【技术领域】

本发明涉及一种磁性微粒，特别涉及一种具有专一性分离生物材料的 磁性微粒及其制造方法。

【背景技术】

通常要将生物材料例如核酸从复杂的生物体中分离是很困难的，因为 其浓度非常低，并且许多其它的固体或不可溶的物质也同时存在。

因此，提出了许多用来分离生物材料的方法和材料，例如使用磁性微 粒去吸附生物材料，并通过施加磁场及进行清洗步骤使得生物材料从原始 的样品中分离出来。

目前有许多用来分离生物材料的磁性微粒，例如美国专利第6133047 号中描述了一种超顺磁性单一分散型微粒，其包括第一高分子制成的核心， 第二高分子制成的内层涂布在核心上，其中具有磁性物质分布，以及第三 高分子制成的外层涂布在内层上，其可以与生物分子作用。美国专利第 6274387号中描述一种磁性载体，包括内含磁性物质的二氧化硅微粒，其表 面上有聚丙烯酰胺(polyacrylamide)，该内含磁性物质的二氧化硅微粒的表面 以耦合试剂处理，且处理过的二氧化硅微粒与丙烯酰胺(acrylamide)和/或聚 丙烯酰胺反应。然而，这些磁性微粒的特性例如尺寸、磁性或分离效果等 并无法充分地控制。

因此，亟需一种磁性微粒，其需具有可调控的尺寸、粒径分布小、均 匀度佳、高磁化量、良好储存稳定性以及具有专一性分离功能的表面修饰。

【发明内容】

本发明所提供的磁性微粒，其可以有效地分离生物材料、纯化生物材 料、传送药品以及应用在环境分析上，该磁性微粒具有可调控的尺寸、粒 径分布小、均匀度佳、高磁化量、良好储存稳定性以及专一性的表面修饰 以分离生物分子。

本发明提供一种磁性微粒，包括高分子核心，包覆高分子核心的磁性 物质层，以及包覆磁性物质层的硅化物层。磁性微粒的直径约为0.1至5μm， 此外，磁性微粒还包括在硅化物层上的耦合试剂，以及连接至耦合试剂的 活性分子。

本发明提供一种磁性微粒的制造方法，包括以乳液聚合法将至少一种 单体聚合形成高分子核心，以氧化还原反应形成磁性物质层包覆高分子核 心，以及以聚合反应形成硅化物层包覆磁性物质层。该方法还包括以耦合 试剂修饰硅化物层的表面，以及将活性分子连接至耦合试剂。

此外，本发明也提供一种在复杂的生物分子样品中分离特定生物分子 的方法，包括将本发明的磁性微粒与复杂的生物分子样品混合形成混合物， 施加磁场至混合物，由此将带有特定生物分子的磁性微粒与复杂的生物分 子样品分离。其中，硅化物层的表面以具有官能团连接至活性分子的耦合 试剂修饰，因此可提高生物分子的分离效率。

为了使本发明的上述目的、特征、及优点能更明显易懂，以下结合多 个实施例与比较例，作详细说明如下：

【附图说明】

图1为依据本发明一实施例的磁性微粒的剖面示意图。

图2为本发明实施例1的高分子核心的SEM照片，其直径为220.4±6.5 nm。

图3为本发明实施例1的另一高分子核心的SEM照片，其直径为921.6± 75.3nm。

图4为依据本发明实施例2，将图2的高分子核心包覆磁性物质层的 SEM照片，其总直径为250.4±7.2nm。

图5为依据本发明实施例2，将图3的高分子核心包覆磁性物质层的 SEM照片，其总直径为950.0±77.2nm。

图6至7为依据本发明实施例3，表面包覆硅化物层的磁性微粒的TEM 照片。

图8为本发明实施例3的磁性微粒的EDX分析光谱图。

图9为使用本发明的磁性微粒所分离的CRP量对原始溶液中CRP浓度 的结果。

【主要附图标记说明】

10～高分子核心；

12～磁性物质层；

14～硅化物层；

16～耦合试剂；

18～活性分子。

【具体实施方式】

本发明提供的磁性微粒适用于特定生物材料的分离以及环境分析，磁 性微粒的表面修饰成与特定的物质或生物分子连接。例如，磁性微粒可应 用于从血液中分离生物材料，其修饰的表面可以与血液中特定的生物分子 结合，并通过磁力简化复杂的分离步骤。此外，磁性微粒还可以应用在环 境分析上，例如从水中分离出污染物。

