IL-36β的应用
阅读：605发布：2020-05-18
专利汇可以提供IL-36β的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，公开了IL-36β在促进Tc9细胞分化及其 肿瘤 过继性免疫 治疗 效应中一系列相关应用，开拓了新的促进Tc9分化的有效手段与方法，并验证了IL-36β促进分化的Tc9细胞在肿瘤过继性免疫治疗中的效应功能，为采用此手段应用于肿瘤临床治疗奠定 基础 。，下面是IL-36β的应用专利的具体信息内容。
1.IL-36β在促进Tc9细胞分化和/或在制备促进Tc9细胞分化的产品中的应用。
2.IL-36β在制备IL-9和/或IL-10中的应用和/或在制备能够提高IL-9和/或IL-10表达水平的产品中的应用。
3.IL-36β在制备Tc9细胞相关细胞因子、效应分子、共刺激分子和转录因子中任意一种或多种物质中的应用和/或制备能够提高Tc9细胞相关细胞因子、效应分子、共刺激分子和转录因子中任意一种或多种物质表达水平的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述Tc9细胞相关细胞因子选自IL-2、IL-3、IL-9、IL-10、IL-21、IL-22、IL-24中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述Tc9细胞相关效应分子选自IFN-γ、FasL、穿孔素、GzmA、GzmB、GzmC中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述Tc9细胞相关共刺激分子选自肿瘤坏死因子受体超家族成员4、肿瘤坏死因子受体超家族成员9中的一种或多种。
7.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述Tc9细胞相关转录因子选自STAT3、STAT5a、BATF、BATF3中的一种或多种。
8.IL-36β在过继治疗肿瘤中的应用和/或在制备肿瘤过继性免疫治疗的产品中的应用。
IL-36β的应用
技术领域
背景技术
[0002] 肿瘤过继性细胞免疫治疗(Adoptive cell immunotherapy，ACT)近年来取得了显+ +著进展。获得以分泌IFN-γ等为特征的肿瘤抗原特异性CD8 细胞毒T淋巴细胞(CD8cytotoxic lymphocyte，CD8+CTL，即Tc1细胞)，并使之在体内发挥杀伤肿瘤活性，是目前肿瘤过继性T细胞免疫治疗常用的技术方法。然而，由于Tc1细胞强大的杀伤效应所引发的细胞因子释放综合症，及Tc1终末分化导致其在体内发挥功能的持久性有限等因素，限制了以Tc1分化类型为主要导向的过继性细胞免疫疗法在临床上进一步有效和广泛应用。因此，设计回输后具有长期存活或增殖能力、对肿瘤具有持续杀伤功能等特性的过继性CD8+T细胞，对提高肿瘤免疫治疗的效果具有十分重要的意义。
[0003] 2013年，Alexander Visekruna等人证明在细胞因子IL-4和TGF-β联合作用下，小+ + +鼠CD8 T细胞可分化为IL-9 CD8 T(Tc9)细胞。Tc9细胞是以分泌白细胞介素-9
(Interleukin-9，IL-9)为主要特征的CD8+T细胞亚群。白细胞介素-9(IL-9)发现于1988年，它最初被鉴定为T细胞生长因子，是常见γ链受体细胞因子家族的成员可调节广泛的免疫应答。IL-9前体含144个氨基酸，包括有18个氨基酸残基的信号肽。人的IL-9基因位于5号染色体5q31-q35区域，小鼠的IL-9基因位13号染色体上，两者的IL-9在蛋白质水平上具有
55％的氨基酸同源性。IL-9是一种具有多种效应功能的细胞因子，由T细胞，嗜酸性粒细胞、肥大细胞等分泌产生。利用Th9细胞分化条件诱导产生的Tc9细胞具有独特的细胞因子及转录因子表达特性。
(Interleukin-9，IL-9)为主要特征的CD8+T细胞亚群。白细胞介素-9(IL-9)发现于1988年，它最初被鉴定为T细胞生长因子，是常见γ链受体细胞因子家族的成员可调节广泛的免疫应答。IL-9前体含144个氨基酸，包括有18个氨基酸残基的信号肽。人的IL-9基因位于5号染色体5q31-q35区域，小鼠的IL-9基因位13号染色体上，两者的IL-9在蛋白质水平上具有
