在低于-80℃的超低温状态下,各种细胞内部的生化反应极其缓慢甚或终 止,利用这一原理,将细胞置于-196℃以下,使其生命活动“固定”而非死亡, 需要时以适当的方法解冻,恢复其活性的方法即为细胞的超低温保存。
冻存过程中引起细胞损伤或死亡的情况很多,其对细胞造成的伤害主要有 以下几个方面:1)细胞膜流动性减小,细胞膜僵化将导致细胞的进一步损伤; 2)在复温过程中产生
氧自由基;3)导致细胞
坏死和凋亡。
但是至今为止,除少数几种细胞以外,超低温的保存技术还不成熟,而且 很难形成一套统一的方案。可见,超低温保存液的成分尚需要进一步的改良与 优化。这对于采用离
体细胞通过体外组装成的人工器官尤其重要。且有望用于
化妆品和药品临床前的体外安全性检测等。因此,本
专利针对超低温保存引起 的细胞损伤现象,改良超低温保存液成分,提高超低温保存效果。
随着中药现代化,中药有效成分具有抑制细胞凋亡、稳定细胞膜和清除自 由基等保护功能,可以通过各自机制保护细胞免于超低温状态下的细胞受损。 以下是文献所报道的部分中药有效成分的一些具体作用。
甘草酸[1]对细胞有抑 制凋亡、清除氧自由基的功效,苦参
碱在0.2~10mg/L浓度范围下能清除自由 基,保护细胞膜结构,减轻细胞的损伤,且能明显抑制由
肿瘤坏死因子所诱导 的体外大鼠
肝细胞的凋亡,且对细胞功能有很强的促进作用。山莨菪碱[2]有稳 定细胞膜和抗氧自由基损伤的作用。五味子乙素[3]对两种不同自由基产生系统 所引起的肝细胞脂质过氧化损伤均有保护作用,使肝细胞存活串提高,并能保 持细胞膜形态完整。有相关功效的中药有效成分还有:丹参素[4]、黄芪多糖[5]、 柴胡皂甙[6]等。
因此,这些中药中的有效成分均是离体细胞超低温保存的良好保护剂。根 据超低温损伤机理,所添加的中药保护成分,主要用来清除氧自由基、抑制
钙 通道、增加细胞膜的
稳定性和抑制超低温引起的细胞凋亡等渠道来保护超低温 保存中的离体细胞。但至今未有文献报道将五味子乙素、山莨菪碱、
甘草酸、 丹参素、黄芪多糖、柴胡皂甙等中药有效成分应用于离体细胞的超低温保存。
本发明的目的在于,针对
现有技术的不足,提供一种动物细胞的超低温保 存溶液,同时,也提供一种应用此保存溶液进行超低温的保存方法。
该发明的基本思路是:在动物细胞
基础培养基中加入各种保护因子,抑制 因为超低温保存所造成的细胞损伤,而且超低温保存中以及前后的预培养和复 温培养中都添加了保护因子,强化其对细胞的保护作用。该保护因子主要由中 药有效成分组成。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种动物细胞的超低温保存溶液,它包括动物细胞基础培养基、胎
牛血清、 二甲基亚砜和中药有效成分山莨菪碱、五味子乙素、甘草酸、苦参碱、丹参素、 黄芪多糖、柴胡皂甙;所述动物细胞基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜的体 积比为7∶2∶1,各中药有效成分的浓度分别为:山莨菪碱0~500mg/L、五味 子乙素0~100mg/L、甘草酸0~100mg/L、苦参碱0~100mg/L、丹参素0~ 100mg/L、黄芪多糖0~100mg/L、柴胡皂甙0~100mg/L。
进一步地,所述动物细胞基础培养基为1640培养基、HTS液、L-15或Ham’s F12。
一种应用上述超低温保存溶液进行的超低温保存方法,用于保存动物细 胞,它包括如下步骤:
(1)将刚分离得到的或已经过一段时间培养的动物细胞在二氧化
碳培养箱中 预培养0~24小时;
