一种永生化人肝细胞系及其制备方法和用途
阅读：33发布：2020-07-20
专利汇可以提供一种永生化人肝细胞系及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种永生化人 肝细胞 系及其制备方法和用途。本发明所提供的永生化人肝细胞系具有原代人肝细胞的主要功能，是通过慢病毒载体向原代分离的人正常肝细胞中 转染 SV40T 抗原 和人端粒酶催化亚单位基因，利用克隆法筛选获得永生化人肝细胞系。该永生化人肝细胞系还可以利用微载体方法大规模体外扩增。本发明所述的永生化人肝细胞系可以用于制备 生物 人工肝 支持系统，可以应用于制备 治疗 肝功能衰竭的药物。，下面是一种永生化人肝细胞系及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
一种永生化人肝细胞系及其制备方法和用途
技术领域
背景技术
[0002] 肝移植是治疗终末期肝功能衰竭的唯一有效方法。但是，由于肝供体器官来源非常有限，大多数急性肝功能衰竭的病人往往在等待肝移植供体期间死亡。因此，建立一种生物人工肝支持系统，重建基本的肝脏功能是治疗急性肝功能衰竭的一种新技术，不仅可提高肝衰竭患者的生存率，而且为患者进行肝移植赢得时间。生物人工肝技术是利用具有部分或全部肝细胞活性的细胞装置在生物反应器中，通过该系统中的肝细胞将患者血浆中的毒性物质进行代谢，从而起到替代肝脏功能的效果。
[0003] 生物人工肝中的核心部分是生物反应器。生物反应器一般由生物活性细胞和提供生物活性细胞生长及代谢环境的支持系统构成。生物反应器中使用的细胞性质和功能是决定生物人工肝功能效果的主要因素。目前生物反应器所使用的生物活性细胞主要是新鲜的猪肝细胞(Donato MT，Castell JV，Gomez-Lechon MJ.Characterization of drugmetabolizing activities in pig hepatocytes for use in bioartificial liver devices：comparisonwith other hepatic cellular models.J Hepatol，1999；31(3)：542-549)和人的肝细胞瘤细胞(Court FG，Wemyss-Holden SA，Dennison AR，Bioartificial liver support devices：historical perspectives.ANZ J Surg，2003 Sep；73(9)：739-48)。
[0004] 由于猪肝细胞的细胞色素P450含量及混合氧化酶活性与人肝细胞接近，且具备较好的代谢胆红素与清除血氨的功能，加之猪细胞来源广泛，价格低廉，因此被应用作为生物人工肝的细胞材料(Donato MT，Castell JV，Gomez-Lechon MJ.Characterization of drug metabolizing activities in pig hepatocytes for use in bioartificialliver devices：comparison with other hepatic cellular models.J Hepatol，1999；31(3)：542-549)。现已证明采用猪肝细胞制备生物人工肝存在两大突出问题：1、由于种属差异而导致免疫排斥反应的发生。尽管生物人工肝系统中常规采用半透膜进行免疫阻隔，但高滴度的抗猪IgM和IgG抗体，仍然可在接受2次以上猪肝细胞型生物人工肝治疗者的血中检出，提示接受治疗者暴露于猪肝抗原的情况仍然存在(BaquerizoA，Mhoyan A，Kearns-Jonker M，et al.Characterization of human xenoreactive antibodiesin liver failure patients exposed to pig hepatoytes after bioartificial liver treatment：an exvivo model of pig to human xenotransplantation.Transplantation，
1999；67(1)：5-18)。2、动物携带病毒的感染。研究显示猪的体内普遍存在猪源性逆转录病毒(porcineendogenous retroviral，PERV)和其他人畜共患病毒，这些病毒可能在生物人工肝治疗过程中传染给患者。有研究表明，PERV可以通过人与猪细胞的体外混合培养而进行转导，并且可在新的宿主细胞内复制(van der Laan LJ，Lockey C，Griffeth BC，et al.Infection by porcine endogenous retrovirus after islet xenotransplantation in SCID mice.Nature，2000；407(6800)：90-94)。