55％的氨基酸同源性。IL-9是一种具有多种效应功能的细胞因子，由T细胞，嗜酸性粒细胞、肥大细胞等分泌产生。利用Th9细胞分化条件诱导产生的Tc9细胞具有独特的细胞因子及转录因子表达特性。
[0004] 与Th9细胞类似，体外分化的Tc9细胞低表达IL-4、IL-13等Th2型细胞因子；高表达细胞因子IL-9和IRF4、STAT6、PU.1等特征性转录因子。与Tc1细胞相比，体外诱导产生的Tc9细胞低表达γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、颗粒酶B(Granzyme-B，GzmB)、穿孔素(Perforin1，Prf1)、T-bet(Tbx21)和脱中胚蛋白(Eomesodermin，Eomes)，有较低的细胞毒活性。在小鼠黑色素瘤模型中，Tc9细胞具有更显著的肿瘤过继治疗效果。Tc9细胞分泌的多效性细胞因子IL-9能够激发肿瘤部位炎症反应，促进细胞溶解性Tc1细胞归巢，也可以促进Tc9细胞、肿瘤浸润性T淋巴细胞、树突状细胞(Dendritic Cell，DC)的存活和功能发挥。其次，Tc9细胞产生的IL-21可以增强NK和CD8+T细胞的细胞毒性并促进其分泌IFN-γ，进而发挥强大的抗肿瘤效应。肿瘤过继性免疫治疗2周后，Tc9细胞的IL-9分泌明显减少，IFN-γ和GzmB表达显著增加，其成功转变为Tc1样的效应细胞。与Tc1细胞相比，Tc9细胞较少耗竭，且表达较低水平的免疫负性分子如细胞程序性死亡受体1(Programmed cell death 1，PD-1)、淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte-activationgene 3，LAG-3)和自然杀伤细胞受体2B4(CD244)。
[0005] 近期的研究揭示，以表达IL-9和IL-10、IL-21和IL-22等细胞因子为特征的Tc9细胞对肿瘤的抑制效果显著强于Tc1细胞，其在体内具有持久的抗肿瘤效应、不易发生功能耗竭、存活时间较长等特性。因此，Tc9细胞可作为一种比较理想的CD8+T细胞分化类型，应用于肿瘤过继性免疫治疗。寻找能有效促进Tc9细胞分化的方法，对肿瘤免疫治疗具有重要的创新意义和潜在的应用价值。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供IL-36β在促进Tc9细胞分化及其肿瘤过继性免疫治疗效应中一系列相关应用。
[0007] IL-36β属于IL-1家族成员，其与IL-1家族其它2个成员IL-36α(又名IL-1F6)、IL-36γ(又名IL-1F8)具有共同的受体IL-36R(又名IL-1R6，IL-1Rrp2或IL-1RL2)及辅助性受体IL-1RAcP。IL-36α、β和γ因具有共同的受体，故统称为IL-36亚家族分子，将其介导的信号统称为IL-36/IL-36R。目前，关于IL-36β在Tc9细胞分化方面的作用尚未任何报道。
[0008] 在本发明的一些实施方式中，通过相关试验验证了IL-36β可促进anti-CD3和anti-CD28抗体刺激或抗原递呈细胞刺激的Tc9细胞分化，在具体试验结果中，与经典的Tc9分化所需细胞因子条件(即TGF-β和IL-4)相比，在此基础上联合IL-36β能够显著促IL-9表达；并发现TGF-β和IL-36β刺激的IL-9的表达水平，也明显高于TGF-β和IL-4，说明IL-36β能+够替代甚至超越经典Tc9极化条件中IL-4的作用，显著增加CD8T细胞中IL-9的表达；同时，伴随着IL-36β浓度的增高，Tc9分化条件和TGF-β刺激培养条件下，CD8+T细胞中IL-9的表达水平均逐渐增高，并呈现剂量依赖性关系，表明IL-36β能够促进APC刺激的Tc9细胞的分化；
在蛋白水平上，IL-36β可促进Tc9细胞IL-9、IL-10的表达，而且TGF-β加IL-36β能够替代Tc9经典极化条件，刺激CD8+T细胞表达更高水平的IL-9以及同等水平的IL-10。
