一种携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株及其构建方法
阅读：478发布：2020-08-01
专利汇可以提供一种携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株及其构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种可回复永生化 肝细胞 株的构建方法，从胚胎期12.5～14.5d天的小鼠肝脏中分离肝脏祖细胞，导入含有SV40T基因和HSV-TK基因的逆转录病毒，筛选具有肝祖细胞标志及向成熟肝细胞分化功能的单克隆细胞株，再导入含有CD基因的逆转录病毒获得携带双自杀基因的可回复永生化小鼠肝祖细胞。该细胞株能够在体外不断增殖又具有正常的肝细胞表型及功能，通过位点重组和药物筛选等可控性方式实现了永生化细胞安全性的可调控，而且最大限度的保证了该细胞在体内应用的 生物 安全性，减少永生化肝细胞应用于体内的危险性，为 生物人工肝 技术提供一种可靠、安全、理想的肝细胞材料。，下面是一种携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株及其构建方法专利的具体信息内容。
1. 一种可回复永生化肝细胞株的构建方法，从胚胎期12.5～14.5d天的小鼠肝脏中分离肝脏祖细胞，导入含有SV40T基因和HSV-TK基因的逆转录病毒，筛选具有肝祖细胞标志及向成熟肝细胞分化功能的单克隆细胞株，再导入含有CD基因的逆转录病毒获得携带双自杀基因的可回复永生化小鼠肝祖细胞。
2. 如权利要求1所述的可回复永生化肝细胞株的构建方法，所述含有SV40T基因和HSV-TK基因的逆转录病毒结构如图1-1所示。
3. 如权利要求1或2所述的可回复永生化肝细胞株的构建方法， 所述含有CD基因的逆转录病毒结构如图1-2所示。
4. 如权利要求1或2所述的可回复永生化肝细胞株的构建方法，包括以下步骤：
（1） 携带SV40T永生化基因和HSV-TK自杀基因的肝祖细胞构建，单克隆筛选及生物学性状鉴定：
①从胚胎期12.5～14.5d的小鼠肝脏中分离出肝祖细胞；用携带SV40T永生化基因及HSV-TK自杀基因的逆转录病毒感染肝祖细胞，经潮霉素抗性加压筛选获得的永生化细胞呈克隆样生长；
②单克隆细胞筛选：以有限稀释法接种细胞于96孔培养板，至每孔一个细胞为止，潮霉素改半量维持；观察96孔培养板中有单克隆细胞团形成的孔标记，待细胞融合度达80％时常规传代，扩大培养，获得多株单克隆细胞；
③单克隆细胞鉴定与筛选：以LC14d成熟肝细胞及Hepa1-6肝肿瘤细胞株为对照，筛选能高表达DLK、POU5f1肝干/祖细胞标志，低表达AFP、ALB、CK18、CK19肝细胞特异基因的肝祖细胞；
④单克隆细胞的诱导分化鉴定：用Dex/DMSO体外诱导成熟肝细胞分化，进行PAS染色及ICG摄取筛选具有体外成熟肝细胞分化能力的细胞；
⑤可回复永生化的检测：用腺病毒介导的Cre重组酶敲除两个同向LoxP位点间的序列，48h后检测到SV40大T抗原被可逆敲除，并检测细胞增殖速度，通过荧光素酶报告基因检测ALB表达水平，Western blot检测细胞的体外诱导分化能力；
⑥单克隆细胞的安全性检测：腺病毒介导firefly luciferase体内示踪，将Luc标记后的细胞皮下植入裸鼠，分别于植入后第ld、1w、4w活体组织成像动态观察植入细胞的生长情况；
（2） 导入CD自杀基因，构建携带双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株及功能鉴定：
①pSEB-CD载体的构建及鉴定：BamHⅠ/SalⅠ酶切位点双酶切带有CD自杀基因全长序列的pIRES-CD质粒，获得1300bp左右的特异性条带，胶回收后连接至同样双酶切的pSEB-3F载体，经Amp筛选，菌落PCR获得阳性克隆；提质粒，EcoRⅠ/SalⅠ酶切获得约