1999；67(1)：5-18)。2、动物携带病毒的感染。研究显示猪的体内普遍存在猪源性逆转录病毒(porcineendogenous retroviral，PERV)和其他人畜共患病毒，这些病毒可能在生物人工肝治疗过程中传染给患者。有研究表明，PERV可以通过人与猪细胞的体外混合培养而进行转导，并且可在新的宿主细胞内复制(van der Laan LJ，Lockey C，Griffeth BC，et al.Infection by porcine endogenous retrovirus after islet xenotransplantation in SCID mice.Nature，2000；407(6800)：90-94)。
[0005] 另一种尝试用于生物人工肝的细胞材料是人肝肿瘤细胞，如低度恶性的肝癌细胞株，C3A细胞(Court FG，Wemyss-Holden SA，Dennison AR，Bioartificial liver supportdevices：historical perspectives.ANZ J Surg，2003 Sep；73(9)：739-48)。由于这种细胞存在致瘤性，生物安全性难以充分保证，并且细胞的生物活性较低，功能上难以令人满意，故至今未能在生物人工肝制备中广泛应用。
[0006] 理想的生物人工肝细胞材料应该是人源性、表型正常(非恶性)、容易获得、具有正常肝细胞的解毒功能(Hoofnagle JH，Carithers RL Jr，Shapiro C，et al.Fulminanthepatic failure：summary of a workshop.Hepatology，1995；21(1)：240-252)。人的肝细胞就其生物学功能及免疫学特性而言无疑是为最理想的生物人工肝细胞材料。但由于其来源受到供肝缺乏的限制，而且在体外培养条件下很难增殖。因此，国内外技术人员试图利用永生化技术建立人源化肝细胞系来解决生物人工肝细胞材料的来源问题。但是，到目前为止，国内外所建立的几种永生化肝细胞系例如：OUMS29(Kobayashi N，Noguchi H，Fujiwara T，et al.Establishment of a highly differentiated immortalized adulthuman hepatoyte cell line by retroviral gene transfer.Transplant Pro.2000；32(7)：2368-2369)、HepZ(Werner A，Duvar S，Muthing J，et al.Cultivation andcharacterization of a new immortalized human hepatocyte cell line，HepZ，for use in anartificial liver support system.Ann N YAcad Sci，1999；
875：364-368)等都表现出不同程度的肝细胞功能缺陷，因此还未见有人源化永生化化肝细胞系应用于生物人工肝制备的文献报道。
875：364-368)等都表现出不同程度的肝细胞功能缺陷，因此还未见有人源化永生化化肝细胞系应用于生物人工肝制备的文献报道。
[0007] 除了肝细胞本身因素外，影响生物人工肝功能的另一个重要因素是装载于生物反10 11
应器中的肝细胞数量。生物人工肝所需的肝细胞数量可高达10 ～10 之多(Hoekstra，R.，Chamuleau，R.A.Recent developments on human cell lines for the bioartificial liver.Int.J.Artif.Organs 2002；25：182-191)，在短时间内仅仅依靠平面培养技术获得数量如此巨大的人肝细胞是很困难的。
应器中的肝细胞数量。生物人工肝所需的肝细胞数量可高达10 ～10 之多(Hoekstra，R.，Chamuleau，R.A.Recent developments on human cell lines for the bioartificial liver.Int.J.Artif.Organs 2002；25：182-191)，在短时间内仅仅依靠平面培养技术获得数量如此巨大的人肝细胞是很困难的。
发明内容
