生物可降解高分子在生物医学领域具有良好的应用前景，原因是生物可降解高 分子可以在生物体内降解，其降解产物或被排除体外，或参与生命体代谢，从而可 以减少副作用。合成的生物可降解高分子在药物输运、基因传递、细胞培养和组织 工程等生物医用领域获得了广泛的应用。在这类聚合物中，聚乳酸由于其良好的机 械性能，优良的可塑性成为应用的最为广泛的聚合物之一。例如：在美国，用乳酸 和乙醇酸的共聚物微球包载促黄体激素释放激素(LHRH)类似物可治疗乳腺癌和前 列腺癌，已经商品化，商品名叫垂普啉。然而，聚乳酸的疏水性阻碍了它在生物医 学领域的应用，特别是在药物控释方面，聚乳酸与水溶性药物的结合力很低。
聚磷酸酯是一类由磷酸酯键连接主链结构单元的可降解高分子材料，最早用作 阻燃材料，在上个世纪80年代，开始用于核酸和磷壁酸的仿生合成，接着在1980 年开始用于药物传输等生物医用方面。聚磷酸酯用于药物输运比较成功的例子是美 国Guilford公司开发的Polilactofate微球，是将聚酯-聚磷酸酯共聚物通过乳液 法制备成微米级颗粒，用于肺癌和卵巢癌的治疗的临床试验。

本发明的目的是提供一种聚磷酸酯-聚乳酸三嵌段共聚物及其应用。
本发明所提供的嵌段共聚物是由聚磷酸酯和聚乳酸组成的三嵌段共聚物；
所述聚乳酸为聚L-乳酸(PLLA)；
所述聚磷酸酯(PEEP)由结构式如式(I)的2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷 杂环戊烷(2-ethoxy-2-oxo-1，3，2-dioxaphospholane或ethyl ethylene phosphate， EEP)单体聚合而成；

所述三嵌段共聚物中，中间嵌段是所述PLLA，两个末端嵌段是所述PEEP；所 述两个PEEP嵌段的聚合度为10-52，对应的数均分子量为1,520-7,900；所述PLLA 的聚合度为9-46，对应的数均分子量为1,300-6,690。
所述三嵌段共聚物表示为PEEP-PLLA-PEEP。
所述的三嵌段共聚物具体可为PEEP10-PLLA9-PEEP10、PEEP10-PLLA29-PEEP10、 PEEP21-PLLA29-PEEP21、PEEP27-PLLA29-PEEP27、PEEP52-PLLA29-PEEP52、PEEP10-PLLA35-PEEP10 或PEEP11-PLLA46-PEEP11。
本发明的还提供了一种纳米颗粒。
本发明所提供的纳米颗粒，由上述PEEP-PLLA-PEEP共聚物制成。
上述PEEP-PLLA-PEEP共聚物在水溶液中可自组装形成直径小于200nm的颗粒， 甚至可以得到直径小于50nm的颗粒。
上述PEEP-PLLA-PEEP共聚物可按照下述方法合成：以端基为羟基的聚乳酸 (HO-PLLA-OH)为大分子引发剂，在异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)的催化下引发2-乙氧 基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)单体开环聚合。
用所述PEEP-PLLA-PEEP共聚物旋涂聚乳酸，得到的改性聚乳酸也属于本发明 的保护范围，改性后的聚乳酸可以应用于组织工程。
本发明得到的PEEP-PLLA-PEEP共聚物具有良好的生物相容性和可降解性，其 物理、化学性能可通过PEEP与PLLA嵌段的分子量及其组成变化而调节。该共聚物 主要适用于纳米药物载体、基因治疗载体，也可用于再生医学的细胞与组织工程培 养的支架材料，大分子前体药物，生物材料表面修饰等领域。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为PEEP-PLLA-PEEP共聚物的合成路线。