2300bp的特异性条带，测序检测pSEB-CD质粒构建成功；
②导入CD基因，构建携带双自杀基因的肝祖细胞株：pSEB-CD与pCL-Ampho包装质粒共转染HEK293细胞，获得逆转录病毒，每ml逆转录病毒加2mg/ml 的polybrene 5μl,用
0.45μm孔径的滤器过滤，感染步骤（1）所得单克隆肝祖细胞，过夜后换新鲜培养基，48h后加入终浓度为3μg/ml的BSD；BSD筛选10d，保留存活细胞，维持筛选浓度，存活细胞开始恢复正常的生长速度及状态，获得携带双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株；
③CD基因的表达及活性检测：Western blot及免疫荧光检测细胞中CD基因的蛋白水平表达；采用100μg/ml的5-氟胞嘧啶作用于细胞株，7d后进行结晶紫染色及MTT检测细胞抑制率；
④携带CD自杀基因的肝祖细胞株的体内安全性检测：将Luc标记的双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株植入裸鼠皮下，体内给药5-FC，于植入后第0天、5天、10天检测细胞的存活情况；
⑤Cre-LoxP重组效率及HSV-TK自杀基因活性的检测：采用3.3μg/ml的GCV作用于细胞株检测，CRE敲除SV40T及HSV-TK基因后，在GCV中存活细胞，SV40T表达完全消失。
一种携带双自杀基因的可回复永生化肝细胞株及其构建方
法
技术领域
[0002] 肝功能衰竭(Liver failure)是临床最常见的死亡率极高的肝病症候群，严重威胁着人类的健康。据统计显示，我国每年因为重症肝功能衰竭导致死亡的人数为30～50万。治疗肝衰竭最有效的方法是肝移植，然而由于供肝来源缺乏，仅有不到10％的患者能得到肝移植的机会。生物人工肝(Bioartificial liver，BAL)是以培养肝细胞为基础的体外生物人工器官装置，可暂时代替肝脏进行解毒、分泌、合成、转化等功能，不仅能为肝衰竭患者等待肝移植争取时间，而且可为肝再生恢复创造条件。目前生物人工肝的细胞来源包括：1)原代细胞：包括自体、同种异体或异种的成体肝细胞，由胚肝细胞、骨髓造血干细胞、肝卵圆细胞等分化而来的肝细胞；2)肝细胞株：肝肿瘤细胞株，永生化的肝细胞株等。肿瘤源性的细胞株来源充足，增殖能力强，且具有一定的合成功能，但目前只有C3A细胞株有应用于临床的报道，然而该细胞代谢解毒功能较弱，尚不具备完全的成熟肝细胞功能，并存在着潜在的致癌性和遗传性状的改变，显然用现有的肝肿瘤细胞株来代替肝脏功能还存在7
着一定的局限性。用于生物人工肝的细胞需要在体外扩增至10数量级并具有成熟的合成代谢解毒功能，但是原代细胞的来源缺乏，而干细胞成肝分化能力有限，这使得如何促进成熟肝细胞的体外增殖分化成为目前研究的一个热点。虽然肝细胞在体内有着强大的增殖潜能，能多次分裂增殖，但在体外分离培养过程中，由于失去了神经体液调节和细胞间的相互作用，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，细胞生存时间短，增殖能力有限，传代困难且易发生变性，这极大地增加了其在生物人工肝应用中的难度和复杂性。因此，如何获得体外增殖良好并具有正常功能的肝细胞，为生物人工肝提供稳定安全的细胞来源变得尤为重要。
着一定的局限性。用于生物人工肝的细胞需要在体外扩增至10数量级并具有成熟的合成代谢解毒功能，但是原代细胞的来源缺乏，而干细胞成肝分化能力有限，这使得如何促进成熟肝细胞的体外增殖分化成为目前研究的一个热点。虽然肝细胞在体内有着强大的增殖潜能，能多次分裂增殖，但在体外分离培养过程中，由于失去了神经体液调节和细胞间的相互作用，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，细胞生存时间短，增殖能力有限，传代困难且易发生变性，这极大地增加了其在生物人工肝应用中的难度和复杂性。因此，如何获得体外增殖良好并具有正常功能的肝细胞，为生物人工肝提供稳定安全的细胞来源变得尤为重要。
