的第3天和第6天之间的CKIT+CXCR4+、SOX17+和FOXA2+阳性细胞的比例的快速和动态增加(图1e)。EB中的内胚层诱导受到使用的基础培养基的影响。StemPro34比我们先前使用的神经基础培养基支持更有效的内胚层诱导(图1f)。高度富集的内胚层的诱导是在从hPSC高效率和可重复地生成肝细胞样细胞的重要的第一步。例如，发现至少90％的CXCR4+CKIT+和80％的SOX17+细胞的诱导水平导致最佳肝谱系的发育。
[0398] nodal/激活素信号传导(nodal/activin signaling)的持续时间影响肝的发育[0399] 为了将CXCR4+CKIT+种群特化为肝的命运，解离第6天的EB并且在基质胶包被的板上将细胞铺板为单层，在FGF10和BMP4的存在下进行48小时，然后在bFGF和BMP4的存20 16
在下进行六天。先前在小鼠 和人类ESC分化培养物 中证明，FGF和BMP对人和小鼠特化是重要的。在Si-Tayeb等人中，FGF2和BMP4组合并且生成的细胞的80％-85％表达白蛋白。发现，这两种因子的组合对于在测试条件下优化肝诱导是必要的(图2a)。包括FGF10/BMP4步骤，因为发现与分化培养物中的单独的bFGF/BMP4相比，增加了白蛋白的表达(图
2b)。在这些诱导条件下，相当数量的白蛋白阳性细胞在分化的第12天和第24天之间的培养物中持续地发育。
在下进行六天。先前在小鼠 和人类ESC分化培养物 中证明，FGF和BMP对人和小鼠特化是重要的。在Si-Tayeb等人中，FGF2和BMP4组合并且生成的细胞的80％-85％表达白蛋白。发现，这两种因子的组合对于在测试条件下优化肝诱导是必要的(图2a)。包括FGF10/BMP4步骤，因为发现与分化培养物中的单独的bFGF/BMP4相比，增加了白蛋白的表达(图
2b)。在这些诱导条件下，相当数量的白蛋白阳性细胞在分化的第12天和第24天之间的培养物中持续地发育。
[0400] 虽然BMP4/FGF特化步骤促进肝发育，第10天的培养物的分析显示，培养物内的SOX17+和FOXA2+细胞的比例已显著下降，从90％以上下降到约50％(图3a)。没有被理论所束缚，这种减少表明，要么第6天的种群受到在FGF和BMP4存在下优先扩增的非内胚层细胞的污染，要么细胞的内胚层命运尚未固定，并且因此一些在使用的条件下采用另一命运。先前证明，延长的激活素/nodal信号传导对于在体外小鼠ESC分化系统中由前原条19
细胞建立内胚层的命运是必要的 。延长的信号传导是否会对人PSC有用还未知。在FGF/BMP4特化步骤之前，通过培养单层细胞两天而在人系统中扩大了增大该信号传导通路的持续时间的效果。当用激活素诱导额外两天时，第12天测量的SOX17+和FOXA2+细胞的比例显著高于未处理组(图3a)。不被理论所束缚，由于细胞总数在处理的种群中较低(图3b)，可能是这个阶段的激活素信号传导优先地支持内胚层细胞的存活。
细胞建立内胚层的命运是必要的 。延长的信号传导是否会对人PSC有用还未知。在FGF/BMP4特化步骤之前，通过培养单层细胞两天而在人系统中扩大了增大该信号传导通路的持续时间的效果。当用激活素诱导额外两天时，第12天测量的SOX17+和FOXA2+细胞的比例显著高于未处理组(图3a)。不被理论所束缚，由于细胞总数在处理的种群中较低(图3b)，可能是这个阶段的激活素信号传导优先地支持内胚层细胞的存活。
[0401] 延长的激活素处理维持CXCR4+CKIT+种群直到培养的第8天(图3c)，并且导致指示肝祖细胞(成肝细胞)发育的基因的更高水平的表达，包括在培养的第26天的HEX、AFP、ALB和HNF4a(图3d)。如通过MEOX1、MESP1、CD31和CD90的表达和通过第24天的CD90+间充质细胞和CD31+内皮细胞的存在所展示的，从未处理的CXCR4+CKIT+内胚层生成的培养物含有污染性中胚层(图3d、图3e)。源自激活素处理的内胚层的种群显示中胚层基因的减少的表达，具有更高部分的EPCAIVT细胞、不可检测的CD31+细胞和少得多的CD90种群(图3e)。与这些差异一致，与培养的第26天的未处理的种群相比，在处理的种群中观察到白蛋白阳性细胞的显著更高的比例(图3f，图3g)。有趣的是，AFP阳性细胞的比例在两组之间没有不同。不被理论所束缚，这表明在这个阶段，AFP阳性细胞在未处理种群中的表达可能不是肝特异性的。
[0402] 聚集促进肝成熟
[0403] 虽然延长的激活素/nodal信号促进肝发育，但是与成人肝脏相比，诸如白蛋白和HNF4α的基因的表达水平在hESC源性种群中显著更低，这表明在第26天培养物中的细胞21-23
仍然不成熟。先前的研究已经表明，细胞聚集可以培养物中保持原代肝细胞 的分化表型
24
以及在促进hESC源性肝细胞 的一定程度的成熟。接下来探讨聚集对源自激活素处理的内胚层的第26天成肝细胞种群的成熟的作用。通过酶处理和人工解离的组合以及然后在HGF、地塞米松(Dex)和抑瘤素M(OSM)的存在下培养六天而从单层生成聚集体(图4a)。聚集影响分化，并且导致与肝功能有关的多个基因的表达增加，包括ALB(白蛋白)、CPS1(氨基甲酰磷酸酶合酶1)、TAT(酪氨酸转氨酶)、G6P(葡萄糖6磷酸酶)和TDO(色氨酸2,3-双加氧酶)(图4b)。在一些情况下，该水平类似于成人肝脏中发现的(ALB)的水平或高于(TDO)的水平(图4b)。聚集也增加了若干细胞色素P450基因的表达，包括CYP7A1、CYP3A7和CYP3A4。CYP3A4的水平类似于在原代肝细胞中发现的水平，但远低于成人肝脏中的水平(图4c)。未诱导其他P450基因(包括CYP1A2和CYP2B6以及阶段II酶UGT1A1)的表达
至任何显著的水平。
仍然不成熟。先前的研究已经表明，细胞聚集可以培养物中保持原代肝细胞 的分化表型
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以及在促进hESC源性肝细胞 的一定程度的成熟。接下来探讨聚集对源自激活素处理的内胚层的第26天成肝细胞种群的成熟的作用。通过酶处理和人工解离的组合以及然后在HGF、地塞米松(Dex)和抑瘤素M(OSM)的存在下培养六天而从单层生成聚集体(图4a)。聚集影响分化，并且导致与肝功能有关的多个基因的表达增加，包括ALB(白蛋白)、CPS1(氨基甲酰磷酸酶合酶1)、TAT(酪氨酸转氨酶)、G6P(葡萄糖6磷酸酶)和TDO(色氨酸2,3-双加氧酶)(图4b)。在一些情况下，该水平类似于成人肝脏中发现的(ALB)的水平或高于(TDO)的水平(图4b)。聚集也增加了若干细胞色素P450基因的表达，包括CYP7A1、CYP3A7和CYP3A4。CYP3A4的水平类似于在原代肝细胞中发现的水平，但远低于成人肝脏中的水平(图4c)。未诱导其他P450基因(包括CYP1A2和CYP2B6以及阶段II酶UGT1A1)的表达
至任何显著的水平。
[0404] 细胞表面标记物无唾液酸糖蛋白受体-1(ASGPR-1)被发现在成熟肝细胞上，并且已显示为标记hESC分化培养物中的成熟细胞。聚集导致在培养物中检测的ASGPR-1+细胞的比例显著增加，一致地产生含有大于50％的阳性细胞的种群(图4d)。免疫染色示出，在白蛋白第32天聚集体细胞上检测到ASGPR-1和E-钙粘蛋白。总的来说，这些发现表明，聚集成3-D结构的简单的过程促进了指示肝成熟的变化。
[0405] cAMP信号传导诱导hESC源性肝细胞样细胞的成熟。
[0406] 为了使细胞进一步成熟，探讨cAMP信号传导的作用。使用肝细胞系的研究已经表明，该通路的激活可以诱导肝基因表达，部分地通过过氧化物酶体增殖子激活受体γ共激活剂1-α(PGC1-α)、与HNF4a一起作用的共激活剂的诱导，以调节涉及肝细胞功能的许多25-28
基因的表达 。为了确定cAMP信号传导是否能够促进hESC源性肝细胞样细胞的成熟，将
8-溴腺苷-3’5”-环单磷酸(8-Br-cAMP)、cAMP的细胞渗透性类似物添加到从培养的第32天到第44天的肝聚集体。用8-Br-cAMP处理显著增强PGC1-a的表达(15倍)，但不增强hESC源性肝细胞中的HNF4α的表达(图5a)。8-Br-cAMP也诱导G6P和TAT的表达，平均分别为25和33倍，达到近似于成人肝脏中的那些的水平(图5a)。与此相反，AFP和ALB的表达水平由8-Br-cAMP下调。流式细胞分析证实了AFP的表达分析并且示出了与未处理的对照相比的8-Br-cAMP处理的聚集体中的AFP阳性细胞的数量的减少(54％至26％)。
ALB阳性细胞的比例未降低，尽管事实上mRNA的水平下降(图5b)。不被理论所束缚，这些差异可能反映了RNA相对于蛋白质表达的差异。诸如胰腺的其他组织也表达PGC-1a。然而，与在肝细胞中观察到的诱导相反，PGC1-a的表达未由hESC源性胰岛素阳性胰腺细胞中的cAMP信号传导诱导(图5c)，这表明该响应可能是组织特异性的。
基因的表达 。为了确定cAMP信号传导是否能够促进hESC源性肝细胞样细胞的成熟，将
8-溴腺苷-3’5”-环单磷酸(8-Br-cAMP)、cAMP的细胞渗透性类似物添加到从培养的第32天到第44天的肝聚集体。用8-Br-cAMP处理显著增强PGC1-a的表达(15倍)，但不增强hESC源性肝细胞中的HNF4α的表达(图5a)。8-Br-cAMP也诱导G6P和TAT的表达，平均分别为25和33倍，达到近似于成人肝脏中的那些的水平(图5a)。与此相反，AFP和ALB的表达水平由8-Br-cAMP下调。流式细胞分析证实了AFP的表达分析并且示出了与未处理的对照相比的8-Br-cAMP处理的聚集体中的AFP阳性细胞的数量的减少(54％至26％)。
ALB阳性细胞的比例未降低，尽管事实上mRNA的水平下降(图5b)。不被理论所束缚，这些差异可能反映了RNA相对于蛋白质表达的差异。诸如胰腺的其他组织也表达PGC-1a。然而，与在肝细胞中观察到的诱导相反，PGC1-a的表达未由hESC源性胰岛素阳性胰腺细胞中的cAMP信号传导诱导(图5c)，这表明该响应可能是组织特异性的。
[0407] 吲哚花青绿(ICG)的细胞摄取被认为是成人肝细胞的特性29并且在临床上用作测30
试基质以评价肝脏功能 。cAMP信号传导急剧增加显示该活性的细胞的比例，如通过用ICG染色的几乎所有处理的聚集体的观察所展示的(图5d)。
试基质以评价肝脏功能 。cAMP信号传导急剧增加显示该活性的细胞的比例，如通过用ICG染色的几乎所有处理的聚集体的观察所展示的(图5d)。
[0408] 共聚焦显微镜用于评估在存在或不存在8-Br-cAMP下培养的第44天聚集体中的ALB和AFP或ALB和HNF4α的共表达。免疫染色分析与流式细胞术数据一致，并且示出，与未处理的聚集体相比，cAMP处理的聚集体表达类似水平的ALB但是较低水平的甲胎蛋白。