图2为PLLA大分子引发剂及PEEP-PLLA-PEEP共聚物的1H NMR和13C NMR谱。
图3为PLLA大分子引发剂及PEEP-PLLA-PEEP共聚物的GPC谱。
图4为芘在不同浓度的纳米颗粒溶液中的激发光谱。
图5为共聚物I338.0/I335.5强度比与CMC对数的关系。
图6为共聚物在在水溶液中的粒径及粒径分布图。
图7为PEEP10-PLLA29-PEEP10在不同酸碱条件、不同时间降解产物的GPC谱。
图8为不同条件下降解产物分子量与时间的关系。
图9为PEEP10-PLLA29-PEEP10共聚物的降解产物的1H NMR图谱。
图10为不同浓度PEEP52-PLLA29-PEEP52纳米颗粒的细胞毒性。
图11为成骨细胞在不同表面培养9小时后的细胞粘附情况。

本发明提供了ABA型三嵌段聚磷酸酯-聚乳酸共聚物的合成及其自组装形成的 纳米颗粒。该共聚物包括聚磷酸酯(A嵌段)和脂肪族聚乳酸(B嵌段)，所述A 嵌段由结构式如式(I)的2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)单体聚 合而成，所述B嵌段为聚L-乳酸(PLLA)。所述三嵌段聚磷酸酯-聚乳酸共聚物表 示为PEEP-PLLA-PEEP。
PEEP-PLLA-PEEP共聚物可按照下述方法合成：以端基为羟基的聚乳酸 (HO-PLLA-OH)为大分子引发剂，在异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)的催化下引发2-乙氧 基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)单体开环聚合。通过控制磷酸酯环状单 体与脂肪族酯的投料比可以制备不同嵌段长度的ABA型三嵌段共聚物；通过改变单 体与引发剂的比例能制备不同分子量的ABA型三嵌段共聚物。聚磷酸酯-聚乳酸共 聚物是生物降解的，生物相容的。生物降解是指该聚合物能够利用水解或酶催降解 作用在身体内降解。生物相容是指全部的组分在身体内无毒。聚磷酸酯-聚乳酸共 聚物具有两亲性，在水溶液中自组装形成纳米尺度的颗粒，颗粒的尺寸与共聚物的 组成相关，可以调控。聚磷酸酯-聚乳酸共聚物纳米颗粒具有良好的生物相容性。 纳米颗粒可用于包载疏水性药物到其内核(疏水核)，实施药物可控释放。
聚乳酸是经FDA批准可用于人体的可降解聚合物材料。聚乳酸不仅具有优良的 机械强度、化学稳定性，还具备可吸收性及环境可降解性。但是聚乳酸材料不具备 细胞外基质材料的良好细胞亲和性。低细胞亲和性成为制约其作为理想组织工程支 架材料的主要障碍之一。因此必须对聚乳酸进行改性。聚磷酸酯是一类具有良好的 细胞亲和性的材料。聚磷酸酯-聚乳酸共聚物改性聚乳酸能够克服聚乳酸细胞亲和 性差的缺点，促进细胞的粘附。
本发明中的A嵌段PEEP，为亲水性聚磷酸酯，作为本发明的三嵌段中的末端链 段结构，其相对分子量是1,520-7,900。
本发明中的B嵌段PLLA，为疏水性脂肪族聚酯，作为本发明的三嵌段共聚物的 中间段结构，其相对分子量为1,300-6,690。它的优点在于：①相对疏水性，因 此在聚合物链之间的疏水-疏水相互作用促进共聚物自组装成纳米颗粒；②可生物 降解，中间降解产物乳酸是体内的正常糖，最终降解产物是二氧化碳和水，不会对 生物体有不良影响；③合成简单且可控。