[0008] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种永生化人肝细胞系及其制备方法。该永生化人肝细胞系具有原代人肝细胞的主要功能，并且在体外大规模培养该细胞系。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 本发明提供一种永生化人肝细胞系，该永生化人肝细胞系IHH已于2009年8月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.3210。保藏地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
[0011] 所述永生化人肝细胞系的制备方法通过慢病毒载体向原代分离的人正常肝细胞中转染SV40 T抗原和人端粒酶催化亚单位基因，利用克隆法筛选获得永生化人肝细胞系。
[0012] 所述永生化人肝细胞系的制备方法通过慢病毒载体pWPT-SV40Tag和pWPT-hTERT向原代分离的人正常肝细胞中转染SV40 T抗原和人端粒酶催化亚单位基因，其中所述慢病毒载体pWPT-SV40Tag或pWPT-hTERT是分别将SV40 T抗原或人端粒酶催化亚单位基因插入到慢病毒载体pWPT的多克隆位点得到的重组载体。
[0013] 其中，所述慢病毒载体pWPT-SV40Tag和pWPT-hTERT按照如下方法将SV40 T抗原和人端粒酶催化亚单位基因导入到人正常肝细胞中：分别构建含有SV40 T抗原或人端粒酶催化亚单位基因的慢病毒载体pWPT-SV40Tag和pWPT-hTERT；然后包装成具有感染能力但复制缺陷的带有SV40 T抗原或人端粒酶催化亚单位基因的慢病毒颗粒；再感染人正常肝细胞。
[0014] 上述人正常肝细胞为人成体肝细胞。
[0015] 经过鉴定，本发明所述永生化人肝细胞系具有以下主要特性及功能：
[0016] (1)具有明显的体外增殖活性，细胞在体外以二倍体方式增殖，采用我们的肝细胞培养基进行体外培养，其细胞倍增时间为27-32小时。此细胞已经过180代以上的培养，其增殖活性没有明显改变。
[0017] (2)永生化人肝细胞系表达肝细胞的功能性分子，包括代谢胆红素的胆红素二磷酸尿苷葡萄糖醛酸转移酶(bilirubin-uridine diphosphate-glucuronosyltransferase，UGT)，代谢氨的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)，解毒和生物转化功能的谷胱甘肽转移酶π(glutathione-S-transferaseπ，GST)；细胞合成并分泌alpha-1抗胰蛋白酶(alpha-1proteinase inhibitor，API)、人类凝血因子X(human blood coagμlation factor X，)和白蛋白(Albumin，ALB)。
[0018] (3)永生化人肝细胞系具有原代肝细胞的下列功能：胆红素的代谢功能、合成尿素的功能、合成凝血因子X的功能、合成白蛋白的功能。
[0019] 细胞与肝衰竭患者血浆进行孵育，结果培养时间的延长血浆中的胆红素进行性降低，而血浆中的尿素浓度进行性升高，表明细胞具有很好的体外解毒功能。
[0020] 本发明所述永生化人肝细胞系的制备方法还包括，筛选获得永生化人肝细胞系后，利用微载体方法大规模体外扩增永生化人肝细胞系。所述微载体可以是任何适于细胞培养的微载体。
[0021] 生物人工肝的制备需要的肝细胞数量非常巨大(约100-200克)，因此，采用传统的平面培养技术很难达到这一目标。为了在体外大规模培养本发明的永生化人肝细胞系，本发明人建立了一种微载体培养永生化人人肝细胞的方法。使用的微载体可以是任何适合细胞培养的微载体，包括但不限于Cytopore 2和Cytodex 3微载体。将微载体按照生产商4 7
的说明进行预处理后，将所述永生化人肝细胞系和微载体按照1.0×10 ～1.0×10cells/
5 6
ml微载体的比例混悬于200ml培养基中，优选比例为1.0×10 ～1.0×10cells/ml微载体。将细胞和微载体悬液加入Magna Flex微载体悬浮培养瓶中，37℃，95％空气5％CO2，饱和湿度环境中培养。
的说明进行预处理后，将所述永生化人肝细胞系和微载体按照1.0×10 ～1.0×10cells/
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ml微载体的比例混悬于200ml培养基中，优选比例为1.0×10 ～1.0×10cells/ml微载体。将细胞和微载体悬液加入Magna Flex微载体悬浮培养瓶中，37℃，95％空气5％CO2，饱和湿度环境中培养。