在蛋白水平上，IL-36β可促进Tc9细胞IL-9、IL-10的表达，而且TGF-β加IL-36β能够替代Tc9经典极化条件，刺激CD8+T细胞表达更高水平的IL-9以及同等水平的IL-10。
[0009] 基于上述技术效果，本发明提出了IL-36β在促进Tc9细胞分化和/或在制备促进Tc9细胞分化的产品中的应用；同时，也提出了IL-36β在制备IL-9和/或IL-10中的应用，以及IL-36β在制备能够提高IL-9和/或IL-10表达水平的产品中的应用。
[0010] 在本发明的另外一些实施方式中，IL-36β能够上调Tc9极化条件下体外培养的CD8+T细胞中细胞因子IL-2、IL-3、IL-9、IL-10、IL-21、IL-22、IL-24，效应分子IFN-γ、FasL、穿孔素(Perforin，Prf1)、GzmA、GzmB、GzmC，共刺激分子肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4，OX40)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9，4-1BB)，转录因子STAT3、STAT5a、BATF、BATF3的表达，同时抑制调节性T细胞(Treg)标志性分子Foxp3的表达。
[0011] 基于上述技术效果，本发明提出了IL-36β在制备Tc9细胞相关细胞因子、效应分子、共刺激分子和转录因子中任意一种或多种物质中的应用，也同时提出了IL-36β在制备能够提高Tc9细胞相关细胞因子、效应分子、共刺激分子和转录因子中任意一种或多种物质表达水平的产品中的应用；所述Tc9细胞相关细胞因子选自IL-2、IL-3、IL-9、IL-10、IL-21、IL-22、IL-24中的一种或多种，所述Tc9细胞相关效应分子选自IFN-γ、FasL、穿孔素(Perforin，Prf1)、GzmA、GzmB、GzmC中的一种或多种；所述Tc9细胞相关共刺激分子选自肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4，OX40)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9，4-1BB)中的一种或多种，所述Tc9细胞相关转录因子选自STAT3、STAT5a、BATF、BATF3中的一种或多种；此外，本发明还提出了IL-36β在抑制调节性T细胞(Treg)标志性分子Foxp3中的应用，以及在制备调节性T细胞(Treg)标志性分子Foxp3的抑制剂中的应用。
[0012] 在本发明的另外一些实施方式中，与经典Tc9相比，IL-36β诱导的Tc9对B16-OVA肿瘤具有明显的抑制作用，并明显延长了荷瘤小鼠的生存期；基于此技术效果，本发明提供了IL-36β在过继治疗肿瘤中的应用，或在制备肿瘤过继性免疫治疗的产品中的应用。
[0013] 由以上技术方案可知，本发明提供了IL-36β在促进Tc9细胞分化及其肿瘤过继性免疫治疗效应中一系列相关应用，开拓了新的促进Tc9分化的有效手段与方法，并验证了IL-36β促进分化的Tc9细胞在肿瘤过继性免疫治疗中的效应功能，为采用此手段应用于肿瘤临床治疗奠定基础。附图说明
[0014] 图1所示为用anti-CD3和anti-CD28抗体进行刺激通过流式细胞术分析CD8+T细胞中IL-9的表达结果；其中，A为不同细胞因子组合条件下，CD8+T细胞中IL-9的表达；B为Tc9分化条件下，加入不同浓度IL-36β(0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50，100ng/ml)，CD8+T细胞+中IL-9的表达；C为TGF-β刺激条件下，加入不同浓度IL-36β，CD8T细胞中IL-9的表达水平；
