酵母-MUC1免疫治疗组合物及其用途
阅读：447发布：2020-10-01
专利汇可以提供酵母-MUC1免疫治疗组合物及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开的是包含粘蛋白-1(MUC1)的基于 酵母 的免疫 治疗 组合物，以及用于 预防 和/或治疗特征为粘蛋白-1(MUC1)表达或过表达的癌症的方法。，下面是酵母-MUC1免疫治疗组合物及其用途专利的具体信息内容。
1.一种酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述免疫治疗组合物包含：
a)一种酵母媒介物；和
b)由所述酵母媒介物表达且包含至少一种MUC1抗原的融合蛋白，其中所述MUC1抗原从N至C末端的次序组成为：MUC1SEA/胞外域(ED)，其中所述MUC1SEA/ED域包含MUC1ED，该MUC1ED在N末端侧翼为来自MUC1SEA域非ED部分的一个或多个氨基酸；至少两个可变数目的串联重复(VNTR)域；MUC1跨膜(TM)域；和MUC1细胞质域(CD)。
2.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述抗原包含两个VNTR域。
3.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原具有与SEQ ID NO:15至少95%相同的氨基酸序列。
4.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1ED具有与选自下组的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:15的位置2-59；SEQ ID NO:14的位置
32-89；SEQ ID NO:2的位置116-173；SEQ ID NO:4的位置107-164；SEQ ID NO:6的位置
107-164；SEQ ID NO:8的位置98-155；SEQ ID NO:11的位置1098-1155；和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。
5.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1ED具有与SEQ ID NO:15的位置2-59或SEQ ID NO:14的位置32-89至少95%相同的氨基酸序列。
6.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1ED具有SEQ ID NO:15位置2-59或SEQ ID NO:14位置32-89的氨基酸序列。
7.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1SEA/ED具有与选自下组的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:15的位置1-59；SEQ ID NO:14的位置31-89；SEQ ID NO:2的位置115-173；SEQ ID NO:4的位置106-164；SEQ ID NO:6的位置106-164；SEQ ID NO:8的位置97-155；SEQ ID NO:11的位置1097-1155；和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。
8.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1SEA/ED具有SEQ ID NO:15位置1-59或SEQ ID NO:14位置31-89的氨基酸序列。
9.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述VNTR域具有与以下序列至少
95%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:15位置60至100之间的任何连续的20个氨基酸；SEQ ID NO:14位置90至130之间的任何连续的20个氨基酸；SEQ ID NO:11的位置126-145；
SEQ ID NO:11位置61至1020之间的任何连续的20个氨基酸；SEQ ID NO:11位置126至
965之间的任何连续的20个氨基酸；SEQ ID NO:12；和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。
10.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述VNTR域具有与以下序列至少
95%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:15位置60至100之间的任何连续的20个氨基酸或SEQ ID NO:14位置90至130之间的任何连续的20个氨基酸。
11.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白具有两个VNTR域，而且其中所述两个VNTR域的氨基酸序列是SEQ ID NO:15的位置60至100或SEQ ID NO:14的位置90至130。
12.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1TM域具有与选自下组的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:15的位置101-128、SEQ ID NO:14的位置131-158、SEQ ID NO:2的位置174-201、SEQ ID NO:4的位置165-192、SEQ ID NO:6的位置165-192、SEQ ID NO:8的位置156-183、SEQ ID NO:11的位置1156-1183、和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。
13.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1TM域具有与SEQ ID
NO:15的位置101-128或SEQ ID NO:14的位置131-158至少95%相同的氨基酸序列。
14.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1TM域具有SEQ ID NO:15位置101-128或SEQ ID NO:14位置131-158的氨基酸序列。
15.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1CD域具有与选自下组的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:15的位置129-200、SEQ ID NO:14的位置159-230、SEQ ID NO:2的位置202-273、SEQ ID NO:4的位置193-264、SEQ ID NO:6的位置193-264、SEQ ID NO:8的位置184-255、SEQ ID NO:11的位置1184-1255、SEQ ID NO:17的位置7-78、SEQ ID NO:17的位置79-150、SEQ ID NO:17的位置151-222、SEQ ID NO:18的位置1-72、SEQ ID NO:18的位置73-144、SEQ ID NO:18的位置145-216、和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。
16.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1CD域具有与SEQ ID
NO:15位置129-200或SEQ ID NO:14位置159-230的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
17.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1CD域具有SEQ ID NO:15的位置129-200或SEQ ID NO:14的位置159-230的氨基酸序列。
18.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原包含SEQ ID NO:15或与SEQ ID NO:15至少99%相同的氨基酸序列。
19.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
20.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白还包含附接于
MUC1SEA/ED N末端的MUC1信号序列。
21.权利要求20的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1信号序列具有与选自下组的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置1-27、SEQ ID NO:4的位置1-32、SEQ ID NO:6的位置1-32、SEQ ID NO:8的位置1-27、SEQ ID NO:11的位置1-23、SEQ ID NO:14的位置1-30、和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。
22.权利要求20的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1信号序列具有与SEQ ID NO:14位置1-30的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
23.权利要求20的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1信号序列具有SEQ ID NO:14位置1-30的氨基酸序列。
24.权利要求1至23中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白具有与SEQ ID NO:14至少95%相同的氨基酸序列。
25.权利要求1至23中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:14或与SEQ ID NO:14至少99%相同的氨基酸序列。
26.权利要求1至23中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
27.权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原包含1至11个氨基酸取代以创建MUC1激动剂抗原。
28.权利要求27的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中对于SEQ ID NO:23而言所述氨基酸取代选自以下：A96Y、P97L、G104V、S105Y、T106L、A147Y、C161V、T199L、D200F、S215Y和T239L。
29.权利要求27的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1激动剂抗原包含与SEQ ID NO:23至少95%相同的氨基酸序列。
30.权利要求27的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1激动剂抗原包含SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO:23至少99%相同的氨基酸序列。
31.一种酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述免疫治疗组合物包含：
a)一种酵母媒介物；和
b)由所述酵母媒介物表达且包含至少一种MUC1激动剂抗原的融合蛋白，其中所述MUC1激动剂抗原包含与SEQ ID NO:25至少95%相同的氨基酸序列。
32.权利要求31的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1激动剂抗原包含与SEQ ID NO:25至少99%相同的氨基酸序列。
33.权利要求31的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1激动剂抗原包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
34.一种酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述免疫治疗组合物包含：
a)一种酵母媒介物；和
b)由所述酵母媒介物表达且包含至少一种MUC1抗原的融合蛋白，其中所述MUC1抗原由MUC1的两个或更多个细胞质域(CD)组成。
35.权利要求34的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原由MUC1的3个细胞质域(CD)组成。
36.权利要求34的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述3个CD来自相同的MUC1蛋白。
37.权利要求34的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述每个CD域包含与选自下组的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:18的位置1-72、SEQ ID NO:18的位置
73-144、SEQ ID NO:18的位置145-216、SEQ ID NO:17的位置7-78、SEQ ID NO:17的位置
79-150、SEQ ID NO:17的位置151-222、SEQ ID NO:2的位置202-273、SEQ ID NO:4的位置
193-264、SEQ ID NO:6的位置193-264、SEQ ID NO:8的位置184-255、SEQ ID NO:11的位置1184-1255、SEQ ID NO:14的位置159-230、SEQ ID NO:15的位置129-200、和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。
38.权利要求34的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述每个CD域包含与选自下组的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:18的位置1-72、SEQ ID NO:18的位置73-144和SEQ ID NO:18的位置145-216、SEQ ID NO:17的位置7-78、SEQ ID NO:17的位置79-150、SEQ ID NO:17的位置151-222和SEQ ID NO:15的位置129-200。
39.权利要求34至38中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原具有与SEQ ID NO:18至少95%相同的氨基酸序列。
40.权利要求34至38中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18至少99%相同的氨基酸序列。
41.权利要求34至38中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
42.权利要求34至41中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白具有与SEQ ID NO:17至少95%相同的氨基酸序列。
43.权利要求34至41中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17至少99%相同的氨基酸序列。
44.权利要求34至41中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
45.权利要求1至44中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述酵母媒介物是整个酵母。
46.权利要求1至44中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述酵母媒介物经过加热失活。
47.权利要求1至44中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述酵母媒介物来自突变的酵母菌株，其相比于野生型酵母菌株产生低糖基化的蛋白质。
48.权利要求1至44中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原在所述酵母媒介物的细胞壁上表达。
49.权利要求1至44中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原在所述酵母媒介物的周质或细胞质中表达。
50.权利要求1至49中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述酵母媒介物来自酵母属(Saccharomyces)。
51.权利要求中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物1至49，其中所述酵母媒介物来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
52.权利要求1至51中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中通过在维持于pH水平5.5至8的培养基中培养能表达所述MUC1抗原的整个酵母，来产生所述免疫治疗组合物。
53.权利要求52的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述培养基用缓冲剂缓冲。
54.权利要求52的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中在维持于pH水平6至8的培养基中培养所述酵母。
55.权利要求1至54中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其还包含至少一种生物反应修饰剂。
56.权利要求1至54中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其还包含药学可接受的赋形剂。
57.权利要求1至56中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中已配制所述免疫治疗组合物用于注射。
58.一种减少肿瘤负荷、抑制肿瘤生长和/或增加患有表达MUC1的癌症的个体存活的方法，包括对所述个体施用权利要求1至57中任一项的免疫治疗组合物。
59.权利要求58的方法，其中在首次施用所述组合物时在所述个体的癌症中检测到MUC1表达。
60.权利要求58的方法，其中所述个体患有I期癌症。
61.权利要求58的方法，其中所述个体患有II期癌症。
62.权利要求58的方法，其中所述个体患有III期癌症。
63.权利要求58的方法，其中所述个体患有IV期癌症。
64.权利要求58至63中任一项的方法，其中所述个体正接受或已接受针对癌症的另一种疗法治疗。
65.权利要求64的方法，其中所述疗法是化疗。
66.权利要求64的方法，其中所述疗法是靶向性癌症疗法。
67.权利要求64的方法，其中所述疗法是放射疗法。
68.权利要求64的方法，其中所述疗法是过继性T细胞转移。
69.权利要求64的方法，其中所述疗法是施用一种或多种另外的免疫治疗组合物。
70.权利要求69的方法，其中所述另外的免疫治疗组合物包含第二癌抗原，该第二癌抗原是MUC1抗原或不是MUC1抗原。
71.权利要求69的方法，其中所述另外的免疫治疗组合物包含酵母媒介物和不包括MUC1抗原在内的第二癌抗原。
72.权利要求70或71的方法，其中所述第二癌抗原选自下组：突变的Ras、癌胚抗原(CEA)、短尾畸形蛋白、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤性结肠息肉病(APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、间皮素和NGEP。
73.权利要求70或71的方法，其中所述第二癌抗原选自下组：突变的Ras、癌胚抗原(CEA)和短尾畸形蛋白。
74.权利要求69的方法，其中所述另外的免疫治疗组合物是病毒载体疫苗。
75.权利要求69的方法，其中所述另外的免疫治疗组合物是树突细胞/肿瘤细胞融合物。
76.权利要求58至75中任一项的方法，其中所述方法还包括从所述个体经手术切除肿瘤。
77.一种预防或延迟表达MUC1的癌症发生的方法，包括对个体施用权利要求1至57中任一项的免疫治疗组合物。
78.权利要求77的方法，其中尚未在个体中检测到所述癌症。
79.权利要求78的方法，其中所述个体有形成癌症的高风险。
80.权利要求77的方法，其中所述个体具有癌前期损伤。
81.权利要求77的方法，其中所述个体患有癌症，但在所述癌症中尚未检测到表达MUC1的癌细胞。
82.权利要求58至81中任一项的方法，其中所述癌症具有上皮细胞起源。