下述实施例中进一步阐述了PEEP-PLLA-PEEP共聚物的合成方法。本发明的三 嵌段共聚物可在水相中自组装形成纳米颗粒并应用于疏水性药物的运输载体。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中的Log特指Log10。
实施例1、PEEP-PLLA-PEEP共聚物的合成和表征
一、PEEP-PLLA-PEEP共聚物的合成
具有不同分子量的端基为羟基的聚L-乳酸(HO-PLLA-OH)大分子引发剂在本体 条件下通过丙交酯单体在乙二醇(EG)引发、异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)催化条件下 的开环聚合反应得到。以两端羟基的聚乳酸为大分子引发剂，在异辛酸亚锡催化下 可以合成一系列PEEP-PLLA-PEEP共聚物。异辛酸亚锡因其高催化效率及无毒性， 是被最广泛应用的内酯及交酯环状单体开环聚合反应的催化剂，已被美国FDA批准 作为食品添加剂。
PEEP-PLLA-PEEP共聚物的合成路线如图1所示。
1、所需组分的制备与预处理
1)2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)的制备
首先通过三氯化磷与乙二醇反应合成2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷 (2-chloro-2-oxo-1，3，2-dioxaphospholane，COP)，然后COP与乙醇反应合成EEP， 具体的合成方法如下：
在1000mL的三口圆底烧瓶中，将三氯化磷(3.0mol)溶解于无水二氯甲烷(500mL) 中，通过恒压滴液漏斗缓慢滴入乙二醇(3.0mol)，待全部滴完后，继续反应0.5 小时，减压下蒸去溶剂，连续减压蒸馏两次将产物蒸出(50℃，200Pa)。将产物溶 解在苯中，通入O2反应48小时，减压下蒸出溶剂苯，再于减压下连续蒸馏两次将 产物(COP)蒸出(88-89℃，20Pa)，在N2气氛下于1℃冰箱中封存。
在一个干燥的1000mL三口烧瓶中，用注射器依次加入0.3mol乙醇，0.3mol 的三乙胺和500mL的四氢呋喃(THF)，将体系冷却到-5℃后，边搅拌边用恒压滴液 漏斗缓慢加入COP的四氢呋喃溶液(0.154mol COP溶于100mL四氢呋喃)，约1小 时滴完，体系在-5℃再反应24小时。将白色的三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，真空下 抽掉溶剂，于减压条件下蒸馏(92-94℃，20Pa)两次纯化，得到EEP。
2)其他组分的制备与预处理
丙交酯(LLA)于85℃下升华提纯。
乙二醇(EG)于室温条件下用氢化钙干燥24小时，使用前减压蒸馏。
异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)减压蒸馏后与对二甲苯共沸两次再减压蒸馏。
四氢呋喃(THF)与钠-钾合金处理后在氮气气氛下蒸出。
2、HO-PLLA-OH的合成
在手套箱中将丙交酯(LLA)、乙二醇(EG)及异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)按表1 的比例分别加入到干燥的圆底烧瓶，在130℃的油浴中加热3小时后溶解于二氯甲 烷，不同投料比可得到不同的产物，如此得到了一系列两端羟基的聚乳酸大分子 (HO-PLLA-OH)，产率(沉淀抽干后得到的聚合物质量/理论得到的聚合物质量× 100％)为92.5％。