[0003] 研究发现将猿病毒40大T抗原基因(simian virus40large T antigen gene，SV40T)导入正常细胞，可调节细胞周期中的重要调控点，使细胞进入永生化的增殖状态，成为能在体外长期传代培养的永生化细胞系。SV40是双链环状DNA病毒，由5243个碱基对组成，其中早期转录区基因编码的大T抗原为708个氨基酸的磷酸蛋白，具有多向效应：在宿主细胞内可结合p53和pRB，下调其阻止细胞增殖的作用；还能特异性干扰一个或多个细胞周期调节蛋白，使细胞逃逸Ml期，获得额外的增殖力量，继续分裂。李君等用pcDNA3.1(-)质粒将SV40T导入原代成人肝细胞，获得了高分化的永生化人源肝细胞系，此细胞具有原代肝细胞的典型特征和生物学功能，能分泌白蛋白、ALT、AST及LDH，表达肝脏丰富的功能标志。故用此方法能获得大量功能成熟的肝细胞，可为生物人工肝提供充足的细胞来源。
[0004] SV40T毕竟是一个外源的病毒癌基因，与宿主细胞DNA发生稳定整合后长期存在于细胞内，具有细胞恶性转化的潜在危险性，并且细胞永生化后可能会因其增殖能力在体内发生癌变。同时，生物人工肝使用过程中外源细胞有可能进入到血液循环，增加了种植瘤形成的可能。近几年来，国内外学者一直对SV40T永生化肝细胞的临床应用安全性进行不断的探索。常见方法有Cre-LoxP位点重组技术，即先将LoxP位点特异修饰的SV40T逆转录病毒导入原代肝细胞，获得永生化细胞株，使其获得体外增殖能力，然后再将Cre重组酶基因通过病毒载体导入细胞，经过特异性位点重组切除SV40T外源基因，使细胞回复到永生化前的状态。另一种方法是把自杀基因整合到永生化肝细胞内，一旦发生恶性转化，用前体药物将其杀灭。
[0005] 但是目前的这两种永生化方案还是存在各自的缺陷。Cre-LoxP方案中对Cre重组酶活性及LoxP位点重组切除的效率无法控制，不能保证所有的细胞都去除永生化基因，由于永生化回复后细胞内残留的永生化基因是否抑制细胞功能，是否存在导致肿瘤发生和细胞转化危险性等问题有待进一步验证。自杀基因方案虽然增加了细胞体内应用的安全性，但是导入体内的永生化细胞仍有SV40T基因存在，影响细胞在体内的分化及功能成熟。
发明内容
[0006] 为了解决以上的问题，本发明提供了一种可回复永生化肝细胞株的构建方法，成功获得了携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T永生化基因的可回复永生化小鼠胚胎肝祖细胞株。
[0007] 本发明的目的是通过以下措施实现的：
[0008] 一种可回复永生化肝细胞株的构建方法，从胚胎期12.5～14.5d天的小鼠肝脏中分离肝祖细胞，逆转录病毒导入SV40T基因和HSV-TK基因，筛选具有肝祖细胞标志及向成熟肝细胞分化功能的单克隆细胞株，再用逆转录病毒导入CD基因，获得携带双自杀基因的可回复永生化小鼠胚胎肝祖细胞。所述CD(cytosine deaminase)为胞嘧啶脱氨酶基因、HSV-TK((Herpes Simplex Virus thymidine kinase)为单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。通过两次转染，解决了多基因转入细胞无法有效表达的问题。