83.权利要求58至81中任一项的方法，其中所述癌症选自下组：乳腺癌、小肠癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、黑素瘤、多髓细胞性白血病(MML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞样白血病(AML)、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、分泌组织的癌症、及其转移性癌。
84.权利要求77至81中任一项的方法，其中所述癌症选自下组：乳腺癌和结肠癌。
85.权利要求58至75中任一项的方法，其中所述癌症选自下组：乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌和AML。
86.权利要求58至75中任一项的方法，其中所述癌症是AML，且其中对骨髓移植(BMT)疗法的供体和受体两者施用所述酵母-MUC1免疫治疗组合物。
87.权利要求58至75中任一项的方法，其中所述癌症是AML，且其中对所述个体施用所述酵母-MUC1免疫治疗组合物连同阿糖胞苷和蒽环类抗生素疗法。
88.权利要求1至57中任一项的酵母-MUC1免疫治疗组合物治疗疾病的用途。
89.权利要求88的用途，其中所述疾病是癌症。
90.权利要求1至57中任一项的免疫治疗组合物在患有癌症的个体中减少、停滞、逆转或预防癌症的转移性进展的用途。
91.权利要求1至57中任一项的免疫治疗组合物预防或延迟表达MUC1的癌症发生的用途。
92.多种免疫治疗组合物的组合在治疗癌症中的用途，所述免疫治疗组合物包含：
a)依照权利要求1至57中任一项的第一免疫治疗组合物；和
b)至少一种另外的免疫治疗组合物，其包含酵母媒介物和并非MUC1抗原的抗原。
93.权利要求92的用途，其中所述并非MUC1抗原的抗原选自突变的Ras、癌胚抗原(CEA)、和/或短尾畸形蛋白。
酵母-MUC1免疫治疗组合物及其用途
[0001] 政府权利
[0002] 本发明是在与卫生和人力资源服务部(Department of Health and Human Services)下属机构，国家卫生研究院的研究和开发合作协议下创建的。美国政府在本发明中具有一定权利。
[0003] 对相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求35U.S.C.§119(e)下对2011年8月17日提交的美国临时专利申请No.61/524,407的优先权权益。美国临时专利申请No.61/524,407的完整公开内容通过提述并入本文。
[0006] 本发明由或代表2008年5月8日执行的研究和开发合作协议各方完成。该研究和开发合作协议的成员有：GlobeImmune,Inc.和由国家癌症研究所(National Cancer Institute)代表的美国卫生和人力资源服务部，该所是国家卫生研究院的一个所、中心或部门。
[0008] 本申请含有通过EFS-Web作为文本文件电子提交的序列表。该文本文件，称为“3923-40-PCT_ST25”，具有89KB的字节大小，并于2012年8月16日录入。依照37CFR§1.52(e)(5)，该文本文件中含有的信息通过提述完整并入本文。
发明领域
发明领域
[0009] 本发明一般涉及基于酵母的免疫治疗组合物，以及用于预防和/或治疗特征为粘蛋白-1(MUC1)表达或过表达的癌症的方法。
[0010] 发明背景
[0011] 癌症是世界范围内的第一大死亡起因，而且开发针对癌症的有效疗法仍然是研究和临床开发的最活跃领域之一。尽管已提出许多新办法来治疗和预防癌症，但许多癌症仍然具有较高的死亡率且可能难以治疗或对常规疗法相对不响应。
[0012] 人的大多数癌症和血液学恶性的特征至少部分在于称为粘蛋白-1(MUC1)的蛋白质的异常过表达，该蛋白的正常功能是帮助保护上皮细胞免于毒素、微生物和其他类型的外部环境应激(Kufe等,Hybridoma1984;3:223-32)。MUC1是从两个亚基的非共价相互作用形成的异二聚体蛋白，所述两个亚基由单个转录本编码，然后翻译后加工成亚基，称为MUC1-N和MUC1-C。MUC1正常见于分泌性内皮细胞的顶端边界，且当细胞应答应激而失去极性时(正常细胞的一种可逆过程)，MUC1能与通常位于基底外侧边界的分子相互作用。另外，应答应激环境，MUC1-N亚基(一种含有用O-连接的多糖大量糖基化的可变数目串联重复(VNTR)的大蛋白)可脱落。MUC1的另一个亚基，称为MUC1-C，具有胞外域、跨膜域和细胞质尾部，且能结合负责将MUC1与表皮生长因子受体(EGFR)(Li等,J Biol Chem2001;276:35239-42;Schroeder等,J Biol Chem2001;276:13057-64)以及其他受体酪氨酸激酶如ErbB2-4,20FGFR321和PDGFR(Li等,Mol Cancer Res2003;1:765-75;Ren等,Mol Cancer Res2006;4:873-83;Singh等,Cancer Res2007;67:5201-10)物理关联的配体。另外，已将MUC1-C与多种包含ErbB受体、c-Src、β-连环蛋白(catenin)、转录因子(p53，ERα)和其他效应器如Grb2/SOS在内的信号传导途径关联起来(Pandey等,Cancer Res1995;55:4000-3;Kinlough等,J Biol Chem2004;279:53071-7)。
[0013] 在经转化的上皮细胞中，膜极性是不可逆的且MUC1表达在癌细胞的整个表面均上调(Kufe等,1984,见上)。MUC1过表达与降低的MUC1-N O-糖基化有关，且MUC1-N在细胞表面的高水平空间上阻断细胞-细胞和细胞-胞外基质相互作用，这与恶性表型有 关 (Ligtenberg等 ,Cancer Res1992;52:223-32;van de Wiel-van Kemenade 等 ,J Immunol1993;151:767-76;Wesseling等,MolBiol Cell1996;7:565-77)。基于其牵涉与肿瘤发生有关的多种信号传导途径，MUC1-C亚基现被视为一种癌蛋白，而且其过表达已显示为涉及阻断应答DNA损伤(Ren等,Cancer Cell2004;5:163-75;Raina等,J Biol Chem2004;279:20607-12)、氧化性应激(Yin和Kufe,J Biol Chem2003;278:35458-64;Yin等,J Biol Chem2004;279:45721-7)、和缺氧(Yin等,J Biol Chem2007;282:257-66)对细胞凋亡的诱导，以及赋予锚地(anchorage)独立性的生长和肿瘤原性(Li等 ,Oncogene2003;22:6107-10;Huang 等 ,Cancer Biol Ther2003;2:702-6;Huang等,Cancer Res2005;65:10413-22;Schroeder等,Oncogene2004;23:5739-47)。
[0014] 如上文论述的，来自各实验室的数据指示MUC1-N(α亚基)在癌症中通过赋予允许免疫逃避和潜在的转移性传播的细胞特性来起作用。MUC1-C(β亚基)牵涉负责肿瘤引发和进展的信号传导途径。MUC1的这些双重功能可解释该抗原似乎在不同的癌症适应证中所起的不同作用。例如，MUC1似乎是癌症如乳腺癌和结肠癌中的早期标志物(例如 参 见 Kretschmer 等,Mol Cancer.2011Feb11;10(1):15;Mukhopadhyay 等 ,Biochim Biophys Acta.2011Apr;1815(2):224-40;Saeki等,Gastroenterology.2011Mar;140(3):892-902)，而MUC1与癌症如胰腺癌和食道癌中的上皮-间充质细胞转换(EMT)途径和转移性传播有关(例如参见Xu等,Life Sci.2011Jun6;88(23-24):1063-9;Besmer等,Cancer Res.2011Jul1;71(13):4432-42;Roy等,Oncogene2011Mar24;30(12):1449-59;Ye等,Lab Invest.2011May;91(5):778-87)，而且在急性髓细胞样白血病(AML)中通过反应性氧种类来防止末端分化(例如参见Yin等,Blood.2011May5;117(18):4863-70;Fatrai等,Exp Hematol.2008Oct;36(10):1254-65)，由此允许这些癌细胞的不受限制的自身再生。
[0015] 鉴于MUC1在癌细胞的恶性表型中的明显作用，MUC1且尤其是MUC1-N，一直是抗癌治疗办法的聚焦点所在。事实上，大多数治疗办法靶向MUC1-N，即MUC1异二聚体的胞外部分。然而，这类靶向MUC1-N的办法在临床中迄今为止尚未成功，可能是由于来自从细胞脱落的MUC1-N的干扰。更近的研究已提出用针对胞外域的抗体，或用肽，缀合于糖聚合物的肽，小分子，用表达MUC1的肿瘤细胞的制备物，和用树突细胞/肿瘤细胞融合物来靶向MUC1-C亚基。然而，目前没有得到批准的特异性靶向MUC1的癌症疗法。因此，本领域中仍然需要有效治疗和/或预防与MUC1表达或过表达有关的癌症的新产品。
[0016] 发明概述
[0017] 本发明的一个实施方案涉及酵母-MUC1免疫治疗组合物，其包含：(a)一种酵母媒介物；和(b)由所述酵母媒介物表达且包含至少一种MUC1抗原的融合蛋白。在一个方面，所述MUC1抗原从N至C末端的次序组成为：MUC1SEA/胞外域(ED)，其中所述MUC1SEA/ED域包含在N末端侧翼为来自MUC1SEA域非ED部分的一个或多个氨基酸的MUC1ED；至少两个可变数目的串联重复(VNTR)域；MUC1跨膜(TM)域；和MUC1细胞质域(CD)。
[0018] 在一个方面，所述抗原包含两个VNTR域。在一个方面，所述VNTR域具有与以下序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:11的位置126-145；SEQ ID NO:11的位置61至1020之间的任何连续的20个氨基酸；SEQ ID NO:11的位置126至965之间的任何连续的20个氨基酸；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:14的位置90至130之间的任何连续的20个氨基酸；SEQ ID NO:15的位置60至100之间的任何连续的20个氨基酸；和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，所述VNTR域具有与以下序列至少
95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:14的位置90至130之间的任何连续的20个氨基酸或SEQ ID NO:15的位置60至100之间的任何连续的20个氨基酸。
在一个方面，所述融合蛋白具有两个VNTR域，且两个VNTR域的氨基酸序列是SEQ ID NO:14的位置90至130或SEQ ID NO:15的位置60至100。
95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:14的位置90至130之间的任何连续的20个氨基酸或SEQ ID NO:15的位置60至100之间的任何连续的20个氨基酸。
在一个方面，所述融合蛋白具有两个VNTR域，且两个VNTR域的氨基酸序列是SEQ ID NO:14的位置90至130或SEQ ID NO:15的位置60至100。
[0019] 在一个方面，所述MUC1ED具有与选自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置116-173；SEQ ID NO:4的位置
107-164；SEQ ID NO:6的位置107-164；SEQ ID NO:8的位置98-155；SEQ ID NO:11的位置
1098-1155；SEQ ID NO:14的位置32-89；SEQ ID NO:15的位置2-59；和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，所述MUC1ED具有与SEQ ID NO:14的位置32-894或SEQ ID NO:15的位置2-59至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1ED具有SEQ ID NO:14的位置32-89或SEQ ID NO:15的位置2-59的氨基酸序列。
在一个方面，所述MUC1SEA/ED具有与选自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置115-173；SEQ ID NO:4的位置106-164；SEQ ID NO:6的位置106-164；SEQ ID NO:8的位置97-155；SEQ ID NO:11的位置1097-1155；
SEQ ID NO:14的位置31-89；SEQ ID NO:15的位置1-59；和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，所述MUC1SEA/ED具有SEQ ID NO:14的位置31-89或SEQ ID NO:15的位置1-59的氨基酸序列。
107-164；SEQ ID NO:6的位置107-164；SEQ ID NO:8的位置98-155；SEQ ID NO:11的位置
1098-1155；SEQ ID NO:14的位置32-89；SEQ ID NO:15的位置2-59；和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，所述MUC1ED具有与SEQ ID NO:14的位置32-894或SEQ ID NO:15的位置2-59至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1ED具有SEQ ID NO:14的位置32-89或SEQ ID NO:15的位置2-59的氨基酸序列。
在一个方面，所述MUC1SEA/ED具有与选自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置115-173；SEQ ID NO:4的位置106-164；SEQ ID NO:6的位置106-164；SEQ ID NO:8的位置97-155；SEQ ID NO:11的位置1097-1155；
SEQ ID NO:14的位置31-89；SEQ ID NO:15的位置1-59；和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，所述MUC1SEA/ED具有SEQ ID NO:14的位置31-89或SEQ ID NO:15的位置1-59的氨基酸序列。
[0020] 在一个方面，所述MUC1TM域具有与选自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置174-201、SEQ ID NO:4的位置
165-192、SEQ ID NO:6的位置165-192、SEQ ID NO:8的位置156-183、SEQ ID NO:11的位置1156-1183、SEQ ID NO:14的位置131-158、SEQ ID NO:15的位置101-128、和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，所述MUC1TM域具有与SEQ ID NO:14的位置131-158或SEQ ID NO:15的位置101-128至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。
在一个方面，所述MUC1TM域具有SEQ ID NO:14的位置131-158或SEQ ID NO:15的位置
101-128的氨基酸序列。
165-192、SEQ ID NO:6的位置165-192、SEQ ID NO:8的位置156-183、SEQ ID NO:11的位置1156-1183、SEQ ID NO:14的位置131-158、SEQ ID NO:15的位置101-128、和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，所述MUC1TM域具有与SEQ ID NO:14的位置131-158或SEQ ID NO:15的位置101-128至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。
在一个方面，所述MUC1TM域具有SEQ ID NO:14的位置131-158或SEQ ID NO:15的位置
101-128的氨基酸序列。
[0021] 在一个方面，所述MUC1CD域具有与选自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置202-273、SEQ ID NO:4的位置
193-264、SEQ ID NO:6的位置193-264、SEQ ID NO:8的位置184-255、SEQ ID NO:11的位置1184-1255、SEQ ID NO:14的位置159-230、SEQ ID NO:15的位置129-200、SEQ ID NO:17的位置7-78、SEQ ID NO:17的位置79-150、SEQ ID NO:17的位置151-222；SEQ ID NO:18的位置1-72、SEQ ID NO:18的位置73-144、SEQ ID NO:18的位置145-216、和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，所述MUC1CD域具有与SEQ ID NO:14的位置159-230或SEQ ID NO:15的位置129-200的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1CD域具有SEQ ID NO:14的位置159-230或SEQ ID NO:15的位置129-200的氨基酸序列。
193-264、SEQ ID NO:6的位置193-264、SEQ ID NO:8的位置184-255、SEQ ID NO:11的位置1184-1255、SEQ ID NO:14的位置159-230、SEQ ID NO:15的位置129-200、SEQ ID NO:17的位置7-78、SEQ ID NO:17的位置79-150、SEQ ID NO:17的位置151-222；SEQ ID NO:18的位置1-72、SEQ ID NO:18的位置73-144、SEQ ID NO:18的位置145-216、和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，所述MUC1CD域具有与SEQ ID NO:14的位置159-230或SEQ ID NO:15的位置129-200的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1CD域具有SEQ ID NO:14的位置159-230或SEQ ID NO:15的位置129-200的氨基酸序列。
[0022] 在本发明该实施方案的一个方面，所述MUC1抗原具有与SEQ ID NO:15至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1抗原包含SEQ ID NO:15或与SEQ ID NO:15至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1抗原具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
[0023] 在本发明该实施方案的一个方面，所述融合蛋白还包含附接于MUC1SEA/ED N末端的MUC1信号序列。在一个方面，所述MUC1信号序列具有与选自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置1-27、SEQ ID NO:4的位置1-32、SEQ ID NO:6的位置1-32、SEQ ID NO:8的位置1-27、SEQ ID NO:11的位置1-23、SEQ ID NO:14的位置1-30、和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，所述MUC1信号序列具有与SEQ ID NO:14的位置1-30的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或
100%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1信号序列具有SEQ ID NO:14的位置1-30的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白具有与SEQ ID NO:14至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:14或与SEQ ID NO:14至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
100%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1信号序列具有SEQ ID NO:14的位置1-30的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白具有与SEQ ID NO:14至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:14或与SEQ ID NO:14至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