[0409] 使用ELISA试验检测由hESC源性单层和聚集体种群以及由HepG2细胞、Huh7细胞和冻存肝细胞(PH，lot OSI)分泌的白蛋白(ALB)的水平。这两个聚集体种群中的HNF4a蛋白的水平相当，证实了PCR分析。由hESC源性细胞分泌的白蛋白不受8-Br-cAMP处理的影响，而是由聚集步骤显着地提高。在单层培养物中在第20天可检测到低水平的白蛋白分泌但是在第32天的聚集培养物中显著增加(约5倍)。在HepG2、Huh7和PH细胞中仅检测到低水平。与此相反，通过cAMP信号传导增强了吸收吲哚花青绿(ICG)的能力(成人肝细胞的特征)(Stieger等人，2012)。在第44天聚集体中测量由cAMP处理和未处理的ICG吸收和释放。
[0410] cAMP信号传导增加hESC源性肝细胞中的代谢酶活性。
[0411] cAMP信号传导也诱导关键阶段I细胞色素P450基因的表达模式的变化，特别是胎儿基因CYP3A7的表达水平的降低和成人基因CYP3A4(2.5倍)、CYP1A2(18倍)和CYP2B6(4.7倍)的表达的显著增加(图6a)。UGT1A1(重要的阶段II酶)也显著由8-Br-cAMP诱导(11倍)(图6a)。CYP3A4和CYP1A2的诱导水平比原代肝细胞中发现的那些显著更高，而CYP2B6的水平在两个种群中相似。hESC源性种群中的UGT1A1表达没有达到原代肝细胞中发现的水平。不被理论所束缚，假定CYP1A2的表达限于肝脏并仅在出生之
31
后检测到 ，这些发现表明，cAMP信号传导促进胎儿阶段发育之外的分化。
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后检测到 ，这些发现表明，cAMP信号传导促进胎儿阶段发育之外的分化。
[0412] cAMP信号传导对P450基因的诱导作用仅在3D聚集体中的细胞观察到，而当cAMP添加到单层培养物中时几乎检测不到CYP1A2和CYP3A4的表达的增加(图6b)。以单层格式诱导PGC1-a和TAT的表达，可能是由于这样的事实，这些基因的启动子区包含cAMP反应元件结合蛋白(CREB)位点。为了进一步限定影响cAMP反应的变量，将从延长的激活素处理的内胚层生成的聚集与从没有激活素/nodal处理额外两天的内胚层生成的那些进行比较。在来自非处理的种群(-Act)的聚集体中几乎观察不到CYP1A2和ALB的诱导，这表明cAMP信号传导只对高度富集、适当模式化的细胞有作用(图6c)。对于上述研究，8-Br-cAMP包括在培养物中12天(第32-44天)。为了确定基因表达的变化是否依赖于连续的信号传导，将用8-Br-cAMP诱导六天和然后在不存在8-Br-cAMP下保持剩余6天的细胞与在8-Br-cAMP中培养整整12天的那些进行比较(图6d)。在较短的诱导时间之后保持CYP1A2的表达，表明更高水平的表达不依赖于连续的信号传导而是反映指示肝细胞成熟的变化。
[0413] 为了探讨P450酶的功能活性，通过高效液相色谱(HPLC)测量代谢同工酶选择性标记药物的能力。8-Br-cAMP处理的细胞的邻去乙基化CYP1A2选择性底物非那西丁(图6e)的水平在与原代培养的肝细胞一样高的水平。非处理的细胞没有显示出可检测的活性。
以相当于原代肝细胞中发现的水平，在8-Br-cAMP处理的细胞中也检测到由安非他酮的羟基化测量的CYP2B6活性(图6f)。阶段II代谢酶(包括芳基胺的N-乙酰转移酶NAT1和/或NAT2(图6g)和UDP葡萄糖醛酸转移酶(UGT)(图6H))的分析显示的活性比原代培养的肝细胞的活性高，这表明cAMP信号传导诱导广泛的酶的表达的上调，与种群的成熟是一致的。总之，这些观察表明，cAMP信号传导促进3-D聚集体中的hESC源性肝细胞样细胞的成熟。
以相当于原代肝细胞中发现的水平，在8-Br-cAMP处理的细胞中也检测到由安非他酮的羟基化测量的CYP2B6活性(图6f)。阶段II代谢酶(包括芳基胺的N-乙酰转移酶NAT1和/或NAT2(图6g)和UDP葡萄糖醛酸转移酶(UGT)(图6H))的分析显示的活性比原代培养的肝细胞的活性高，这表明cAMP信号传导诱导广泛的酶的表达的上调，与种群的成熟是一致的。总之，这些观察表明，cAMP信号传导促进3-D聚集体中的hESC源性肝细胞样细胞的成熟。
[0414] 此外，也评估两个关键酶CYP1A2和CYP3A4的代谢活性的诱导性。8-Br-cAMP处理的细胞能够代谢CYP1A2选择性底物非那西丁。用兰索拉唑诱导细胞72小时导致该活性增加3.4倍。未处理(8-Br-cAMP)的细胞具有不可诱导的低水平的活性。两个独立的原代肝细胞样本示出低于或相当于基础代谢活性的水平，但是显示更高水平的诱导(18倍和9倍)。通过细胞将睾酮代谢为6β羟基睾酮的能力测量CYP3A4活性。8-Br-cAMP处理的细胞显示该活性。CYP3A4诱导剂利福平的添加增大活性2.2倍，这表明这种酶在hESC源性细胞中也可诱导。当观察CYP1A2时，在未诱导的细胞中几乎检测不到CYP3A4活性。原代肝细胞示出低但是显著水平的CYP3A4诱导。
[0415] 从其他hPSC细胞系的肝特化和成熟
[0416] 为了确定上面详述的方法是否广泛适用于不同的人多能干细胞系，方案用于将hESC细胞系H9和H1以及诱导的多能干细胞(iPSC)系38-2分化成肝命运。在Wnt3a/激活素诱导步骤之后，来自所有三个细胞系的第6天的EB包含高比例的CKIT+CXCR4+和CKIT+EPCAM+细胞(图7a)。虽然EPCAIVT细胞的比例在所有的EB中较高，H9源性细胞比从其他细胞系生成的细胞表达基本上更高水平的EPCAM。EPCAM表达的水平与内胚层诱导的程度相关，如大于95％的H9源性种群表达SOX17+和FOXA2+，而仅65-70％的iPSC源性细胞表达这些转录因子(图7a)。这些发现表明单独的表面标记物分析不足以监测内胚层发育，以及SOX17和FOXA2表达的定量分析是必需的以测量这个胚层的诱导。如观察到的HES2细胞，延长的激活素/nodal信号传导提高来自每个细胞系的CKIT+CXCR4+种群的肝发育(图7b)。然而，生成显著水平的ALB表达所需的激活素处理的持续时间在细胞系之间变化。而较高水平的ALB表达在激活素处理H9源性细胞两天后实现，H1和38-2细胞需要四天额外的激活素信号传导。由于这个处理，有可能生成分别来自H9、H1和38-2细胞系的包括90％、85％和70％的ALB+细胞的培养物(图7c)。在分化的第26天的H9源性细胞显示出非常类似于培养的肝细胞的鹅卵石形态(图7d)。
[0417] 8-Br-cAMP的添加确实诱导CYP3A4(16倍)、CYP1A2(100倍)和CYP2B6(10倍)以及H9源性聚集体中的阶段II酶UGT1A1(16倍)的显著水平的表达(图7e)。诱导的幅度基本上大于HES2源性细胞中的那些，并且CYP1A2和CYP3A4的表达水平比原代肝细胞中的那些显著更高。两个hESC细胞系之间的诱导的差异的原因目前未知。8-Br-cAMP也诱导hiPSC源性聚集体中的这些酶的表达至与原代肝细胞中那些一样高的水平(图7e)。
[0418] 正如用HES2细胞系观察到的，H9源性细胞具有兰索拉唑诱导的CYP1A2活性。H9和iPSC源性细胞也示出可用利福平诱导的CYP3A4活性。诱导CYP1A2活性无法在iPSC源性细胞中检测到，这可能反映这个种群的次优分化。
[0419] cAMP刺激的肝种群的微阵列分析
[0420] 为了进一步评价cAMP诱导的结果和评估相对于原代肝细胞的hESC源性肝种群的发育状况，进行微阵列分析，以比较不同种群的全局表达谱。共有23038个过滤的转录子用于最终的分析。双向无监督层次集群分析显示，三组显示为不同的种群。三个cAMP诱导的种群彼此最类似，而三个原代肝细胞种群显示出最发散的表达模式。FDR校正的ANOVA(q<0.05)用于识别784个转录子，示出所有三个样品组中统计学上的最显著差异。这些数据的分层集群可视化识别每个生物组中的高表达转录子的集群。这些集群包括原代肝细胞中的181个转录子、8-Br-cAMP诱导的细胞中的106个转录子和非处理的细胞中的80个转录子。8-Br-cAMP诱导的细胞中富集的基因包括关键P450酶的大多数以及涉及肝功能(包括糖异生、葡萄糖稳态和脂质代谢)的许多方面的那些的基因的个体发育类别。在原代肝细胞中的最高水平表达的集群包括免疫系统、炎症相关和MHC基因。在非诱导的hESC源性细胞中检测到的集群不含有任何富集基因的个体发育类别。
[0421] 对于种群的更详细的比较，分析编码涉及肝功能的关键方面的蛋白质的所选择的转录子集合。这些包括阶段I和II药物代谢酶、转运蛋白、凝血因子、脂蛋白、核受体和转录因子以及一般性肝酶和其他功能性分子的子集。这些数据的分析显示，许多基因的表达处于与在8-Br-cAMP处理的hESC源性细胞和原代肝细胞中相当的水平。与未处理的细胞或原代肝细胞相比，每个类别中的选择基因在8-Br-cAMP处理的细胞中以显著更高的水平表达。这些包括证实qPCR和功能研究的阶段I酶CYP1A2和CYP3A4、阶段II酶SULT2A1、转运蛋白SLCO1B1、一般肝酶TAT、G6P和TDO(分别负责酪氨酸代谢、糖异生和色氨酸的代谢)、表面受体ASGPR-1和ALB。由于肝细胞中的ICG的细胞摄取是由有机阴离子转运蛋白SLCO1B1和SLCO1B3和Na+非依赖性转运蛋白SLC10A129调节，它们的表达的诱导与cAMP处理的聚集体示出更高水平的ICG摄取的发现一致。两者合计，来自微阵列分析的这些数据表明，用cAMP诱导成肝细胞阶段的聚集体导致指示肝细胞成熟的全局表达变化。基于这些分析，通过这种方法生成的hESC源性肝细胞似乎代表至少等同于原代人肝细胞的发育阶段。
[0422] 讨论
[0423] 为了使hPSC源性肝细胞对药物带代谢分析和对治疗肝脏疾病的移植有用，细胞必须是相对成熟的并且显示成人肝细胞的许多特征，包括可测量水平的关键阶段I和阶段II药物代谢酶。迄今为止，许多不同的研究表明，使用设计为重现胚胎中的关键发育步骤的分期的方案，有可能从hESC和hiPSC生成未成熟的肝细胞谱系细胞。这些研究的成功反映了这样的事实：控制早期阶段的分化的通路受到合理地良好地限定。与此相反，控制肝细胞成熟的因子和细胞相互作用了解甚少，并且因此只有少数研究报道了代谢功能细胞的发12
育。Duan等人 示出，它可能从H9 hESC衍生肝细胞，CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9和CYP2D6酶活性的显示水平相当于在原代肝细胞中发现的那些。Duan等人在他们的方法中使用的血清包括许多因子，其中一些因子在血清批次之间有所不同。未限定负责的因子。虽然这些发现表明，可以生成相对成熟的hESC源性肝细胞，该研究并没有提供关于促进成熟的通路的细节，也没有表明该策略广泛适用于其他hPSC细胞系。如Duan等人的图6中，他们测量来自人ES细胞(H9)的肝细胞中的代谢药物。非那西丁诱导并且提供了CYP1A2活性的评估，咪达唑仑、丁呋洛尔和双氯灭痛分别诱导并且提供了CYP3A4和CYP2B6和CYP2D6的评估。在例如本文所述的HES2细胞系中，与原代肝细胞中看到的相比，酶活性水平(CYP1A2和CYP2B6)几乎等同。在qPCR分析中，H9细胞中的CYP1A2和CYP2B6的表达的水平比HES2细胞系中发现的那些高5-8倍。本文所描述的方法产生的细胞在CYP酶CYP1A2和CYP2B6方面更接近于原代肝细胞。类似地，与原代肝细胞相比，在使用本方法生成的细胞中看到CYP2D6表达的几乎相同或相当的水平。