(2)将预培养后的动物细胞在
权利要求1所述的超低温保存溶液中保存0~48 月;
(3)保存完毕后,在二氧化碳培养箱中复温培养。
进一步地,所述动物细胞是从组织器官中分离得到的原代细胞。
进一步地,所述步骤(1)和(3)中,所述二氧化碳培养箱中,为防止细 胞在逐渐升温过程中受损,使用的动物细胞基础培养基中添加了各保护因子, 其组成为:钙离子Ca2+0~10mol/L、山莨菪碱0~500mg/L、五味子乙素0~ 100mg/L、甘草酸0~100mg/L、苦参碱0~100mg/L、丹参素0~100mg/L、黄 芪多糖0~100mg/L、柴胡皂甙0~100mg/L。
本发明专利的有益效果是,通过独特的中药有效成分和其他化学保护剂成 分的添加,优化了超低温保存液配方,较好地通过超低温保存方法维持细胞的 生物学活性及特异性功能。同时,在-80~-196℃下超低温保存情况下,细胞 运输和保存过程中不需要任何营养和氧气供给,操作简单可行,为离体细胞的 长期保存和远程运输带来便利,具有很大的实用价值。
下面根据具体
实施例详细介绍本发明内容,本发明的目的和效果将变得更 加明显。
为了克服现有的超低温保存过程中保存细胞效果差的严重不足,本发明以 基于添加各种不同功能的中药保护成分为
主要发明创造点,此外结合廉价的化 学保护剂来研制一种有效的用于超低温保存离体细胞的溶液,同时也提供一种 相应的便于操作的超低温保存方法。
在预培养和复温过程中,为了防止细胞在逐渐升温时受到损伤,二氧化碳 培养箱中在现有的动物细胞基础培养基中加入了各种保护因子:Ca2+0~ 10mol/L、山莨菪碱0~500mg/L、五味子乙素0~100mg/L、甘草酸0~100mg/L、 苦参碱0~100mg/L、丹参素0~100mg/L、黄芪多糖0~100mg/L、柴胡皂甙0~ 100mg/L,pH调节至7.4;二氧化碳培养箱的培养条件为37℃,内含5%的二氧 化碳。
现有的基础培养基可为:Eagle’s MEM,DMEM,Ham’s F10或12,DMEM /F12,PRMI 1640,L-15,M199,Williams’E等培养基。
本发明的超低温保存溶液是在0.7升现有的动物细胞基础培养基中加入 0.2升的胎牛血清(FBS)、0.1升二甲基亚砜(DMSO)、0~500mg/L的山莨菪碱、 0~100mg/L的五味子乙素、0~100mg/L的甘草酸、0~100mg/L的苦参碱、0~ 100mg/L的丹参素、0~100mg/L的黄芪多糖、0~100mg/L的柴胡皂甙,最终 pH为7.4。
超低温保存溶液所使用的动物细胞基础培养基可为:1640培养基,HTS液, L-15,Ham’s F12等。
超低温保存方法的步骤为:将体外培养或刚分离得到的细胞先在正常培养
温度(37℃)下采用含有效保护成分的培养基来预培养0~24小时,将培养基 切换成0~4℃的超低温冻存溶液,保存细胞
密度为5.0×106/毫升,放入-80℃
冰箱过夜保存(12~15小时)后,再将其放入液氮中保存0~48月。保存完毕 后采用37℃
水浴快速复温,采用新鲜的动物细胞培养基进行复温培养,该培 养基仍添加了有效保护成分。
保存和培养细胞的方式有悬浮培养、贴壁培养、凝胶包埋培养、聚球体培 养等。这样所得到的高活率细胞可用于人工器官和其他医药研究。
实施例1