[0024] 在本发明该实施方案的一个方面，所述MUC1抗原相比于野生型MUC1序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个氨基酸取代以形成在MUC1抗原内的1至11个激动剂表位(本文中亦称为MUC1激动剂抗原)。在本发明该实施方案的一个方面，对于SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的MUC1抗原部分，所述氨基酸取代选自：A96Y、P97L、G104V、S105Y、T106L、A147Y、C161V、T199L、D200F、S215Y和T239L。在一个方面，所述MUC1激动剂抗原具有与SEQ ID NO:23至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1抗原包含SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO:23至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1抗原具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。权利要求1的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其中所述MUC1抗原包含1至11个氨基酸取代以创建MUC1激动剂抗原。
[0025] 本发明的另一个实施方案涉及包含以下的酵母-MUC1免疫治疗组合物：(a)一种酵母媒介物；和(b)由所述酵母媒介物表达且包含至少一种MUC1抗原的融合蛋白。所述MUC1抗原由MUC1的两个或更多个细胞质域(CD)组成。在一个方面，所述MUC1抗原由MUC1的3个细胞质域(CD)组成。在一个方面，所述3个CD来自相同的MUC1蛋白。在一个方面，每个CD域包含与选自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置202-273、SEQ ID NO:4的位置193-264、SEQ ID NO:6的位置193-264、SEQ ID NO:8的位置184-255、SEQ ID NO:11的位置1184-1255、SEQ ID NO:14的位置159-230、SEQ ID NO:15的位置129-200、SEQ ID NO:17的位置7-78、SEQ ID NO:17的位置79-150、SEQ ID NO:17的位置151-222、SEQ ID NO:18的位置1-72、SEQ ID NO:18的位置73-144、SEQ ID NO:18的位置145-216、和来自不同人MUC1蛋白的相应序列。在一个方面，每个CD域包含与选自下组的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:15的位置129-200、SEQ ID NO:17的位置7-78、SEQ ID NO:17的位置79-150、SEQ ID NO:17的位置151-222、SEQ ID NO:18的位置1-72、SEQ ID NO:18的位置73-144和SEQ ID NO:18的位置145-216。
[0026] 在该实施方案的一个方面，所述MUC1抗原具有与SEQ ID NO:18至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1抗原具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1抗原具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白具有与SEQ ID NO:17至少95%、96%、
97%、或98%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
97%、或98%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
[0027] 本发明的另一个实施方案涉及一种酵母-MUC1免疫治疗组合物，其包含：(a)一种酵母媒介物；和(b)由所述酵母媒介物表达且包含至少一种MUC1激动剂抗原的融合蛋白。在本发明该实施方案的一个方面，所述MUC1激动剂抗原相比于野生型MUC1序列包含1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个氨基酸取代以形成在MUC1抗原内的1至11个激动剂表位(本文中亦称为MUC1激动剂抗原)。在一个方面，所述MUC1激动剂抗原具有与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1抗原包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25或与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1抗原具有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多个氨基酸取代以形成在MUC1抗原内的1至11个激动剂表位(本文中亦称为MUC1激动剂抗原)。在一个方面，所述MUC1激动剂抗原具有与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1抗原包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25或与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25至少99%相同的氨基酸序列。在一个方面，所述MUC1抗原具有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
[0028] 本发明的再一个实施方案涉及一种减轻肿瘤负担、抑制肿瘤生长和/或增加患有表达MUC1的癌症的个体存活的方法。所述方法包括对个体施用上文或本文别处所描述的酵母-MUC1免疫治疗组合物。在一个方面，在首次施用所述组合物时在所述个体的癌症中检测所述MUC1表达。在一个方面，所述个体患有I期癌症。在一个方面，所述个体患有II期癌症。在一个方面，所述个体患有III期癌症。在一个方面，所述个体患有IV期癌症。
[0029] 本发明的另一个实施方案涉及本文中描述的任一种酵母-MUC1免疫治疗组合物治疗疾病的用途。在一个方面，所述疾病是癌症。
[0030] 本发明的再一个实施方案涉及本文中描述的任一种酵母-MUC1免疫治疗组合物在患有癌症的个体中减少、停滞、逆转或预防癌症的转移性进展的用途。
[0031] 本发明的又一个实施方案涉及本文中描述的任一种酵母-MUC1免疫治疗组合物预防或延迟表达MUC1的癌症发生的用途。
[0032] 本发明的另一个实施方案涉及一种免疫治疗组合物的组合治疗癌症的用途，所述免疫治疗组合物包含：(a)第一组合物，其为本文中描述的任一种酵母-MUC1免疫治疗组合物；和(b)至少一种另外的免疫治疗组合物，其包含酵母媒介物和并非MUC1抗原的抗原。在一个方面，所述并非MUC1抗原的抗原选自突变的Ras、癌胚抗原(CEA)、和/或短尾畸形蛋白。
[0033] 在涉及关于本文中描述的酵母-MUC1免疫治疗组合物的方法或用途的任一实施方案的一个方面，所述个体正接受或已接受针对癌症的另一种疗法治疗，其包括但不限于，化疗、靶向性癌症疗法、放射疗法、过继性T细胞转移、从个体手术切除肿瘤、和/或施用一种或多种另外的免疫治疗组合物。在一个方面，所述另外的免疫治疗组合物包含是MUC1抗原的第二癌抗原或不是MUC1抗原的癌抗原。在一个方面，所述另外的免疫治疗组合物包含酵母媒介物和不包括MUC1抗原在内的第二癌抗原。在一个方面，所述另外的免疫治疗组合物包含的第二癌抗原包括但不限于，突变的Ras、癌胚抗原(CEA)、短尾畸形蛋白(Brachyury)、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤性结肠息肉病(APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、间皮素(Mesothelin)、和/或NGEP。在一个方面，第二癌抗原选自下组：突变的Ras、癌胚抗原(CEA)和短尾畸形蛋白。在一个方面，所述另外的免疫治疗组合物是病毒载体疫苗。在一个方面，所述另外的免疫治疗组合物是树突细胞/肿瘤细胞融合物。
[0034] 本发明的再一个实施方案涉及一种预防或延迟表达MUC1的癌症发生的方法。所述方法包括对个体施用本文中描述的任一种酵母-MUC1免疫治疗组合物的步骤。在一个方面，尚未在个体中检测到所述癌症。在一个方面，所述个体有形成癌症的高风险。在一个方面，所述个体具有癌前期损伤。在一个方面，所述个体患有癌症，但在所述癌症中尚未检测到表达MUC1的癌细胞。
[0035] 在涉及本文中描述的酵母-MUC1免疫治疗组合物的任一种方法或用途中，在一个方面，所述癌症是上皮细胞起源的。在一个方面，所述癌症可包括但不限于：乳腺癌、小肠癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、黑素瘤、多髓细胞性白血病(multiple myelogenous leukemia)(MML)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、急性髓细胞样白血病(acute myeloid leukemia)(AML)、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、分泌组织的癌症、及其转移性癌。在一个方面，所述癌症选自乳腺癌和结肠癌。在一个方面，所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌和AML。在一个方面，所述癌症是AML，且对骨髓移植(BMT)疗法的供体和受体两者施用所述酵母-MUC1免疫治疗组合物。在一个方面，所述癌症是AML，且对所述个体施用所述酵母-MUC1免疫治疗组合物连同阿糖胞苷和蒽环类抗生素疗法。
[0036] 在上文和本文别处描述的本发明的任一个实施方案中，在一个方面，所述酵母媒介物是整个酵母。在一个方面，所述酵母媒介物是经过加热失活的。在一个方面，所述酵母媒介物来自突变的酵母菌株，其相比于野生型酵母菌株产生低糖基化的蛋白质。在一个方面，所述MUC1抗原在酵母媒介物的细胞壁上表达。在一个方面，所述MUC1抗原在酵母媒介物的周质或细胞质中表达。在一个方面，所述酵母媒介物来自酵母属(Saccharomyces)。在一个方面，所述酵母媒介物来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0037] 在上文和本文别处描述的本发明的任一个实施方案中，在一个方面，通过在维持于pH水平5.5至8的培养基中培养表达所述MUC1抗原的整个酵母产生所述免疫治疗组合物。在一个方面，所述培养基用缓冲剂缓冲。在一个方面，在维持于pH水平6至8的培养基中培养所述酵母。
[0038] 在上文和本文别处描述的本发明的任一个实施方案中，在一个方面，所述组合物还包含至少一种生物反应修饰剂。
[0039] 在上文和本文别处描述的本发明的任一个实施方案中，在一个方面，所述组合物还包含药学可接受的赋形剂。
[0040] 在上文和本文别处描述的本发明的任一个实施方案中，在一个方面，配制所述免疫治疗组合物用于注射。
[0042] 图1A是显示全长MUC1蛋白的结构的示意图。
[0043] 图1B是显示在称为GI-6101的基于酵母的免疫治疗组合物中表达的融合蛋白结构的示意图。
[0044] 图1C是显示在称为GI-6104的基于酵母的免疫治疗组合物中表达的融合蛋白结构的示意图。
[0045] 图2A是显示GI-6101的MUC1融合蛋白表达的数字化图像。
[0046] 图2B是显示在去糖基化之前和之后来自GI-6101和6104的MUC1融合蛋白表达的数字化图像。
[0047] 图2C是显示GI-6104的MUC1融合蛋白表达的数字化图像。
[0048] 图3是显示GI-6105的MUC1融合蛋白表达的数字化图像。
[0049] 发明详述
[0050] 本发明一般涉及基于酵母的免疫治疗组合物以及用于预防和/或治疗特征为表达或过表达粘蛋白-1(可在本文中一般性称为“MUC1”，且其亦称为或已知为“DF3抗原”或“HMFG”)的癌症的方法。本发明包括包含酵母媒介物和新MUC1抗原的基于酵母的免疫治疗组合物(亦称为基于酵母的免疫治疗组合物或产品)(本文中亦称为“酵母-MUC1免疫治疗组合物”、“酵母-MUC1免疫治疗产品”或“酵母-MUC1免疫治疗组合物”)的用途。发明人在本文中描述了新的酵母-MUC1免疫治疗产品的构建和产生，并显示酵母-MUC1免疫疗法熟化人树突细胞(DC)、增加来自DC的细胞因子产生(其与预期在肿瘤治疗中有益的免疫应答有关)，并引发MUC1特异性T细胞系的活化。总之，本文中呈现的数据显示酵母-MUC1+ +免疫治疗可用于引发MUC1特异性细胞免疫应答(CD4 和CD8)而且预期酵母-MUC1免疫治疗可用于预防和治疗表达MUC1的肿瘤。
[0051] 酵母-MUC1免疫疗法可容易地适应于在相同的酵母组合物内使用另外的肿瘤抗原，或与靶向其他肿瘤抗原的其他基于酵母的免疫治疗物(序贯或同时)或其他免疫治疗物和治疗/疗法组合用于癌症。因此，所述酵母-MUC1免疫治疗可适应于癌症类型、癌症阶段、癌症分级、肿瘤表达的抗原、和个体的总体医学状态(即该疗法是易于个体化的)，且对于已患有癌症的个体，其使用可随着癌症在个体中进展而改变从而提供在多种肿瘤阶段的最大功效。酵母-MUC1免疫治疗提供了具有广泛基础的预防性和/或治疗性处理大范围癌症的机会。
[0052] 事实上，酵母-MUC1免疫治疗可以灵活方式使用以治疗各种MUC1阳性癌症，其通过针对该抗原在每种类型的癌症适应证中所起的特定作用定制酵母-MUC1免疫疗法。例如，由于MUC1已描述为癌症如乳腺癌或结肠癌中的早期标志物，可在患有MUC1阳性恶化前乳腺增生或结肠息肉的患者中预防性使用基于酵母的免疫疗法。另一个例子是，由于已将MUC1与癌症如胰腺癌、卵巢癌和食道癌中的上皮-间充质细胞转换(EMT)途经和转移性扩散关联，因此酵母-MUC1免疫治疗物可作为这些癌症中的标准护理治疗的治疗附加使用以促进MUC1阳性3期胰腺癌、卵巢癌和食道癌中转移性扩散的停滞。再一个例子是，由于已显示MUC1在急性髓细胞样白血病(AML)中通过反应性氧种类来阻止末端分化，由此允许这些癌细胞的不受限制的自身再生，因此，酵母-MUC1免疫治疗可作为MUC1阳性AML中的标准治疗的附加使用以促进细胞凋亡并阻止恶性细胞的不受限制的自身再生。在AML患者中使用酵母-MUC1免疫治疗的临床试验记载于实施例中。
[0053] 本文中描述的酵母-MUC1组合物诱导先天免疫应答，以及针对靶抗原(MUC1)的适+应性免疫应答，包括CD4依赖性TH17和TH1T细胞应答和抗原特异性CD8T细胞应答，其包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，所有均没有使用其中许多具有毒性问题的外源佐剂、细胞因子或其他免疫刺激性分子。另外，酵母-MUC1免疫治疗组合物抑制调节性T细胞(Treg)数目和/或功能，由此增强例如可能正常被肿瘤存在抑制的效应器T细胞应答。而且，与通过生成抗体应答来免疫的免疫治疗组合物相比，认为由酵母-MUC1免疫治疗引发的抗原特异性的、基础广泛的和有力的细胞免疫应答在靶向肿瘤细胞中特别有效。事实上，大量研究+
已显示在I类MHC分子的背景中当经由识别肿瘤肽的CD8CTL来靶向肿瘤细胞时，免疫治疗办法得到增强。酵母-MUC1免疫治疗高度擅长活化抗原提呈细胞，且具有交叉引发免疫应+
答的独特能力，从而生成对肿瘤通常有效的CD8CTL应答，甚至在面对可能是抑制性环境的情况中。由于该类型的免疫治疗利用抗原提呈细胞呈现相关免疫原的天然能力，因此不需要知晓MUC1的CTL表位或II类MHC表位的准确身份以产生依照本发明的有效免疫治疗。
+ +
事实上，在单一的酵母-MUC1免疫治疗组合物中可靶向多种CD4 和CD8T细胞表位，因此本发明的酵母-MUC1免疫治疗不限于使用短肽。确实，在这些组合物中使用含有靶抗原多个域的更长的多肽和融合蛋白是有效的。因此，通过使用酵母-MUC1免疫治疗，避免了使用算法和复杂公式来鉴定推定的T细胞表位。
已显示在I类MHC分子的背景中当经由识别肿瘤肽的CD8CTL来靶向肿瘤细胞时，免疫治疗办法得到增强。酵母-MUC1免疫治疗高度擅长活化抗原提呈细胞，且具有交叉引发免疫应+
答的独特能力，从而生成对肿瘤通常有效的CD8CTL应答，甚至在面对可能是抑制性环境的情况中。由于该类型的免疫治疗利用抗原提呈细胞呈现相关免疫原的天然能力，因此不需要知晓MUC1的CTL表位或II类MHC表位的准确身份以产生依照本发明的有效免疫治疗。
+ +
事实上，在单一的酵母-MUC1免疫治疗组合物中可靶向多种CD4 和CD8T细胞表位，因此本发明的酵母-MUC1免疫治疗不限于使用短肽。确实，在这些组合物中使用含有靶抗原多个域的更长的多肽和融合蛋白是有效的。因此，通过使用酵母-MUC1免疫治疗，避免了使用算法和复杂公式来鉴定推定的T细胞表位。
[0054] 可在免疫方案(预防性或治疗性)中有效利用酵母-MUC1而不使用外源佐剂、免疫刺激剂或分子、共刺激分析或细胞因子，尽管在期望时可以纳入这类药剂。而且，可重复施用酵母-MUC1免疫治疗而不损失功效，这对于其他类型的免疫治疗可能是成问题的。
[0055] 本发明的组合物
[0056] 本发明的一个实施方案涉及基于酵母的免疫治疗组合物，其可用于预防和/或治疗特征为MUC1表达或过表达的癌症(包括初始可能不含表达可检测MUC1的细胞，但在癌症进展的后期阶段可能或将含有表达MUC1的细胞的癌症)。所述组合物是酵母-MUC1免疫治疗组合物，其包含：(a)一种酵母媒介物；和(b)包含一种或多种MUC1抗原和/或其免疫原性域的癌抗原。MUC1抗原或其免疫原性域最典型地由酵母媒介物表达为重组蛋白(例如通过完整的酵母或酵母原生质球，其任选地可进一步加工成酵母胞质体、酵母空胞(ghost)、或酵母膜提取物或其级分)，尽管作为本发明的一个实施方案，将一种或多种MUC1抗原加载到酵母媒介物中或与本文中所述酵母媒介物复合、附接、混合或一起施用以形成本发明的组合物。
[0057] “酵母-MUC1免疫治疗组合物”是一种特定类型的“基于酵母的免疫治疗组合物”，其含有至少一种MUC1抗原或其免疫原性域。术语“基于酵母的免疫治疗组合物”可与“基于酵母的免疫治疗产品”、“基于酵母的免疫疗法组合物”、“基于酵母的组合物”、“基于酵母的免疫治疗物”、“基于酵母的疫苗”或这些术语的衍生物交换使用。“免疫治疗组合物”是一种引发足以在受试者中实现至少一种治疗益处的免疫应答的组合物。如本文中使用的，基于酵母的免疫治疗组合物指包含酵母媒介物组分并在受试者中引发足以实现至少一种治疗益处的免疫应答的组合物。更具体地，基于酵母的免疫治疗组合物是包含酵母媒介物组分和通常地抗原组分，并能引发或诱导免疫应答如细胞免疫应答的组合物，所述细胞免疫应答包括但不限于T细胞介导的细胞免疫应答。在一个方面，可用于本发明的基于酵母+ + +的免疫治疗组合物能诱导CD8 和/或CD4T细胞介导的免疫应答，且在一个方面，是CD8+ +
和CD4T细胞介导的免疫应答，特别是针对靶抗原(例如癌抗原)的。CD4 免疫应答可包括TH1免疫应答、TH2免疫应答、TH17免疫应答或上述的任意组合。基于酵母的免疫治疗物尤+
其能够生成TH1和TH17应答。CD8 免疫应答可包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，而基于酵母的免疫治疗物能生成这类应答。在一个方面，基于酵母的免疫治疗组合物调控受试者中调节性T细胞(Treg)的数目和/或功能性。基于酵母的免疫治疗还可改变为促进一种类型相对于另一种类型的应答，例如通过加入细胞因子、抗体，和/或调控酵母的制造过程。任选地，基于酵母的免疫治疗组合物能引发体液免疫应答。
和CD4T细胞介导的免疫应答，特别是针对靶抗原(例如癌抗原)的。CD4 免疫应答可包括TH1免疫应答、TH2免疫应答、TH17免疫应答或上述的任意组合。基于酵母的免疫治疗物尤+
其能够生成TH1和TH17应答。CD8 免疫应答可包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，而基于酵母的免疫治疗物能生成这类应答。在一个方面，基于酵母的免疫治疗组合物调控受试者中调节性T细胞(Treg)的数目和/或功能性。基于酵母的免疫治疗还可改变为促进一种类型相对于另一种类型的应答，例如通过加入细胞因子、抗体，和/或调控酵母的制造过程。任选地，基于酵母的免疫治疗组合物能引发体液免疫应答。
[0058] 本发明的酵母-MUC1免疫治疗组合物可以是“预防性”或“治疗性”的。当预防性提供时，本发明的组合物在表达MUC1的癌症形成或检测出形成之前提供，其目标是预防、抑制或延迟表达MUC1的肿瘤的形成；和/或预防、抑制或延迟这类肿瘤的转移和/或一般性预防或抑制个体中的癌症进展。如本文中论述的，MUC1在几种癌症中表达。因此，预防性组合物可施用给看似无癌症的个体(健康或正常的个体)、癌前期的个体(恶性前期损伤)、以及患有癌症但其中尚未检测到MUC1的个体(即在癌症中的肿瘤细胞表达MUC1之前)。有形成癌症，特别是与MUC1表达和/或转移通常有关的癌症的高风险的个体，可用本发明的组合物预防性治疗。当治疗性提供时，将所述免疫治疗组合物提供给患有表达MUC1的癌症的个体，其目标是改善癌症，如通过减轻个体中的肿瘤负担；抑制个体中的肿瘤生长；增加个体存活；和/或预防、抑制、逆转或延迟个体中癌症的进展。