[0015] 图2所示为用抗原递呈细胞进行刺激通过流式细胞术分析CD8+T细胞中IL-9的表达结果；其中，A为不同细胞因子组合条件下，CD8+T细胞中IL-9的表达；B为Tc9分化条件下，加入不同浓度IL-36β(0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50，100ng/ml)，CD8+T细胞中IL-9的表+达；C为TGF-β刺激条件下，加入不同浓度IL-36β，CD8T细胞中IL-9的表达水平；
[0016] 图3所示为IL-36β促进抗原递呈细胞刺激的Tc9细胞的IL-9和IL-10分泌；其中，A为ELISA检测IL-9的表达水平；B为ELISA检测IL-10的表达水平；
[0017] 图4所示为IL-36β对Tc9细胞相关细胞因子和转录因子的表达影响；其中，A为利用Graphpad Prism 7绘制经典Tc9细胞与IL-36β促进分化的Tc9细胞中细胞因子、效应分子和共刺激分子的基因表达热图；B为利用Graphpad Prism 7绘制经典Tc9细胞与IL-36β促进分化的Tc9细胞中转录因子的基因表达热图；
[0018] 图5所示为IL-36β促进分化的Tc9细胞对肿瘤的抑制作用；其中，A为B16-OVA荷瘤小鼠肿瘤生长曲线；B为B16-OVA荷瘤小鼠生存曲线。
具体实施方式
[0019] 本发明公开了IL-36β的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0020] 在具体实施例中的对比试验中，除了各组应有的区别外，其他试验条件均保证一致，确保实验结果的可对比性。本发明具体实施方式中，IL-36β可单独或联合TGF-β和IL-4中的任意一种或两种以上细胞因子来使用。
[0021] 以下就本发明所提供的IL-36β的应用做进一步说明。
[0022] 实施例1：IL-36β可显著促进anti-CD3和anti-CD28抗体刺激的Tc9细胞分化[0023] 采用免疫磁珠纯化C57BL/6j小鼠CD8+T细胞，在TGF-β、IL-4等细胞因子组合条件下，加或不加入IL-36β，用anti-CD3和anti-CD28抗体包板进行刺激，体外培养42hr后收集细胞，通过流式细胞术，分析各组细胞中IL-9蛋白质的表达水平(图1A)。进一步探究了在经典Tc9分化所需细胞因子条件(即TGF-β和IL-4)(图1B)，或TGF-β单独存在条件下(图1C)，加入不同浓度的IL-36β(0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50，100ng/ml)对IL-9表达的影响。
[0024] 与经典的Tc9分化所需细胞因子条件(即TGF-β和IL-4)相比，在此基础上联合IL-36β能够显著促IL-9表达；并发现TGF-β和IL-36β刺激的IL-9的表达水平，也明显高于TGF-β和IL-4，说明IL-36β能够替代甚至超越经典Tc9极化条件中IL-4的作用，显著增加CD8+T细胞中IL-9的表达(图1A)。
[0025] 伴随着IL-36β浓度的增高，Tc9细胞的IL-9表达水平逐渐升高，表明IL-36β对Tc9细胞中IL-9的表达呈现剂量依赖性的促进作用(图1B)。
[0026] 在TGF-β刺激而缺少IL-4培养条件下，随着IL-36β浓度增高，CD8+T细胞中IL-9的表达水平也逐渐增高，并呈现剂量依赖性关系(图1C)。
[0027] 实施例2：IL-36β可促进抗原递呈细胞刺激的Tc9细胞分化
[0028] 在TGF-β、IL-4等细胞因子组合条件，以及Tc9分化所需细胞因子条件(即TGF-β和IL-4)或TGF-β刺激条件下，加入不同浓度的IL-36β(0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50，100ng/m1)，采用抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)负载OVA抗原肽(SIINFEKL)刺激OT-I小鼠来源的CD8+T细胞，体外共培养64hr后，通过流式分析各组CD8+T细胞中IL-9的表达水平(图2)，并采用ELISA检测其细胞培养上清中IL-9和IL-10分泌水平(图3)。
