技术领域
[0001] 本
发明涉及一种肝修复用支架的制备方法，尤其是半乳糖化壳聚糖/聚酯类聚合物复合支架的制备方法。
背景技术
[0002] 肝脏是人体的重要器官之一，担负着代谢、解毒和糖类
蛋白质的释放等多种功能。然而，人类却经常受到各种肝脏
疾病的困扰。世界各国罹患病毒性
肝炎、脂肪性肝病、酒精性肝病等多种肝脏疾病患者的数量在逐年增加。由各种慢性肝病引发的急性肝衰竭有着极高的致死率。肝脏移植虽然是目前
治疗肝衰竭最有效的手段，但是其面临着肝脏供体短缺、手术创口大、花费昂贵等问题。随着组织工程和再生医学的研究和发展，
肝细胞移植和体外
生物人工肝支持系统等治疗方法为肝病的治疗提供了新的途径，并具有良好的治疗效果。
其中，组织工程支架在其中起着十分重要的作用。
[0003] 肝脏是由多种细胞组成的具有复杂血管网络结构的器官。肝小叶是肝脏的基本结构单位。每个肝小叶的中央沿长轴部贯穿着一条中央静脉。肝细胞以中央静脉为轴心放射状排列生长构成板状结构，又称肝板。肝板相互间连接成网络，这些网络之间的空隙处称为窦状隙。窦状隙的窦壁由是由扁平的肝内皮细胞构成。此外，在窦腔内还有许多体积较大、形状不规则的星状细胞，以细胞的突起与窦壁相连。相邻紧密
接触的肝细胞之间存在着间隙，这些间隙相连构成了一些微管道，称为胆小管，其管壁即是肝细胞膜。
[0004] 作为肝脏修复
基础的肝细胞是一种锚着依赖性细胞，在体外培养时容易迅速失去其正常表型及分泌代谢等功能。研究表明利用肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体与支持细胞黏附生长的基质材料表面存在的半乳糖基配体的特异性识别作用，可以促使肝细胞之间相互聚集形成细胞聚集体，在聚集体中生长的肝细胞能够较好维持的表型和功能。肝修复用支架通常是将含有半乳糖基配体的天然大分子配制成一定浓度的溶液，然后利用
冷冻干燥法制备。这类支架组分单一，存在着机械性能差、难以加工、降解过快等
缺陷，难以满足生物人工肝等治疗方法的应用要求。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服现有肝修复支架的不足，提供一种能有效促进肝细胞的生长和功能维持、尺寸形状可控、机械性能良好的半乳糖化壳聚糖/聚酯类聚合物复合支架的制备方法。
[0006] 半乳糖化壳聚糖/聚酯类聚合物复合支架的制备方法，其步骤如下：
[0007] (1)将半乳糖化壳聚糖溶解于蒸馏
水中，配制成浓度为0.01-0.05g/mL的半乳糖化壳聚糖溶液，静置
脱泡；将聚酯类聚合物溶解于二
氧六环或四氢呋喃中，配制成浓度为0.02-0.2g/ml的溶液；
[0008] (2)将尺寸为280-450μm的明胶粒子倒入模具中，用
注射器将体积分数为85％的
乙醇溶液注入模具中至浸没粒子；将模具放置于50-70℃烘箱中2-5分钟，使明胶粒子粘结成模板，取出模具，放置数天至乙醇挥发完毕，冷冻干燥；取出明胶模板，浸入到聚酯类聚合物溶液中，反复使用先抽
真空后恢复至常压的方法将聚酯类聚合物溶液导入模板内部，冷冻干燥，然后置于37℃热水中浸泡至明胶完全溶解，得到聚酯类聚合物多孔支架；
[0009] (3)将步骤(2)得到的聚酯类聚合物多孔支架浸入0.5-2mol/L的氢氧化钠溶液中，反复使用先抽真空后恢复至常压的方法，将氢氧化钠溶液导入到聚酯类聚合物多孔支架内部；将盛有支架的容器在37℃水浴中放置5-60min，取出支架，用1mol/L的
盐酸溶液终止反应，用蒸馏水洗涤至中性；
[0010] (4)将经步骤(3)处理的聚酯类聚合物多孔支架浸入
碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按摩尔比1∶1混合的溶液中活化4-12小时，然后用蒸馏水冲洗，浸入步骤(1)配制的半乳糖化壳聚糖的水溶液中，在37℃水浴中搅拌下反应4-16小时，取出支架，用蒸馏水冲洗，冷冻干燥，得到半乳糖化壳聚糖/聚酯类聚合物复合支架。
[0011] 上述的聚酯类聚合物可以是聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸-乙醇酸共聚物。
[0012] 本发明的有益效果在于：
[0013] 本发明制备的半乳糖化壳聚糖/聚酯类聚合物复合支架，其中聚酯类聚合物多孔支架可以提供良好的
力学强度和肝细胞生长的空间；而半乳糖化壳聚糖中含有半乳糖配体，具有良好的
生物相容性和生物活性，能够促进肝细胞的生长、肝细胞球形聚集体的形成和其特异性功能的维持。本发明制备方法简单、材料来源广泛、生产效率高，具有在生物人工肝和肝组织修复方面的应用价值。
附图说明
[0014] 图1(a)为制备的聚己内酯多孔支架横截面的扫描电镜照片；