[0059] 通常而言，酵母-MUC1免疫治疗组合物包含酵母媒介物和至少一种包含MUC1抗原或其免疫原性域的癌抗原，其中所述癌抗原由所述酵母媒介物表达、与其附接、加载入其中或与其混合。在一些实施方案中，所述癌抗原，MUC1抗原或其免疫原性域提供为融合蛋白。下文描述了适用于本发明的组合物和方法中的几种MUC1蛋白和融合蛋白。在一些实施方案中，所述癌抗原和MUC1抗原是相同的元件。在一些实施方案中，所述癌抗原包含其他抗原，包括除了MUC1抗原以外的其他癌抗原。在本发明的一个方面，可用作癌抗原的融合蛋白可包含两种或更多种抗原，例如MUC1抗原和另一种并非MUC1抗原的癌抗原，或两种不同的MUC1抗原。在一个方面，所述融合蛋白可包含一种或多种抗原的两个或更多个免疫原性域如MUC1抗原的两个或更多个免疫原性域，或一种或多种抗原的两个或更多个表位如MUC1抗原的两个或更多个表位。
[0060] 依照本发明，用于酵母-MUC1免疫治疗组合物的酵母媒介物是任何可连同一种或多种抗原、其免疫原性域或其表位用在本发明的组合物(例如治疗性或预防性组合物)中的酵母细胞(例如全细胞或完整细胞)或其衍生物(见下文)。因此，所述酵母媒介物可包含但不限于，活的完整(全)酵母微生物(即具有其包括细胞壁在内的所有组分的酵母细胞)、杀死(死亡)或失活的完整酵母微生物、或完整酵母的衍生物，其包括：酵母原生质球(即缺少细胞壁的酵母细胞)、酵母胞质体(即缺少细胞壁和细胞核的酵母细胞)、酵母空胞(即缺少细胞壁、细胞核和细胞质的酵母细胞)、亚细胞酵母膜提取物或其级分(亦称为酵母膜颗粒或先前作为亚细胞酵母颗粒)、任何其他酵母颗粒、或酵母细胞壁制备物。
[0061] 酵母原生质球通常通过对酵母细胞壁的酶消化产生。这类方法记载于例如Franzusoff等,1991,Meth.Enzymol.194,662-674，通过提述完整并入本文。
[0062] 酵母胞质体通常通过酵母细胞的去核产生。这类方法记载于例如Coon,1978,Natl.Cancer Inst.Monogr.48,45-55，通过提述完整并入本文。
[0063] 酵母空胞(ghost)通常通过将透化或裂解的细胞重密封产生，且可以但不必需地含有该细胞的至少一些细胞器。这类方法记载于例如Franzusoff等,1983,J.Biol.Chem.258,3608-3614和Bussey等,1979,Biochim.Biophys.Acta553,185-196，其各自通过提述完整并入本文。
[0064] 酵母膜颗粒(亚细胞的酵母膜提取物或其级分)指缺少天然细胞核或细胞质的酵母膜。该颗粒可以具有任意大小，包括从天然酵母膜到通过超声处理或其他本领域技术人员已知的膜破坏方法继之以重密封产生的微颗粒的大小。用于产生亚细胞酵母膜提取物的方法记载于例如Franzusoff等,1991,Meth.Enzymol.194,662-674。还可以使用酵母膜颗粒级分，其含有酵母膜部分和所述抗原或其他感兴趣的蛋白质(当在制备酵母膜颗粒之前由酵母重组表达所述抗原或其他蛋白质时)。可以在膜的内部、膜的任一表面或其组合携带有抗原或其他感兴趣的蛋白质(即蛋白质可在膜的内部和外部和/或跨越酵母膜颗粒的膜)。在一个实施方案中，酵母膜颗粒是重组酵母膜颗粒，其可以是完整的、受破坏的或破坏并重密封的酵母膜，在膜的表面上或至少部分包埋于膜内地包含至少一种期望的抗原或其他感兴趣的蛋白质。
[0065] 酵母细胞壁制备物的一个例子是在其表面上或至少部分包埋于细胞壁内地携带抗原的分离的酵母细胞壁的制备物，从而当对动物施用该酵母细胞壁制备物时，刺激针对疾病靶物的期望的免疫应答。
[0066] 可使用任意酵母菌株来产生本发明的酵母媒介物。酵母是属于以下三类之一的单细胞微生物：子囊菌(Ascomycetes)、担子菌(Basidiomycetes)和半知菌(Fungi Imperfecti)。对将一种类型的酵母选择用作免疫调控物的一个考虑是酵母的致病性。在一个实施方案中，所述酵母是非致病性菌株如酿酒酵母。非致病性酵母菌株的选择使得对其施用酵母媒介物的个体的任何不良作用最小化。然而，如果酵母的致病性可通过本领域技术人员已知的任何手段抵消(例如突变体菌株)，那么可以使用致病性酵母。依照本发明的一个方面，使用非致病性酵母菌株。
[0067] 可在本发明中使用的酵母菌株的属包括但不限于酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)(其可以是致病性的)、隐球菌属(Cryptococcus)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和西洋蓍霉属(Yarrowia)。在一个方面，酵母的属选自酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，而在一个方面，使用酵母属。可在本发明中使用的酵母菌株的物种包括但不限于，酿酒酵母、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母变种乳酸(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、深红酵母(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、和解脂西洋蓍霉酵母(Yarrowia lipolytica)。要领会的是，在这些物种中有许多包括多种亚种、类型、亚型等，其意图纳入前述物种中。在一个方面，本发明中使用的酵母物种包括酿酒酵母、白色假丝酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母。可使用酿酒酵母，因为其易于操作且对于用作食品添加剂是“一般认为安全”或“GRAS”的(GRAS，FDA提出的细则62FR18938，1997年4月17日)。本发明的一个实施方案是能够将质粒复制成特别高拷贝数的酵母菌株，如酿酒酵母cir°菌株。所述酿酒酵母菌株是一种能支持表达载体的这类菌株，所述载体允许以高水平表达一种或多种靶抗原和/或抗原融合蛋白和/或其他蛋白质。另一种可用于本发明的酵母菌株是酿酒酵母W303α。另外，可在本发明中使用任何突变体酵母菌株，包括那些展现出所表达的靶抗原或其他蛋白质的降低的翻译后修饰的酵母菌株，如扩大N-连接的糖基化的酶中的突变。在本发明的一个方面，使用突变体酵母菌株产生酵母-MUC1免疫治疗组合物，该突变体酵母菌株将MUC1抗原产生为相比于由野生型菌株产生的相同抗原(具有正常的糖基化)低糖基化的蛋白质。这类MUC1抗原可能更类似于由肿瘤细胞表达的MU1抗原，其随后可由抗原提呈细胞加工成独特的T细胞表位，如此增强特异性的抗肿瘤应答。
[0068] 本发明的酵母-MUC1免疫治疗组合物包含至少一种包含MUC1抗原的癌抗原。依照本发明，术语“抗原”在本文中的一般使用指：蛋白质的任意部分(例如肽、部分蛋白质、全长蛋白质)，其中所述蛋白质对于细胞组合物(全细胞、细胞裂解物或破坏的细胞)、对于生物体(全生物体、裂解物或破坏的细胞)或对于糖类、或其他分子、或其部分是天然存在或合成性得到或设计的。抗原可引发通过免疫系统元件(例如T细胞、抗体)的抗原特异性免疫应答(例如体液和/或细胞介导的免疫应答)，其针对在体外、体内或离体所遇到的相同或类似的抗原。
[0069] 抗原可以小至单个表位、单个免疫原性域或更大，并且可包含多个表位或免疫原性域。如此，抗原的大小可以小至约8-11个氨基酸(即肽)且大至：蛋白质的域、全长蛋白质、多聚体、融合蛋白、嵌合蛋白、全细胞、全生物体、或其任意部分(例如蛋白质片段(多肽)、全细胞的裂解物或微生物的提取物)。可用于本发明酵母-MUC1免疫治疗物中的抗原是肽、多肽、蛋白质域、蛋白质亚基、全长蛋白质、多聚体、融合蛋白和嵌合蛋白。另外，抗原可包含糖类，其可加载到本发明的酵母媒介物或组合物中。会领会在一些实施方案中(例如当抗原由酵母媒介物从重组核酸分子表达时)，抗原是蛋白质(包括片段、域、亚基和全长蛋白质)、融合蛋白、嵌合蛋白或其片段，而非完整的细胞或微生物。对于酵母中的表达，在一个实施方案中，如果抗原是要由酵母表达的完整蛋白质的话，那么抗原具有能在酵母中重组表达的最小大小(换言之，包含或组成为抗原的由酵母表达的蛋白质优选为长度至少25个氨基酸)，且通常长度为至少或超过25个氨基酸、或至少或超过26个氨基酸、至少或超过27个氨基酸、至少或超过28个氨基酸、至少或超过29个氨基酸、至少或超过30个氨基酸、至少或超过31个氨基酸、至少或超过32个氨基酸、至少或超过33个氨基酸、至少或超过34个氨基酸、至少或超过35个氨基酸、至少或超过36个氨基酸、至少或超过37个氨基酸、至少或超过38个氨基酸、至少或超过39个氨基酸、至少或超过40个氨基酸、至少或超过41个氨基酸、至少或超过42个氨基酸、至少或超过43个氨基酸、至少或超过44个氨基酸、至少或超过45个氨基酸、至少或超过46个氨基酸、至少或超过47个氨基酸、至少或超过48个氨基酸、至少或超过49个氨基酸、或长度为至少或超过50个氨基酸、或长度为至少25-50个氨基酸、长度为至少30-50个氨基酸、或长度为至少35-50个氨基酸、或长度为至少40-50个氨基酸、或至长度为少45-50个氨基酸，尽管可以表达更小的蛋白质，且可以表达大得多的蛋白质(例如长度为数百个氨基酸或甚至长度为几千个氨基酸)。在一个方面，可表达全长蛋白质或蛋白质的域，其在N和/或C末端缺少1至20个氨基酸。融合蛋白和嵌合蛋白也是可在本发明中表达的抗原。“靶抗原”是由本发明的免疫治疗组合物特异性靶向的抗原(即一种抗原，通常是天然抗原，期望引发针对其的免疫应答)。“癌抗原”是一种包含至少一种与癌症有关抗原(如肿瘤细胞表达的抗原)的抗原，从而靶向该抗原也就靶向了肿瘤细胞和/或癌症。癌抗原可包含来自一种或多种蛋白质(包括一种或多种肿瘤有关的蛋白质)的一个或多个抗原。“MUC1抗原”是从MUC1蛋白得到、设计或产生的抗原(包括MUC1-N、MUC1-C或MUC1-N和MUC1-C两者)。
[0070] 当述及免疫应答的刺激时，术语“免疫原”是术语“抗原”的子集，因此在一些情况中，可与术语“抗原”交换使用。如本文中使用的，免疫原描述引发体液和/或细胞介导的免疫应答的抗原(即为免疫原性)，从而使得对个体施用免疫原产生针对由个体免疫系统遇到的相同或类似抗原的抗原特异性免疫应答。在一个实施方案中，免疫原引发细胞介导+ +的免疫应答，包括CD4T细胞应答(例如TH1、TH2和/或TH17)和/或CD8T细胞应答(例如CTL应答)。
[0071] 给定抗原的“免疫原性域”或“免疫学域”可以是抗原的任何部分、片段或表位，其含有在对动物施用时可充当免疫原的至少一个表位(例如肽片段或亚基或抗体表位或其他构象性表位)。因此，免疫原性域大于单个氨基酸且其大小至少足以含有至少一个能充当免疫原的表位。例如，单一的蛋白质可含有多个不同的免疫原性域。免疫原性域在蛋白质内不需要是线性序列，如在体液免疫应答情况中的，其中涵盖构象域。
[0072] 表位在本文中定义为给定抗原内的单一免疫原性位点，在适宜的共刺激信号和/或免疫系统的活化细胞的背景中向免疫系统提供时，其足以引发免疫应答。换言之，表位是由免疫系统组分识别的抗原部分，其亦可称为抗原决定簇。本领域技术人员将认可T细胞表位在大小和组成中与B细胞或抗体表位不同，且经由I类MHC途径呈现的表位在大小和结构属性上与经由II类MHC途径呈现的表位不同。例如，由I类MHC分子呈现的T细胞表位通常长度为8至11个氨基酸，而由II类MHC分子呈现的表位在长度上不那么受限，且可以长达25个氨基酸或更长。另外，根据表位结合的特定MHC分子，T细胞表位具有预测的结构特征。表位可以是线性序列表位或构象性表位(保守的结合区域)。大多数抗体识别构象性表位。
[0073] MUC1(其亦可称为“粘蛋白-1”还有“DF3抗原”或“HMFG1”)是由大多数上皮分泌组织在基底水平表达，且由上皮细胞起源的恶性以高水平表达的一种较大的糖蛋白。MUC1最通常发现为多形性、具有较大胞外域(亦称为MUC1-N亚基)的I型跨膜蛋白质，其包含经由O-连接高度糖基化的可变数目串联重复(VNTR；通常为20至125个重复)。
MUC1蛋白编码为单一转录物，然后在翻译后加工成亚基，分别称为MUC1-N和MUC1-C、或α和β亚基，其然后通过两个亚基的非共价强相互作用形成异二聚体蛋白质。MUC1在“海胆精子蛋白质、肠激酶和集聚蛋白(agrin)”(SEA)域内切割成其N-和C-亚基，该域为一种高度保守的蛋白质域，其基于初始鉴定于精子蛋白质中、肠激酶中、和集聚蛋白中发现而命名，并且在通常束缚于膜的许多重度糖基化的粘蛋白样蛋白质中发现。MUC1蛋白在SEA域内的序列GSVVV(例如SEQ ID NO:11的位置1097-1101)中存在的甘氨酸和丝氨酸残基之间切割(Lillehoj等,2003,Biochem.Biophys.Res.Commun.307:743–749;Parry等 ,2001,Biochem.Biophys.Res.Commun.283:715–720;Wreschner 等 ,2002,Protein Sci.11:698–706)。
MUC1蛋白编码为单一转录物，然后在翻译后加工成亚基，分别称为MUC1-N和MUC1-C、或α和β亚基，其然后通过两个亚基的非共价强相互作用形成异二聚体蛋白质。MUC1在“海胆精子蛋白质、肠激酶和集聚蛋白(agrin)”(SEA)域内切割成其N-和C-亚基，该域为一种高度保守的蛋白质域，其基于初始鉴定于精子蛋白质中、肠激酶中、和集聚蛋白中发现而命名，并且在通常束缚于膜的许多重度糖基化的粘蛋白样蛋白质中发现。MUC1蛋白在SEA域内的序列GSVVV(例如SEQ ID NO:11的位置1097-1101)中存在的甘氨酸和丝氨酸残基之间切割(Lillehoj等,2003,Biochem.Biophys.Res.Commun.307:743–749;Parry等 ,2001,Biochem.Biophys.Res.Commun.283:715–720;Wreschner 等 ,2002,Protein Sci.11:698–706)。
[0074] 所述MUC1-C亚基包含胞外域(ED)，其为糖基化的且结合半乳凝素(galectin)-3配体，该配体相应地充当将MUC1与表皮生长因子受体(EGFR)和可能的其他受体酪氨酸激酶物理关联的桥。MUC1-C还包含跨膜(TM)域、和含有几个酪氨酸残基的细胞质域(CD)，所述酪氨酸残基在磷酸化时能充当具有SH2域的蛋白质的结合基序(对于MUC1蛋白以及已知和推定功能的详细论述，参见Kufe,2008,Cancer Biol.&Ther.7:81-84)。MUC1的备选的剪接变体(例如称为MUC1/Y和MUC1/X)是MUC1“短”型，其缺乏大部分MUC1-N(包括较大的VNTR区)，但包含ED、TM和CD区以及SEA域和N末端区信号序列区的部分。SEA域内的切割可能不发生在这些短型中。
[0075] 已报告了编码人MUC1的DNA和cDNA的分离和测序(参见例如Siddiqui等,1998,PNAS85:2320-2323;Abe和Kufe,1993,PNAS90:282-286;Hareuveni等,1990,Eur.J.Biochem.189(3)475-486;Gendler 等 ,1990,J.Biol.Chem.265(25)15286-15293;Lan等,1990,J.Biol.Chem265(25)15294-15299;Tsarfaty等,1990,Gene93(2)313-318;Lancaster,1990,Biochem.Biophys.Res.Commun.173(3)1019-1029)。含有MUC1-N和MUC1-C区的全长人MUC1前体蛋白质的一个例子记载于SwissProt登录号P15941.3(GI:296439295)，且此处由SEQ ID NO:11代表。可从编码SEQ ID NO:11的基因通过备选的转录本剪接创建出
10种不同的MUC1同等型。例如，称为MUC1/Y的同等型缺少SEQ ID NO:11的位置54-105。
各种其他同等型记载于该蛋白质的数据库说明中。
10种不同的MUC1同等型。例如，称为MUC1/Y的同等型缺少SEQ ID NO:11的位置54-105。
各种其他同等型记载于该蛋白质的数据库说明中。
[0076] 为了例示MUC1蛋白内的域的鉴定(其可容易地应用于任何人MUC1蛋白以及其他哺乳动物MUC1蛋白)，可在SEQ ID NO:11中容易地鉴定出以下域。MUC1信号序列，本文中亦称为前导序列，位于SEQ ID NO:11的大概位置1-23(MUC1信号序列在一些MUC1变体中鉴定为更长，且可能包含另外的氨基酸如位置1-32)。MUC1-N亚基或α亚基包含SEQ ID NO:11的大概位置24-1097，而MUC1-C亚基或β亚基包含SEQ ID NO:11的大概位置1098-1255。
[0077] 在MUC1-N亚基中，可发现VNTR(可变数目的串联重复)域，其包含在此特定蛋白内的多个重复，包括大概位置为126-965的区域，其含有序列PAPGSTAPPAHGVTSAPDTR(例如SEQ ID NO:11的位置126-145)的42个20氨基酸重复，该序列是通常识别的VNTR序列(亦见下文SEQ ID NO:12，其指明了该序列内的常见多态性)。由于这些是重复的序列，因此可以从一个VNTR中的20氨基酸中的任意一个开始计数，然后对该第一氨基酸的重复重新开始编号。更具体地，由于单个VNTR域是之前和/或之后为另一个相同、近乎相同或同源性的20氨基酸序列的大概20氨基酸的序列，其可能在大量这类重复序列之内，因此为了描述VNTR区内的单个VNTR，可将给定VNTR的“位置1”视为VNTR中20个氨基酸中的任一个，然后将对之前和之后的侧翼氨基酸依此编号，其中位置1上游(之前)的氨基酸为前一VNTR的最后一个氨基酸(位置20)或连接于该VNTR的序列(如果这类之前序列并不也是VNTR)的最后一个氨基酸，而位置1下游的一个氨基酸为该VNTR的位置2，接着是位置3，诸如此类，直至序列重复于下一个VNTR。
[0078] SEQ ID NO:11的位置61-1120包含上文论述的VNTR区，加上称为“重复区域”的另外区域。例如，位置81-100、位置101-120、位置121-140、位置141-160、位置161-180、位置181-200、位置201-220、位置221-240、位置241-260、位置261-180、位置281-300，诸如此类，以20个氨基酸的增量直至SEQ ID NO:11的位置1001-1120，代表了该蛋白质中的重复区域。
[0079] 在由SEQ ID NO:11代表的全长MUC1蛋白中(在切割成亚基之前)，SEA域跨越SEQ ID NO:11的位置1034-1152。在SEQ ID NO:11的氨基酸1097至1098对SEA域的切割产生MUC1-C域。在MUC1-C域内，胞外域(ED)见于SEQ ID NO:11的大概位置1098-1155；跨膜(TM)域见于SEQ ID NO:11的大概位置1156-1183；而细胞质域(CD，亦称为细胞质尾部)见于SEQ ID NO:11的大概位置1184-1255。
[0080] 给定MUC1-N亚基中的VNTR的数目是高度多态性的，且可以例如从20个变化到125个重复。串联重复的二十肽通常在三个位置(SEQ ID NO:12的位置9、18和19)的一个或多个中具有多态性：PAPGSTAP[P/A/Q/T]AHGVTSAP[DT/ES]R(SEQ ID NO:12，中括号区域指示常见的多态性)，其中在SEQ ID NO:12的位置18和19处的多态性以DT>ES的优先性存在，而其中在位置9处的单一替换以以下优先性存在：P>A、P>Q和P>T。最频繁的替换DT>ES在高达50%的重复中存在。
[0081] 已知MUC1的多种转录本变体，但可在变体中容易地鉴定出在上文例示性SEQ ID NO:11中描述的MUC1亚基、域或区，从而可基于给定的MUC1序列或来自另一MUC1蛋白的相应序列设计或产生可用于本发明的MUC1抗原。例如，编码人MUC1蛋白的一条核苷酸序列在本文中由SEQ ID NO:1代表，其对应于 登录号NM_002456.4(GI:65301116)。SEQ ID NO:1编码273个氨基酸的人MUC1蛋白(转录本变体1，亦称为MUC1/ZD)，其氨基酸序列此处代表为SEQ ID NO:2(亦见于 登录号NP_002447.4;GI:65301117)。
在SEQ ID NO:2内，存在以下域：信号序列(SEQ ID NO:2的位置1-27)；SEA域(SEQ ID NO:2的位置55-170)；ED(SEQ ID NO:2的位置116-173)；TM域(SEQ ID NO:2的位置174-201)；
和CD(SEQ ID NO:2的位置202-273)。SEA域内将ED域从SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位点在SEQ ID NO:2的位置115至116。该转录本变体不含如SEQ ID NO:11中显示的VNTR区。
在SEQ ID NO:2内，存在以下域：信号序列(SEQ ID NO:2的位置1-27)；SEA域(SEQ ID NO:2的位置55-170)；ED(SEQ ID NO:2的位置116-173)；TM域(SEQ ID NO:2的位置174-201)；
和CD(SEQ ID NO:2的位置202-273)。SEA域内将ED域从SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位点在SEQ ID NO:2的位置115至116。该转录本变体不含如SEQ ID NO:11中显示的VNTR区。