图1为磁性微粒的剖面示意图，其包括高分子核心10，包覆高分子核 心的磁性物质层12，以及包覆磁性物质层的硅化物层14。磁性微粒的直径 约为0.1至5μm，高分子核心可为均聚合物(homopolymer)或共聚合物 (copolymer)，其可由单体聚合而成，单体例如为苯乙烯(styrene)、苯乙烯衍 生物(styrene derivative)、烷基丙烯酸酯(alkylacrylate)、烷基甲基丙烯酸酯 (alkylmethacrylate)、N-烷基丙烯酰胺(N-alkylacrylamide)或N，N-二烷基丙烯 酰胺(N，N-dialkyl-acrylamide)，其中烷基为C3-20烷基，且其中优选的单体为 苯乙烯或苯乙烯衍生物。苯乙烯衍生物例如为甲基苯乙烯(methyl styrene)、 乙基苯乙烯(ethyl styrene)、叔丁基苯乙烯(tert-butyl styrene)、氯甲基苯乙烯 (chloromethylstyrene)或二乙烯基苯(di-vinyl benzene)。磁性物质层可以是顺 磁性(paramagnetic)、超顺磁性(superparamagnetic)、铁磁性(ferromagnetic)或 铁氧磁性(ferritemagnetic)材料，适合的磁性物质包括铁、钛、钴、锌、铜、 锰或镍及其金属氧化物、磁铁矿(magnetite)、赤铁矿(hematite)、铁氧体(ferrite) 例如锰、镍或锰-锌铁氧体，或是钴或镍的合金。包覆磁性物质层的硅化物 层可以使磁性物质固定在核心表面上，提高磁性微粒储存的稳定性，同时 易于进行表面修饰。硅化物层可以是硅氧烷(siloxane)、硅石玻璃(silica glass)、氧化硅(silicon oxide)、硅酸盐(silicate salt)或其它类似的材料。

如图1所示，磁性微粒还可包括在硅化物层上的耦合试剂16，以及连 接至耦合试剂的官能团的活性分子18。耦合试剂可以是功能性硅烷 (functional silane)，耦合试剂16的官能团包括氨基(amino)、硫醇基(thiol)、 羟基(hydroxyl)、醛基(aldehyde)、羧基(carboxylic)、酯基(ester)或其它类似的 官能团，其可以与活性分子18连接。活性分子18具有亲和力以吸附特定 物质、生物分子或细胞，活性分子可包含但不限定于抗体(antibody)、核酸 (nucleic acid)、寡聚核苷酸(oligonucleotide)、蛋白质(protein)、醣类(sugar) 或抗原(antigen)。