育。Duan等人 示出，它可能从H9 hESC衍生肝细胞，CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9和CYP2D6酶活性的显示水平相当于在原代肝细胞中发现的那些。Duan等人在他们的方法中使用的血清包括许多因子，其中一些因子在血清批次之间有所不同。未限定负责的因子。虽然这些发现表明，可以生成相对成熟的hESC源性肝细胞，该研究并没有提供关于促进成熟的通路的细节，也没有表明该策略广泛适用于其他hPSC细胞系。如Duan等人的图6中，他们测量来自人ES细胞(H9)的肝细胞中的代谢药物。非那西丁诱导并且提供了CYP1A2活性的评估，咪达唑仑、丁呋洛尔和双氯灭痛分别诱导并且提供了CYP3A4和CYP2B6和CYP2D6的评估。在例如本文所述的HES2细胞系中，与原代肝细胞中看到的相比，酶活性水平(CYP1A2和CYP2B6)几乎等同。在qPCR分析中，H9细胞中的CYP1A2和CYP2B6的表达的水平比HES2细胞系中发现的那些高5-8倍。本文所描述的方法产生的细胞在CYP酶CYP1A2和CYP2B6方面更接近于原代肝细胞。类似地，与原代肝细胞相比，在使用本方法生成的细胞中看到CYP2D6表达的几乎相同或相当的水平。
[0424] 若干其他组已经示出，hESC源性种群中的特定转录因子的强迫表达单独或连同与32-34
Swiss 3T3细胞共培养可以促进成熟，该成熟导致表达关键代谢酶 的细胞的生成。然而，这种方法的主要缺点是对于每个实验需要病毒转导和使得这些操作(包括感染效率差和建立适当表达水平的有效转录因子的差别)的变化。当与原代肝细胞相比时，通过这种方法生成的hESC源性种群中的表达水平比原代肝细胞中发现的低得多。
Swiss 3T3细胞共培养可以促进成熟，该成熟导致表达关键代谢酶 的细胞的生成。然而，这种方法的主要缺点是对于每个实验需要病毒转导和使得这些操作(包括感染效率差和建立适当表达水平的有效转录因子的差别)的变化。当与原代肝细胞相比时，通过这种方法生成的hESC源性种群中的表达水平比原代肝细胞中发现的低得多。
[0425] 在此，提供了对调节成熟的通路的深刻理解。也表明，3D聚集和cAMP信号传导的组合在成肝细胞的成熟中起着关键作用。此外，内胚层诱导之后的激活素/nodal信号传导对于肝祖细胞群的最佳生成是必要的，并且富集的祖细胞群对于成熟种群的分离是有用的。这三个不同步骤的组合例如导致肝细胞样细胞的生成，该肝细胞样细胞显示与原代成人肝细胞中发现的那些类似的表达谱和功能性代谢酶的水平。
[0426] CXCR4+C-KIT+种群内的持续的激活素/nodal信号传导对成熟肝细胞的生成有用的观察突出早期细胞的适当操作对高效地生成成熟细胞的重要性。在分化的第6天和第8天之间(对于HES2细胞)的延长的激活素/nodal信号传导的效果影响基因表达模式和在培养的第26天检测到的白蛋白阳性细胞的比例。此步骤也促进肝细胞的种群的发育，响应于cAMP，成熟以产生代谢功能性肝细胞。这个额外的信号传导步骤不补偿差内胚层诱导，由于第6天的EB靶种群包括大于95％的CXCR4+CKIT+EPCAM+SOX17+细胞。相反，不被理论所束缚，这似乎减少污染中胚层衍生物(CD90+和CD31+细胞)，可能是由于激活素不能诱导这些谱系或促进它们在不存在BMP或FGF下存活。除了减少中胚层污染，额外的激活素培养35，
步骤也可以在适当地模式化内胚层至腹侧前肠内命运中发挥作用，因为该通路在肠道管
36
的前-后模式化中发挥作用是已知的。先前表明，持续的激活素/nodal信号传导也影响
18
来自hESC的胰腺发育 。
步骤也可以在适当地模式化内胚层至腹侧前肠内命运中发挥作用，因为该通路在肠道管
36
的前-后模式化中发挥作用是已知的。先前表明，持续的激活素/nodal信号传导也影响
18
来自hESC的胰腺发育 。
[0427] 在特定实施例中，方案的成熟阶段包括两个不同但相互依存的步骤。第一个是3D聚集体的生成。先前的研究示出，3D培养可以提高肝细胞存活以及小鼠和人的原代胎儿肝24，37，38
细胞 的成熟。最近，Miki等人报告说，在灌注生物反应器中的3D培养可以提高hESC源性肝细胞的分化，表明3D环境对于细胞的成熟可能是重要的。然而，这些差异的幅度难以解释，因为未与胎儿和成人肝脏对照进行比较。本研究已扩展了这些发现以示出，静态3D格式的培养促进分化，如由诸如ALB、CPS1、G6P和TDO的关键肝基因的表达的显著增加和由表达ASGPR1、成熟的肝细胞中发现的受体的细胞的比例的显著增加所展示的。聚集体内的成熟对于cAMP响应性也是重要的，因为诸如CYP1A2和CYP3A4的基因在2D培养中未诱导。聚集促进成熟的机制目前尚不清楚，但不被理论束缚，这可能与增强的细胞相互作用和可能的3D结构内的极化的上皮细胞的生成、模仿、肝脏内的肝细胞的一定程度的细胞形态有关。
细胞 的成熟。最近，Miki等人报告说，在灌注生物反应器中的3D培养可以提高hESC源性肝细胞的分化，表明3D环境对于细胞的成熟可能是重要的。然而，这些差异的幅度难以解释，因为未与胎儿和成人肝脏对照进行比较。本研究已扩展了这些发现以示出，静态3D格式的培养促进分化，如由诸如ALB、CPS1、G6P和TDO的关键肝基因的表达的显著增加和由表达ASGPR1、成熟的肝细胞中发现的受体的细胞的比例的显著增加所展示的。聚集体内的成熟对于cAMP响应性也是重要的，因为诸如CYP1A2和CYP3A4的基因在2D培养中未诱导。聚集促进成熟的机制目前尚不清楚，但不被理论束缚，这可能与增强的细胞相互作用和可能的3D结构内的极化的上皮细胞的生成、模仿、肝脏内的肝细胞的一定程度的细胞形态有关。
[0428] 成熟策略的第二个步骤是任选地通过添加细胞渗透性和更缓慢水解的cAMP类似物8-Br-cAMP激活3D聚集体内的cAMP通路。肝脏内的特定基因(包括PGC1-α、TAT和25，39，40
G6P)包含它们的启动子区域中的CREB元件并且因此是cAMP信号传导的直接靶标 。
鉴于此，这些靶基因在2D单层以及3D聚集体中诱导。PCR和微阵列分析清楚地表明，cAMP信号传导的作用超出靶基因的诱导，因为诱导的通路的激活改变与肝细胞功能的不同方面相关的基因表达模式，肝细胞功能的不同方面包括药物代谢、线粒体生物合成、脂质合成和葡萄糖代谢。这些全局变化支持这一解释：cAMP信号传导促进成肝细胞的成熟。不需要持续的cAMP信号传导来保持升高的表达水平的事实进一步支持这个解释：效果是成熟之一并且不是特定基因的表达的简单的诱导和维持。观察到的表达中的一些最显着的变化是，检测到的包括CYP1A2、CYP3A4和UGT1A1的主要药物代谢酶的水平高达或高于在原代人肝细胞中发现的那些。转录水平指示功能，如HES2源性细胞显示的功能酶的水平与原代肝细胞的水平相当。诱导的类似的模式在来自两个hESC细胞系和一个hiPSC细胞系的肝细胞样细胞中观察到，表明该成熟策略是广泛适用的。
G6P)包含它们的启动子区域中的CREB元件并且因此是cAMP信号传导的直接靶标 。
鉴于此，这些靶基因在2D单层以及3D聚集体中诱导。PCR和微阵列分析清楚地表明，cAMP信号传导的作用超出靶基因的诱导，因为诱导的通路的激活改变与肝细胞功能的不同方面相关的基因表达模式，肝细胞功能的不同方面包括药物代谢、线粒体生物合成、脂质合成和葡萄糖代谢。这些全局变化支持这一解释：cAMP信号传导促进成肝细胞的成熟。不需要持续的cAMP信号传导来保持升高的表达水平的事实进一步支持这个解释：效果是成熟之一并且不是特定基因的表达的简单的诱导和维持。观察到的表达中的一些最显着的变化是，检测到的包括CYP1A2、CYP3A4和UGT1A1的主要药物代谢酶的水平高达或高于在原代人肝细胞中发现的那些。转录水平指示功能，如HES2源性细胞显示的功能酶的水平与原代肝细胞的水平相当。诱导的类似的模式在来自两个hESC细胞系和一个hiPSC细胞系的肝细胞样细胞中观察到，表明该成熟策略是广泛适用的。
[0429] 诸如胰岛素和胰高血糖素的内分泌激素可以影响成人肝脏中的cAMP水平，cAMP水平具有对葡萄糖代谢的急性效应以及通过调节基因表达的慢性效应。在禁食的条件下，41，42
cAMP水平的上调导致糖异生涉及的PGC1-α和基因的快速诱导，从而确保能量供应 。除
43
了禁食的条件外，已经报道PGC1-α的表达在小鼠肝脏中在出生之后一天显著上调 。此上调被认为是快速促进新生儿肝细胞的成熟。不被理论所限制，通过PGC-1α表达的上调，cAMP信号传导对hESC源性成肝细胞的影响可能在一定程度上重现，在禁食期间在肝脏中和/或在出生时在肝细胞谱系中观察到的改变导致显示成熟细胞的许多特性的细胞的生成。
cAMP水平的上调导致糖异生涉及的PGC1-α和基因的快速诱导，从而确保能量供应 。除
43
了禁食的条件外，已经报道PGC1-α的表达在小鼠肝脏中在出生之后一天显著上调 。此上调被认为是快速促进新生儿肝细胞的成熟。不被理论所限制，通过PGC-1α表达的上调，cAMP信号传导对hESC源性成肝细胞的影响可能在一定程度上重现，在禁食期间在肝脏中和/或在出生时在肝细胞谱系中观察到的改变导致显示成熟细胞的许多特性的细胞的生成。
[0430] 总之，发明人首次限定了促进来自hPSC的肝细胞谱系细胞的成熟的步骤，导致细胞(显示基因表达轮廓类似于原代人肝细胞的那些)的生成。代谢功能细胞的发育是重要的终点，因为它表明，这些进步将使hPSC源性肝细胞样细胞的常规生产能够用于制药工业中的药物代谢分析。cAMP诱导的细胞也提供了用于生物人工肝脏装置的发展并最终用于治疗肝脏疾病的细胞替代疗法的移植的理想的候选种群。
[0431] 材料和方法：
[0432] HPSC培养和分化
[0433] HPSC维持在hESC培养基中的照射小鼠胚胎饲养层细胞上，hESC培养基包括如先44
前描述的补充有20％的敲除血清替代品(KSR)的DEME/F12的(50:50；Gibco) 。在生成胚TM
状体(EB)之前，将hESC传代到Matrigel 包被的板1天以耗尽饲养细胞的种群。在这个
44,45
阶段，hESC由0.25％胰蛋白酶-EDTA解离，以生成如先前描述的集群 以及然后在存在BMP4(3ng/ml)的无血清分化(SFD)培养基中培养24小时(第0天至第1天)。在第1天，收集EB和在包括 的诱导培养基A中再培养3天， 补充有
谷氨酰胺(2mM:)、抗坏血酸(50pg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10-4M；Sigma)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；2.5ng/ml)、激活素A(100ng/ml)、Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(0.25ng/ml)。在第4天，收集EB并在 中再培养EB， 补充有bFGF(10ng/