[0029] 与经典的Tc9分化所需细胞因子条件(即TGF-β和IL-4)相比，在此基础上联合IL-36β能够显著促IL-9表达；并发现TGF-β和IL-36β刺激的IL-9的表达水平，也明显高于TGF-β和IL-4，说明IL-36β能够替代甚至超越经典Tc9极化条件中IL-4的作用，显著增加CD8+T细胞中IL-9的表达(图2A)。
[0030] 伴随着IL-36β浓度的增高，Tc9分化条件和TGF-β刺激培养条件下，CD8+T细胞中IL-9的表达水平均逐渐增高，并呈现剂量依赖性关系，表明IL-36β能够促进APC刺激的Tc9细胞的分化(图2B和图2C)。
[0031] 在蛋白水平上，IL-36β可促进Tc9细胞IL-9、IL-10的表达，而且TGF-β加IL-36β能够替代Tc9经典极化条件，刺激CD8+T细胞表达更高水平的IL-9以及同等水平的IL-10(图3)。结果有统计学意义(p＜0.001)。
[0032] 实施例3：IL-36β促进Tc9细胞相关细胞因子和转录因子表达
[0033] Tc9分化条件下，加入IL-36β(100ng/m1)，采用抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)负载OVA抗原肽(SIINFEKL)刺激OT-I小鼠来源的CD8+T细胞，体外共培养50hr后，收集细胞，进行转录组测序分析。转录组测序的基因组比对率正常，数据筛选标准为p＜0.05，利用Graphpad Prism 7绘制热图。在此基础上，分析经TGF-β联合IL-4刺激的经典Tc9细胞和IL-36β促进分化的Tc9细胞中相关细胞因子、转录因子等基因的表达情况(图4)。
[0034] IL-36β能够上调Tc9极化条件下体外培养的CD8+T细胞中细胞因子IL-2、IL-3、IL-9、IL-10、IL-21、IL-22、IL-24，效应分子IFN-γ、FasL、穿孔素(Perforin，Prf1)、GzmA、GzmB、GzmC，共刺激分子肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4，OX40)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9，4-1BB)，转录因子STAT3、STAT5a、、BATF、BATF3的表达，同时抑制调节性T细胞(Treg)标志性分子Foxp3的表达。
[0035] 经典Tc9细胞和IL-36β促进分化的Tc9细胞均高表达Tc9细胞的特征性转录因子IRF4，低表达Tc1细胞的特征性转录因子Tbx21、Tc2细胞的特征性转录因子Gata3、Tc17细胞的特征性转录因子RORc，并且其IRF4、Tbx21和RORc的表达水平相近，IL-36β促进分化的Tc9细胞中Gata3的表达水平略高于经典Tc9细胞。
[0036] 综上所述，IL-36β可显著促进Tc9细胞相关细胞因子和转录因子的表达，并上调部分效应性分子的表达，其对Tc9细胞的分化及功能具有明显的促进作用。
[0037] 实施例4：IL-36β促进分化的Tc9细胞比经典Tc9具有更强的抗肿瘤效应[0038] 6-8周龄C57BL/6j小鼠于腹部外侧皮下接种B16-OVA细胞，5天后腹腔注射环磷酰胺，第6天腹腔注射负载OVA抗原肽(SIINFEKL)的骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。用负载OVA抗原肽的APC，刺激来源于OT1小鼠的CD8+T细胞，结合不同细胞因子条件，将其诱导成Tc9、IL-36β促进分化的Tc9(Tc9+IL-36β)和TGF-β、IL-36β联合刺激的CD8+ T(CD8+ T：TGF-β+IL-36β)细胞，然后分别用于过继治疗B16-OVA荷瘤小鼠，结果发现，与经典Tc9相比，IL-36β诱导的Tc9对B16-OVA肿瘤具有明显的抑制作用，并明显延长了荷瘤小鼠的生存期(图5)。
[0039] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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