[0022] 微载体培养不仅为肝细胞的生长提供了充分的贴壁空间，使培养的细胞数量在同等容器中达到平面培养的3-6倍，细胞非常容易从培养体系中装置到生物反应器内，而且由于肝细胞在微载体贴壁生长使肝细胞在生物反应器中的存活时间明显延长，从而提高生物人工肝的解毒功能。这些特点也使得微载体培养技术在生物人工肝领域中具有良好应用前景。
[0023] 本发明所要解决的第二个技术问题是所述永生化人肝细胞系在制备生物人工肝中的应用。
[0024] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0025] 本发明提供了上述方法获得的永生化人肝细胞系在制备生物人工肝中的应用。尤其是将微载体培养的永生化人肝细胞系作为肝细胞材料，装载到中空纤维滤器的管外空间中，制备成一种生物反应器。这种生物反应器通过与透析治疗仪相连接，就制备成一种混合型人工肝支持系统，该系统可以应用于肝功能衰竭病人的治疗。
[0026] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种永生化人肝细胞系在制备治疗肝功能衰竭药物中的应用。
[0027] 试验表明，本发明所述的永生化人肝细胞系，尤其是采用微载体培养的永生化人肝细胞对急性肝功能衰竭的动物进行腹腔透析，可以使动物的生存率由0％提高到80％，进一步表明永生化人肝细胞系具有体内解毒功能。
[0028] 综合上述，本发明所述的永生化人肝细胞系的优势在于：
[0029] 1.细胞保留了原代人肝细胞的主要特性，例如表达肝细胞的功能性分子，包括代谢胆红素的胆红素二磷酸尿苷葡萄糖醛酸转移酶(bilirubin-uridinediphosphate-glucuronosyltransferase，UGT)，代谢氨的谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，GS)，解毒和生物转化功能的谷胱甘肽转移酶π(glutathione-S-transferaseπ，GST)；细胞合成并分泌alpha-1抗胰蛋白酶(alpha-1 proteinase inhibitor，API)、人类凝血因子X(human blood coagμlation factor X，)和白蛋白(Albumin，ALB)。
[0030] 2.细胞保留了原代人肝细胞的主要功能，例如胆红素的代谢功能、合成尿素的功能、合成凝血因子X的功能、合成白蛋白的功能。
[0031] 3.细胞可以在体外进行无限制的体外扩增培养。
[0032] 4.本发明的永生化肝细胞是人源化的，无种属差异，用于生物人工肝治疗时，避免了异种蛋白的免疫反应，从根本上解决了现有猪肝细胞作为生物人工肝活性细胞的动物源性感染问题。
[0033] 5.将本发明永生化人肝细胞系联合微载体培养技术，可以用于制备生物人工肝支持系统，可以用于制备治疗肝功能衰竭的药物，应用于肝功能衰竭病人的治疗。
附图说明
[0036] 所用的载体包括三个质粒：pWPT-GFP基因转移载体，含有由CMV启动子启动的增强型GFP基因(EGFP)；病毒包装载体psPAX2，编码HIV-1的Gag和Pol前体，以及调节蛋白Tat和Rev；衣壳编码质粒pMD.G，表达病毒的VSV G包装蛋白。
[0037] 图2.永生化人肝细胞系的形态；
[0038] A.永生化人肝细胞系的形态B.永生化人肝细胞系的生长曲线
[0039] 图3.IHH的功能特性分析；
[0040] A：RT-PCR检测IHH细胞肝脏特异基因的mRNA表达，泳道1-14依次为1：DL-2000DNA标记；2：猴病毒40大T抗原；3：人端粒酶逆转录酶；4：α1-抗胰蛋白酶；5：
细胞角蛋白18；6：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶；7：谷胺酰胺合成酶；8：谷胱甘肽硫转移酶；9：人凝血因子X；10：β-actin；11：白蛋白；12：ASGPI；13：CYP；14：DL-2000 DNA标记；
细胞角蛋白18；6：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶；7：谷胺酰胺合成酶；8：谷胱甘肽硫转移酶；9：人凝血因子X；10：β-actin；11：白蛋白；12：ASGPI；13：CYP；14：DL-2000 DNA标记；
[0041] B：蛋白质印迹法检测IHH上肝细胞特异性功能蛋白的表达，泳道1-6分别为1：α1-抗胰蛋白酶；2：谷胺酰胺合成酶；3：谷胱甘肽硫转移酶；4：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶；5：白蛋白6：actin；
[0042] 图4：Gimsa染色观察微载体培养的IHH，A：中空微载体上培养的IHH；B：实体微载体培养的IHH；