ml)、激活素A(100ng/ml)、Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(0.25ng/ml)(培养基B)。EB在第6天TM 5
收集，解离为单个细胞并且在Matrigel 包被的12孔板上以4×10 个细胞的浓度培养细胞2天，培养基中无WNT3A，并且激活素A的浓度为50ng/ml。在第8天，培养基B替换为包括Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)的肝特化培养基，IMDM补充有1％体积/体积的B27添加剂(Invitrogen：A11576SA)，抗坏血酸、MTG、FGF10(50ng/ml)(从第8天至第10天)、bFGF(20ng/ml)(从第10天至第14天)和BMP4(50ng/ml)。从第8天至第14
天，每2天更换培养基。为了促进HES2源性肝细胞的成熟，将它们在成熟培养基A中培养
12天。成熟培养基A由IMDM组成，IMDM有1％体积/体积B27补充物、抗坏血酸、谷氨酰胺、MTG、肝细胞生长因子(HGF)(20ng/ml)、地塞米松(40ng/ml)和抑瘤素M(20ng/ml)。在培养的第26天从种群生成聚集体。为了生成聚集体，用胶原酶和TrypleLE解离细胞，然后
5
在六孔超低集群板以每孔6×10个细胞的浓度在成熟培养基A中培养，成熟培养基A补充有Rho激酶抑制剂和0.1％BSA。聚集体维持在这些条件下，直到第32天，其中每3天更换培养基。在第32天，将培养基改变为成熟培养基B，成熟培养基B由不含EGF的肝细胞培养基(HCM)(Lonza：CC-4182)组成。在这个阶段加入10mM 8-Br-cAMP(Biolab：B007)。每
3天更换培养基。为了从H9、H1和IPS细胞生成肝细胞样细胞，对肝特化培养基进行了以下改变。bFGF的浓度增加至40ng/ml，并且从第8天至第14天基础培养基从IMDM切换到H16DMEM进行培养，然后从第14天至第20天切换至H16DMEM与25％的Ham‘s F12。IMDM置换为H21DMEM与25％的Ham‘s F12和0.1％BSA，从第20至第32天使用的成熟培养基A。所有的细胞因子是人的，并且从R&D Systems公司购买，除非另有说明。EB和单层培养物保持在5％CO2、5％O2、90％N2环境中。聚合培养物保持在5％CO2的周围空气环境。
前描述的补充有20％的敲除血清替代品(KSR)的DEME/F12的(50:50；Gibco) 。在生成胚TM
状体(EB)之前，将hESC传代到Matrigel 包被的板1天以耗尽饲养细胞的种群。在这个
44,45
阶段，hESC由0.25％胰蛋白酶-EDTA解离，以生成如先前描述的集群 以及然后在存在BMP4(3ng/ml)的无血清分化(SFD)培养基中培养24小时(第0天至第1天)。在第1天，收集EB和在包括 的诱导培养基A中再培养3天， 补充有
谷氨酰胺(2mM:)、抗坏血酸(50pg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10-4M；Sigma)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；2.5ng/ml)、激活素A(100ng/ml)、Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(0.25ng/ml)。在第4天，收集EB并在 中再培养EB， 补充有bFGF(10ng/
ml)、激活素A(100ng/ml)、Wnt3a(25ng/ml)和BMP4(0.25ng/ml)(培养基B)。EB在第6天TM 5
收集，解离为单个细胞并且在Matrigel 包被的12孔板上以4×10 个细胞的浓度培养细胞2天，培养基中无WNT3A，并且激活素A的浓度为50ng/ml。在第8天，培养基B替换为包括Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)的肝特化培养基，IMDM补充有1％体积/体积的B27添加剂(Invitrogen：A11576SA)，抗坏血酸、MTG、FGF10(50ng/ml)(从第8天至第10天)、bFGF(20ng/ml)(从第10天至第14天)和BMP4(50ng/ml)。从第8天至第14
天，每2天更换培养基。为了促进HES2源性肝细胞的成熟，将它们在成熟培养基A中培养
12天。成熟培养基A由IMDM组成，IMDM有1％体积/体积B27补充物、抗坏血酸、谷氨酰胺、MTG、肝细胞生长因子(HGF)(20ng/ml)、地塞米松(40ng/ml)和抑瘤素M(20ng/ml)。在培养的第26天从种群生成聚集体。为了生成聚集体，用胶原酶和TrypleLE解离细胞，然后
5
在六孔超低集群板以每孔6×10个细胞的浓度在成熟培养基A中培养，成熟培养基A补充有Rho激酶抑制剂和0.1％BSA。聚集体维持在这些条件下，直到第32天，其中每3天更换培养基。在第32天，将培养基改变为成熟培养基B，成熟培养基B由不含EGF的肝细胞培养基(HCM)(Lonza：CC-4182)组成。在这个阶段加入10mM 8-Br-cAMP(Biolab：B007)。每
3天更换培养基。为了从H9、H1和IPS细胞生成肝细胞样细胞，对肝特化培养基进行了以下改变。bFGF的浓度增加至40ng/ml，并且从第8天至第14天基础培养基从IMDM切换到H16DMEM进行培养，然后从第14天至第20天切换至H16DMEM与25％的Ham‘s F12。IMDM置换为H21DMEM与25％的Ham‘s F12和0.1％BSA，从第20至第32天使用的成熟培养基A。所有的细胞因子是人的，并且从R&D Systems公司购买，除非另有说明。EB和单层培养物保持在5％CO2、5％O2、90％N2环境中。聚合培养物保持在5％CO2的周围空气环境。
[0434] 流式细胞术45
[0435] 流式细胞分析如先前描述那样进行 。对于细胞表面标记物，在具有10％FCS的PBS中进行染色。对于细胞内蛋白质，在PBS中对用4％多聚甲醛固定的细胞(电子显微镜科学，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州，美国)染色。将细胞用90％冰冷甲醇透化20分钟，用于45
如先前描述的SOX17和FOXA2染色 。在PBS中用10％FCS和0.5％皂苷(Sigma)实施白蛋白和甲胎蛋白染色。使用LSRII流式细胞仪(BD)分析染色的细胞。
如先前描述的SOX17和FOXA2染色 。在PBS中用10％FCS和0.5％皂苷(Sigma)实施白蛋白和甲胎蛋白染色。使用LSRII流式细胞仪(BD)分析染色的细胞。
[0436] 免疫染色45
[0437] 如先前描述 地进行免疫染色。在37℃下用4％PFA将细胞固定在培养孔中15分钟，用DPBS(具有氯化钙和氯化镁)+0.1％BSA洗涤三次，然后在具有0.2％的Triton-X100的洗涤缓冲液中透化20分钟。在DPBS(具有氯化钙和氯化镁)+0.1％BSA中额外洗涤3次之后，在室温下用蛋白封闭液(DAKO；X0909)封闭细胞20分钟。为了评价白蛋白和甲胎蛋白阳性细胞，在室温下用山羊抗ALB抗体(Bethyl)或兔抗AFP抗体(DAKO)染色细胞1小时。同型对照的浓度匹配一抗。为了显现信号，随后在室温下用驴抗山羊Alexa 488抗体(Invitrogen)或驴抗兔Cy3抗体(Jackson免疫研究)孵育细胞1小时。对于SOX17染色，如上所述地固定、透化和封闭细胞。在4℃下用山羊抗SOX17(R&D)孵育细胞过夜。通过用驴抗山羊的Alexa488(Invitrogen)孵育细胞使信号可视化。对于ASGPR-1染色，在TMMatrigel 包被的盖玻板上培养聚集物1天。在附着和扩散之后，在37℃下用4％PFA固定细胞15分钟，然后用冷100％甲醇透化10分钟。如上所述地洗涤和封闭细胞。在4℃下用山羊抗ASGPR-1(Santa Cruz)孵育固定的细胞过夜，然后在室温下用兔抗ALB(DAKO)孵育固定的细胞1小时。通过用驴抗山羊Alexa488抗体和驴抗兔CY3抗体孵育使信号可视化。在DPBS+2％BSA+0.05％Triton-X100中稀释一抗和二抗。利用DAPI(Invitrogen)的金抗荧光淬灭用于复染细胞核。使用荧光显微镜(Leica CTR6000)和使用莱
卡应用套装软件捕获的图像使染色的细胞可视化。
卡应用套装软件捕获的图像使染色的细胞可视化。
[0438] 定量实时PCR
[0439] 用 微型 试剂盒(Ambion)制 备总RNA，并 且用无RNA 酶的DNA酶(Ambion)处 理 总RNA。500ng至1μg的RNA 使用 随 机六 聚 体和 寡 聚(dT)与 逆转录酶(Invitrogen)逆转录成cDNA。如先前描述
的45，使 用 QuentiFast SYBR Green PCR试 剂 盒 (Quiagen)对 ep
realplex(Eppendorf)实施定量PCR。表达水平标准化为管家基因TATA盒结合蛋白(TBP)。
为了测量UGT1A1的表达，使用相对于8-Br-cAMP(-)处理细胞的水平的delta-delta CT方法评估相关基因的表达。总的人类成人和胎儿肝脏RNA从Clontech公司购入。两种原代肝细胞的RNA样品由Dr Stephen C.Strom(匹兹堡大学)提供，和第三样品从Zenbio(批号：
2199)购得。两个原代肝细胞样品培养2天和收集。一个(HH1892)从1岁的白人男性分离，而另一个(HH1901)从14个月大的男性分离，植肝是由于胆汁淤积。第三个样品(Zenbio：
批号2199)从48岁的男性白人器官捐献者分离。
的45，使 用 QuentiFast SYBR Green PCR试 剂 盒 (Quiagen)对 ep
realplex(Eppendorf)实施定量PCR。表达水平标准化为管家基因TATA盒结合蛋白(TBP)。
为了测量UGT1A1的表达，使用相对于8-Br-cAMP(-)处理细胞的水平的delta-delta CT方法评估相关基因的表达。总的人类成人和胎儿肝脏RNA从Clontech公司购入。两种原代肝细胞的RNA样品由Dr Stephen C.Strom(匹兹堡大学)提供，和第三样品从Zenbio(批号：
2199)购得。两个原代肝细胞样品培养2天和收集。一个(HH1892)从1岁的白人男性分离，而另一个(HH1901)从14个月大的男性分离，植肝是由于胆汁淤积。第三个样品(Zenbio：
批号2199)从48岁的男性白人器官捐献者分离。
[0440] 肝聚集体的吲哚花青绿摄取
[0441] 吲哚花青绿(ICG，Sigma)溶液以HCM(Lonza)中的最终浓度1mg/mL的ICG添加到细胞。在37℃下孵育细胞1小时，用PBS洗涤3次，然后用倒置显微镜(Leica)检查。
[0442] 通过HPLC的药物代谢分析