[0082] 编码另一种人MUC1蛋白的另一条核苷酸序列在本文中由SEQ ID NO:3代表，其对应于 登录号NM_001018016.1(GI:67189006)。SEQ ID NO:3编码264个氨基酸的人MUC1蛋白(转录本变体2，亦称为“MUC1/Y”)，其氨基酸序列此处代表为SEQ ID NO:4(亦见于 登录号NP_001018016.1;GI:67189007)。在SEQ ID NO:4内，
存在以下域：信号序列(SEQ ID NO:4的位置1-32)；SEA域(SEQ ID NO:4的位置45-161)；
ED(107-164of SEQ ID NO:4)；TM域(SEQ ID NO:4的位置165-192)；和CD(SEQ ID NO:4的位置193-264)。SEA域内将ED域从SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位点在SEQ ID NO:4的位置106至107。该转录本变体不含如SEQ ID NO:11中显示的VNTR区。
存在以下域：信号序列(SEQ ID NO:4的位置1-32)；SEA域(SEQ ID NO:4的位置45-161)；
ED(107-164of SEQ ID NO:4)；TM域(SEQ ID NO:4的位置165-192)；和CD(SEQ ID NO:4的位置193-264)。SEA域内将ED域从SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位点在SEQ ID NO:4的位置106至107。该转录本变体不含如SEQ ID NO:11中显示的VNTR区。
[0083] 编码另一种人MUC1蛋白的另一条核苷酸序列在本文中由SEQ ID NO:5代表，其对应于 登录号AY327587.1(GI:33150003)。SEQ ID NO:5编码264个氨基酸的人MUC1蛋白(转录本变体2，亦称为“MUC1/Y”)，其氨基酸序列此处代表为SEQ ID NO:6(亦见于 登录号AAP97018.1(GI:33150004))。在SEQ ID NO:6内，存在以下域：
信号序列(SEQ ID NO:6的位置1-32)；SEA域(SEQ ID NO:6的位置45-161)；ED(SEQ ID NO:6的位置107至164)；TM域(SEQ ID NO:6的位置165-192)；和CD(SEQ ID NO:6的位置193至264)。SEA域内将ED域从SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位点在SEQ ID NO:6的位置106至107。该转录本变体不含如SEQ ID NO:11中显示的VNTR区。SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:499%相同，例示了在来自不同来源的MUC1序列中高程度的同源性。
信号序列(SEQ ID NO:6的位置1-32)；SEA域(SEQ ID NO:6的位置45-161)；ED(SEQ ID NO:6的位置107至164)；TM域(SEQ ID NO:6的位置165-192)；和CD(SEQ ID NO:6的位置193至264)。SEA域内将ED域从SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位点在SEQ ID NO:6的位置106至107。该转录本变体不含如SEQ ID NO:11中显示的VNTR区。SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:499%相同，例示了在来自不同来源的MUC1序列中高程度的同源性。
[0084] 编码另一种人MUC1蛋白的另一条核苷酸序列在本文中由SEQ ID NO:7代表，其对应于 登录号NM_001018017(GI:324120954)。SEQ ID NO:7编码255个氨基酸的人MUC1蛋白(转录本变体3)，其氨基酸序列此处代表为SEQ ID NO:8(亦见于登录号NP_001018017.1；GI:67189069)。在SEQ ID NO:8内，存在以下域：
信号序列(SEQ ID NO:8的位置1-27)；SEA域(SEQ ID NO:8的位置36-152)；ED(SEQ ID NO:8的位置98-155)；TM域(SEQ ID NO:8的位置156-183)；和CD(SEQ ID NO:8的位置
184-255)。SEA域内将ED域从SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位点在SEQ ID NO:6的位置97至98。该转录本变体不含如SEQ ID NO:11中显示的VNTR区。
信号序列(SEQ ID NO:8的位置1-27)；SEA域(SEQ ID NO:8的位置36-152)；ED(SEQ ID NO:8的位置98-155)；TM域(SEQ ID NO:8的位置156-183)；和CD(SEQ ID NO:8的位置
184-255)。SEA域内将ED域从SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位点在SEQ ID NO:6的位置97至98。该转录本变体不含如SEQ ID NO:11中显示的VNTR区。
[0085] 人MUC1与来自其他动物物种的MUC1具有高度同源性，因此，可预期基于序列比较能够鉴定给定的MUC1蛋白内的域。另外，能在本发明的酵母-MUC1免疫治疗组合物的制备中利用来自其他动物物种特别是哺乳动物物种的MUC1的特定序列，尤其是在这些序列相同或实质性同源，且当这些序列引发针对靶抗原(例如肿瘤细胞表达的天然MUC1)的有效免疫应答的情况中。例如，鼠MUC1蛋白在本文中由SEQ ID NO:9的氨基酸序列代表。SEQ ID NO:9对应于 登录号NM_013605(GI:7305292)。SEQ ID NO:9编码631个氨基酸的鼠MUC1蛋白，其氨基酸序列此处代表为SEQ ID NO:10(亦见于 登
录号NP_038633；GI:7305293)。在SEQ ID NO:10内，存在以下域：信号序列(大概为SEQ ID NO:10的位置1-20)；VNTR(可在SEQ ID NO:10的位置21-425中鉴定)；SEA域(SEQ ID NO:10的位置426-528)；ED(SEQ ID NO:10的位置475-536)；TM域(SEQ ID NO:10的位置
531-559)；和CD(SEQ ID NO:10的位置560-631)。SEA域内将ED域从SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位点在SEQ ID NO:10的位置474至475。为了例示域内MUC1序列的保守水平，SEQ ID NO:10的鼠MUC1SEA域与SEQ ID NO:11的人MUC1SEA域62%相同且68%同源或阳性(如由BLAST定义)。SEQ ID NO:10的鼠MUC1ED与SEQ ID NO:11的人MUC1ED56%相同且73%同源。SEQ ID NO:10的鼠MUC1TM域与SEQ ID NO:11的人MUC1TM域89%相同且93%同源。SEQ ID NO:10的鼠MUC1CD与SEQ ID NO:11的人MUC1CD88%相同且88%同源。
+ +
录号NP_038633；GI:7305293)。在SEQ ID NO:10内，存在以下域：信号序列(大概为SEQ ID NO:10的位置1-20)；VNTR(可在SEQ ID NO:10的位置21-425中鉴定)；SEA域(SEQ ID NO:10的位置426-528)；ED(SEQ ID NO:10的位置475-536)；TM域(SEQ ID NO:10的位置
531-559)；和CD(SEQ ID NO:10的位置560-631)。SEA域内将ED域从SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位点在SEQ ID NO:10的位置474至475。为了例示域内MUC1序列的保守水平，SEQ ID NO:10的鼠MUC1SEA域与SEQ ID NO:11的人MUC1SEA域62%相同且68%同源或阳性(如由BLAST定义)。SEQ ID NO:10的鼠MUC1ED与SEQ ID NO:11的人MUC1ED56%相同且73%同源。SEQ ID NO:10的鼠MUC1TM域与SEQ ID NO:11的人MUC1TM域89%相同且93%同源。SEQ ID NO:10的鼠MUC1CD与SEQ ID NO:11的人MUC1CD88%相同且88%同源。
+ +
[0086] 人MUC1，包括本文中描述的人MUC1蛋白和MUC1抗原，含有各种CD4 和CD8T细胞表位。这类T细胞表位已记载于例如美国专利6,546,643；美国专利No.7,118,738；美国专利No.7,342,094；美国专利No.7,696,306；和美国专利申请公开文本No.2008/0063653。
[0087] 在本发明的一个实施方案中，MUC1抗原包含或组成为包含MUC1蛋白多个域的融合蛋白。在一个实施方案中，所述MUC1抗原从MUC1-C亚基的部分得到或设计。在一个实施方案中，所述MUC1抗原从MUC1-N亚基的部分得到或设计。在一个实施方案中，所述MUC1抗原从MUC1-C和MUC1-N亚基两者的部分得到或设计。
[0088] 在本发明的一个实施方案中，可用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物中的融合蛋白包含至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种以下MUC1抗原，其在融合蛋白内以任意次序排列，且其中任一种可在融合蛋白内重复两次或更多次(例如两个或更多个CD区段的组合)：(1)MUC1信号序列；(2)MUC1SEA域的至少一部分和/或MUC1胞外域(ED)的至少一部分或其免疫原性域，在一个方面，其可以包含大部分或完整的ED加上侧接来自SEA域的一个或多个侧翼氨基酸；(3)至少两个VNTR域；(4)至少一个MUC1跨膜域或其免疫原性域；和(5)至少一个MUC1细胞质域(CD)或其免疫原性域。这类融合蛋白不包含全长MUC1蛋白(即它不包含完整的MUC1-N亚基和完整的MUC1-C亚基)，且这类融合蛋白不包含全长MUC1-N亚基。在一个方面，这类融合蛋白不包含全长MUC1-C亚基。在一个方面，融合蛋白的区段(例如MUC1蛋白或域，包括免疫原性域)以不同于其会存在于天然或野生型MUC1蛋白中的区段排列次序进行排列。
[0089] 可用于上文或本文别处描述的融合蛋白中的MUC1信号序列(或前导序列)可以是来自任意MUC1蛋白的信号序列，且在一个方面，为来自人MUC1蛋白的。在本发明的一个方面，用于本发明融合蛋白的MUC1信号序列具有包含或组成为选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置1-27、SEQ ID NO:4的位置1-32、SEQ ID NO:6的位置1-32、SEQ ID NO:8的位置1-27、SEQ ID NO:11的位置1-23、SEQ ID NO:14的位置1-30、来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一条至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。在本发明的一个方面，MUC1信号序列置于可用于本发明的融合蛋白的N末端。在本发明的一个方面，替换(代替)代替MUC1信号序列而使用非MUC1序列，如下文描述的与本发明融合蛋白一起使用的任一种N末端合成肽和酵母衍生肽。
[0090] 可用于上文或本文别处描述的融合蛋白中的MUC1海胆精子蛋白、肠激酶和集聚蛋白(SEA)域可以是包含来自任一种MUC1蛋白的至少一个免疫原性域的SEA域或其部分，且在一个方面，为来自人MUC1蛋白的。在本发明的一个方面，可用于本发明融合蛋白的MUC1SEA域的一部分包含至少来自MUC1胞外域(ED)的氨基酸序列，但可排除ED域上游的序列。在本发明的一个方面，可用于本发明融合蛋白的MUC1SEA域具有包含或组成为选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置55-170或位置116-170或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:4的位置45-161或位置107-161或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:6的位置45-161或位置107-161或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:8的位置36-152或位置98-152或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:11的位置1034-1152或位置1098-1152或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:14的位置31-86或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:15的位置1-56或其至少一个免疫原性域，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0091] 可用于上文或本文别处描述的融合蛋白中的MUC1胞外域(ED)可以是包含来自任一种MUC1蛋白的至少一个免疫原性域的ED或其部分，且在一个方面，是来自人MUC1蛋白的。在本发明的一个方面，用于本发明融合蛋白的MUC1ED具有包含或组成为选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置116-173或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:4的位置107-164或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:6的位置107-164或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:8的位置98-155或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:11的位置1098-1155或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:14的位置32-89或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:15的位置2-59或其至少一个免疫原性域，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0092] 可用于上文或本文中别处描述的融合蛋白中的MUC1单个可变数目串联重复(VNTR)域可以是来自任何MUC1蛋白的VNTR域，且在一个方面，是来自人MUC1蛋白的。在本发明的一个方面，用于本发明融合蛋白的MUC1VNTR域具有包含或组成为选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:11的位置126-145，SEQ ID NO:11的位置61至1020之间的任何连续的20个氨基酸，或SEQ ID NO:11的位置126至965之间的任何连续的20个氨基酸；SEQ ID NO:12(包括如上文描述的SEQ ID NO:12内的任一种多态性)，SEQ ID NO:14的位置90至130之间的任何连续的20个氨基酸，SEQ ID NO:15的位置60至100之间的任何连续的20个氨基酸，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应VNTR序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0093] 可用于上文或本文中别处描述的融合蛋白中的MUC1跨膜(TM)域可以是包含来自任何MUC1蛋白的至少一个免疫原性域的TM域或其部分，且在一个方面，是来自人MUC1蛋白的。在本发明的一个方面，用于本发明融合蛋白的MUC1TM域具有包含或组成为选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置174-201或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:4的位置165-192或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:6的位置165-192或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:8的位置156-183或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:11的位置1156-1183或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:14的位置131-158或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:15的位置101-128或其至少一个免疫原性域，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0094] 可用于上文或本文中别处描述的融合蛋白中的MUC1细胞质域(CD)可以是包含来自任何MUC1蛋白的至少一个免疫原性域的CD或其部分，且在一个方面，是来自人MUC1蛋白的。在本发明的一个方面，用于本发明融合蛋白的MUC1CD具有包含或组成为选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置202-273或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:4的位置193-264或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:6的位置193-264或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:8的位置184-255或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:11的位置1184-1255或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:14的位置159-230或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:15的位置129-200或其至少一个免疫原性域，SEQ ID NO:17的位置7-78或位置79-150或位置151-222或其至少一个免疫原性域；SEQ ID NO:18的位置1-72或位置73-144或位置145-216或其免疫原性域，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0095] 在本发明的一个实施方案中，可用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物的融合蛋白包含以下MUC1抗原，其从N至C末端次序为：(1)MUC1SEA域和MUC1胞外域(ED)的一部分，其包含大部分或所有的MUC1ED；(2)至少两个VNTR域；(3)MUC1跨膜域；和(4)MUC1细胞质域(CD)。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含以下MUC1抗原，其从N至C末端次序为：(1)MUC1信号序列；(2)MUC1SEA域和MUC1胞外域(ED)的一部分，其包含大部分或所有的MUC1ED；(3)至少两个VNTR域；(4)MUC1跨膜域；和(5)MUC1细胞质域(CD)。要纳入本发明融合蛋白中的另外或备选的元件可包括改进或协助融合蛋白的表达或稳定性，和/或允许融合蛋白的鉴定和/或纯化的N末端和/或C末端肽，和/或融合蛋白区段之间的短介入接头序列(例如1、2、3、4、或5个氨基酸的肽)，其可用于引入限制酶位点以协助克隆，作为宿主吞噬体蛋白酶的切割位点，加速蛋白质或抗原加工，及用于构建体的后来操作。这类元件在下文详细描述。
[0096] 可用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物的这类融合蛋白的一个例子包含或包括以下MUC1抗原，其从N至C末端的次序为：
[0097] (1)MUC1胞外域(ED)，其在N末端可由1、2、3、4、5或更多个侧翼氨基酸附接，所述氨基酸来自位于野生型蛋白质中ED上游的SEA域的非ED部分，其中所述ED区段包含或组成为选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置116-173；或SEQ ID NO:4的位置107-164；SEQ ID NO:6的位置107-164；SEQ ID NO:8的位置98-155；SEQ ID NO:11的位置
1098-1155；SEQ ID NO:14的位置32-89；SEQ ID NO:15的位置2-59；来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列；或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；