[0009] 上述含有SV40T基因和HSV-TK基因的逆转录病毒载体的结构如图1-1示，5’LTR-ATG-LoxP-Hyg-HSV-TK-IRES-ATG-SV40T-LoxP-Neo-3’L TR，依次相连形成环形。该载体为逆转录病毒载体，LTR间的DNA序列可插入至宿主细胞DNA中实现稳定转染。携带SV40T永生化基因、HSV-TK自杀基因及潮霉素抗性基因，潮霉素抗性用于稳定细胞株的筛选，可在体外实现永生化的增殖。插入基因DNA序列两端有同向的LoxP位点，Cre重组酶定点敲除SV40T永生化基因和HSV-TK自杀基因，细胞回复到永生化前的状态，未敲除的永生化细胞还有HSV-TK自杀基因，将前体药物更昔洛韦转变为有毒性的三磷酸盐，被选择性杀灭，保证保证体内应用前细胞永生化基因的彻底清除。
[0010] 上述含有CD基因的逆转录病毒载体结构如图1-2所示。该载体带有稻瘟菌素(Balsticidin，BSD)基因和CD自杀基因。稳定转染CD自杀基因的细胞能在含有BSD的培养基中存活。BSD的筛选是一个全或无的效应，整合了此基因的细胞存活，反之细胞死亡，能保证所有的抗性细胞都含有CD自杀基因。在细胞用于生物人工肝进行血液净化后，可能进入血液循环的外源细胞带有CD自杀基因，可将安全性好的前体药物5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)转变为强毒性的5氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)，被选择性杀灭，进一步增加了该细胞株体内应用的安全性。
[0011] 具体的，上述可回复永生化肝细胞株的构建方法，包括以下步骤：
[0012] (1)携带SV40T永生化基因和HSV-TK自杀基因的小鼠肝祖细胞构建，单克隆筛选及生物学性状鉴定：
[0013] ①从胚胎期12.5～14.5d的小鼠肝脏中分离出肝祖细胞；用携带SV40T永生化基因及HSV-TK自杀基因的逆转录病毒感染肝祖细胞，经潮霉素抗性加压筛选获得的永生化细胞呈克隆样生长；
[0014] ②单克隆细胞筛选：以有限稀释法接种细胞于96孔培养板，至每孔一个细胞为止，潮霉素半量维持；观察96孔培养板中有单克隆细胞团形成的孔标记，待细胞融合度达80％时常规传代，扩大培养，获得多株单克隆细胞；
[0015] ③单克隆细胞鉴定与筛选：以LC14d成熟肝细胞及Hepa1-6肝肿瘤细胞株为对照，筛选能高表达DLK、POU5f1肝干/祖细胞标志，低表达AFP、ALB、CK18、CK19肝细胞特异基因的肝祖细胞；
[0016] ④单克隆细胞的诱导分化鉴定(肝功能检测)：用Dex/DMSO体外诱导肝祖细胞成熟分化，进行PAS染色及ICG摄取实验筛选具有体外肝细胞成熟分化能力的细胞；
[0017] ⑤可回复永生化的检测：用腺病毒介导的Cre重组酶敲除两个同向LoxP位点间的序列，48h后检测到SV40大T抗原被可逆敲除，并检测细胞增殖速度，通过ALB-GLuc(荧光素酶报告基因)检测ALB表达水平，Western blot检测细胞的体外诱导分化能力；
[0018] ⑥单克隆细胞的安全性检测：腺病毒介导firefly luciferase体内示踪，将Luc标记后的细胞皮下植入裸鼠，分别于植入后第1d、1w、4w活体组织成像动态观察植入细胞的生长情况。
[0019] (2)导入CD自杀基因，构建携带双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株及功能鉴定：
[0020] ①pSEB-CD载体的构建及鉴定：BamH I/Sal I酶切位点双酶切带有CD自杀基因全长序列的pIRES-CD质粒，获得1300bp左右的特异性条带，胶回收后连接至同样双酶切的pSEB-3F载体，经Amp筛选，菌落PCR获得阳性克隆；提质粒，EcoR I/Sal I酶切获得约2300bp的特异性条带，测序检测pSEB-CD质粒构建成功；