[0443] 肝聚集物在含有CYP1A2底物非那西丁(200μM)、CYP2B6底物安非他酮(900μM)、NAT1/2底物磺胺二甲嘧啶(SMZ)(500μM)或总UGT底物4-甲基伞形酮(4-MU)(200μM)的HCM中孵育24或48小时。孵育之后，收集培养基的等分，并且使用单独优化的高效液相色46
谱测定法定量代谢物的水平。基于Loboz等人的HPLC方法 测定羟基安非他酮水平。通
47
过如先前描述 的高效液相色谱法与串联质谱法一起测量4-MU葡糖苷酸。冷冻保存的肝
4
细胞解冻并以每孔1×10个细胞的密度接种在胶原的培养皿上24或48小时。在培养24或48小时之后，收集上清液，并且测量CYP1A2、CYP2B6、NAT1/2和总UGT的活性。
谱测定法定量代谢物的水平。基于Loboz等人的HPLC方法 测定羟基安非他酮水平。通
47
过如先前描述 的高效液相色谱法与串联质谱法一起测量4-MU葡糖苷酸。冷冻保存的肝
4
细胞解冻并以每孔1×10个细胞的密度接种在胶原的培养皿上24或48小时。在培养24或48小时之后，收集上清液，并且测量CYP1A2、CYP2B6、NAT1/2和总UGT的活性。
[0444] 芯片处理和数据分析
[0445] 在大学健康网络基因组学中心遵循标准Affymetrix公司的运行准则，在Affymetrix人类基因ST V1.0芯片上运行RNA样品。简言之，对于每个样品，将300ng的总RNA的起始材料用作Ambion公司WT表达试剂盒的输入。2.7微克扩增的cDNA然后片段化、标记和杂交至Affymetrix人类基因ST 1.0芯片18小时(45℃，在60RPM)。使用基因芯片射流站P450流体工作台洗涤阵列，并且用Affymetrix基因芯片扫描仪7G扫描阵列。在扫描之后，检查每个芯片，并且发现通过Affymetrix质量控制指南。原始CEL文件导入到Genspring软件(Agilent，v11.5.1)，并且使用基于HuGene-1_0-st0v1_na31_hg19_2010-09-03的ExonRMA16算法总结探针水平数据。此外，每个基因标准化为所有考虑的样品中的中间值。在Log2转换数据上实施所有统计。总共28869转录子表示该阵列上。
[0446] 作为第一步骤，过滤转录子以去除那些在所有3个样本组中测量的表达的百分位数始终在第20以下的那些。利用平均连接规则下的皮尔森中心距离的无监督层次集群分析用于解决样品和组之间的总体相似性和差异。3个样本组之间的定向统计分析采用48
ANOVA与Benjamini和霍赫贝格错误发现率(FDR，q<0.05) 进行。为了查找具有生物学意义的差异表达的转录子的集合，使用校正的Benjamini和Yuketieli超几何测试在q<0.1
49
的显著水平 进行基因本体(GO)分析。更具体地检查特定转录子的两个先验定义的集合：
涉及到感兴趣的特定肝脏相关的活性的转录子；以及发现被表达并且基于来自HOMER数据
55
库 的公开资料的肝特化的转录子。
ANOVA与Benjamini和霍赫贝格错误发现率(FDR，q<0.05) 进行。为了查找具有生物学意义的差异表达的转录子的集合，使用校正的Benjamini和Yuketieli超几何测试在q<0.1
49
的显著水平 进行基因本体(GO)分析。更具体地检查特定转录子的两个先验定义的集合：
涉及到感兴趣的特定肝脏相关的活性的转录子；以及发现被表达并且基于来自HOMER数据
55
库 的公开资料的肝特化的转录子。
[0447] 实例2
[0448] CHIR99021是已报道以模仿经典Wnt信号通路的GSK3的选择性抑制剂。CHIR99021在诱导胚状体和用于来自hPSC的定形内胚层的单层诱导中作为wnt3a(例如，与激活素组合添加)的替换进行测试。如见图8a)和图8b)，使用CHIR99021替换Wnt3a诱导的CKIT+CXCR4+和CXCR4+EPCAM+细胞的比例大于种群的95％以及相当于激活素/wnt3a诱导中看见的。
[0449] 图8(a)和图8(b)展示出，CHIR99021可以诱导定形内胚层细胞。图8(a)是流式细胞分析，流式细胞分析示出利用激活素/wnt3a的胚状体诱导的第6天激活素/CHIR99021中的CXCR4+、CKIT+和EPCAM+细胞的比例。图8(b)是示出第6天激活素/CHIR99021中的CXCR4+、CKIT+和EPCAM+细胞的比例的流式细胞分析。图8(c)和图8(d)示出用(c)激活素/wnt3a或(d)激活素/CHIR99021的单层诱导的第7天。
[0450] 方法
[0451] 利用GSK3β抑制剂诱导定形内胚层
[0452] 对于EB诱导，CHIR99021(0.3μM)替换Wnt3a用于内胚层诱导。
[0453] 对于单层诱导，HPSC维持在hESC培养基中的辐照的小鼠胚胎饲养细胞上，hESC培养基包括如先前所述(Kennedy等，2007)的补充有20％敲除血清替代品(KSR)的DEME/F12(50:50：Gibco)。在单层培养物中诱导内胚层之前，hESC传代到基质胶包被的表面(通常为12孔板)1天。在第0天，在RPMI基培养基中培养细胞，RPMI基培养基补充有谷氨酰胺-4(2mM)、MTG(4.5×10 M：Sigma)、激活素A(100ng/ml)、CHIR99021(0.3μM)或Wnt3a(25ng/ml)。从第1天到第3天，每天用RPMI更换培养基，RPMI补充有谷氨酰胺(2mM:)、抗坏血酸-4
(50pg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；5ng/ml)、激活素A(100ng/ml)。从第3至第5天，在SFD基培养基中培养细胞，SFD基培养基补充有谷-4
氨酰胺(2mM:)、抗坏血酸(50pg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；5ng/ml)、激活素A(100ng/ml)。每隔一天更换培养基。如上所述，通过用FGF、BMP通路激动剂处理，在第7天，定形内胚层特化至肝命运。
(50pg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；5ng/ml)、激活素A(100ng/ml)。从第3至第5天，在SFD基培养基中培养细胞，SFD基培养基补充有谷-4
氨酰胺(2mM:)、抗坏血酸(50pg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；5ng/ml)、激活素A(100ng/ml)。每隔一天更换培养基。如上所述，通过用FGF、BMP通路激动剂处理，在第7天，定形内胚层特化至肝命运。
[0454] 实例3
[0455] NSG小鼠中的异位肝组织
[0456] 移植的hESC源性肝细胞植入并且生成表达肝细胞分化标记物的细胞。
[0457] 图8(e)、图8(f)和图8(g)展示了使用实例1中描述的方法制备的ES源性肝细胞的植入，除了GSK3抑制剂CHIR99021用于制作实例2中所述的移植的细胞。
[0458] 图8(e)、图8(f)和图(g)、图8(h)NSG小鼠中的异位肝组织。图8(e)是肠系膜区域的H&E染色的示范显微照片，示出了移植之后2个月的hESC源性肝细胞(箭头)的集群。放大倍数为5倍。肠(箭头)、植入细胞(箭头的头)。图8(f)示出来自图8(e)的H&E染色部分的高放大倍数(10×)的显微照片。
[0459] 图8(g)、图8(h)的免疫组织化学染色示出了移植后2个月的肠系膜区域中的hESC源性细胞的存在。用于人白蛋白(Alexa488：绿色)(示出为箭头)和CK19(Cy3：红)(示出为箭头的头)的双染示出，移植的细胞具有分化成肝细胞和胆管细胞谱系的潜力。hESC源性肝细胞样细胞观察为白蛋白阳性细胞(箭头)，而胆管细胞样细胞表达CK19和被发现在导管状结构(箭头的头)中。
[0460] 方法
[0461] NSG小鼠中的异位肝组织
[0462] 六周龄NSG小鼠从杰克逊实验室(巴尔港，缅因州，美国)获得以及存放在UHN动物设施处。聚集体(第27天)包括hESC源性肝祖细胞(成肝细胞)，并且hESC源性CD34+内皮细胞悬浮在50μl的基质胶(BD生物科学)中，并保持在冰上直到移植。受体小鼠用1-3％异氟醚进行麻醉并且剖腹。肠系膜区域被暴露，并且将具有基质胶的细胞混合物定位在肠系膜区域和用可吸收止血剂Surgicel(Ethicon360，美国)覆盖。移植之后两个月，处死小鼠并且通过组织学分析评估hESC源性细胞的存在。
[0463] 实例4
[0464] 与Wnt/p-连环蛋白通路相关的小分子可以扩增肝祖细胞。第27天的肝祖细胞4
(H9)被解离并且以每孔1×10个细胞的密度接种在96孔基质胶包被的器皿上。细胞用不同浓度的CHIR99021(0.3μM、1μM和3μM)处理并且培养9天。与没有处理的第27天的细胞数相比，通过计数细胞数检查肝祖细胞的比例的增加(图9a)。
(H9)被解离并且以每孔1×10个细胞的密度接种在96孔基质胶包被的器皿上。细胞用不同浓度的CHIR99021(0.3μM、1μM和3μM)处理并且培养9天。与没有处理的第27天的细胞数相比，通过计数细胞数检查肝祖细胞的比例的增加(图9a)。
[0465] Wnt和MEK/ERK通路的抑制可以增加与阶段I药物代谢酶相关的基因的表达。
[0466] 用小分子培养的第44天3D肝脏聚集中的CYP3A4的基因表达与Wnt/β-连环蛋白信号(XAV939：1μM)和MEK/Erk信号(PD0325901：1μM)的抑制相关。连同8-Br-cAMP，Wnt和MEK/Erk信号的抑制对增加CYP3A4的基因表达有影响(图9d)。
[0467] 用小分子培养的第44天3D肝脏聚集中的CYP1A2的基因表达与Wnt/β-连环蛋白信号(XAV939：1μM)和MEK/Erk信号(PD032590：1μM)的抑制相关。连同8-Br-cAMP，Wnt和MEK/Erk信号的抑制对增加CYP1A2的基因表达有影响(图9d)。
[0468] 培养在若干不同的细胞外基质(ECM)上的第26天肝细胞样细胞的ALB的基因表5
达。如上所述的第26天的来自胚状体(EB)的内胚层细胞解离并且以4×10个细胞的细胞密度接种在ECM上，并且在肝特化和成熟培养基中培养。从第26天的细胞提取总RNA，并且测量白蛋白表达的水平。与明胶包被的培养条件相比，由倍数差异确定表达水平(图9f)。
达。如上所述的第26天的来自胚状体(EB)的内胚层细胞解离并且以4×10个细胞的细胞密度接种在ECM上，并且在肝特化和成熟培养基中培养。从第26天的细胞提取总RNA，并且测量白蛋白表达的水平。与明胶包被的培养条件相比，由倍数差异确定表达水平(图9f)。
[0469] 方法
[0470] 用GSK3β抑制剂诱导定形内胚层。
[0471] 对于EB诱导，CHIR99021(0.3μM)在内胚层诱导期间代替Wnt3a。