[0043] 图5：IHH对肝功能衰竭患者血浆的解毒作用；A为对肝功能衰竭患者血浆总胆红素的影响，B为对肝功能衰竭患者血浆尿素氮浓度的影响；其中LSEC为人肝窦内皮细胞，作为阴性对照；HFHC为人胚胎肝细胞，作为阳性对照；IHH为本发明的永生化人肝细胞系；TB指总胆红素，BUN指尿素氮；
[0044] 图6：微载体培养IHH制备的生物人工肝对肝功能衰竭患者血浆的解毒作用；A为对肝功能衰竭患者血浆总胆红素的影响，B为对肝功能衰竭患者血浆尿素氮浓度的影响；其中TB指总胆红素，BUN指尿素氮。
具体实施方式
[0045] 实施例1永生化人肝细胞系(IHH)的建立：
[0046] 原代分离的人肝细胞的获得：通过胶原酶灌注法从肝切除的外科手术标本分离肝细胞(Nguyen TH，Oberholzer J，Birraux J，et al.Highly efficient Lentiviral vector-mediatedtransduction of nondividing，fully reimplantable primary hepatocytes.Molecular therapy，2002，6(2)：1 99-209)。
[0047] 载体和质粒：如图1所示，所用的载体包括三个质粒：pWPT-GFP基因转移载体，含有由CMV启动子启动的增强型GFP基因(EGFP)；病毒包装质粒psPAX2，编码HIV-1的Gag和Pol前体，以及调节蛋白Tat和Rev；衣壳编码质粒pMD.G，表达病毒的包装蛋白VSV G。携带SV40 T抗原基因的质粒Plox-Ttag-iresTK和携带hTERT基因的质粒pBabe-hygro-hTert。(载体质粒均购自瑞士Addgene机构)。
[0048] 构建编码SV40 T抗原和hTERT的慢病毒载体：将慢病毒载体质粒pWPT-GFP用NEB公司的BamH1和Sal I酶进行双酶切释放出GFP，酶切条件为50μl反应体系中BamH1和Sal I的量分别加1μl，37℃1h，15min，然后65℃20min使酶灭活；然后将载体两端抹平，方法是在上述反应结束后向反应体系加入1μl Klenow酶和2mMdNTP，室温放置15min，75℃，25min，最后再加入0.25μlcip酶于37℃孵育30min。最后将酶切产物进行1％低融点琼脂糖凝胶电泳，用德国Qiagen公司凝胶回收试剂盒(货号28704)回收载体pWPT片段。
将质粒Plox-Ttag-iresTK和质粒Plox-TERT-iresTK用Sal I和EcoRI进行双酶切，酶切条件为37℃30min，65℃20min使酶灭活；然后将两端抹平，方法是在上述反应结束后向反应体系加入1μl Klenow酶和2mM dNTP，室温放置15min，75℃，25min，最后再加入0.25μl cip酶于37℃孵育30min。最后将酶切产物进行1％低融点琼脂糖凝胶电泳，用德国Qiagen公司凝胶回收试剂盒(货号28704)分别回收SV40T抗原片段和hTERT片段。将这两个片段测序后进行基因序列比对证实：SV40 T抗原片段与Genebank No.J02400的nt2691-5163序列相同；而hTERT片段与Genebank No.AF018167序列相同。随后将得到的目的基因片段(SV40 T抗原片段和hTERT片段)分别与回收的载体片段连接，连接反应条件为：使用T4连接酶，16℃过夜。如此得到分别编码SV40 T抗原和hTERT基因的pWPT-SV40Tag载体和pWPT-hTERT载体。
将质粒Plox-Ttag-iresTK和质粒Plox-TERT-iresTK用Sal I和EcoRI进行双酶切，酶切条件为37℃30min，65℃20min使酶灭活；然后将两端抹平，方法是在上述反应结束后向反应体系加入1μl Klenow酶和2mM dNTP，室温放置15min，75℃，25min，最后再加入0.25μl cip酶于37℃孵育30min。最后将酶切产物进行1％低融点琼脂糖凝胶电泳，用德国Qiagen公司凝胶回收试剂盒(货号28704)分别回收SV40T抗原片段和hTERT片段。将这两个片段测序后进行基因序列比对证实：SV40 T抗原片段与Genebank No.J02400的nt2691-5163序列相同；而hTERT片段与Genebank No.AF018167序列相同。随后将得到的目的基因片段(SV40 T抗原片段和hTERT片段)分别与回收的载体片段连接，连接反应条件为：使用T4连接酶，16℃过夜。如此得到分别编码SV40 T抗原和hTERT基因的pWPT-SV40Tag载体和pWPT-hTERT载体。
[0049] 慢病毒颗粒的包装