[0021] ②导入CD基因，构建携带双自杀基因的肝祖细胞株：pSEB-CD与pCL-Ampho包装质粒共转染HEK293细胞，获得逆转录病毒，每ml逆转录病毒加2mg/ml的polybrene5μl，用0.45μm孔径的滤器过滤，感染步骤(1)所得单克隆肝祖细胞iHP14-19，过夜后换新鲜培养基，48h后加入终浓度为3μg/ml的BSD；BSD筛选10d，保留存活细胞，维持筛选浓度，存活细胞开始恢复正常的生长速度及状态，获得携带双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株；
[0022] ③CD基因的表达及活性检测：Western blot及免疫荧光检测细胞中CD基因的蛋白水平表达；采用100μg/ml的5-FC作用于细胞株，7d后进行结晶紫染色及MTT检测细胞抑制率；
[0023] ④携带双自杀基因的肝祖细胞株的体内CD自杀基因活性检测：将Luc标记的双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株植入裸鼠皮下，体内给药5-FC，于第0d、5d、10d进行活体组织成像动态检测细胞的存活情况；
[0024] ⑤Cre-LoxP重组效率及HSV-TK自杀基因活性的检测：采用3.3μg/ml的GCV作用于细胞株检测，Cre敲除SV40T及HSV-TK基因后，在GCV中存活细胞，SV40T表达完全消失。
[0025] 有益效果
[0026] 1.本发明创造性地将Cre-LoxP位点重组技术和自杀基因可控性表达有机结合，可以有效地实现对SV40T永生化基因的敲除以及对双自杀基因的调控，用于优化现有永生化方案。简化了操作步骤，减低了应用难度和风险。
[0027] 2.本发明优化了转录载体，操作流程和方法，将SV40T永生化基因、CD基因、HSV-TK自杀基因通过恰当方式导入细胞，并能在细胞内稳定表达有效蛋白，实现相关功能。采用的逆转录病毒系统和方法，能有效感染多种哺乳动物细胞，并有效整合到细胞基因组中且表达目的基因，从而建立稳定的细胞株。Cre-LoxP位点特异重组成功，经GCV筛选，敲除效率几乎可达到100％。
[0028] 3.本发明得到了一种新型的可回复永生化肝细胞株，具有肝脏功能替代作用。该细胞株能够在体外不断增殖又具有正常的肝细胞表型及功能，并在细胞体内应用前将有导致细胞恶性转化危险和影响细胞功能的永生化基因SV40T去除，细胞导入体内后还可利用药物5-FC的作用下选择性杀灭，通过位点重组和药物筛选等可控性方式实现了永生化细胞安全性的调控，而且最大限度的保证了该细胞在体内应用的生物安全性，减少永生化肝细胞应用于体内的危险性，为生物人工肝技术提供一种可靠、安全、理想的肝细胞材料。
[0029] 4.本发明利用双载体逆转录病毒系统将SV40T永生化基因及HSV-TK自杀基因导入小鼠胚胎肝祖细胞，筛选体外分化良好的永生化细胞株iHP14-19，再将CD自杀基因导入该细胞获得写到双自杀基因的小鼠胚胎肝祖细胞，命名为：iHP14-19-CD。该细胞具有肝祖细胞的表面标志，体外诱导能分化为有正常肝细胞功能的成熟肝细胞，移植入急性肝衰竭小鼠中能改善存活率及肝脏功能。该细胞的永生化基因SV40T能被可逆敲除，并用HSV-TK自杀基因纯化永生化回复后的细胞，生物安全性好，另一个CD自杀基因用于细胞体内移植后的自发清除。解决了原代肝细胞体外生存时间短，增殖能力有限，生物学性状异变的缺点，可替代原代肝细胞用于肝细胞分化机制，肝癌病因学，耐药剂量及药物筛选的科学研究。
[0031] 图1-1SV40T基因和HSV-TK基因的逆转录病毒载体的结构图
[0032] 图1-2CD基因的逆转录病毒载体结构图
[0033] 图2携带HSV-TK自杀基因的永生化肝细胞
[0034] 图3携带HSV-TK自杀基因的永生化肝细胞的单克隆细胞呈上皮样细胞形态，不完全相同
[0035] 图4Real-time PCR检测POU5f1(Oct4)、DLK、AFP、ALB、ApoB指标，筛选携带HSV-TK自杀基因的永生化肝祖细胞单克隆株