[0472] 对于单层诱导，HPSC维持在hESC培养基中的辐照的小鼠胚胎饲养细胞上，hESC培养基包括如先前所述(Kennedy等人，2007)的补充有20％敲除血清替代品(KSR)的DEME/F12(50:50：Gibco)。在单层培养物中诱导内胚层之前，hESC传代到12孔基质胶包被的平板1天。在第0天，将细胞在RPMI基培养基中，RPMI基培养基补充有谷氨酰胺(2mM)、-4MTG(4.5×10 M：Sigma)、激活素A(100ng/ml)、CHIR99021(0.3μM)或Wnt3a(25ng/ml)。
从第1天至第3天，每天更换包括RPMI的培养基，RPMI补充有谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸-4
(50μg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；5ng/ml)、激活素A(100ng/ml)。在第3天、第5天，将细胞培养在SFD基培养基中，SFD基培养基补充有-4
谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸(50μg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；5ng/ml)、激活素A(100ng/ml)。每隔一天更换培养基。在第7天，定形内胚层细胞开始如上所述用肝特化培养基分化。
从第1天至第3天，每天更换包括RPMI的培养基，RPMI补充有谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸-4
(50μg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；5ng/ml)、激活素A(100ng/ml)。在第3天、第5天，将细胞培养在SFD基培养基中，SFD基培养基补充有-4
谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸(50μg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；5ng/ml)、激活素A(100ng/ml)。每隔一天更换培养基。在第7天，定形内胚层细胞开始如上所述用肝特化培养基分化。
[0473] 实例5
[0474] 用cAMP处理诱导细胞聚集体的成熟
[0475] 如实例1中生成细胞聚集体。
[0476] 细胞聚集体培养在HGF、Dex和OSM中，直到第32天，此时添加cAMP。当添加cAMP类似物和/或cAMP激动剂时，去除OSM。在一些实验中，当添加cAMP类似物和/或cAMP激动剂时，也从培养物中去除HGF。在其他实验中，当添加cAMP时添加10ng/ml的HGF(从20ng/ml减小)示出为促进聚集体的存活。
[0477] 不被理论所束缚，据信，保持OSM对阶段1CYP酶的表达的诱导有抑制作用，特别是CYP3A4。
[0478] 实例6
[0479] 肝祖细胞中的Notch信号传导通路影响胆管细胞谱系的分化
[0480] 为了探讨胆管细胞样细胞的分化，H9源性第27天肝祖细胞在20ng/ml的HGF和50ng/ml的EGF的存在下与OP9细胞(Notch信号传导供体)共培养。如实例1中得到H9源性第27天肝祖细胞。当肝祖细胞从OP-9细胞接收Notch信号传导激活时，白蛋白阳性细胞被完全减弱，并且变成了具有组织分支外观的CK19阳性细胞(图10a，图10b)。相反，当用γ分泌酶抑制剂(GSI)L-685、458(10μM；Tocris)抑制共培养的细胞中的Notch信号传导时，发现白蛋白和CK-19阳性细胞(图10b)。
[0481] 此外，在存在或不存在GSI下的共培养的细胞的H&E部分表明，在GSI的存在下，保持嵌合聚集。在没有GSI处理的情况下，细胞排列成含有内腔的上皮导管样结构(图10a)。
[0482] 如图10b所示，第36天并且在不存在GSI下的OP9共培养中的CK19和囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的增加的表达。示出的值相对于GSI的存在下培养的细胞。当通过在GSI的存在下培养而使Notch信号传导失活时，看到白蛋白的表达，展示出细胞保留成肝细胞的特征。
[0483] 最后，与2D培养相比，肝祖细胞与OP9细胞的3D共培养导致第36天的CFTR的增加的表达(图10c)。
[0484] 以上描述的实验表明，形成胆状结构的胆管细胞样细胞可以通过激活Notch信号传导从H9-源性肝祖细胞诱导(例如，通过与OP9、OP9delta和/或OP9Jagged1细胞共培养)。功能性胆管细胞的CFTR、标记物在3D凝胶共培养物中的表达比2D培养物中更高，示出环境也可以影响胆管细胞成熟。
[0485] 实例7
[0486] 示例性成熟培养基配方
[0487] 对于从第14天(EB)/第13天单层至第26天(EB)/第25天(单层)的HES2细胞系
[0488] 基础培养基：
[0489] IMDM，1％体积/体积B27添加剂、谷氨酰胺(2mM:)、抗坏血酸(50μg/ml；Sigma)、-4MTG(4.5×10 M；Sigma)
[0490] 细胞因子和生长因子：
[0491] 肝细胞生长因子(HGF)(20ng/ml)、地塞米松(Dex)(40ng/ml)和抑瘤素M(20ng/ml)。
[0492] 对于从第14天(EB)/第13天单层至第20天(EB)/第19天(单层)的H9和iPS细胞系
[0493] 基础培养基：
[0494] H16/Ham’s F12(75％/25％)、1％体积/体积B27补充物、谷氨酰胺(2mM:)、抗坏-4血酸(50pg/ml的；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)
[0495] 细胞因子和生长因子：
[0496] 肝细胞生长因子(HGF)(20ng/ml)、地塞米松(Dex)(40ng/ml)和抑瘤素M(20ng/ml)。
[0497] 从第20天(EB)/第19天单层至第26天(EB)/第25天(单层)
[0498] 基础培养基：
[0499] H21/Ham’s F12(75％/25％)、1％体积/体积B27补充物、谷氨酰胺(2mM:)、抗坏-4血酸(50μg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)
[0500] 细胞因子和生长因子：
[0501] 肝细胞生长因子(HGF)(20ng/ml)、地塞米松(Dex)(40ng/ml)和抑瘤素M(20ng/ml)。
[0502] 聚集阶段
[0503] 从第26天/第25天至第32天/第31天
[0504] 基础培养基：
[0505] IMDM或H21/Ham’s F12(75％/25％)、1％体积/体积B27补充物、谷氨酰胺-4(2mM:)、抗坏血酸(50μg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)、Rho激酶抑制剂(10μM)和
0.1％BSA中。
0.1％BSA中。
[0506] 细胞因子和生长因子：
[0507] 肝细胞生长因子(HGF)(20ng/ml)、地塞米松(Dex)(40ng/ml)和抑瘤素M(20ng/ml)。
[0508] 具有cAMP的聚集阶段
[0509] 从第32天/第31天至第44天/第43天
[0510] 基础培养基：
[0511] 无EGF的肝细胞培养基(HCM)(Lonza：CC-4182)。10mM 8-Br-cAMP(Biolab：B007)、与Wnt/β连环蛋白信号(XAV93：1μM)和MEK/Erk信号(PD032590：1μM)的抑制相关的小分子。
[0512] 胆管细胞成熟培养基
[0513] 基础培养基：
[0514] H21/Ham’s F12(75％/25％)、1％体积/体积B27添加剂、谷氨酰胺(2mM)、抗坏-4血酸(50pg/ml；Sigma)、MTG(4.5×10 M；Sigma)，
[0515] 细胞因子和生长因子：
[0516] 肝细胞生长因子(HGF)(20ng/ml)、表皮生长因子(EGF)(50ng/ml)
[0517] 实例8
[0518] 内皮细胞对hESC源性肝发育的影响。
[0519] 鉴于内皮细胞在肝发育中起重要作用，评估这个谱系对hESC源性肝细胞的生长和/或成熟的影响。对于这些研究，从hESC生成CD34+内皮细胞。对于这些研究，使用HES2hESC细胞系，HES2hESC细胞系设计为表达来自ROSA基因座的红色荧光蛋白(RFP)cDNA，以使我们能够跟踪内皮细胞。通过用BMP4、bFGF和VEGF的组合诱导6天来生成内皮细胞，此时通过FACS分离CD34+细胞(也CD31+和KDR+)。挑选的CD34+细胞在EGM2内皮TM细胞生长培养基中培养6天，然后使用Aggrewells 用于嵌合聚集体的生成。内皮细胞在肝细胞之前2天加入到Aggrewells，以允许它们以包被在孔的底部(图12a)。在这时，在内皮细胞的顶部上添加第25天成肝细胞的单细胞悬浮液，并且混合物在Aggrewells培养
48小时。聚集体随后从Aggrewells去除并且培养额外的6天，此时，收集和分析它们。如图12b所示，与内皮细胞一起培养的聚集体含有RFP+细胞，并且多于单独培养的那些。流式细胞分析显示，RFP+细胞表示大于种群的30％(图12c)，这表明很大数量已与聚集体中的肝细胞整合。qRT-PCR分析示出，培养额外12天的嵌合聚集体比没有内皮细胞的肝聚集体表达基本上更高水平的CYP3A4消息(图12d)。重要的是，这些水平在不添加cAMP的情况下实现，表明内皮细胞可以促进hPSC源性肝细胞的成熟。这些结果表明，与胚胎内皮细胞相互作用影响hESC源性肝细胞的存活和成熟。
48小时。聚集体随后从Aggrewells去除并且培养额外的6天，此时，收集和分析它们。如图12b所示，与内皮细胞一起培养的聚集体含有RFP+细胞，并且多于单独培养的那些。流式细胞分析显示，RFP+细胞表示大于种群的30％(图12c)，这表明很大数量已与聚集体中的肝细胞整合。qRT-PCR分析示出，培养额外12天的嵌合聚集体比没有内皮细胞的肝聚集体表达基本上更高水平的CYP3A4消息(图12d)。重要的是，这些水平在不添加cAMP的情况下实现，表明内皮细胞可以促进hPSC源性肝细胞的成熟。这些结果表明，与胚胎内皮细胞相互作用影响hESC源性肝细胞的存活和成熟。
[0520] 胶原凝胶中的hESC源性肝细胞的成熟。
[0521] 3D聚集、cAMP和PD/XAV的组合确实促进人多能干细胞源性肝细胞的显著分化(图9)，(图9d和图9e)。细胞确实保留AFP和胎儿CYP3A7的一些表达，表明它们可能不完全成熟。为了促进种群的进一步成熟，用cAMP、PD和XAV的组合处理嵌合内皮/肝聚集体。这些聚集体保持在液体培养物或在胶原凝胶中以提供细胞外基质蛋白的来源。如图13所示，当聚集体保持在液体培养物中时，将内皮细胞添加至聚集体(端)不显著影响ALB、CYP3A4、AFP或CYP3A7的表达水平。与此相反，胶原凝胶中的聚集体的培养对AFP和CYP3A7表达有显著影响，因为两者都降低至几乎检测不到的水平，类似于成人肝脏中发现的那些。该发现表明，信号传导通路、细胞相互作用和细胞外环境都在hPSC源性肝细胞的成熟中发挥作用。这表明，有可能生成表达很少AFP(如果有的话)的细胞。这种表达模式表明，这些细胞已经进展到相当于成人肝脏中的肝细胞的阶段。