新鲜分离肝细胞,Williams’E培养基(添加有5mg/L苦参碱、5mg/L山 莨菪碱、10mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸,10mg/L丹参素、10mg/L黄芪 多糖、10mg/L柴胡皂甙),37℃,5%CO2培养箱悬浮预培养0.5小时。将培 养基换成1640培养基,该溶液成分为50%的1640培养基,添加体积比为10 %的二甲基亚砜(DMSO),此外复合保存液中还添加有100mg/L苦参碱、 50mg/L山莨菪碱、50mg/L五味子乙素、50mg/L甘草酸、100mg/L黄芪多糖、 100mg/L柴胡皂甙等,细胞最终密度1×107。-80℃冰箱过夜保存(15-20小时), 最后放入液氮中保存15天。于37℃水浴中进行解冻,然后进行复温培养。该 复温时使用的Williams’E培养基中添加了与预培养时相同成分的保护剂,复 温并贴壁培养24小时、48小时、96小时后检测各项指标。
单层贴壁培养方式下,使用添加有各种中药保护成分的超低温保存液与不 含中药保护成分的超低温保存液的结果差别: MTT(OD570) 对照组 加药组 24h 96h 0.348 0.296 0.442 0.401
由实验数据,加药组与对照组相比,其细胞存活率更高,可见使用添加有 各种中药成分的超低温保存液其保存效果优于普通超低温保存液。
实施例2
将无菌条件下
收获的软骨细胞,置于37℃进行凝胶包埋,注入中空
纤维丝, 细胞密度为1×105。将中空纤维丝组件放入5cm玻璃皿,浸没于DMEM/F12培养 基(培养液中的添加成分:10mg/L苦参碱、50mg/L山莨菪碱、10mg/L五味子 乙素、10mg/L甘草酸,10mg/L丹参素、10mg/L黄芪多糖、10mg/L柴胡皂甙, 3mMCa2+。),37℃,5%CO2培养箱静置预培养2h。将培养基换成保护剂添加含量 和成分均相同的的HTS液,-80℃冰箱过夜保存(15-20小时),最后放入液氮中 保存2个月。于37℃水浴解冻,复温时使用的DMEM/F12培养基中也添加了与预 培养时同样成分的保护剂,复温并贴壁培养24小时、48小时、96小时后检测各 项指标。
凝胶包埋培养方式下,使用添加有各种中药保护成分的超低温保存液与 不含中药保护成分的超低温保存液的结果差别:
白蛋白分泌量(pg/cell) 对照组 加药组 0h 24h 48h 96h 0 3.1 4.0 6.7 0 3.5 5.2 8.3
实施例3
将无菌条件下收获的
成纤维细胞细胞,置于37℃进行聚球体培养,注入中 空纤维丝,细胞密度为1×106。将中空纤维丝装入
硅胶管,加入RPMI 1640培 养基(培养液中的添加成分:10mg/L苦参碱、50mg/L山莨菪碱、10mg/L五味 子乙素、10mg/L甘草酸,10mg/L丹参素、10mg/L黄芪多糖、10mg/L柴胡皂甙, 3mMCa2+。),37℃,5%CO2培养箱静置预培养1h。将培养基换成保护剂添加含量 和成分均相同的的UW液,-80℃冰箱过夜保存(15-20小时),最后放入液氮中 保存5个月。于37℃水浴解冻,复温时使用的RPMI 1640培养基中也添加了与 预培养时同样成分的保护剂,复温并贴壁培养24小时、48小时、96小时后检测 各项指标。
聚球体培养方式下,使用添加有各种中药保护成分的超低温保存液与不含 中药保护成分的超低温保存液的结果差别如下: 尿素分泌量(pg/cell) 对照组 加药组 0h 48h 96h 0 60.1 99.8 0 78.9 123.8
上述实施例用来解释说明本发明,而不是对本发明进行限制,在本发明的 精神和权利要求的保护范围内,对本发明作出的任何
修改和改变,都落入本发 明的保护范围。
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