[0051] 每个培养皿转染20ug质粒DNA，其中包括：10ug转染载体质粒(pWPT-GFP或pWPT-SV40Tag或pWPT-hTERT)，3.5ug衣壳编码质粒和6.5ug包装质粒。将此20ug质粒载体用0.1xTE溶液(1mM Tris-HCl和0.1mM EDTA)重悬至体积450μl，再加入50μl的2.5M CaCl2溶液，轻轻混匀。然后一边涡旋混匀一边逐滴加入500μl的2x HEPES缓冲盐溶液(0.1M HEPES，0.281 M NaCl，和1.5mM Na2HPO4[pH 7.12])。室温放置30min，然后将混合物加到培养的细胞上，慢慢加入悬液，边加边轻轻震动皿中的培养基。然后将培养皿放入37℃培养箱培养。16h后更换10ml新鲜培养基。以后每隔24h收集并更换一次培养基，收集的上清通过900g离心10min以去除细胞碎片，用0.2-μm孔径的针头滤器过滤。通过上述方法分别包装成具有感染能力但复制缺陷的带有GFP基因、SV40 T抗原和人端粒酶催化亚单位基因的慢病毒颗粒，然后直接使用或冻存在-80℃备用。
[0052] 病毒颗粒的滴定
[0053] 在12孔板中接种Hela细胞，密度为1x105细胞/孔，培养在添加10％FCS，2mM谷氨酰胺，和10mM Hepes(GibcoBRL，Life Technologies)的DMEM培养基中。在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
[0054] 加入连续稀释的慢病毒颗粒和终浓度8μl/ml凝聚胺，继续培养48h。用胰酶消化收集细胞，离心后弃上清，将沉淀重悬在300μl 3.7％甲醛/PBS中，用FACS分析EGFP阳性细胞比例。滴度表示为转导单位/ml(TU/ml)，TUs(transduction units)。本实验测得的7
病毒颗粒滴度为2x10TU/ml。
病毒颗粒滴度为2x10TU/ml。
[0055]
[0056] 慢病毒颗粒感染人肝细胞
[0057] 原代分离的人肝细胞接种于24孔板中，使用DMEM/F-12培养基(GIBCO-BRL)，其中添加10％FCS，1×10-6M地塞米松，1×10-8M三碘甲腺原氨酸，1×10-8M牛胰岛素，5ug/ml转铁蛋白，15mM Hepes和100ug/ml肝细胞生长因子。培养24h后用PBS洗一次，然后加入含3x106TU的带有SV40 T抗原基因的病毒颗粒500μl，相当于感染复数(multiplicity ofinfection，moi)30。然后放入37℃培养箱中，培养16h后更换新鲜培养基。7天后用同样方法感染带有hTERT基因的病毒颗粒。
[0058] 感染后阳性克隆的筛选：由于正常人肝细胞体外不增殖，只有感染成功的细胞表现出增殖现象，并在局部形成细胞克隆。因此，感染后选择增殖的肝细胞克隆，用弯头吸水管吸取一滴消化液(0.1％胰酶/0.1％EDTA溶液)，在倒置相差显微镜观察下，将吸管尖端置于增殖的细胞克隆上，轻轻挤出消化液并保持吸管位置不变，待该克隆细胞收缩变圆后立即吸起该克隆的细胞，用IHH培养基重悬后分别接种96孔板和24孔板各一孔。所述的IHH培养基为DMEM/F-12培养基(GIBCO-BRL)，其中添加10％FCS，15mM Hepes和100ug/ml肝细胞生长因子。将96孔板的细胞用于筛选鉴定，24孔板的细胞用于扩增培养。由于alpha-1抗胰蛋白酶(Api)是肝细胞的特异性标志物，因此Api阳性的细胞克隆将是我们所需要的肝细胞克隆。具体地，待96孔板内细胞生长至80％汇合，将其用PBS洗涤2次，然后用4％多聚甲醛于室温固定30min。PBS洗涤3次后，加入1％BSA/PBS溶液室温封闭15min，然后加入小鼠抗人Api抗体(美国，Sigma公司)4℃过夜。经PBS洗涤3次后，加入FITC标记的羊抗小鼠IgG，室温孵育30min，PBS洗涤3次后在荧光显微镜下观察并记录Api阳性的细胞克隆。选择和Api阳性细胞克隆对应的24孔板中的细胞用IHH培养基连续传代培养，传代超过80代，获得了该永生化人肝细胞系(Immortal human hepatocyte cell line，IHH)，该细胞系呈单层贴壁生长(如图2A)，经MTT分析测定细胞的生长曲线(如图2B)发现其体外增殖迅速。该永生化人肝细胞系IHH已于2009年8月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.3210。保藏地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
[0059] 实施例2 IHH的功能特性：
[0060] 评价实施例1所获得的永生化人肝细胞系的功能特性，首先应用RT-PCR方法检测了IHH表达成人肝细胞特异分子mRNA的情况。收集IHH细胞，使用Qiagen公司的RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，随后取2ug总RNA，使用Qiagen公司的逆转录试剂盒进行逆转录。然后使用Promega公司的Taq酶进行PCR扩增，其中所使用的引物由上海生工生物工程有限公司合成，各基因的特异引物序列如下表1：