[0522] 实例9
[0523] 用于从人胚胎和诱导的多能干细胞(多能干细胞；PSC)有效地生成组织特异性细胞类型的方案的发展有助于朝人类发育和疾病的体外模型的建立和设计用于药物发现和预测毒理学的新的平台。包括肝细胞的谱系是特别重要的，因为构成器官的胆道系统的肝细胞以及胆管细胞是药物的不利影响的主要靶标以及遗传和传染病的范围的主要靶标。鉴于肝细胞在药物代谢中的核心作用，迄今的大多数努力已导向来自hPSC的该细胞类型的生成。已经能够开发出促进细胞的生成的阶段化的分化方案，尽管效率低和缺乏代谢功能，但是显示成熟肝细胞的一些特性，包括功能性P450酶的表达。最近的研究已经将这一策略扩展向患者特定诱导的多能干细胞(iPSC)，以及模拟影响肝细胞功能的遗传肝病。
[0524] 涉及胆道的疾病是慢性肝病的常见原因，导致显著的发病率和通常需要整个器官移植以用于确定的管理。诸如囊性纤维化肝和Alagille综合症的单基因胆道疾病的潜在机制仍然不完全了解，而诸如原发性硬化性胆管炎和胆管闭锁的更复杂的胆道疾病缺乏用于理解其病理生理学或用于筛选新的药物试剂的合适的模型。从hPSC生成功能性胆管细胞的能力将实现这些未满足的需求。
[0525] 从hPSC成功得到胆管细胞将取决于准确地模拟分化培养物中的这种谱系的胚胎发育的能力。胆管细胞在胎儿生命的早期发育，并且从称为肝细胞的双电位祖细胞得到，成肝细胞也产生肝细胞谱系。小鼠中的靶向研究已经示出，来自成肝细胞的胆管细胞谱系的特化是Notch依赖的事件，该事件由通过存在于发育门户间充质上的祖细胞和Jagged-1表达的Notch2的相互作用介导的。小儿胆道疾病Alagille综合征是由Notch2或Jagged1引起的发现提供了强有力的证据，该通路也涉及人类的胆管细胞发育。当胆管细胞成熟时，它们组织以形成极化上皮，极化上皮细胞系发育原始腺管结构，原始腺管结构产生胆道。
[0526] 作为来自具有胆道疾病的患者的iPSC的探讨的基础，描述了来自hPSC的功能性胆管细胞的定向分化和成熟的强大的方案。可以诱导hPSC源性胆管细胞以形成表达标记物的上皮囊性结构，该标记物在包括囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的成熟胆管中发现。通过用毛喉素刺激cAMP通路之后的包囊溶胀的调节来展示这些结构中的CFTR功能。从囊性纤维化患者的iPSC生成的包囊示出毛喉素诱导的肿胀测定中的缺陷，该缺陷可以通过添加CFTR校正剂来挽救。共同地，这些发现表明，可能从hPSC生成胆管细胞和胆汁导管状结构以及使用这些衍生的细胞类型以在体外模拟囊性纤维化胆道疾病的各个方面。
[0527] 结果
[0528] hPSC分化培养物中的发育的成肝细胞阶段的表征
[0529] 为了从hPSC生成胆管细胞，有必要首先表征分化培养物中的发育的成肝细胞阶段。对于这些研究，我们使用方案的修改版本(图14a)，该方案开发用于从hPSC生成功能1
性肝细胞 。与我们先前的方法的主要差别是：在单层而不是在3D胚状体(EB)中进行内胚层诱导的步骤。这种变化导致了培养物中的内胚层发育的加速，这是由于通过分化的第3天生成包括大于90％的CXCR4+CKIT+和EPCAM+细胞的种群(图14b)。未检出相当的种群
1
直到EB分化的第五天 。为了将内胚层特化至肝命运，在分化的第7天用bFGF和BMP4的组合处理培养物。
性肝细胞 。与我们先前的方法的主要差别是：在单层而不是在3D胚状体(EB)中进行内胚层诱导的步骤。这种变化导致了培养物中的内胚层发育的加速，这是由于通过分化的第3天生成包括大于90％的CXCR4+CKIT+和EPCAM+细胞的种群(图14b)。未检出相当的种群
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直到EB分化的第五天 。为了将内胚层特化至肝命运，在分化的第7天用bFGF和BMP4的组合处理培养物。
[0530] 胚胎新形成的成肝细胞中的肝发育开始，从腹侧前肠细胞分层并且侵入横膈以形2,3
成肝芽。芽的形成取决于在该过程的早期阶段期间过渡表达的转录因子TBX3 。随着芽扩增，祖细胞下调Tbx3和保持，和/或上调通常在肝和/或胆管细胞谱系中表达的基因的组合的表达(包括白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白19(CK19)、Sox9、NHF6p和NOTCH2)。bFGF/BMP4处理的hESC源性内胚层种群的RT-qPCR分析显示在分化的第13天的TBX3表达的过渡上调，这个时间识别为成肝细胞特化的阶段(图14c)。免疫染色显示，第13天种群中的大多数细胞是TBX3+，表明成肝细胞特化是有效的。SOX9和HNF6B表达的开始与TBX3表达的开始重叠(图14c)。然而，不同于TBX3，这些基因的表达持续升高直至第25天，分析的最后一天。ALB和AFP的表达在第19天上调，并且也在第25天增加。CK19呈双相模式，在第13天和第25天检测到表达的峰值水平。免疫荧光染色和流式细胞分析显示，在分化的第25天的大部分细胞为ALB+、AFP+和CK19+。连同这些发现强烈表明，第
25天种群中的细胞代表发育的扩增的成肝细胞阶段，体内的肝芽的等同。Notch2但不是Notch1的表达也在第25天上调，进一步支持了解释：这个种群包含能够通过这个通路信号传导的成肝细胞。
成肝芽。芽的形成取决于在该过程的早期阶段期间过渡表达的转录因子TBX3 。随着芽扩增，祖细胞下调Tbx3和保持，和/或上调通常在肝和/或胆管细胞谱系中表达的基因的组合的表达(包括白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白19(CK19)、Sox9、NHF6p和NOTCH2)。bFGF/BMP4处理的hESC源性内胚层种群的RT-qPCR分析显示在分化的第13天的TBX3表达的过渡上调，这个时间识别为成肝细胞特化的阶段(图14c)。免疫染色显示，第13天种群中的大多数细胞是TBX3+，表明成肝细胞特化是有效的。SOX9和HNF6B表达的开始与TBX3表达的开始重叠(图14c)。然而，不同于TBX3，这些基因的表达持续升高直至第25天，分析的最后一天。ALB和AFP的表达在第19天上调，并且也在第25天增加。CK19呈双相模式，在第13天和第25天检测到表达的峰值水平。免疫荧光染色和流式细胞分析显示，在分化的第25天的大部分细胞为ALB+、AFP+和CK19+。连同这些发现强烈表明，第
25天种群中的细胞代表发育的扩增的成肝细胞阶段，体内的肝芽的等同。Notch2但不是Notch1的表达也在第25天上调，进一步支持了解释：这个种群包含能够通过这个通路信号传导的成肝细胞。
[0531] Notch信号传导促进来自hPSC源性肝细胞样种群的胆管细胞发育。
[0532] 为了探讨Notch信号传导对胆管细胞发育的影响，我们共同培养成肝细胞种群4，5
(第25天)与已知表达包括Jagged1的不同的Notch配体的OP9基质细胞 。当在基质上作为单细胞悬浮液培养时，hPSC源性细胞没有良好地存活。为了克服这个问题，我们从第
25天单层细胞生成3D聚集体，并且将3D聚集体培养在OP9基质细胞上。免疫染色和流式细胞分析显示，共培养之前的聚集体内的大部分细胞是ALB+AFP+CD19+NOTCH2+，表明它们保持成肝细胞特性。这个聚集步骤中似乎选择成肝细胞，因为在培养48小时之后，从仅包括
80％ALB+AFP+CK19+细胞的第25天种群生成的聚集体包含大于90％的ALB+AFP+CK19+细胞。当共培养在OP9基质(9天)上时，聚集体形成的CK19+细胞的不同集群不再表达ALB，这表明它们经历了胆管细胞特化的初始阶段。如在小鼠的研究中示出，HGF、EGF和TGFpi
6-8
信号传导在胆管发育中起作用 ，我们接下来将这些因子单独或组合地添加至培养物，以
6-8
确定这些通路的激活是否将促进CK19+集群的进一步发育 。添加EGF或TGFβ1或两者的组合导致CK19+聚集体的尺寸的增加，与此相反，单独的HGF效果甚微。有趣的是，EGF和HGF或EGF、HGF和TGFpi的组合诱导了急剧的形态变化，并且促进了包括CK19+细胞的分支结构的形成。RT-qPCR图15a和流式细胞分析(图21)确证了免疫染色发现，并且证明了在与OP9共培养之后完全没有ALB+细胞。
(第25天)与已知表达包括Jagged1的不同的Notch配体的OP9基质细胞 。当在基质上作为单细胞悬浮液培养时，hPSC源性细胞没有良好地存活。为了克服这个问题，我们从第
25天单层细胞生成3D聚集体，并且将3D聚集体培养在OP9基质细胞上。免疫染色和流式细胞分析显示，共培养之前的聚集体内的大部分细胞是ALB+AFP+CD19+NOTCH2+，表明它们保持成肝细胞特性。这个聚集步骤中似乎选择成肝细胞，因为在培养48小时之后，从仅包括
80％ALB+AFP+CK19+细胞的第25天种群生成的聚集体包含大于90％的ALB+AFP+CK19+细胞。当共培养在OP9基质(9天)上时，聚集体形成的CK19+细胞的不同集群不再表达ALB，这表明它们经历了胆管细胞特化的初始阶段。如在小鼠的研究中示出，HGF、EGF和TGFpi
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信号传导在胆管发育中起作用 ，我们接下来将这些因子单独或组合地添加至培养物，以
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确定这些通路的激活是否将促进CK19+集群的进一步发育 。添加EGF或TGFβ1或两者的组合导致CK19+聚集体的尺寸的增加，与此相反，单独的HGF效果甚微。有趣的是，EGF和HGF或EGF、HGF和TGFpi的组合诱导了急剧的形态变化，并且促进了包括CK19+细胞的分支结构的形成。RT-qPCR图15a和流式细胞分析(图21)确证了免疫染色发现，并且证明了在与OP9共培养之后完全没有ALB+细胞。
[0533] 添加γ分泌酶抑制剂(GSI)、Notch通路的拮抗剂阻碍ALB表达的下调，减少CK19+细胞在培养物中的比例和抑制分支结构的发育，表明这些作用由Notch信号传导介导(图15a)。在OP9上培养9天之后，Notch靶标HES1、HES5和HEY1表达上调。(图15b)表达的这种增加通过添加γ分泌酶抑制剂而阻止，表明与OP9共培养有效地激活Notch通路(图15b)。另外两个hPSC细胞系(ESC HES2和iPSC Y2-1)的分化潜能的分析显示TBX3和成肝细胞标记物表达的类似时间模式，这表明通过这些阶段的过渡是体外肝发育的特征。(图22)在与OP9基质细胞共培养后，从两个细胞系衍生的聚集体生成包括CK19+ALB-细胞的分支结构。如用H9源性种群观察到的，ALB表达的下调和这些结构的发育是NOTCH依赖事件。共同地，这些发现表明，成肝细胞种群中的Notch信号传导的激活诱导胆管细胞发育的初始阶段，并且HGF、EGF和TGFpi信号传导的组合促进导致分支结构的形成的形态变化，可能反映管形态发生的早期阶段。