1098-1155；SEQ ID NO:14的位置32-89；SEQ ID NO:15的位置2-59；来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列；或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；
[0098] (2)至少两个VNTR域，其中每个VNTR域包含或组成为选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:11的位置126-145，SEQ ID NO:11的位置61至1020之间的任何连续的20个氨基酸，或SEQ ID NO:11的位置126至965之间的任何连续的20个氨基酸；SEQ ID NO:12(包括如上文描述的SEQ ID NO:12内的任一种多态性)，SEQ ID NO:14的位置90至130之间的任何连续的20个氨基酸，SEQ ID NO:15的位置60至100之间的任何连续的20个氨基酸，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应VNTR序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；
[0099] (3)MUC1跨膜(TM)域，其中所述TM域包含或组成为选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置174-201，SEQ ID NO:4的位置165-192，SEQ ID NO:6的位置165-192，SEQ ID NO:8的位置156-183，SEQ ID NO:11的位置1156-1183，SEQ ID NO:14的位置131-158，SEQ ID NO:15的位置101-128，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；和
[0100] (4)MUC1细胞质域(CD)，其中所述CD包含或组成为选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置202-273，SEQ ID NO:4的位置193-264，SEQ ID NO:6的位置193-264，SEQ ID NO:8的位置184-255，SEQ ID NO:11的位置1184-1255，SEQ ID NO:14的位置159-230，SEQ ID NO:15的位置129-200，SEQ ID NO:17的位置7-78或位置79-150或位置151-222；SEQ ID NO:18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少
97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0101] 在该实施方案的一个方面，可用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物中的融合蛋白包含或组成为SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。SEQ ID NO:14包含以下MUC1抗原，其从N至C末端的次序为：(1)MUC1信号序列(SEQ ID NO:14的位置1-30)；(2)MUC1SEA/ED区段(SEQ ID NO:14的位置31-89)；(3)包含两个VNTR域的VNTR区段(SEQ ID NO:14的位置90-130)；(4)MUC1TM域(SEQ ID NO:14的位置131-158)；(5)MUC1CD(SEQ ID NO:14的位置159-230)；和(6)6肽组氨酸标签(SEQ ID NO:14的位置231-236)。SEQ ID NO:14由SEQ ID NO:13代表的核苷酸序列编码。SEQ ID NO:15包含以下MUC1抗原，其从N至C末端的次序为：(1)MUC1SEA/ED区段(SEQ ID NO:15的位置1-59)；(2)包含两个VNTR域的VNTR区段(SEQ ID NO:15的位置60-100)；(3)MUC1TM域(SEQ ID NO:15的位置101-128)；和(4)MUC1CD(SEQ ID NO:15的位置129-200)。任选地，SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的融合蛋白包含N末端肽，其为设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性并稳定表达的合成的N末端肽，代表性的为SEQ ID NO:21，或来自酵母alpha前导序列的N末端肽如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20，或适于与本文所述基于酵母的免疫治疗物一起使用的另一种N末端肽。还是任选地，具有1、2、3个或更多个氨基酸的一种或多种接头肽，如Thr-Ser的两个氨基酸的接头，可插入融合蛋白的区段之间。在融合蛋白C末端的6组氨酸标签也是任选的。
[0102] 在本发明的一个实施方案中，可用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物的融合蛋白包含以下MUC1抗原，其从N至C末端的次序为：(1)至少两个VNTR域；和(2)MUC1SEA域和MUC1胞外域(ED)的一部分，其包含大部分或所有的MUC1ED。这类融合蛋白可包含VNTR域侧翼的MUC1-N区的另外部分。这类融合蛋白不包含完整的MUC1-N亚基。
[0103] 在本发明的另一个实施方案中，可用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物的融合蛋白包含以下MUC1抗原，其从N至C末端的次序为：(1)第一MUC1细胞质域(CD)；(2)第二MUC1细胞质域(CD)；和(3)第三MUC1细胞质域(CD)。在一个实施方案中，可将另外的MUC1细胞质域纳入这类融合蛋白。在一个实施方案中，至少一个MUC1CD来自与其他MUC1CD不同的来源(例如一个MUC1CD来自第一人MUC1蛋白，而一个MUC1CD来自第二MUC1蛋白，其中在第一和第二MUC1CD之间可以有序列差异)。在一个实施方案中，该融合蛋白在N末端附接有MUC1信号序列。在另一个实施方案中，该融合蛋白可包含改进或协助融合蛋白的表达或稳定性，和/或允许融合蛋白的鉴定和/或纯化的N末端和/或C末端肽，和/或融合蛋白区段之间的短介入接头序列(例如具有1、2、3、4、或5个氨基酸的肽)，其可用于引入限制酶位点以协助克隆，作为宿主吞噬体蛋白酶的切割位点，加速蛋白质或抗原加工，及用于构建体的后来操作。
[0104] 可用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物中的这类融合蛋白的一个例子包含或包括以下MUC1抗原，其从N至C末端的次序为：
[0105] (1)第一MUC1细胞质域(CD)，其中所述CD包含或组成为选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置202-273，SEQ ID NO:4的位置193-264，SEQ ID NO:6的位置193-264，SEQ ID NO:8的位置184-255，SEQ ID NO:11的位置1184-1255，SEQ ID NO:14的位置
159-230，SEQ ID NO:15的位置129-200，SEQ ID NO:17的位置7-78或位置79-150或位置
151-222；SEQ ID NO:18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；
159-230，SEQ ID NO:15的位置129-200，SEQ ID NO:17的位置7-78或位置79-150或位置
151-222；SEQ ID NO:18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；
[0106] (2)第二MUC1细胞质域(CD)，其中所述CD包含或组成为选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置202-273，SEQ ID NO:4的位置193-264，SEQ ID NO:6的位置193-264，SEQ ID NO:8的位置184-255，SEQ ID NO:11的位置1184-1255，SEQ ID NO:14的位置
159-230，SEQ ID NO:15的位置129-200，SEQ ID NO:17的位置7-78或位置79-150或位置
151-222；SEQ ID NO:18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；
159-230，SEQ ID NO:15的位置129-200，SEQ ID NO:17的位置7-78或位置79-150或位置
151-222；SEQ ID NO:18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；
[0107] (3)第三MUC1细胞质域(CD)，其中所述CD包含或组成为选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2的位置202-273，SEQ ID NO:4的位置193-264，SEQ ID NO:6的位置193-264，SEQ ID NO:8的位置184-255，SEQ ID NO:11的位置1184-1255，SEQ ID NO:14的位置
159-230，SEQ ID NO:15的位置129-200，SEQ ID NO:17的位置7-78或位置79-150或位置
151-222；SEQ ID NO:18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
159-230，SEQ ID NO:15的位置129-200，SEQ ID NO:17的位置7-78或位置79-150或位置
151-222；SEQ ID NO:18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，来自不同MUC1蛋白如另一种人MUC1蛋白的相应序列，或与这些氨基酸序列中任一种至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0108] 在该实施方案的一个方面，可用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物中的融合蛋白包含或组成为SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列。SEQ ID NO:17包含以下MUC1抗原，其从N至C末端的次序为：(1)由SEQ ID NO:21代表的合成肽(SEQ ID NO:17的位置1-6)；(2)第一MUC1CD(SEQ ID NO:17的位置7-78)；(3)第二MUC1CD(SEQ ID NO:17的位置79-150)；(4)第三MUC1CD(SEQ ID NO:17的位置151-222)；和(5)6组氨酸标签(SEQ ID NO:17的位置223-228)。SEQ ID NO:17由SEQ ID NO:16代表的核苷酸序列编码。SEQ ID NO:18包含以下MUC1抗原，其从N至C末端的次序为：(1)第一MUC1CD(SEQ ID NO:18的位置1-72)；(2)第二MUC1CD(SEQ ID NO:18的位置73-144)；(3)第三MUC1CD(SEQ ID NO:18的位置145-216)。任选地，SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的融合蛋白包含N末端肽，其为设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性并稳定表达的合成的N末端肽，代表性的为SEQ ID NO:21，或为来自酵母alpha前导序列的N末端肽如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20，或适于与本文所述基于酵母的免疫治疗物一起使用的另一种N末端肽。还是任选地，具有1至3个或更多个氨基酸的一种或多种接头肽，具有1、2、3或更多个氨基酸的接头序列，如Thr-Ser的两个氨基酸的接头，可插入融合蛋白的区段之间。在融合蛋白C末端的6组氨酸标签也是任选的。
[0109] 可用于本发明的MUC1抗原还包括具有与本文中描述的任一种MUC1蛋白、域、融合蛋白或抗原的氨基酸序列在蛋白质的全长上，或对于形成蛋白质部分的其限定的片段或域(例如免疫学域或功能域(具有至少一种生物学活性的域))至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%相同的氨基酸序列的蛋白质。例如，本文中描述的MUC1蛋白的域包含信号序列、VNTR域、SEA域、胞外域(ED)、TM域和/或细胞质域(CD)。上文已详细描述了免疫学域。本文中描述的MUC1融合蛋白包括那些由SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18代表的。因此，可用于本发明的基于酵母的免疫治疗物的MUC1抗原包含或组成为以下任一种的MUC1抗原：SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的任一种至少约95%，96%，97%，98%或99%相同的氨基酸序列，和/或来自不同MUC1蛋白的相应序列(例如一种融合蛋白，其中一个或多个融合区段来自不同MUC1蛋白或MUC1蛋白激动剂序列的相应序列，从而相比于此处呈现的序列可能存在微小序列差异)。
[0110] 使用从本文中例示的那些之外的序列(且特别是来自相同动物物种的序列或来源的)衍生或获得的任一种MUC1蛋白或域的相应部分来创建与本文中所述融合蛋白具有相似或相同的总体结构的融合蛋白是简单的。举例而言，能容易地在来自任何来源的给定人MUC1蛋白中鉴定出对应于SEQ ID NO:11的位置1034-1152的相应序列，其使用简单的序列比对工具或过程。因此，与本文中例示的序列具有微小和/或保守差异的序列明确涵盖在本发明中。
[0111] 在本发明的一些方面，可对野生型或参照MUC1蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个或更多个氨基酸进行氨基酸插入、缺失和/或取代，只要所得MUC1蛋白在用作本发明酵母-MUC1免疫治疗组合物中的抗原时，引发针对天然MUC1蛋白如野生型或参照MUC1蛋白的免疫应答，其可包括增强的免疫应答、减少的免疫应答、或实质性相似的免疫应答。例如，本发明包括使用MUC1激动剂抗原，其可包含一种或多种已经突变以增强针对MUC1激动剂的T细胞应答的T细胞表位，如通过改进表位对MHC分子或对在MHC呈现背景中识别该表位的T细胞受体的亲合力或亲和力。因此，MUC1激动剂可改进针对由肿瘤细胞表达的天然MUC1的T细胞应答的效力或效率。多种MUC1T细胞表位，包括记载于以下的激动剂表位：美国专利6,546,643；美国专利No.7,118,738；美国专利No.7,342,094；美国专利No.7,696,306；和美国专利申请公开文本No.2008/0063653，且这些表位中的任一种或多种可用于本发明的MUC1抗原，包括通过在本文描述的序列内添加、缺失或取代一个或多个氨基酸以使该序列符合在该位置处公开的表位序列。
[0112] 本文中提供了MUC1激动剂抗原的例子(见实施例3和4)。在一个实施方案中，适合用于本发明的MUC1激动剂抗原包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或所有11个以下取代，其中相对于由登录号NP_001191214代表的野生型MUC1提供取代的位置(尽管可在任何其他野生型MUC1序列中容易地鉴定出相同或等同的位置)：T93，A161，P162，G169，S170，T171，A392，C406，T444，D445、或S460。在一个实施方案中，可用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物的MUC1激动剂抗原包含或组成为SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的氨基酸序列。SEQ ID NO:23包含以下MUC1抗原，其从N至C末端的次序为：(1)MUC1信号序列(SEQ ID NO:23的位置1-30)；(2)MUC1SEA/ED区段(SEQ ID NO:23的位置31-89)；(3)包含两个VNTR域的VNTR区段(SEQID NO:23的位置90-130)；(4)MUC1TM域(SEQ ID NO:23的位置131-158)；(5)MUC1CD(SEQ ID NO:23的位置159-230)；(6)MUC1激动剂表位(SEQ ID NO:23的位置231-246)和(7)6组氨酸标签(SEQ ID NO:23的位置247-252)。SEQ ID NO:23由SEQ ID NO:22代表的核苷酸序列编码(针对酵母表达优化过密码子)。MUC1信号序列(SEQ ID NO:23的位置1-30)可用设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性和/或稳定表达的不同N末端序列(如SEQ ID NO:21代表的肽)，或来自酵母alpha前导序列的N末端肽如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20取代。6组氨酸C末端标签是任选的，且其促进蛋白质的鉴定和/或纯化。相比于SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15中的MUC1抗原，SEQ ID NO:23含有以下氨基酸取代以创建多种激动剂表位(参照SEQ ID NO:23给出取代位置，并进一步参照由登录号NP_001191214代表的野生型MUC1中的取代位置)：A96Y(野生型MUC1中的位置161)，P97L(野生型MUC1中的位置162)，G104V(野生型MUC1中的位置169)，S105Y(野生型MUC1中的位置170)，T106L(野生型MUC1中的位置171)，A147Y(野生型MUC1中的位置392)，C161V(野生型MUC1中的位置406)，T199L(野生型MUC1中的位置444)，D200F(野生型MUC1中的位置445)，S215Y(野生型MUC1中的位置460)和T239L(野生型MUC1中的位置93)。
[0113] SEQ ID NO:25包含以下MUC1抗原，其从N至C末端的次序为：(1)本文中别处由SEQ ID NO:19公开的alpha因子前导序列(SEQ ID NO:25的位置1-89)；(2)Thr-Ser的接头序列(SEQ ID NO:25的位置90-91)；(3)对应于野生型蛋白质，只不过引入11个激动剂表位的全长MUC1激动剂蛋白(SEQ ID NO:25的位置92-566)和(7)6肽组氨酸标签(SEQ ID NO:25的位置567-572)。SEQ ID NO:25由SEQ ID NO:24代表的核苷酸序列编码(针对酵母表达优化过密码子)。Alpha前导序列(SEQ ID NO:25的位置1-89)可用设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性和/或稳定表达的不同N末端序列(如由SEQ ID NO:21代表的肽)，或来自不同酵母alpha前导序列的N末端肽如SEQ ID NO:20，或MUC1信号序列取代。6组氨酸C末端标签是任选的，且其促进蛋白质的鉴定和/或纯化。相比于用作模板的野生型MUC1蛋白，GI-6106中的序列含有以下氨基酸取代以创建多种激动剂表位(参照SEQ ID NO:25给出取代位置，并进一步参照由登录号NP_001191214代表的野生型MUC1中的取代位置)：T184L(野生型MUC1中的位置93)，A232Y(野生型MUC1中的位置161)，P233L(野生型MUC1中的位置162)，G240V(野生型MUC1中的位置169)，S241Y(野生型MUC1中的位置
170)，T242L(野生型MUC1中的位置171)，A483Y(野生型MUC1中的位置392)，C497V(野生型MUC1中的位置406)，T535L(野生型MUC1中的位置444)，D536F(野生型MUC1中的位置
445)和S551Y(野生型MUC1中的位置460)。
170)，T242L(野生型MUC1中的位置171)，A483Y(野生型MUC1中的位置392)，C497V(野生型MUC1中的位置406)，T535L(野生型MUC1中的位置444)，D536F(野生型MUC1中的位置
445)和S551Y(野生型MUC1中的位置460)。
[0114] 因此，可用于本发明的基于酵母的免疫治疗物的MUC1激动剂抗原包括包含或组成为SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的MUC1抗原，或在这些更大融合蛋白中的MUC1特异性序列，或与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25的任一种至少约95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列，或在这些更大融合蛋白中的MUC1特异性序列，和/或来自不同MUC1蛋白的相应序列(例如一种融合蛋白，其中一个或多个融合区段来自不同MUC1蛋白的相应序列，从而相比于此处呈现的序列可能存在微小序列差异)。