[0036] 图5携带HSV-TK自杀基因的永生化肝祖细胞单克隆株的形态学及标志物鉴定[0037] 图6PAS染色及ICG摄取检测诱导后携带HSV-TK自杀基因的永生化肝祖细胞单克隆株的功能
[0038] 图7携带HSV-TK自杀基因的永生化肝祖细胞单克隆株的可回复永生化检测[0039] 图8 Cre敲除SV40T前后不同单克隆细胞及Hepa1-6裸鼠皮下成瘤试验[0040] 图9 pSEB-CD载体构建及鉴定
[0041] 图10携带CD自杀基因的iHP14-19-CD细胞构建及CD基因的表达检测[0042] 图11 5-FC对iHP14-19和iHP14-19-CD细胞的细胞毒作用
[0043] 图12携带双自杀基因的肝祖细胞株的体内CD自杀基因活性检测，裸鼠左边包块(上下)为iHP14-19-CD组，裸鼠右边包块(上下)为iHP14-19组
[0044] 图13 HSV-TK自杀基因活性及Cre-LoxP重组效率的检测
[0045] 图14 SV40T基因与CD/HSV-TK基因融合表达载体结构图
[0046] 图15瞬时转染L02细胞中SV40T、CD、HSV-TK的表达(1.L02对照组；2.L02转染组；3.L02转染后经Ad-Cre感染48h)
具体实施方式
[0047] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
[0048] 实施例1
[0049] 一种可回复永生化肝细胞株及其构建方法，包括以下步骤：
[0050] 1.携带SV40T永生化基因和HSV-TK自杀基因的肝祖细胞构建，单克隆筛选及生物学性状鉴定
[0051] 1)获取肝祖细胞：从胚胎期12.5-14.5d的小鼠肝脏中分离出肝祖细胞，分离后3天呈集落样聚集生长，呈多边形相嵌紧密，部分细胞可见双核，传代后细胞形态不均一(圆形、椭圆形、梭形、多边形)，部分细胞扁平样伸展，生长缓慢。用SSR69逆转录病毒质粒(携带SV40T永生化基因及HSV-TK自杀基因)包装逆转录病毒，感染细胞，经潮霉素5μg/ml抗性加压筛选。获得的永生化细胞呈克隆样生长，细胞增殖活跃，呈典型的上皮样细胞形态，细胞浆丰富，胞核大而圆，有多核，核浆比例高。有些细胞能见到明显的细胞分裂相(图2)。
[0052] 2)单克隆细胞筛选：以有限稀释法接种细胞于96孔培养板，至每孔一个细胞为止，潮霉素改半量维持。观察96孔培养板中有单克隆细胞团形成的孔标记，待细胞融合度达80％时常规传代，扩大培养，获得60余株单克隆细胞，形态不完全一致(图3)。
[0053] 3)单克隆细胞鉴定：我们鉴定了其中30个克隆，发现与LC14d成熟肝细胞及Hepa1-6肝肿瘤细胞株相比较，来自E13.5d的iHP13-6、13-16、13-19及来自E14.5d的iHP14-2、14-19能高表达DLK、POU5f1肝干/祖细胞标志，并且与其他的克隆比较，这5株克隆有AFP、ALB、CK18、CK19等肝细胞特异基因的低表达，属于低分化阶段的肝祖细胞(图4)。说明我们分离得到的单克隆细胞基因表达谱不一致，不同的单克隆细胞可能是不同阶段的肝实质细胞或肝纤维细胞、窦状上皮细胞、星状细胞、kuffer’s细胞等其他非实质肝细胞。
[0054] 对这5株细胞的后续鉴定发现，5株单克隆呈现上皮细胞样形态，细胞浆丰富，胞核较大而圆，有多核，核浆比例高，细胞增殖速度有差异，其中13-6和14-19细胞形态比较均一，增殖速度较快，细胞在生长过程中有逐渐形成“肝板样结构”的趋势。而14-2细胞生长稍慢，细胞形态较不均一(图5A)。HNFs、AFP等基因的表达不完全一致，对Dex、DMSO诱导的反应也不尽相同。其中，14-19细胞形态均一，有肝特异性基因的高表达，成熟肝细胞标志的低表达，对Dex+DMSO诱导的反应最好(图5B，5C)。