[0061] 表1.PCR扩增引物序列
[0062]
[0063] 扩增条件为：初始变性温度94℃ 2min，循环变性温度94℃ 30s，退火温度55℃30s，延伸温度72℃30s，共30个循环。终末延伸温度72℃10min，4℃冷却。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，在AlphaImager 2200型凝胶成像系统上进行分析。
[0064] 结果发现IHH表达肝细胞特异的基因Api和CK-18的mRNA，表达参与胆红素代谢的酶UGT1的mRNA、参与氨代谢的酶GS和氧化还原反应的II相酶GST的mRNA，也表达凝血因子HBCF-X和ALB的mRNA(图3A)。
[0065] 随后应用Western blot检测了肝细胞功能蛋白α1-抗胰蛋白酶(Api)尿苷二磷酸胆红素葡萄糖醛酸转移酶1(UGT1)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和白蛋白(ALB)的表达。结果证实在蛋白质水平IHH也表达这几种蛋白(图3B)。
[0066] 实施例3 IHH的安全性评价：
[0067] 取对数生长期的实施例1获得的IHH细胞，用Hank’s液(137.93mM NaCl，5.33mMKCl，4.17mM NaHCO3，1.26mM CaCl2，0.493mM MgCl2，0.441mM KH2PO4，
0.338mMNa2HPO4，5.56mM D-葡萄糖)洗涤2次后重悬于DMEM/F12基础培养基中，将细胞接
6
种于5只BALB/c裸鼠皮下和肝脏，每个点接种5×10 个细胞。另一组裸鼠同时于皮下及
6
肝脏相同部位接种肝癌细胞BEL-7402作为阳性对照，每个点接种5×10 个细胞作为阳性对照。接种后连续观察6个月，结果在裸鼠的皮下和肝脏接种点均无肿瘤形成，而在相同部位接种同样数量肝癌细胞BEL-7402的裸鼠皮下和肝脏在移植1个月后即均有肿瘤形成。
0.338mMNa2HPO4，5.56mM D-葡萄糖)洗涤2次后重悬于DMEM/F12基础培养基中，将细胞接
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种于5只BALB/c裸鼠皮下和肝脏，每个点接种5×10 个细胞。另一组裸鼠同时于皮下及
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肝脏相同部位接种肝癌细胞BEL-7402作为阳性对照，每个点接种5×10 个细胞作为阳性对照。接种后连续观察6个月，结果在裸鼠的皮下和肝脏接种点均无肿瘤形成，而在相同部位接种同样数量肝癌细胞BEL-7402的裸鼠皮下和肝脏在移植1个月后即均有肿瘤形成。
[0068] 实施例4.微载体培养永生化人肝细胞系：
[0069] 分别取5g微载体Cytopore 2(空心微载体)或Cytodex 3(实心微载体)，置入2+ 2+
300ml无Ca 和Mg 的PBS液中，加1-2ml Tween-80，震荡混匀，水化过夜，离心，去除上清
2+ 2+ 2+
液，用新的无Ca 和Mg 的PBS液300-500ml冲洗几分钟，重复3次，最后再加入无Ca 和
2+
Mg 的PBS液至300ml，在115℃，15psi条件下高压灭菌15min，迅速冷却，加入300ml DMEM培养基，30min后弃去上清，重新加入300ml含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基，放置过夜后使用。
300ml无Ca 和Mg 的PBS液中，加1-2ml Tween-80，震荡混匀，水化过夜，离心，去除上清
2+ 2+ 2+
液，用新的无Ca 和Mg 的PBS液300-500ml冲洗几分钟，重复3次，最后再加入无Ca 和
2+
Mg 的PBS液至300ml，在115℃，15psi条件下高压灭菌15min，迅速冷却，加入300ml DMEM培养基，30min后弃去上清，重新加入300ml含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基，放置过夜后使用。
[0070] 将实施例1获得的IHH细胞和微载体以5.0×105cells/ml微载体的比例混合，接种于未处理的培养瓶中，使用的培养基为DMEM/F-12培养基(GIBCO-BRL)，其中添加10％FCS，15mM Hepes和100ug/ml肝细胞生长因子。将培养瓶置于含有5％CO2、95％空气、饱和湿度的37℃培养箱培养。为利于细胞贴附在微载体上，使用滚动培养。每隔24h换液一次。微载体上的肝细胞形态和数量通过Gimsa染色进行观察，当微载体上长满细胞时，Gimsa染色可见微载体上均匀分布的着色的细胞核(图4)。