表1  不同投料比制备的HO-PLLA-OH

3、PEEP-PLLA-PEEP的合成
40℃下，将表1中的四种HO-PLLA-OH和EEP分别按照表2的配比加入干燥的 四氢呋喃溶液中，再分别按照表2中的配比加入异辛酸亚锡，反应2小时后浓缩再 沉淀于冷的乙醚中，沉淀物于真空下干燥至恒重，不同投料比可得到不同的产物， 如此得到了一系列PEEP-PLLA-PEEP共聚物，产率(沉淀抽干后得到的聚合物质量/ 理论得到的聚合物质量×100％)为73％。
表2  不同投料比制备PEEP-PLLA-PEEP


二、HO-PLLA-OH和PEEP-PLLA-PEEP的表征
对上述HO-PLLA-OH大分子引发剂及其对应的PEEP-PLLA-PEEP共聚物进行核磁 共振氢谱(1H NMR)分析，测定其分子结构和数均分子量，1H NMR谱见图2(A)， 数均分子量见表3。对HO-PLLA29-OH大分子引发剂及其对应的PEEP10-PLLA29-PEEP10 共聚物进行核磁共振碳谱(13C NMR)分析，进一步确定其分子结构，13C NMR谱见图 2(B)。其余共聚物的13C NMR谱与PEEP10-PLLA29-PEEP10共聚物的谱类似。
图2(A)中，PEEP-PLLA-PEEP的1H NMR图谱字母a到e标记了归属于三嵌段 聚合物的质子氢。聚乳酸的聚合度通过5.17ppm的四重峰(归属于聚乳酸的次甲 基)与4.32ppm的单峰(归属于乙二醇的-CH2CH2-)的积分面积比计算得到。对比 图2(A)中PLLA与PPEP-PLLA-PEEP三嵌段共聚物的1H NMR，在嵌段共聚物NMR 中新出现的在1.38ppm(b)，4.19ppm(c)，归属于磷酸酯侧链的甲基(-CH2CH3) 及亚甲基(-OCH2CH3)。另外，4.28(a)ppm是磷酸酯主链上的亚甲基。
图2(B)中，三嵌段共聚物的所有碳均能在13C NMR中找到相应的归属。169.2 ppm的峰归属于聚乳酸的羰基碳，对化学环境很敏感，对于无规的聚乳酸共聚物， 其羰基峰往往显示多重峰，而不是单峰。进一步证实制备得到的共聚物含有PLLA 和PEEP嵌段。
用凝胶渗透色谱(GPC〕法以聚苯乙烯为标准分析HO-PLLA-OH大分子引发剂及 其对应的PEEP-PLLA-PEEP共聚物的数均分子量和分子量分布PDI(分子量分布宽度 指数)，GPC谱见图3，数均分子量和分子量分布PDI见表3。
由图3可见，共聚物的GPC谱为单峰，而没有PLLA大分子引发剂的峰，表明 大分子引发剂已完全消耗且得到了PLLA在中间、磷酸酯在两侧的三嵌段共聚物。
表3  PLLA大分子引发剂及PEEP-PLLA-PEEP共聚物的分子量与组成


a由1H NMR得到；b由GPC得到；c由GPC得到。
实施例2、PEEP-PLLA-PEEP共聚物的纳米颗粒化
一、纳米颗粒的制备
两亲性嵌段共聚物用于药物传递载体已被广泛研究。当两亲性嵌段共聚物溶于 其中一个嵌段的良溶剂而另外一个嵌段的不良溶剂时，共聚物自发组装成聚集体， 嵌段之间的共价键阻止了嵌段间的相分离。
通过溶剂挥发法(Solvent evaporation)制备PEEP-PLLA-PEEP共聚物的纳米颗 粒，具体方法如下：
将1g PEEP-PLLA-PEEP共聚物溶解于30mL四氢呋喃中，边搅拌边滴入100mL 超纯水中，于室温下搅拌三小时后，于减压下抽掉有机溶剂，再定容至100mL得到 纳米颗粒(1.0g L-1)。分别稀释配制得到不同浓度(1.0×10-6-1.0g L-1)的溶液。