[0055] 4)单克隆细胞的诱导分化鉴定(肝功能检测)：用Dex/DMSO体外诱导成熟肝细胞分化。肝脏是进行糖原合成及糖异生的器官，PAS试剂特异使碳水化合物着色，肝细胞中的己二醇基在过碘酸的作用下转变为乙醛，Schiff试制使其变为紫红色着色。靛青绿为暗绿色色素，静脉注射后迅速与白蛋白结合，90％以上被肝细胞摄取，以原形从胆汁排出，此实验主要反映肝细胞摄取色素的功能。功能实验结果显示：除了13-6，其他单克隆在未诱导时具有少部分ICG摄取功能，仅14-19在未诱导前具有少量PAS染色阳性细胞，诱导后，13-6、13-19、14-19表现出较强的糖原合成能力和ICG摄取的代谢功能(图6)。获得了具有体外成熟肝细胞分化能力的3个HP克隆，进行后续实验。
[0056] 5)可回复永生化的检测：结果可见永生化单克隆细胞株可表达SV40T抗原，说明外源性的SV40T导入成功，用腺病毒介导的Cre重组酶敲除两个同向LoxP位点间的序列，48h后检测到SV40T抗原被可逆敲除(图7A)。永生化细胞增殖能力强，加入Cre重组酶处理后，细胞的增殖速度明显减慢(图7B)。ALB-GLuc是由ALB启动子启动的荧光素酶报告基因，转入细胞后，其活性间接反应了细胞中ALB的表达水平，是判断肝细胞成熟分化的重要检测手段。永生化回复前后检测ALB-Gluc表达，结果可见：1)无论有无Cre重组酶处理，Dex/DMSO均能诱导肝细胞的分化，Gluc表达上升。2)不论是否诱导，敲除SV40T永生化基因后，Gluc的表达均上升(图7C)。Western blot结果证实iHP14-19细胞的体外诱导分化能力(图7D)。因此，外源性SV40T可显著促进肝祖细胞的增殖，但在一定程度上影响细胞的分化，其去除对于细胞的体内应用是有必要的。
[0057] 6)三株单克隆细胞的安全性检测：腺病毒介导firefly luciferase体内示踪，分为对照组(Ad-GFP+Luc组)和实验组(Ad-Cre+Luc组)(图8A)，将Luc标记后的细胞皮下植入裸鼠，分别于植入后第1d、1w、4w活体组织成像动态观察植入细胞的生长情况。随着时间的延长，植入细胞荧光素酶的表达降低，说明皮下存活的细胞数减少。与肝癌细胞株相比，皮下植入永生化细胞株荧光素酶的表达在4w基本消失，没有成瘤的趋势(图8B)。而经Cre重组酶处理的永生化细胞株，荧光素酶的表达消失提前(图8C，8D)，说明细胞体内增殖降低，存活时间缩短，也进一步证实了外源导入的SV40T抗原是能被可逆敲除的。
[0058] 2.导入CD自杀基因，构建携带双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株及功能鉴定
[0059] 1)pSEB-CD载体的构建及鉴定：BamH I/Sal I酶切位点双酶切带有CD自杀基因全长序列的pIRES-CD质粒，获得1300bp左右的特异性条带，胶回收后连接至同样双酶切的pSEB-3载体，经Amp筛选，菌落PCR获得9个阳性克隆。提质粒，EcoR I/Sal I酶切获得约2300bp的特异性条带，测序结果显示，克隆的目的片断与Genebank中的大肠杆菌CD基因完全一致，无突变，证明pSEB-CD质粒构建成功(图9)。
[0060] 2)导入CD基因，构建携带双自杀基因的肝祖细胞株：pSEB-CD与pCL-Ampho包装质粒共转染HEK293细胞，获得逆转录病毒，每ml逆转录病毒加2mg/ml的polybrene5μl，用0.45μm孔径的滤器过滤，感染iHP14-19细胞，过夜后换新鲜培养基。48h后加入终浓度为3μg/ml的BSD，同时设置对照。BSD筛选第4天，细胞开始明显生长缓慢，失去细胞原有的多角形形态，细胞膜破裂，细胞崩解，并在转代中不能贴壁，逐渐死亡。10d左右，对照组细胞全部死亡，实验组剩下仅5％细胞存活，维持筛选浓度，存活细胞开始恢复正常的生长速度及状态(图10A)。获得携带双自杀基因的可回复永生化肝祖细胞株iHP14-19-CD。