在本发明的磁性微粒的制造方法的一实施例中，高分子核心可由上述 至少一种单体以乳液聚合法(emulsion polymerization)合成，例如可在水与乙 醇的混合物中，使用苯乙烯单体与甲基丙烯酸(methylacrylic acid，简称MAA) 以乳液聚合法反应，合成出表面带有羧酸基(carboxylic acid group)的聚苯乙 烯核心，并且通过调整水与乙醇的比例及苯乙烯的含量，得到各种尺寸的 高分子核心。高分子核心的直径可约为200至5000nm，并且其粒径的分布 是均匀的。接着，通过高分子核心上的官能团将磁性物质前体均匀地吸附 在高分子核心表面上，高分子核心上的官能团可为氨基、羟基、羧基或其 它类似的官能团，然后，磁性物质前体通过氧化还原反应转换成磁性物质 层覆盖在高分子核心上。例如，Fe2+离子通过高分子核心上的羧酸基均匀地 吸附在每一个聚苯乙烯核心的表面上，然后将Fe2+离子转换成Fe3O4作为磁 性物质层覆盖在核心上，磁性物质层的厚度约在15至30nm。接下来，形 成硅化物层覆盖磁性物质层，硅化物层的厚度约为20至30nm，硅化物层 可以是硅氧烷、硅石玻璃、氧化硅或硅酸盐，其可由含硅的前体形成，含 硅的前体可以是硅烷氧化物(silicon alkoxide)、硅酸钠(sodium silicate)、3-氨 基丙炔基硅烷(3-aminopropinyl silane)、乙烯基三氯硅烷(vinyltrichlorosilane)、 三甲氧乙烯基硅烷(trimethoxyvinylsilane)、乙烯基三乙氧基硅烷 (triethoxyvinylsilane)、乙烯基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷 (tris(2-methoxyethoxy)vinylsilane)、3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷 (3-glycidoxypropyltrimethoxysilane)、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷 (3-methacryloxypropyltrimethoxysilane)、二乙氧基-3-缩水甘油氧基丙基甲基 硅烷(diethoxy-3-glycidoxypropylmethyllsilane)或前述的组合，其中硅烷氧化 物例如为Si(OCH3)4、Si(OC2H5)4、Si(O-n-C3H7)4、Si(O-i-C3H7)4、Si(O-n-C4H9)4 或Si(O-i-C4H9)4。例如，可加入原硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate，简称 TEOS)Si(OC2H5)4作为硅化物层的前体，以覆盖磁性物质层形成磁性微粒。

硅化物层的表面可用耦合试剂修饰，耦合试剂带有官能团包括氨基、 硫醇基、羟基、醛基、羧基、酯基或其它类似的官能团。活性分子可以连 接至磁性微粒上的耦合试剂，以分离复杂的生物分子样品中特定的生物分 子，被分离的特定生物分子可以是抗体、核酸、寡聚核苷酸、蛋白质、醣 类或抗原。例如，可使用耦合试剂(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷((3-aminopropyl) triethoxysilane，简称APTES)修饰磁性微粒的硅化物层，然后将末端氨基转 换成羧酸基，并与活性分子例如抗体连接，以分离血液中的抗原。

本发明的磁性微粒可以从复杂的生物分子样品中分离出特定的生物分 子，首先，将其上含有活性分子的磁性微粒与复杂的生物分子样品混合， 活性分子可以分离复杂的生物分子样品中特定的生物分子，然后通过施加 磁场及进行清洗步骤，使得特定的生物分子从复杂的生物分子样品中分离 出来。

本发明的磁性微粒的制造方法的实施例如下所述，然而其并非限定本 发明的磁性微粒的制造方法。

【实施例1】

高分子核心的制备

将18毫升的苯乙烯、1毫升的甲基丙烯酸(methylacrylic acid)、0.1克的 过硫酸钾(potassium peroxydisulfate，K2S2O8)、10毫升的乙醇以及60毫升的 去离子水置入反应器中，在氮气下，将上述混合物在70℃搅拌反应24小 时，然后冷却至室温，得到聚苯乙烯核心。接着，可使用扫描式电子显微 镜(SEM)观察并测量这些高分子核心的直径，依据上述反应条件所得到的高 分子核心的SEM照片如图3所示，其直径约为921.6±75.3nm，且粒径分 布小，均匀度高。

上述反应条件中水对乙醇的比例可调整为7∶0，并且可将混合物在80℃ 搅拌反应24小时，其它反应条件保持不变，如此所得到的高分子均匀性高， 核心的直径约为220.4±6.5nm，其SEM照片如图2所示，并且其粒径亦是 均匀的。

【实施例2】

在高分子核心上包覆磁性物质层

将200毫克实施例1的聚苯乙烯核心以及30毫升的乙二醇(ethylene glycol)以超声波震荡10分钟，然后加入120毫升的去离子水。接着，将2 克的六亚甲基四胺(hexamethylenetetramine)、0.1克的硝酸钾(potassium nitrate，KNO3)以及1克的氯化亚铁(Iron(II)chloride，FeCl2)加入上述混合物 中，在80℃反应4小时。反应完成后，用去离子水清洗产物，得到以聚苯 乙烯为核心且表面包覆氧化铁磁性物质层的微粒。图4为直径220.4±6.5nm 的高分子核心被磁性物质层包覆的SEM照片，图4中的微粒的总直径约为 250.4±7.2nm，其饱和磁化量为61.3emu/g。图5为直径921.6±75.3nm的 高分子核心被磁性物质层包覆的SEM照片，其总直径约为950±77.2nm， 其饱和磁化量为52.3emu/g。上述的磁性物质层的厚度约为30nm。