用上述方法分别制备表3中7种嵌段共聚物的纳米颗粒，以芘为探针通过荧光 光谱的方法证实纳米颗粒的形成(λem＝373nm)，7种共聚物的荧光光谱见图4。
由图4可见，随着PEEP-PLLA-PEEP共聚物浓度从1.0×10-5增加至1.0g L-1， 荧光光谱发生了(0，0)吸收谱带从335.5到338.0nm的红移，该红移是由于芘 由水环境转移至疏水核中，意味着核壳结构的纳米颗粒的形成。
二、纳米颗粒的特性
按照步骤一的方法，分别制备表3中7种共聚物的纳米颗粒。
1、PEEP-PLLA-PEEP共聚物的临界聚集浓度(CMC)
通过芘在疏水核与亲水环境中的分配比例，用荧光光谱的方法分别研究表3中 7种PEEP-PLLA-PEEP纳米颗粒的CMC，具体方法如下：
在25℃下，以溶液338.0nm与335.5nm(I338.0/I335.5)强度比和共聚物浓度作 图，聚合物在水溶液中的浓度范围为1.0×1-6-1.0g L-1。图5为不同共聚物 I338.0/I335.5强度比与浓度对数的关系。
由图5可见，所有曲线均呈S型，在低浓度下，聚合物的荧光强度基本稳定， 当达到一定浓度后，其比值开始迅速增大，表明芘选择性的由水环境进入疏水核中， 此时纳米颗粒形成。继续增大聚合物浓度时，荧光强度到达一个平台，不再增大， 这表明共聚物在水中已完全自组装形成了以聚乳酸为疏水核的纳米颗粒。CMC值从 水平线与斜线切线的交点确定。PEEP-PLLA-PEEP的低临界聚集浓度可能归因为PEEP 嵌段与聚乙二醇(PEG)相比的轻微疏水性，因此，可以认为PEEP-PLLA-PEEP在水 中是热力学稳定的。
2、纳米颗粒的体积与体积分布
通过动态光散射测量由表4的7种共聚物形成的纳米颗粒的粒径与粒径分布， 其中，该7种共聚物在水溶液中浓度均为0.1g L-1。结果见表4和图6，表明当三 嵌段共聚物在水溶液中浓度为0.1g L-1时，所形成的纳米颗粒粒径均小于50nm。
表4  纳米颗粒的直径

三、纳米颗粒的体外水解
对PEEP10-PLLA29-PEEP10共聚物形成的纳米颗粒进行水解，由于其他三嵌段共聚 物与PEEP10-PLLA29-PEEP10具有相同的结构而仅是三嵌段的分子量不同，水解的结果 对于其它PEEP-PLLA-PEEP共聚物同样适用。
体外水解具体方法如下：
将三份等量的PEEP10-PLLA29-PEEP10纳米颗粒分别重悬于等体积的硼砂-碳酸钠 缓冲液(pH 10.9)、磷酸盐缓冲液(pH 2.5)、磷酸盐缓冲液(pH 7.4)缓冲液中， 纳米颗粒浓度均为2.0g L-1。37℃下进行降解，在不同的时间间隔，取出一定体积 的聚合物纳米颗粒，冻干后通过凝胶渗透色谱分析降解产物的分子量，试验重复三 次，结果见图7。
图7(A)为磷酸盐缓冲液(pH 7.4)条件下PEEP10-PLLA29-PEEP10降解产物的GPC 谱。从图中可见，26天后聚合物分子量减少，出现了低分子量的降解产物峰，并且 低分子量峰峰强随着降解时间而增强。图7(B)为硼砂-碳酸钠缓冲液(pH 10.9) 条件下PEEP10-PLLA29-PEEP10降解产物的GPC谱。图7(C)为磷酸盐缓冲液(pH 2.5) 条件下PEEP10-PLLA29-PEEP10降解产物的GPC谱。
图8为不同条件下降解产物分子量与时间的关系。从图中可见，在中性条件下 分子量变化最慢，酸性条件下次之，碱性条件下最快。可知碱性和酸性条件下可以 催化这类三嵌段聚合物水解，其中碱性条件下降解速度最快。