[0061] 3)CD基因的表达及活性检测：iHP14-19-CD细胞表达永生化基因SV40T及CD、HSV-TK双自杀基因，Western blot及免疫荧光也证实iHP14-19-CD细胞中CD基因的蛋白水平表达(图10B)。CD基因表达的胞嘧啶脱氨酶可将5-FC转变为有细胞毒性的5-FU)，带有CD基因的细胞可在有5-FC的培养基中死亡。采用0、10、20、50、100、200、400μg/ml的5-FC作用于iHP14-19及iHP14-19-CD细胞，7d后进行结晶紫染色及MTT检测细胞抑制率，图11结果显示5-FC对iHP14-19及iHP14-19-CD细胞均有明显的细胞毒作用，随着剂量增加，作用逐渐增强，100μg/ml浓度5-FC对iHP14-19-CD细胞的毒性作用为100％。5-FC本身无毒性作用，对iHP14-19细胞的抑制作用可能是由于配置5-FC使用甲酸溶剂的因素，因此，真实的5-FC浓度可能小于100μg/ml。
[0062] 4)携带双自杀基因的肝祖细胞株的体内CD自杀基因活性检测：腺病毒介导Luc标记的iHP14-19和iHP14-19-CD细胞分别植入裸鼠皮下，腹腔注射5-FC500mg/kg.d，共10d。于第0d、5d、10d动态监测细胞的存活情况。在5-FC的作用下，iHP14-19-CD细胞的荧光值明显弱于iHP14-19细胞(图12)，第10d基本消失。4w后取注射部位组织，均未见成瘤，细胞团块消失。
[0063] 5)Cre-LoxP重组效率及HSV-TK自杀基因活性的检测：采用0、0.01、0.033、0.1、0.33、1、3.3、10μg/ml的GCV作用于iHP14-19-CD细胞，HSV-TK自杀基因能诱导细胞在GCV的环境中选择性自杀，最适浓度为3.3μg/ml。Cre敲除SV40T及HSV-TK基因后，细胞能在GCV中存活。Cre-LoxP的重组效率不是100％的，仍然有低水平SV40T及HSV-TK自杀基因的表达，经过GCV筛选之后，SV40T表达消失(图13)，保证所有的细胞在体内应用之前去除永生化基因，增加了体内应用的安全性。
[0064] 对照实验组：将SV40T基因、CD、HSV-TK基因及eGFP示踪基因整合入同一逆转录病毒载体(如图14所示)中，采用一步法构建携带双自杀基因的可回复永生化细胞，实验结果如图15所示，其存在以下问题，：
[0065] 1、无法获得稳定细胞株：测序显示质粒构建成功，但转染细胞的效率低下，单纯质粒脂质体转染后GFP阳性细胞的表达仅为10～15％，且无法获得高滴度的逆转录病毒，外源基因不能有效整合入宿主细胞基因组DNA中获得稳定转染细胞，稻瘟菌素筛选4次均失败。
[0066] 2、同时该方案不能有效表达重要的效应蛋白：瞬时表达后，能检测到所有外源基因的mRNA水平表达，但是蛋白水平只能检测到SV40T永生化基因，考虑CD自杀基因与eGFP融合表达，CD蛋白的N端可能与抗体结合受阻，我们分别采用抗C端和全长的CD抗体，但是均不能检测到CD蛋白表达。Cre-LoxP位点特异重组成功但敲除效率不是100％，SV40T表达水平显著降低，但仍能检测到，CD基因不能有效表达功能蛋白，不能清除掉未重组回复的永生化细胞。
[0067] 3、HSV-TK的可控性表达无法实现：Cre-LoxP重组前HSV-TK基因置于强启动子hEF1后面，可启动mRNA水平表达，但CD基因后面有终止密码，HSV-TK只转录不翻译。Cre-LoxP重组之后，HSV-TK基因置于5-LTR后面，5-LTR的效率有限，无法启动HSV-TK基因的转录翻译，由于Cre-LoxP的效率不是100％，仍然有一些细胞存在hEF1启动HSV-TK，因此，HSV-TK的表达下降，但仍可检测。
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