[0115] 如上文论述的，N-末端表达序列和C-末端标签，如那些上文对于SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:25的融合蛋白所描述的，是任选的，但可选自本文中别处描述的几种不同的序列以改进或协助表达、稳定性和/或允许鉴定和/或纯化蛋白质。还有，适用于酵母的许多不同的启动子是本领域中已知的。此外，出于多种原因，包括引入限制酶位点以促进克隆、作为宿主吞噬体蛋白酶的切割位点、加速蛋白质或抗原加工、及构建体的后来操作，可将短介入接头序列(例如具有1、2、3、4、或5个氨基酸的肽)引入包含MUC1抗原的融合蛋白部分之间。
[0116] 任选地，使用特别可用于改进或稳定酵母中异源抗原表达的抗原构建体来产生包括融合蛋白在内的蛋白质，其被用作本发明酵母-MUC1免疫治疗组合物的组分。在一个实施方案中，期望的抗原性蛋白质或肽在其氨基末端端融合至：(a)一种特定的合成肽，其稳定酵母媒介物中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后修饰(这类肽详细记载于，例如美国专利公开文本No.2004-0156858A1，2004年8月12日公开，通过提述完整并入本文)；(b)至少一部分的内源性酵母蛋白质，其中任一种融合伴侣均提供蛋白质在酵母中表达的改进的稳定性和/或防止酵母细胞对蛋白质的翻译后修饰(这类蛋白质亦详细记载于，例如美国专利公开文本No.2004-0156858A1，见上)；和/或(c)至少一部分的酵母蛋白质，其导致融合蛋白在酵母表面上表达(例如在本文中更详细描述的Aga蛋白质)。另外，本发明任选地包括使用融合至编码抗原的构建体C末端的肽，具体地用于蛋白质的选择和鉴定。这类肽包括但不限于，任何合成或天然的肽，如肽标签(例如6X His或6肽)或任何其他短表位标签。附接于依照本发明的抗原的C末端的肽可在添加或不添加上述N末端肽的情况下使用，反之亦然。
[0117] 在一个实施方案中，可用于要在酵母中表达的融合蛋白中的合成肽连接至抗原的N末端，该肽包括至少2个与该抗原异源的氨基酸位置，其中所述肽稳定酵母媒介物中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后修饰。所述合成肽和抗原的N末端部分一起形成具有以下要求的融合蛋白：(1)融合蛋白位置1的氨基酸残基是甲硫氨酸(即合成肽中的第一氨基酸是甲硫氨酸)；(2)融合蛋白位置2的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸(即合成肽中的第二氨基酸不是甘氨酸或脯氨酸)；(3)融合蛋白位置2-6处的氨基酸位置中没有一处是甲硫氨酸(即位置2-6处的氨基酸，不管是合成肽还是蛋白质的部分(如果合成肽短于6个氨基酸)，均不包含甲硫氨酸)；和(4)融合蛋白位置2-6处的氨基酸中没有一个是赖氨酸或精氨酸(即位置2-6处的氨基酸，不管是合成肽还是蛋白质的部分(如果合成肽短于5个氨基酸)，均不包含赖氨酸或精氨酸)。合成肽可以短至2个氨基酸，但在一个方面，是2-6个氨基酸(包括3、4、5个氨基酸)，并且可以长于6个氨基酸，以全整数而言，长达约200个氨基酸、300个氨基酸、400个氨基酸、500个氨基酸或更长。
[0118] 在一个实施方案中，融合蛋白包含M-X2-X3-X4-X5-X6的氨基酸序列，其中M是甲硫氨酸；其中X2是除甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X3是除甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X4是除甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X5是除甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；且其中X6是除甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸。在一个实施方案中，X6残基是脯氨酸。增强抗原在酵母细胞中表达的稳定性和/或防止该蛋白在酵母中的翻译后修饰的一种例示性的合成序列包括序列M-A-D-E-A-P(本文中由SEQ ID NO:21代表)。除了表达产物的增强的稳定性以外，该融合伴侣似乎不会不利地影响针对构建体中免疫抗原的免疫应答。另外，合成的融合肽可设计为提供可由选择剂如抗体识别的表位。
[0119] 在一个实施方案中，MUC1抗原在N末端连接至酵母蛋白质，如alpha因子前原序列(亦称为alpha因子信号前导序列)，其氨基酸序列在本文中由SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20例示。酵母alpha因子前原序列的其他序列是本领域中已知的且涵盖用于本发明中。
[0120] 在本发明的一个方面，操作酵母媒介物从而通过表达的蛋白质产物的投递或易位部分或全部地在酵母媒介物的表面上(胞外表达)表达或提供抗原。一种实现本发明这一方面的方法是使用间隔臂来将一种或多种蛋白质定位到酵母媒介物的表面上。例如，可使用间隔臂来创建抗原或其他感兴趣的蛋白质与将该抗原或其他感兴趣的蛋白质靶向到酵母细胞壁的蛋白质的融合蛋白。例如，可用于靶向其他蛋白质的一种这类蛋白质是使得抗原或其他蛋白质能靶向到酵母细胞壁从而将抗原或其他蛋白质位于酵母表面上的酵母蛋白质(例如细胞壁蛋白2(cwp2)、Aga2、Pir4或Flo1蛋白质)。可将酵母蛋白质以外的蛋白质用于间隔臂；然而，对于任何间隔臂蛋白质，最期望具有针对靶抗原而非间隔臂蛋白质的免疫原性应答。如此，如果将其他蛋白质用于间隔臂，那么使用的间隔臂蛋白质不应生成对间隔臂蛋白质本身的较大免疫应答而覆盖对靶抗原的免疫应答。本领域技术人员应以相对于对靶抗原的免疫应答较小的对间隔臂蛋白质的免疫应答为目标。间隔臂可构建为具有切割位点(例如蛋白酶切割位点)，其允许容易地按期望从酵母移去抗原或进行加工掉。可使用任何已知的测定免疫应答的幅度的方法(例如抗体产生、溶胞作用测定等)，而且这是本领域技术人员容易已知的。
[0121] 另一种用于定位靶抗原或要暴露于酵母表面的其他蛋白质的方法是使用信号序列如糖基磷脂酰肌醇(GPI)来将靶物锚定至酵母细胞壁。或者，定位可通过附加将抗原或其他感兴趣的蛋白质靶向到分泌途径中(经由到内质网(ER)中的易位)的信号序列，从而使抗原结合与细胞壁结合的蛋白质(例如cwp)来实现。
[0122] 在一个方面，所述间隔臂蛋白质是酵母蛋白质。酵母蛋白质可由约2至约800个氨基酸的酵母蛋白质组成。在一个实施方案中，所述酵母蛋白质为约10至约700个氨基酸。在另一个实施方案中，所述酵母蛋白质为约40至600个氨基酸。本发明的其他实施方案包括至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少350个氨基酸、至少400个氨基酸、至少450个氨基酸、至少500个氨基酸、至少550个氨基酸、至少600个氨基酸、或至少650个氨基酸的酵母蛋白质。在一个实施方案中，所述酵母蛋白质长为至少450个氨基酸。优化抗原表面表达(若期望的话)的另一个考虑是应将抗原和间隔臂组合表位为单体还是二聚体还是三聚体，或者甚至更多的相连单元。单体、二聚体、三聚体等的使用允许抗原的适宜间隔或折叠，从而抗原的一些部分(如果不是所有)以使其更具免疫原性的方式展现在酵母媒介物的表面上。
[0123] 酵母蛋白质的使用可稳定融合蛋白在酵母媒介物中的表达，预防所表达的融合蛋白的翻译后修饰，和/或将融合蛋白靶向到酵母中的特定区室中(例如要表达在酵母细胞表面上)。对于投递到酵母分泌途径中，使用的例示性酵母蛋白质包括但不限于：Aga(包括但不限于Agal和/或Aga2)；SUC2(酵母转化酶)；alpha因子信号前导序列；CPY；Cwp2p(因其定位和保留在细胞壁中)；BUD基因(因在子细胞形成的初始阶段期间位于酵母细胞芽处)；Flo1p；Pir2p；和Pir4p。
[0124] 可使用将蛋白质靶向、保留和/或稳定化到酵母媒介物其他部分(例如在胞质溶胶或线粒体或内质网或细胞核中)的其他序列。可用于上文任一个实施方案的合适的酵母蛋白质的例子包括但不限于，TK、AF、SEC7；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PCK1、磷酸甘油激酶PGK和丙糖磷酸异构酶TPI基因产物(针对其在葡萄糖和胞质溶胶定位中的可抑制的表达)；热激蛋白SSA1、SSA3、SSA4、SSC1，其表达受到诱导且其蛋白质在细胞暴露于热处理时更热稳定；线粒体蛋白质CYC1(针对到线粒体中的输入)；ACT1。
[0125] 本发明涵盖产生酵母媒介物以及表达酵母媒介物、将其与抗原和/或其他感兴趣的蛋白质和/或药剂组合和/或关联以产生基于酵母的免疫治疗组合物的方法。
[0126] 依照本发明，术语“酵母媒介物-抗原复合物”或“酵母-抗原复合物”一般用于描述酵母媒介物与抗原的任何关联，且与“基于酵母的免疫治疗组合物”在这类组合物用于引发如上文所述的免疫应答时可交换使用。这类关联包括由酵母(重组酵母)表达所述抗原、将抗原引入酵母、将抗原物理附接至酵母、及将酵母和抗原混合在一起，如在缓冲液或其他溶液或配制剂中。这些复合物的类型在下文详细描述。
[0127] 在一个实施方案中，将用于制备酵母媒介物的酵母细胞用编码某蛋白质(例如抗原)的异源核酸分子转染，从而使得该蛋白质由酵母细胞表达。这类酵母在本文中亦称为重组酵母或重组酵母媒介物。然后，可将酵母细胞与药学可接受的赋形剂一起配制并直接对患者施用、存储用于后面施用、或作为完整细胞加载到树突细胞中。还可以杀死酵母细胞，或可以将其衍生化如通过形成酵母原生质球、细胞质、空胞或亚细胞颗粒，其中任一种可继之以存储、施用、或将衍生物加载到树突细胞中。还可将酵母原生质球直接用重组核酸分子转染(例如原生质球从整个酵母产生，然后转染)以产生表达该抗原的重组原生质球。可将重组表达抗原的酵母细胞或酵母原生质球用于产生包含酵母细胞质、酵母空胞、或酵母膜颗粒或酵母细胞壁颗粒、或其级分的酵母媒介物。
[0128] 一般地，所述酵母媒介物和抗原和/或其他药剂可通过本文中描述的任何技术联合起来。在一个方面，将所述酵母媒介物用抗原和/或药剂胞内加载。在另一个方面，抗原和/或药剂共价或非共价附接于酵母媒介物。在又一个方面，所述酵母媒介物和抗原和/或药剂通过混合联合。在另一个方面，且在一个实施方案中，所述抗原和/或药剂由酵母媒介物或由衍生酵母媒介物的酵母细胞或酵母原生质球重组表达。
[0129] 要由本发明的酵母媒介物产生的许多抗原和/或其他蛋白质是任意数目的可由酵母媒介物合理产生的抗原和/或其他蛋白质，且范围通常从至少1种至至少约6种或更多种，包括从约2种至约6种抗原和/或其他蛋白质。
[0130] 抗原或其他蛋白质在本发明的酵母媒介物中的表达使用本领域技术人员已知的技术来实现。简言之，将编码至少一种期望的抗原或其他蛋白质的核酸分子以使得该核酸分子可操作地连接至转录调控序列的方式插入到表达载体中，从而在转化到宿主酵母细胞中时能够引起该核酸分子的组成性或受调节的表达。编码一种或多种抗原和/或其他蛋白质的核酸分子可以在一种或多种表达载体上可操作地连接至一种或多种表达调控序列。特别重要的表达调控序列是那些调控转录启动的，如启动子和上游激活序列。任何合适的酵母启动子均可用于本发明且多种这类启动子是本领域技术人员已知的。用于在酿酒酵母中表达的启动子包括但不限于，编码以下酵母蛋白质的基因的启动子：醇脱氢酶I(ADH1)或II(ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙糖磷酸异构酶(TPI)、翻译延伸因子EF-1alpha(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH；对于丙糖磷酸脱氢酶亦称为TDH3)、半乳糖激酶(GAL1)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GAL7)、UDP-半乳糖差向异构酶(GAL10)、细胞色素c1(CYC1)、Sec7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PHO5)，包括杂合启动子如ADH2/GAPDH和CYC1/GAL10启动子，且包括ADH2/GAPDH启动子，当细胞中的葡萄糖浓度较低时(例如约0.1至约0.2个百分数)其被诱导，以及CUP1启动子和TEF2启动子。类似地，许多上游激活序列(UAS)，亦称为增强子，是已知的。针对在酿酒酵母中表达的上游激活序列包括但不限于，编码以下蛋白质的基因的UAS：PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7和GAL10，以及由GAL4基因产物激活的其他UAS，其中在一个方面使用ADH2UAS。由于ADH2UAS由ADR1基因产物激活，因此当异源基因可操作地连接至ADH2UAS时，优选可以过表达ADR1基因。针对在酿酒酵母中表达的转录终止序列包括α-因子、GAPDH和CYC1基因的转录终止序列。
[0132] 将核酸分子转染到依照本发明的酵母细胞中可通过其中核酸分子可导入细胞中的任意方法实现，所述方法包括但不限于，扩散、活性运输、浴式超声处理、电穿孔、微注射、脂转染、吸附、和原生质体融合。使用本领域技术人员已知的技术，经转染的核酸分子可整合到酵母染色体中或维持在染色体外载体上。携带这类核酸分子的酵母媒介物的例子在本文中详细公开。如上文论述的，还可通过用期望的核酸分子转染完整的酵母微生物或酵母原生质球，其中产生抗原，然后进一步使用本领域技术人员已知的技术操作微生物或原生质球以重组产生酵母细胞质、酵母空胞和酵母膜颗粒或细胞壁制备物，来产生含有期望的抗原或其他蛋白质的细胞质、空胞和亚细胞酵母膜提取物或其级分。
[0133] 用于重组酵母媒介物的产生并通过酵母媒介物表达抗原和/或其他蛋白质的有效条件包括其中可培养酵母菌株的有效培养基。有效培养基通常是包含可同化的糖、氮和磷酸盐源，以及适宜的盐、矿物质、金属和其他营养物如维生素和生长因子的水性培养基。所述培养基可包含复杂的营养物或可以是限定的最小培养基。本发明的酵母菌株可在多种容器中培养，包括但不限于，生物反应器、Erlenmeyer瓶、试管、微滴定皿和皮氏培养皿(Petri plate)。培养在适于该酵母菌株的温度、pH和氧含量进行。这类培养条件完全在本领域普通技术人员的技能范围之内(参见例如，Guthrie等(编),1991,Methods in Enzymology,vol.194,Academic Press,San Diego)。例如，在一个方案中，可使用从酵母-MUC1免疫治疗组合物的起始板和/或起始培养物获得的培养物接种含有适宜培养基的液体培养物，并在30℃生长约20小时，伴随着250rpm的搅拌。然后，原代培养物在期望时可扩展成更多的培养物。来自转化酵母的载体的蛋白质表达(例如MUC1表达)可以是组成性的(如果利用的启动子是组成性启动子的话)，或者可以是通过添加针对该启动子的适宜诱导条件诱导(如果利用的启动子是可诱导启动子的话)(例如在CUP1启动子的情况中为硫酸铜)。在可诱导启动子的情况中，可在培养物生长至适宜细胞密度之后启动蛋白质表达的诱导，所述密度可以在约0.2Y.U./ml或更高密度。
[0134] 适于培养本发明酵母-MUC1免疫治疗组合物的培养基的一个非限制性的例子是U2培养基。U2培养基包含以下组分：15g/L的葡萄糖、6.7g/L的含硫酸铵的酵母氮基、和各0.04mg/mL的组氨酸、色氨酸和腺嘌呤、以及0.06mg/ml的亮氨酸。适于培养本发明酵母-MUC1免疫治疗组合物的培养基的另一个非限制性的例子是UL2培养基。UL2培养基包含以下组分：15g/L的葡萄糖、6.7g/L的含硫酸铵的酵母氮基、以及各0.04mg/mL的组氨酸、色氨酸和腺嘌呤。
[0135] 在本发明的一些实施方案中，在中性pH条件下生长酵母。如本文中使用的，术语“中性pH”的一般性使用指在约pH5.5至约pH8的pH范围，且在一个方面，为约pH6至约8。本领域技术人员会领会当用pH计测量时可能存在微小波动(例如以数十分之一或数百分之一计)。如此，使用中性pH来生长酵母细胞意指对于培养中的大部分时间酵母细胞在中性pH中生长。在一个实施方案中，酵母生长在维持于至少5.5的pH水平(即不允许培养基的pH掉至低于pH5.5)的培养基中。在一个其他方面，酵母生长在维持于约6、6.5、7、
7.5或8的pH水平。在一个方面，通过使用适宜的缓冲剂来创建缓冲的培养物或生长培养基来维持中性pH。在培养酵母中使用中性pH促进几种生物学效应，其为使用酵母作为用于免疫调控的媒介物所期望的特征。例如，在中性pH培养酵母允许酵母的良好生长，而不对细胞世代时间有不利影响(例如延迟倍增时间)。酵母可持续生长至较高密度而不丧失其细胞壁柔韧性。使用中性pH允许产生具有柔韧细胞壁的酵母和/或在所有收获密度对消化细胞壁的酶(例如葡聚糖酶)更敏感的酵母。期望该性状，因为具有柔性细胞壁的酵母能诱导相比于在更酸性条件下生长的酵母不同或改进的免疫应答，例如通过促进已吞噬酵母的抗原提呈细胞的细胞因子分泌(例如TH1型细胞因子，包括但不限于IFN-γ、白介素-12(IL-12)和IL-2，以及促炎性细胞因子如IL-6)。另外，这类培养方法提供了对位于细胞壁内的抗原的更大的可达性。在另一个方面，对一些抗原使用中性pH允许通过用二硫苏糖醇(DTT)处理来释放二硫键连接的抗原，这对于在更低pH(例如pH5)的培养基中培养表达抗原的酵母时是不可能的。在使用中性pH条件来培养用于本发明的酵母的一个非限制性例子中，使用例如4.2g/L Bis-Tris来缓冲上文描述的UL2培养基。
7.5或8的pH水平。在一个方面，通过使用适宜的缓冲剂来创建缓冲的培养物或生长培养基来维持中性pH。在培养酵母中使用中性pH促进几种生物学效应，其为使用酵母作为用于免疫调控的媒介物所期望的特征。例如，在中性pH培养酵母允许酵母的良好生长，而不对细胞世代时间有不利影响(例如延迟倍增时间)。酵母可持续生长至较高密度而不丧失其细胞壁柔韧性。使用中性pH允许产生具有柔韧细胞壁的酵母和/或在所有收获密度对消化细胞壁的酶(例如葡聚糖酶)更敏感的酵母。期望该性状，因为具有柔性细胞壁的酵母能诱导相比于在更酸性条件下生长的酵母不同或改进的免疫应答，例如通过促进已吞噬酵母的抗原提呈细胞的细胞因子分泌(例如TH1型细胞因子，包括但不限于IFN-γ、白介素-12(IL-12)和IL-2，以及促炎性细胞因子如IL-6)。另外，这类培养方法提供了对位于细胞壁内的抗原的更大的可达性。在另一个方面，对一些抗原使用中性pH允许通过用二硫苏糖醇(DTT)处理来释放二硫键连接的抗原，这对于在更低pH(例如pH5)的培养基中培养表达抗原的酵母时是不可能的。在使用中性pH条件来培养用于本发明的酵母的一个非限制性例子中，使用例如4.2g/L Bis-Tris来缓冲上文描述的UL2培养基。
[0136] 发明人在本文中显示，使用中性pH条件生长的本发明的酵母-MUC1免疫治疗组合物是更有力的树突细胞的激活剂且活化MUC-1特异性T细胞以产生比在标准条件下生长(其中不维持中性pH)的相同酵母-MUC1免疫治疗组合物更高水平的IFN-γ(见实施例)。
[0137] 在一个实施方案中，利用对酵母糖基化的量的控制来控制酵母的抗原(特别是在表面上)的表达。酵母糖基化的量能影响抗原特别是在表面上表达的抗原的免疫原性和抗原性，因为糖模块倾向于较大。如此，在依照本发明的酵母的调控中应考虑酵母表面上糖模块的存在及其对靶抗原周围三维空间的影响。可使用任何方法来降低或增加酵母的糖基化的量，如期望的。例如，可使用选择的具有较低糖基化的酵母突变体菌株(例如mnn1、och1和mnn9突变体)，或可通过突变消除靶抗原上的糖基化接受体序列。或者，可使用具有短小糖基化模式的酵母，例如毕赤酵母。还可以使用降低或改变糖基化的方法来处理酵母。
[0138] 在本发明的一个实施方案中，作为在酵母媒介物中抗原或其他蛋白质重组表达的备选，将酵母媒介物用蛋白质或肽，或用糖类或其他充当抗原和/或可用作依照本发明的免疫调控剂或生物反应修饰剂的分子胞内加载。其后，可将现胞内含有抗原和/或其他蛋白质的酵母媒介物施用给个体或加载到载体如树突细胞中。肽和蛋白质可直接插入到本发明的酵母媒介物中，其通过本领域技术人员已知的技术，如扩散、活性运输、脂质体融合、电穿孔、吞噬作用、冻融循环和浴式超声处理。可用肽、蛋白质、糖类或其他分子直接加载的酵母媒介物包括完整的酵母，以及原生质球、空胞或细胞质，其可在产生后用抗原和其他药剂加载。或者，完整的酵母可用抗原和/或药剂加载，然后可从其制备原生质球、空胞、细胞质或亚细胞颗粒。可将任意数目的抗原和/或其他药剂加载到该实施方案中的酵母媒介物中，从至少1、2、3、4种或任何全整数直至成百或上千种抗原和/或其他药剂，如通过加载例如微生物或其部分会提供的。
[0139] 在本发明的另一个实施方案中，抗原和/或其他药剂物理附接至酵母媒介物。抗原和/或其他药剂对酵母媒介物的物理附接可通过本领域中合适的任何方法实现，包括共价和非共价联合方法，其包括但不限于，将抗原和/或其他药剂化学交联至酵母媒介物的外部表面或将抗原和/或其他药剂生物学连接至酵母媒介物的外部表面，如通过使用抗体或其他结合伴侣。化学交联可例如通过包括戊二醛连接、光亲和性标记、用碳二亚胺处理、用能连接二硫键的化学物处理、以及用本领域中标准的其他交联化学物处理在内的方法来实现。或者，可以使改变酵母膜的脂质双层或细胞壁组成的化学物与酵母媒介物接触，从而使得酵母的外部表面更可能融合或结合至具有特定电荷属性的抗原和/或其他药剂。还可将靶向性药剂如抗体、结合肽、可溶性受体和其他配体纳入抗原中作为融合蛋白或与抗原关联以用于抗原对酵母媒介物的结合。