[0534] 三维培养促进胆管细胞成熟
[0535] 为了确定OP9共培养物中观察到的分支是否指示胆管发育的初始阶段，我们接下来建立培养系统，以促进3D细胞结构的生长。通过这种方法，将包括第25天hESC源性细胞和OP9基质细胞(GFP+)的嵌合聚集体培养在培养基混合物中，培养基混合物包括1.2mg/ml的胶原、40％基质胶和HGF、EGF和TGFpi(图23a)。在在这些条件下培养2周之内，聚集体经历巨大形态学变化和形成管状结构、中空包囊或两者的混合(图16a、图16b)。包囊在这些培养物中是最丰富的结构(图16b)。与从没有OP9细胞的聚集体衍生的种群相比，Notch靶基因Hes1、Hes5和Hey1的表达在从嵌合聚集体发育的种群中上调，表明Notch信号传导在培养物中是活跃的(图23b)。组织学分析显示，管状和囊性结构具有带有内腔的导管形态并且包括上皮样细胞，上皮样细胞表达CK19+和E-钙粘蛋白+但不表达ALB-。ZO-1(闭合带1)，紧密连接的标记物也表达以及被发现限制于结构的顶面，这表明细胞已经获得基因表达极性，成熟上皮管道的特征。管中的细胞也表达囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)，首先在成人胆道基因座中表达的跨膜通道。由于具有ZO-1，在管状结构的顶面上主要检测到CFTR蛋白。免疫印迹分析证实从嵌合聚集体生成的种群中的蛋白质的存在(图23d)。CFTR信息和蛋白质的水平在源自没有OP9培养的聚集体的细胞中相当低，这表明它的表达依赖于Notch信号传导(图23d、图23e)。肝标记物(包括ALB、AFP和CYP3A7)的缺乏和这些结构中的胆管细胞标记物CK19、SOX9和CFTR的表达的上调通过RT-qPCR分析证实(图
16c)。在这些条件下培养之后，从iPSC源性聚集体发育类似的CK19+CFTR+管状和囊性结构。总之，这些发现示出，当在基质胶和胶原的混合物中培养时，成肝细胞种群可以生成管状结构，管状结构表达在成熟的胆管中发现的标记物。
16c)。在这些条件下培养之后，从iPSC源性聚集体发育类似的CK19+CFTR+管状和囊性结构。总之，这些发现示出，当在基质胶和胶原的混合物中培养时，成肝细胞种群可以生成管状结构，管状结构表达在成熟的胆管中发现的标记物。
[0536] GSI的添加防止了管状结构和包囊的形成并且促进了发育密集聚集体(图16a，图16b球体)，该聚集体表达ALB和低水平的CK19，这表明，在没有Notch信号传导的情况下，具有成肝细胞特性的细胞持续存在于培养物中。GSI的添加也导致肝细胞标记物(ALB、AFP和CYP3A7)的表达的增加以及与胆管细胞发育相关的基因(CK19、Sox9和CFTR)的表达的减少(图16c)。
[0537] hPSC源性胆管细胞在体内形成管状结构。
[0538] 为了评价在体内hPSC源性胆管细胞的发育潜能，我们将基质胶栓中的hPSC源性6
胆管细胞(10个细胞)移植到免疫缺陷NOD/SCID/IL2rg-/-(NSG)小鼠的乳房脂肪垫内。对于这些研究，我们使用从分支结构解离的细胞，分支结构通过从具有OP9基质的HES2-RFP hESC衍生的第25天成肝细胞种群的共培养生成。这些hESC设计为从ROSA基因座表达
9
RFP。在移植6至8周后，在基质胶栓中检测到多个管状结构(图17a和图17b)。管道内的细胞是RFP+，表明它们是人类的起源，源自HES2-RFP细胞(图17c、图17d)。此外，表达CK19和CFTR的细胞表明，它们显示胆管细胞的特性。如用在体外生成的结构观察到的，CFTR表达与导管的顶面分离。没有在任何移植的动物中观察到畸胎瘤。
胆管细胞(10个细胞)移植到免疫缺陷NOD/SCID/IL2rg-/-(NSG)小鼠的乳房脂肪垫内。对于这些研究，我们使用从分支结构解离的细胞，分支结构通过从具有OP9基质的HES2-RFP hESC衍生的第25天成肝细胞种群的共培养生成。这些hESC设计为从ROSA基因座表达
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RFP。在移植6至8周后，在基质胶栓中检测到多个管状结构(图17a和图17b)。管道内的细胞是RFP+，表明它们是人类的起源，源自HES2-RFP细胞(图17c、图17d)。此外，表达CK19和CFTR的细胞表明，它们显示胆管细胞的特性。如用在体外生成的结构观察到的，CFTR表达与导管的顶面分离。没有在任何移植的动物中观察到畸胎瘤。
[0539] hPSC源性胆管细胞样是功能性的
[0540] 作为评估hPSC源性胆管细胞的功能的第一步骤，我们评估它们外排罗丹明123的能力，罗丹明123是用于测量存在于正常的胆管细胞中的MDR1转运蛋白的功能活性的示踪染料。源自H9 hESC或iPSC的囊性结构将染料转运至腔空间，表明主动转运活性。在20μM维拉帕米、MDR转运蛋白的抑制剂的存在下，罗丹明没有在结构的内腔中积聚，确认了反映主动运输的染料的运动可能是通过MDR转运蛋白。
[0541] 为了展示CFTR功能活动，接下来我们进行了对囊性结构的毛喉素诱导的肿胀测定。利用这种测定，通过添加毛喉素/IBMX激活cAMP通路增加CFTR功能，CFTR功能导致流体输送和包囊的肿胀。在用钙黄绿素绿、细胞渗透性荧光染料染色之后，可以使肿胀可视化(图18a)。当24小时后测量时，将毛喉素和IBMX添加到培养物分别诱导H9-和iPSC源性包囊的尺寸增加2.09+/-0.21和2.65+/-3.1倍(Fig18b)。添加CFTR抑制剂(CFTRinh-172)阻止毛喉素/IBMX诱导的肿胀，表明包囊尺寸的增加是CFTR依赖的。来自这些测定的发现表明，hPSC源性包囊/管状结构中的细胞显示在肝胆管中发现的功能性胆管细胞的特性。
[0542] 来自囊性纤维化患者iPSC的胆管细胞的生成和功能分析。
[0543] 为了展示该系统在体外模拟疾病的用途，我们接下来分析了来自从携带共同F508缺失(例如，deltaF508)的两个不同的囊性纤维化患者生成的iPSC的包囊形成。hiPSC细胞系以类似于野生型hPSC观察到的那些的动力学生成成肝细胞种群(图24a和图24b)。尽管成肝细胞发育没有改变，来自患者的iPSC的包囊形成清楚地受损，因为在培养两周后在凝胶中仅观察到分支结构(图19a)。可以通过在双周培养期(变化)的第一周加入毛喉素来诱导来自患者细胞的包囊形成(图19a、图19b)。然而，许多从患者iPSC发育的包囊不完全是中空的，而是包含分支管状结构(图19c)。在较长培养期之后检测到较高频率的中空包囊(典型的从正常iPSC发育的那些)，表明突变细胞的成熟被推迟。将CFTR抑制剂添加到正常iPSC源性胆管细胞的培养物也延迟包囊形成，表明这些结构的生成在一定程度上依赖于功能性CFTR(Fig19b)。
[0544] 接下来，在CFTR功能测定之前2天，我们使用化学校正剂VX-809和Corr-4a评估来自囊性纤维化患者iPSC的胆管细胞样细胞中的F508del CFTR的功能恢复。这两种分子用于校正突变的CFTR蛋白质的折叠缺陷。添加校正剂未改善包囊形成，但是确实导致可检测水平的CFTR在内腔的顶端位点上的积累。然而，不像野生型包囊的内腔中的CFTR的均匀分布，蛋白质出现在用校正剂处理的患者来源的包囊中的不同的块片中。这种模式可能反映突变蛋白的转运缺陷的不完整的挽救。免疫印迹分析还示出添加校正剂的效果。正常细胞中的大多数CFTR是通过图20a中的带(lane)HBE中的上频带(C)识别的较大的成熟形式。患者来源的细胞含有少得多的CFTR蛋白，并且大部分是较小的不成熟形式。添加校正剂急剧增加患者细胞中的成熟蛋白质的比例。为了确定校正剂是否影响CFTR功能，我们接下来使处理和未处理的包囊经受毛喉素/IBMX诱导的肿胀测定(图20b、图20c)。患者具体包囊在没有校正剂的情况下示出小肿胀。然而，随着添加校正剂，在用毛喉素/IBMX和VX770诱导之后24小时，从患者C1生成的包囊增加了大约2.18+/-0.52倍，而来自患者997的那些增加了1.64±0.08倍。总之，这些发现示出，模拟患者特定iPSC源性胆管细胞中的CFTR功能障碍的方面是可能的，并且用于处理这些患者的校正剂可以挽救缺陷。
[0545] 讨论
[0546] 描述了用于将hPSC定向分化为功能性胆管细胞样细胞的系统，功能性胆管细胞样细胞在体外和体内自组织成管状结构。
[0547] 小鼠的研究表明，Notch通路对于在体内诱导胆管细胞命运决定是重要的，包括与门户间质细胞相互作用的Jagged 1和肝细胞上的Notch2。
[0548] 不仅在单层中，而且在三维凝胶培养物中，由OP9细胞提供的Notch信号传导成功操作命运的决定。除了G分泌酶抑制剂之外，当Notch信号受到影响时，观察到反效果。先前的报告示出，从人ES细胞生成胆管细胞样管状结构(尽管效率低)导致示出具有极性和罗丹明123摄取的功能。
[0549] 由OP9提供的Notch信号传导促进来自人ES源性胆管细胞样细胞的植入，并且细胞在小鼠乳腺脂肪垫中形成RFP阳性管状结构。在没有OP9的情况下未观察到这些结构。总之，OP9共培养系统有效地提供notch信号传导以在体外和体内从人PSC源性成肝细胞诱导胆管细胞样细胞。
[0550] 来自hPSC的肝细胞成熟被示出为通过本文中的三维培养环境被增强。类似地，也通过三维凝胶培养系统促进胆管细胞谱系细胞的成熟。当经由OP9细胞通过Notch信号传导刺激成肝细胞聚集体时，与胆管细胞谱系相关的基因表达和成熟显著增加。此外，在体外检测到作为胆管细胞的功能活性。
[0551] 人IPS源性胆管细胞样管道结构展示出功能性CFTR活性。这些细胞可以以患者特定方式用于药物筛选。
[0552] 此外，患者特定胆管细胞样管道结构可以有效地获得并且用于验证用于其他严重胆道疾病的现有的或新的治疗药物，诸如单基因条件进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC类型1、2和3)和Alagille综合征，以及更常见和复杂的胆道疾病、胆道闭锁和原发性硬化性胆道炎。
[0554] 所有的出版物、专利和专利申请在本文中通过引用并入其全部内容，犹如每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地通过引用并入其全部内容。具体而言，本文所提供的与每个添加编号相关的序列包括例如在表格或其他任何地方提供的添加编号和/或生物标记物序列(例如，蛋白质和/或核酸)，通过引用并入其全部内容。
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