【实施例3】

在磁性物质层上包覆硅化物层

将50毫克实施例2的微粒、50毫升去离子水以及1.25克聚乙烯吡咯 烷酮(polyvinylpyrrolidone，简称PVP-10)置入反应器中，以转速600rpm搅 拌反应24小时。将得到的固体产物以离心力分离，并加入50毫升乙醇与 固体产物混合。接下来，将2.42毫升浓度为4.2％的氨水溶液(ammonia solution)溶于乙醇的溶液以及浓度为10％的原硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)溶于乙醇的溶液加入上述混合物中，搅拌反应15小时， 得到表面包覆硅化物层的磁性微粒。图6和7为表面包覆硅化物层的磁性 微粒的SEM照片，图8为实施例3的磁性微粒以能量分散X射线光谱仪 (energy dispersive x-ray，EDX)作元素分析所得到的最终分析光谱图，如图8 所示，其显示磁性微粒具有Si、O及Fe的波峰，这表示在磁性微粒上形成 有硅化物层。

【实施例4】

与耦合试剂连接

将实施例3的磁性微粒与浓度为20％的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 ((3-aminopropyl)triethoxysilane，简称APTES)溶于乙醇的溶液搅拌反应15 小时，待反应完成后，将产物以乙醇及去离子水各清洗3次，得到其上具 有耦合试剂APTES的磁性微粒，然后将末端氨基转换成羧酸基。

【实施例5】

与活性分子连接

将1克实施例4其上具有羧酸基的磁性微粒以25mM、pH 5的2-(N- 吗啉代)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)缓冲液(MES buffer)清 洗，搅拌5分钟，然后以磁性分离器将磁性微粒从溶液中分离。将上述步 骤重复2次，接着，将清洗过的磁性微粒、50μl的50mg/ml N-乙基-N′-(3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺(N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，简 称EDC)以及50μl的50mg/ml羟基-2，5-二氧代吡咯烷-3-磺酸钠 (Hydroxy-2，5-dioxopyrrolidine-3-sulfonicacid sodium salt，简称sulfo-NHS) 搅拌反应30分钟，然后以25mM、pH 5的MES缓冲液清洗2次。

将100μl的900μg/ml C-反应蛋白(C-reactive protein，简称CRP)抗体 溶液以及依上述方式处理过的磁性微粒搅拌反应2小时，并将未反应的抗 体溶液除去。接着，加入100μl的1M、pH 7.4的三羟甲基氨基甲烷(Tris (hydroxymethyl)aminomethane)Tris溶液反应0.5小时，然后以0.01M、pH 7.4 的磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，简称PBS)清洗，得到10mg/ml表 面具有CRP抗体修饰的磁性微粒溶液，每1毫克的磁性微粒表面可以键结 约30μg的活性CRP抗体。

【实施例6】

生物分子分离测试

将100μl实施例5的表面具有CRP抗体修饰的磁性微粒溶液放置于磁 性分离器中，除去其中的缓冲液。接着，以0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液 调配各种浓度的CRP溶液，并与上述处理过的磁性微粒混合。在磁性微粒. 上的CRP抗体可以分离溶液中的CRP，在反应1小时之后，将混合物放置 于磁性分离器中分离，收集未反应的CRP溶液，测定其中的CRP量，如此 可估算被磁性微粒分离的CRP量。图9为被磁性微粒分离的CRP量对原始 溶液中CRP浓度的结果，由CRP分离测试的结果可得知，表面具有CRP 抗体修饰的磁性微粒，其分离CRP的效率高于95.4％。

虽然本发明已以优选实施例披露如上，然其并非用以限定本发明。任 何本发明所属技术领域中的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内， 应可作任意更动与润饰，因此，本发明的保护范围应以所附权利要求书所 限定的范围为准。