图9为不同pH、不同时间的降解产物的1H NMR。其中A为硼砂-碳酸钠缓冲液 (pH 10.9)条件下降解16天的降解产物的1H NMR图；B为磷酸盐缓冲液(pH 2.5) 条件下降解21天的降解产物的1H NMR图；C为磷酸盐缓冲液(pH 7.4)条件下降解 39天的降解产物的1H NMR图。由图可见，降解产物的质子信号峰都得到相应的归 属。从图中可知，PEEP-PLLA-PEEP共聚物的磷酸酯嵌段和聚乳酸嵌段同时降解，而 且磷酸酯嵌段的主链和侧链降解同时进行。
四、PEEP-PLLA-PEEP共聚物纳米颗粒的体外毒性
通过MTT方法测定不同浓度PEEP52-PLLA29-PEEP52纳米颗粒的细胞毒性。
分别将浓度为1/256、1/128、1/64、1/32、1/16、1/8、1/4、1/2、1g L-1的 PEEP52-PLLA29-PEEP52纳米颗粒与HEK293细胞共培养24小时后测细胞活力，用同样 浓度的SDS作为对照，结果见图10。实验重复三次，结果数据采用平均值±标准差 的形式。
由图可见，当PEEP52-PLLA29-PEEP52纳米颗粒浓度为1mg mL-1时，细胞活力为 100％±6。
同样，采用同样的方法测定其它6种共聚物纳米颗粒的体外毒性。 PEEP10-PLLA9-PEEP10纳米颗粒浓度为1mg mL-1时，细胞活力为98％±5； PEEP10-PLLA29-PEEP10纳米颗粒浓度为1mg mL-1时，细胞活力为98％±3； PEEP21-PLLA29-PEEP21纳米颗粒浓度为1mg mL-1时，细胞活力为97％±6； PEEP27-PLLA29-PEEP27纳米颗粒浓度为1mg mL-1时，细胞活力为100％±4； PEEP11-PLLA46-PEEP11纳米颗粒浓度为1mg mL-1时，细胞活力为99％±3。
实施例3、PEEP-PLLA-PEEP共聚物应用于组织工程
一、应用聚磷酸酯-聚乳酸嵌段聚合物表面改性聚乳酸
将聚磷酸酯-聚乳酸嵌段聚合物通过旋涂的方法表面改性聚乳酸，具体的方法 如下：
1、将300mg PLLA溶解于10mL四氢呋喃中，于室温下搅拌三小时后，加到直 径为13mm的玻璃细胞培养片上(每片加120uL PLLA溶液)，旋涂速率为2500rpm， 然后将处理后的细胞培养片在真空干燥箱中室温过夜，得到表面覆盖一层聚乳酸的 细胞培养片甲。
2、将300mg PEEP21-PLLA29-PEEP21共聚物溶解于10mL四氢呋喃中，于室温下搅 拌三小时后，加到细胞培养片甲上(每片加120uL PEEP21-PLLA29-PEEP21溶液)，旋涂 速率为2500rpm，然后在室温下真空干燥箱中过夜，得到细胞培养片乙；
将300mg PEEP27-PLLA29-PEEP27共聚物溶解于10mL四氢呋喃中，于室温下搅拌 三小时后，加到细胞培养片甲上(每片加120uL PEEP27-PLLA29-PEEP27溶液)，旋涂速 率为2500rpm，然后在室温下真空干燥箱中过夜，得到细胞培养片丙。
二、表面改性后的聚乳酸促进成骨细胞的粘附
通过荧光显微镜拍照的方法测定改性后材料的细胞粘附的变化
分别将细胞培养片甲、细胞培养片乙、细胞培养片丙、细胞培养板(Greiner 公司的24孔贴壁细胞培养板)和成骨细胞共培养9小时，用Hoechst 33342将细 胞核染色，通过荧光显微镜测定不同细胞培养片细胞粘附的变化，结果见图11。图 11中，(A)细胞培养片乙；(B)细胞培养片丙；(C)细胞培养片甲；(D)细胞培养 板。
结果表明，PEEP-PLLA-PEEP改性乳酸后，能够有力的促进成骨细胞粘附，克服 聚乳酸细胞亲和性差的缺点。