[0071] 实施例5 IHH对肝衰竭患者血浆的体外解毒功能评价
[0072] 为分析实施例1获得的IHH对肝衰竭患者血浆的解毒能力，将IHH(1×105细胞)5
分别接种于24孔培养板，同时，以1×10 细胞/孔的细胞密度接种永生化人肝窦内皮细胞系(human liver sinusoidal endothelial cells，LSEC)作为阴性对照，以人胚胎肝细胞作为阳性对照。培养2天后将培养基换成含有50％肝衰竭患者血清的培养基，每孔1ml，每个血清样本设三个平行孔。分别于培养12、24、48小时收集各培养孔的上清200μl，冻存于-80℃冰箱待测。待样品全部收集结束后，应用OLYMPUS AU400型生化检测仪，分别测定培养上清中总胆红素和尿素的水平。结果如图5，实施例1获得的永生化人肝细胞系IHH能有效降低肝衰竭患者血浆中的胆红素，增加血浆中尿素浓度，并表现明显的时间依赖性。
分别接种于24孔培养板，同时，以1×10 细胞/孔的细胞密度接种永生化人肝窦内皮细胞系(human liver sinusoidal endothelial cells，LSEC)作为阴性对照，以人胚胎肝细胞作为阳性对照。培养2天后将培养基换成含有50％肝衰竭患者血清的培养基，每孔1ml，每个血清样本设三个平行孔。分别于培养12、24、48小时收集各培养孔的上清200μl，冻存于-80℃冰箱待测。待样品全部收集结束后，应用OLYMPUS AU400型生化检测仪，分别测定培养上清中总胆红素和尿素的水平。结果如图5，实施例1获得的永生化人肝细胞系IHH能有效降低肝衰竭患者血浆中的胆红素，增加血浆中尿素浓度，并表现明显的时间依赖性。
[0073] 实施例6 IHH对肝衰竭实验动物的体内解毒功能评价
[0074] 采用腹腔注射四氯化碳的方法用裸鼠制备急性肝功能衰竭的动物模型，并将模型动物分为三组(每组14只)。第一组在四氯化碳注射后24小时腹腔注射0.9％氯化钠溶液2ml，第二组在四氯化碳注射后24小时腹腔注射2ml没有肝细胞的微载体，第三组在四氯化碳注射后24小时注射2ml长满永生化人肝细胞的微载体(按照实施例4所述的方法6
培养，达到6x10 细胞)，比较各组动物的生存率。结果显示：第一组动物在四氯化碳注射3天后动物生存率为0％；第二组动物在四氯化碳注射4天后生存率为0％；而第三组动物在四氯化碳注射3天后生存率为80％，并持续2周没有变化。结果表明，采用微载体培养的永生化人肝细胞对急性肝功能衰竭的动物进行腹腔透析，可以使动物的生存率由0％提高到
80％，进一步表明实施例1获得的永生化人肝细胞系具有体内解毒功能。
培养，达到6x10 细胞)，比较各组动物的生存率。结果显示：第一组动物在四氯化碳注射3天后动物生存率为0％；第二组动物在四氯化碳注射4天后生存率为0％；而第三组动物在四氯化碳注射3天后生存率为80％，并持续2周没有变化。结果表明，采用微载体培养的永生化人肝细胞对急性肝功能衰竭的动物进行腹腔透析，可以使动物的生存率由0％提高到
80％，进一步表明实施例1获得的永生化人肝细胞系具有体内解毒功能。
[0075] 实施例7：永生化人肝细胞系作为细胞材料在生物人工肝制备中的应用[0076] 按照实施例4所述方法使用微载体大量扩增培养IHH，使用无血清培养基Keratinocyte-SFM( 美 国 Invitrogen公 司 )，添 加 rEGF(终 浓 度0.1ng/ml) 和BPE(bovinepituitary extract)20-30ug/ml。扩增至400-500ml微载体后，将这些长满IHH的微载体用无血清基础DMEM/F12培养基洗涤三次，将长满IHH的微载体装载到中空纤维滤器的管外空间中，制备成一种生物反应器。其中中空纤维滤器可以是任何适用于制备生物反应器的中空纤维滤器，优选中空纤维管的截流分子质量30-200kDa，膜孔径100-300nm，更优选其截流分子质量为50-150kDa，膜孔径150-250nm。这种生物反应器通过与透析治疗仪相连接，就制备成一种混合型人工肝支持系统。为检测该系统的解毒能力，收集肝衰竭患者的置换血浆，将其用此系统进行透析12h和24h，分别检测透析前后总胆红素和尿素的含量。结果显示，透析后总胆红素进行性下降，而尿素氮水平逐渐升高(图6)。说明该细胞既可以降低胆红素，又具备转化氨的能力，表明其可以作为细胞材料，用于制备生物人工肝。
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