[0015] 图1(b)为制备的聚己内酯多孔支架中大孔形貌的扫描电镜照片；
[0016] 图2(a)为在
碱液中处理15分钟后的聚己内酯多孔支架横截面的扫描电镜照片；
[0017] 图2(b)为在碱液中处理15分钟后的聚己内酯多孔支架大孔形貌的扫描电镜照片；
[0018] 图3为半乳糖化壳聚糖/聚己内酯复合多孔支架内部形貌的扫描电镜照片；
[0019] 图4为半乳糖化壳聚糖/聚己内酯复合多孔支架的激光共聚焦
显微镜照片；其中半乳糖化壳聚糖用异硫氰酸
荧光素进行标记，为较亮区域；
[0020] 图5为半乳糖化壳聚糖/聚己内酯复合多孔支架的
应力应变曲线图[0021] 图6为人肝癌细胞在半乳糖化壳聚糖/聚己内酯复合多孔支架中的分布及细胞骨架形态的激光共聚焦显微镜照片；
[0022] 图7(a)为人肝癌细胞在半乳糖化壳聚糖/聚己内酯复合多孔支架中的分布及形态的扫描电镜照片；
[0023] 图7(b)为人肝癌细胞在半乳糖化壳聚糖/聚己内酯复合多孔支架中形成的细胞球形聚集体的扫描电镜照片。
具体实施方式
[0024] 以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
[0025] 实例1：
[0026] (1)将半乳糖化壳聚糖溶解于蒸馏水中，配制成浓度为0.01g/mL的半乳糖化壳聚糖溶液，静置脱泡；将聚己内酯溶解于二氧六环中，配制成浓度为0.1g/ml的聚合物溶液；
[0027] (2)将用标准试验筛筛分的尺寸为280-450μm的明胶粒子倒入模具中，用注射器将体积分数为85％的乙醇溶液注入模具中至浸没粒子；将模具放置于70℃烘箱中5分钟，使明胶粒子粘结成模板，取出模具，放置数天至乙醇挥发完毕，冷冻干燥；取出明胶模板，浸入到聚己内酯溶液中，反复使用先抽真空后恢复至常压的方法将聚己内酯溶液导入模板内部，冷冻干燥，然后置于37℃热水中浸泡至明胶完全溶解，得到聚己内酯多孔支架；如图1(a)所示，可以看出支架具有多孔结构，连通性良好；如图1(b)所示，可以看出支架具有
300μm左右的大孔结构；
[0028] (3)将步骤(2)得到的聚己内酯多孔支架浸入0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，反复使用先抽真空后恢复至常压的方法，将氢氧化钠溶液导入到聚己内酯多孔支架内部；将盛有支架的容器在37℃水浴中放置15min，取出支架，用1mol/L的盐
酸溶液终止反应，用蒸馏水洗涤至中性；在氢氧化钠溶液中处理15分钟的支架，其微观形貌如图2所示，可以看出支架经氢氧化钠溶液处理15分钟后，内部多孔结构仍然得到良好的保持，微观形貌与未处理的支架相比基本没有变化；
[0029] (4)将经步骤(3)处理的聚己内酯多孔支架浸入碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按摩尔比1∶1混合的溶液中活化4小时，然后用蒸馏水冲洗，浸入步骤(1)配制的半乳糖化壳聚糖的水溶液中，在37℃水浴中搅拌下反应8小时，取出支架，用蒸馏水冲洗，冷冻干燥，得到半乳糖化壳聚糖/聚己内酯复合支架。如图3所示，可以看到在多孔支架的孔壁上复合有
纤维层状结构的物质，这种物质即为半乳糖化壳聚糖。图4进一步确认了半乳糖化壳聚糖在多孔支架中的存在，并且从照片上可看出其分布较均匀。该复合支架的应力应变曲线如图5所示，可见该复合支架具有较好的压缩强度。
[0030] (5)将步骤(4)中制备的半乳糖化壳聚糖/聚己内酯复合支架放置于24孔培养板中，在其上接种人肝癌细胞，加入培养液，在
培养箱中进行体外培养。细胞培养一周后的形态采用激光共聚焦显微镜和扫描电镜进行观测，结果分别见图6和图7，由图可见，人肝癌细胞在半乳糖化壳聚糖/聚己内酯复合支架上生长良好，形成了球形聚集体，有望应用到生物人工肝反应器中。
[0031] 实例2：
[0032] 步骤同实例1中的步骤，但在半乳糖化壳聚糖的水溶液中37℃下搅拌下反应16小时，得到半乳糖化壳聚糖/聚己内酯复合支架。
[0033] 实例3：
[0034] 步骤同实例1的步骤，但采用的是聚乳酸-乙醇酸共聚物的二氧六环溶液，且在0.5mol/L的氢氧化钠溶液溶液中的处理60分钟，然后在碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按摩尔比1∶1混合的溶液中活化12小时，最后在半乳糖化壳聚糖的水溶液中37℃下搅拌下反应4小时，得到半乳糖化壳聚糖/聚乳酸-乙醇酸共聚物复合支架。
[0035] 实例4：
[0036] 步骤同实例1的步骤，但采用的是聚乳酸的四氢呋喃溶液，且在2mol/L的氢氧化钠溶液中处理10分钟，得半乳糖化壳聚糖/聚乳酸复合多孔支架。