[0140] 当抗原或其他蛋白质在酵母表面上表达或物理附接至表面时，在一个方面，可仔细选择间隔臂来优化抗原或其他蛋白质在表面上的表达或含量。间隔臂的大小能影响抗原或其他蛋白质暴露多少用于酵母表面上的结合。如此，根据使用的是哪种/些抗原或其他蛋白质，本领域技术人员会选择对于酵母表面上的抗原或其他蛋白质实现适宜间隔的间隔臂。在一个实施方案中，所述间隔臂是至少450个氨基酸的酵母蛋白质。间隔臂已在上文详细论述。
[0141] 在又一个实施方案中，所述酵母媒介物与抗原或其他蛋白质彼此联合，其通过更被动的、非特异性的或非共价的结合机制，如通过将酵母媒介物和抗原或其他蛋白质温和地一起混合在缓冲液或其他合适的配置剂中(例如加药配液(admixture))。
[0142] 在一个实施方案中，可将完整的酵母(有或无异源抗原或其他蛋白质的表达)碾碎或以产生酵母细胞壁制备物、酵母膜颗粒或酵母片段(即不完整的)方式加工，且在一些实施方案中，酵母片段可与包含抗原的其他组合物(例如DNA疫苗、蛋白质亚基疫苗、杀死或失活的病原体、病毒载体疫苗)一起提供或一起施用以增强免疫应答。例如，可利用酶处理、化学处理或物理力(例如机械剪切或超声处理)来将酵母分解成用作佐剂的部分。
[0143] 在本发明的一个实施方案中，可用于本发明的酵母媒介物包括已杀死或失活的酵母媒介物。酵母的杀死或失活可通过多种本领域中已知的适宜方法中的任一种来实现。例如，酵母的加热失活是将酵母失活的一种标准途径，且本领域技术人员若期望的话能通过本领域中已知的标准方法来监测靶抗原的结构变化。或者，可以使用将酵母失活的其他方法，如化学、电、放射性或UV方法。参见例如，披露在标准酵母培养教科书如Methods of Enzymology,Vol.194,Cold Spring Harbor Publishing(1990)中的方法学。使用的任一种失活策略均应考虑到靶抗原的二级、三级或四级结构并保留这类结构以优化其免疫原性。
[0144] 可使用本领域技术人员已知的许多技术将酵母媒介物配制成本发明的基于酵母的免疫治疗组合物或产品。例如，酵母媒介物可通过冻干干燥。包含酵母媒介物的配制物还可通过将酵母包装成饼状或片剂来制备，如对于用在烘焙或酿造操作中的酵母所进行的。另外，可将酵母媒介物与药学可接受的赋形剂如宿主或宿主细胞耐受的等渗缓冲剂混合。这类赋形剂的例子包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、汉克氏溶液和其他生理学平衡的水性盐溶液。还可使用非水性媒介物，如不挥发性油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酸酯。其他可用的配制物包括含有粘度增强剂，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、甘油或葡聚糖的悬液。赋形剂还可含有少量的添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲剂的例子包括磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂和Tris缓冲剂，而防腐剂的例子包括硫柳汞(thimerosal)、间甲酚或邻甲酚、福尔马林和苯甲醇。标准的配制剂可以是液体注射剂或可吸纳到合适的液体中作为悬液或溶液用于注射的固体。如此，在一种非液体配制物中，所述赋形剂可包含例如右旋糖、人血清清蛋白、和/或防腐剂，在施用前可向其加入无菌水或盐水。
[0145] 在本发明的一个实施方案中，组合物可包含另外的亦可称为生物反应修饰剂化合物的药剂，或产生这类药剂/修饰剂的能力。例如，可用至少一种抗原和至少一种药剂/生物反应修饰剂化合物转染或加载酵母媒介物，或者本发明的组合物可连同至少一种药剂/生物反应修饰剂施用。生物反应修饰剂包括佐剂和能调控免疫应答的其他化合物(其可称为免疫调控化合物)，以及修饰其他化合物或药剂如基于酵母的免疫治疗物的生物学活性的化合物，这类生物学活性不限于免疫系统影响。某些免疫调控化合物能刺激保护性的免疫应答，而其他能抑制有害的免疫应答，且免疫调控与给定的基于酵母的免疫治疗物组合是否有用至少部分可取决于要治疗或预防的疾病状态或状况，和/或要治疗的个体。某些生物反应修饰剂优先增强细胞介导的免疫应答而其他优先增强体液免疫应答(即能刺激其中相比于体液免疫具有水平升高的细胞介导免疫的免疫应答，或反之)。某些生物反应修饰剂具有与基于酵母的免疫治疗物的生物学特性共同的一种或多种特性，或增强或补充基于酵母的免疫治疗物的生物学特性。本领域技术人员已知许多技术来测量对免疫应答的刺激或抑制，以及区分细胞介导的免疫应答与体液免疫应答，和区分一种类型与另一种类型的细胞介导的应答(例如TH17应答对TH1应答)。
[0146] 可用于本发明的药剂生物反应修饰剂可包括但不限于，细胞因子、趋化因子、激素、脂质衍生物、肽、蛋白质、多糖、小分子药物、抗体及其抗原结合片段(包括但不限于抗细胞因子抗体、抗细胞因子受体抗体、抗趋化因子抗体)、维生素、多核苷酸、核酸结合模块、适体、和生长调控物。一些合适的药剂包括但不限于，IL-1或IL-1或IL-1R的激动剂、抗IL-1或其他IL-1拮抗剂；IL-6或IL-6或IL-6R的激动剂、抗IL-6或其他IL-6拮抗剂；IL-12或IL-12或IL-12R的激动剂、抗IL-12或其他IL-12拮抗剂；IL-17或IL-17或IL-17R的激动剂、抗IL-17或其他IL-17拮抗剂；IL-21或IL-21或IL-21R的激动剂、抗IL-21或其他IL-21拮抗剂；IL-22或IL-22或IL-22R的激动剂、抗IL-22或其他IL-22拮抗剂；IL-23或IL-23或IL-23R的激动剂、抗IL-23或其他IL-23拮抗剂；IL-25或IL-25或IL-25R的激动剂、抗IL-25或其他IL-25拮抗剂；IL-27或IL-27或IL-27R的激动剂、抗IL-27或其他IL-27拮抗剂；I型干扰素(包括IFN-α)或I型干扰素或其受体的激动剂或拮抗剂；II型干扰素(包括IFN-γ)或II型干扰素或其受体的激动剂或拮抗剂；抗CD40、CD40L、淋巴细胞活化基因3(LAG3)蛋白质和/或IMP321(源自LAG3的可溶性形式的T细胞免疫刺激性因子)、抗CTLA-4抗体(例如以释放无变应性T细胞)；T细胞共刺激物(例如抗CD137、抗CD28、抗CD40)；alemtuzumab(例如 )、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)(例如 )；抗CD4；抗CD25；抗PD-1、抗PD-L1、抗
PD-L2；阻断FOXP3的药剂(例如废除活性/杀死CD4+/CD25+T调节性细胞)；Flt3配体、TM
咪喹莫特(imiquimod)(Aldara )、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、沙格司亭(sargramostim)( )；激素包括但不限于促乳素和
生长激素；Toll样受体(TLR)激动剂，包括但不限于TLR-2激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂和TLR-9激动剂；TLR拮抗剂，包括但不限于TLR-2拮抗剂、TLR-4拮抗剂、TLR-7拮抗剂和TLR-9拮抗剂；抗炎性剂和免疫调控剂，包括但不限于COX-2抑制剂(例如塞来考昔(Celecoxib)、NSAID)、糖皮质激素类、他汀类、和沙利度胺(thalidomide)及其类似物，包括IMiDTM(其为沙利度胺的结构和功能类似物(例如 (lenalidomide)、
(pomalidomide))；促炎性剂，如真菌或细菌组分或任何促炎性细胞因子或趋
化因子；免疫治疗疫苗，包括但不限于基于病毒的疫苗、基于细菌的疫苗或基于抗体的疫苗；和任何其他免疫调控剂、免疫加强剂、抗炎性剂、促炎性剂和任何调控抗原提呈细胞或TH17、TH1和/或T调节细胞的数目、调控其活化状态、和/或调控其存活的药剂。这类药剂的任意组合均由本发明涵盖，且与基于酵母的免疫治疗物组合或在方案中一起施用(例如同时、序贯或以其他形式一起)的任一种这类药剂均为由本发明涵盖的组合物。这类药剂是本领域中公知的。这些药剂可单独使用或与本文中描述的其他药剂组合使用。
PD-L2；阻断FOXP3的药剂(例如废除活性/杀死CD4+/CD25+T调节性细胞)；Flt3配体、TM
咪喹莫特(imiquimod)(Aldara )、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、沙格司亭(sargramostim)( )；激素包括但不限于促乳素和
生长激素；Toll样受体(TLR)激动剂，包括但不限于TLR-2激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂和TLR-9激动剂；TLR拮抗剂，包括但不限于TLR-2拮抗剂、TLR-4拮抗剂、TLR-7拮抗剂和TLR-9拮抗剂；抗炎性剂和免疫调控剂，包括但不限于COX-2抑制剂(例如塞来考昔(Celecoxib)、NSAID)、糖皮质激素类、他汀类、和沙利度胺(thalidomide)及其类似物，包括IMiDTM(其为沙利度胺的结构和功能类似物(例如 (lenalidomide)、
(pomalidomide))；促炎性剂，如真菌或细菌组分或任何促炎性细胞因子或趋
化因子；免疫治疗疫苗，包括但不限于基于病毒的疫苗、基于细菌的疫苗或基于抗体的疫苗；和任何其他免疫调控剂、免疫加强剂、抗炎性剂、促炎性剂和任何调控抗原提呈细胞或TH17、TH1和/或T调节细胞的数目、调控其活化状态、和/或调控其存活的药剂。这类药剂的任意组合均由本发明涵盖，且与基于酵母的免疫治疗物组合或在方案中一起施用(例如同时、序贯或以其他形式一起)的任一种这类药剂均为由本发明涵盖的组合物。这类药剂是本领域中公知的。这些药剂可单独使用或与本文中描述的其他药剂组合使用。
[0147] 药剂可包括给定蛋白质或其肽或域的激动剂和拮抗剂。如本文中使用的，“激动剂”是结合受体或配体并产生或触发应答的任意化合物或药剂，包括但不限于小分子、蛋白质、肽、抗体、核酸结合剂等，其可包括模拟或增强结合受体或配体的天然存在物质的作用的药剂。“拮抗剂”是阻断或抑制或降低激动剂作用的任何化合物或药剂，其包括但不限于小分子、蛋白质、肽、抗体、核酸结合剂等。
[0148] 本发明的组合物还可包括可用于预防或治疗癌症的任何其他药剂或组合物或方案，或治疗或改善癌症(特别是与MUC1表达或过表达有关的癌症)的任何症状的任何化合物，或与之一起施用(同时、序贯或间歇地)。另外，本发明的组合物可与其他免疫治疗组合物，包括预防用药和/或治疗性免疫治疗一起使用。可用于治疗癌症的另外的药剂、组合物或方案(例如治疗方案)包括但不限于，化疗、肿瘤的手术切除、放疗、同种异体或自体同源性的干细胞移植、T细胞过继性转移、其他类型的免疫治疗，包括基于病毒载体的免疫治疗和树突细胞/肿瘤融合免疫治疗、和/或靶向性癌症疗法(例如小分子药物、生物制剂、或单克隆抗体疗法，其特异性靶向牵涉肿瘤生长和进展的分子，包括但不限于，选择性雌激素受体调控物(SERM)、芳香酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、类维生素A(retinoid)受体激活剂、细胞凋亡刺激物、血管发生抑制剂、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂、或免疫刺激物)。这些另外的治疗剂和/或治疗方案中的任一种可在本发明的免疫治疗组合物之前、同时、交替、或之后施用，或在不同的时间点施用。例如，在连同化疗或靶向性癌症疗法对个体施用时，可能期望在化疗或靶向性癌症疗法的剂量之间的“假期”期间施用酵母-MUC1免疫治疗组合物，以使得免疫治疗组合物的功效最大化。肿瘤的手术切除可经常先于酵母-MUC1免疫治疗组合物的施用，但另外或初始的手术可在酵母-MUC1免疫治疗组合物的施用期间或之后进行。
[0149] 本发明还包括包含本文中描述的任一种组合物，或本文中描述的组合物的任一种分别组分的试剂盒。试剂盒可包含另外的试剂和用于使用本发明的任一种组合物来预防或治疗与MUC1表达或过表达有关或特征为MUC1表达或过表达的癌症的书面用法说明书或指导。
[0150] 用于施用或使用本发明组合物的方法
[0151] 设计本发明的酵母-MUC1免疫治疗组合物用于预防或治疗与MUC1表达或过表达有关或特征为MUC1表达或过表达的癌症，包括通过预防这类癌症的出现、停滞这类癌症的进展或消除这类癌症。更具体地，酵母-MUC1免疫治疗组合物可用于预防、抑制或延迟表达MUC1的肿瘤的形成，和/或预防、抑制或延迟肿瘤迁移和/或其他组织的肿瘤侵入(转移)和/或一般性预防或抑制个体中癌症的进展。酵母-MUC1免疫治疗组合物还可用于改善癌症的至少一种症状，如通过减轻个体中的肿瘤负担；抑制个体中的肿瘤生长；增加个体的存活；和/或预防、抑制、逆转或延迟个体中癌症的进展。
[0152] 与本发明的组合物和方法有关的癌症是表达或可以表达MUC1的任何癌症，或邻近于表达或可以表达MUC1的癌症的癌症，包括上皮组织的癌症，且包括但不限于，乳房、小肠、胃、肾、膀胱、子宫、卵巢、睾丸、肺、结肠、胰腺、前列腺、睾丸的癌症及其转移性癌。另外，MUC1是或可以在血液癌症，如淋巴瘤、白血病和骨髓瘤中表达，包括但不限于，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多髓细胞性淋巴瘤(MML)、急性髓细胞样白血病(AML)、Epstein-Barr病毒(EBV)转化的B细胞、伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
[0153] 在一个方面，在首次施用所述组合物时未在个体的癌症中检测出MUC1。当未在个体的癌症中检测出MUC1时，个体可能具有更早期的癌症，其中尚未显现MUC1表达(例如I期或II期)，或其中不能在任何事件中检测出MUC1表达(即MUC1可能以或不以低水平表达或在少量肿瘤细胞中表达，但使用标准检测方法尚未能容易地检出)。或者，所述个体可能具有癌症前期损伤或肿瘤，或者可能已知倾向于形成癌症(例如由家族史、遗传标志等已知)。在本发明的这些方面，通过使用酵母-MUC1免疫治疗组合物来预防、延迟或抑制表达MUC1的肿瘤细胞的形成。
[0154] 在另一个方面，在首次施用所述组合物时在或能在个体的癌症中检测出MUC1表达。在本发明的这一方面，所述个体可能患有I期、II期、III期或IV期癌症。在这一方面，酵母-MUC1免疫治疗组合物的使用降低、消除或延迟或停滞了表达MUC1的肿瘤的生长，其能引起个体中肿瘤负担的降低、抑制表达MUC1的肿瘤生长、和/或个体的增加的存活。
[0155] 本发明的另一个实施方案涉及一种治疗癌症，尤其是表达MUC1的癌症的方法。所述方法包括对患有表达MUC1的癌症的个体施用本文中描述的酵母-MUC1免疫治疗组合物，其可包括包含以下的组合物：(a)一种酵母媒介物；和(b)包含至少一种MUC1抗原的癌抗原。在一个方面，所述方法减轻患者中的肿瘤负担。在一个方面，所述方法增加患者的存活。在一个方面，所述方法抑制个体中的肿瘤生长。
[0156] 在一个方面，用至少一种可用于治疗癌症的其他治疗性化合物或治疗性方案来另外地治疗所述个体。这类治疗剂和方案已在本文中别处详细论述。例如，在关于本文所述发明方法的任一个实施方案中，在一个方面，当个体患有癌症(不考虑肿瘤细胞中可检测的MUC1表达的状态)时，所述个体正接受或已接受过针对癌症的另一种疗法治疗。这类疗法可包括任一种治疗性方案或使用本文中先前描述的任一种治疗性化合物或药剂，包括但不限于，化疗、放疗、靶向性癌症疗法、肿瘤的手术切除、干细胞转移、细胞因子疗法、过继性T细胞转移、和/或第二免疫治疗组合物的施用。在施用第二免疫治疗组合物的情况中，这类组合物可包括但不限于，另外的基于酵母的免疫治疗、基于重组病毒的免疫治疗(病毒载体，例如参见PCT公开文本No.WO/00/34494)、细胞因子疗法、免疫刺激物疗法(包括具有免疫刺激特性的化疗)、DNA疫苗、树突细胞/肿瘤融合免疫治疗(例如参见PCT公开文本No.WO/2009/062001)、和其他免疫治疗组合物。
[0157] 在一个方面，第二免疫治疗组合物包含并非MUC1抗原的第二癌抗原。例如，可与酵母-MUC1免疫治疗组合物组合使用的第二免疫治疗组合物是包含由同一肿瘤类型表达、或要治疗的个体患有或可能形成的其他肿瘤表达的另一种癌抗原的酵母-免疫治疗组合物。这类癌抗原包括但不限于以下任意一种或多种：癌胚抗原(CEA)、点突变的Ras癌蛋白、短尾畸形蛋白、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、正常和点突变的p53癌蛋白、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤性结肠息肉病(APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、间皮素、NGEP、这类抗原的修饰、这类抗原的剪接变体、和这类抗原的表位激动剂、以及这类抗原的组合、和/或其免疫原性域、其修饰、其变体、和/或其表位激动剂。
[0158] 如本文中使用的，“治疗”癌症或其任意变换(例如“用于癌症地治疗”等)一般指一旦发生癌症(例如一旦已在个体中诊断出癌症或检出癌症)就施用本发明的组合物，其具有包括以下的至少一个治疗的治疗性目标(如相比于没有该治疗)：肿瘤负担的减轻；肿瘤生长的抑制；个体存活的增加；延迟、抑制、停滞或预防转移性癌症的发生或形成(如通过延迟、抑制、停滞或预防肿瘤迁移形成的发生和/或原发性癌症之外的组织的肿瘤侵袭和/或与癌症的转移性进展有关的其他过程)；延迟或停滞原发性癌症进展；改进针对肿瘤的免疫应答；改进针对肿瘤抗原的长期记忆免疫应答；和/或改进个体的一般健康。“预防”或“保护免于”癌症，或其任意变换(例如“预防癌症”等)一般指在发生癌症之前，当检测出癌症前期的细胞时，或在特定阶段的癌症或癌症中的肿瘤抗原表达发生之前(例如在癌症中检测出MUC1表达之前)，施用本发明的组合物，其具有包括以下的至少一个治疗目标(如相比于没有该治疗)：预防或延迟癌症的发生或形成，或若癌症在治疗后发生，至少降低癌症的严重程度(例如降低肿瘤生长水平、停滞癌症进展、改进针对癌症的免疫应答、抑制转移性过程等)或改进个体中的结果(例如改进存活)。
[0159] 本发明包括向受试者或个体投递(施用、免疫、疫苗接种)本发明的酵母-MUC1免疫治疗组合物。施用过程可离体或体内进行，但通常在体内进行。离体施用指在患者外实施部分调节性步骤，如对从患者取出的细胞群体(树突细胞)在使得酵母媒介物、抗原和任意其他药剂或组合物加载到细胞中的条件下施用本发明的组合物，并将细胞返还到患者。然后，本发明的治疗性组合物可返还至患者，或通过任何适宜的施用模式对患者施用。
[0160] 组合物的施用可以是系统性、经粘膜和/或在临近靶部位的位置(例如在肿瘤部位附近)。根据要预防或治疗的癌症类型和/或靶细胞群体或组织，合适的施用路径对于本领域技术人员将是明显的。各种可接受的施用方法包括但不限于，静脉内施用、腹膜内施用、肌内施用、节内施用、冠状动脉内施用、动脉内施用(例如到颈动脉中)、皮下施用、经皮施用、气管内施用、关节内施用、心室内施用、吸入(例如气雾剂)、颅骨内、脊柱内、眼内、耳、鼻内、口服、肺部施用、导管注入、和直接注射到组织中。在一个方面，施用路径包括：静脉内、腹膜内、皮下、皮内、节内、肌内、经皮、吸入、鼻内、口服、眼内、关节内、颅骨内、和脊柱内。胃肠外投递可包括皮内、肌内、腹膜内、胸膜内、肺内、静脉内、皮下、动脉导管和静脉导管路径。耳投递可包括耳滴液，鼻内投递可包括鼻滴液或鼻内注射，而眼内投递可包括眼滴液。气雾剂(吸入)投递还可使用本领域种的标准方法实施(参见例如，Stribling等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA189:11277-11281,1992)。在一个方面，皮下施用本发明的酵母-MUC1免疫治疗组合物。在一个方面，将酵母-MUC1免疫治疗组合物直接施用到肿瘤环境中。
[0161] 一般地，适宜的单剂酵母-MUC1免疫治疗组合物是当在一个适宜的时间段内施用一次或多次时，能有效向给定的细胞类型、组织或患者身体区域提供酵母媒介物和MUC1抗原的剂量，其量有效引发针对一种或多种MUC1抗原或表位的抗原特异性免疫应答。例如，5 7
在一个实施方案中，本发明的酵母-MUC1的单剂为约1x10 至约5x10 酵母细胞等同物每千
7
克施用该组合物的生物的体重。一个酵母单位(Y.U.)是1x10 个酵母细胞或酵母细胞等同
6
物。在一个方面，本发明的单剂酵母媒介物为约0.1Y.U.(1x10 个酵母细胞或酵母细胞等
9 6
同物)至约100Y.U.(1x10 个细胞)每剂(即每生物)，包括任何中间剂量，增量为0.1x10
6 6 6
个细胞(即1.1x10、1.2x10、1.3x10...)。在一个实施方案中，适宜的剂量包括1Y.U.至
40Y.U.的剂量且在一个方面，为10Y.U.至40Y.U或10Y.U.至80Y.U。在一个实施方案中，剂量在个体上不同部位但在同一给药时段内施用。例如，40Y.U.剂量可通过在一个给药阶段内向个体上的4个不同部位注射10Y.U.剂量来施用。本发明包括在个体上1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10或更多个不同部位施用酵母-MUC1免疫治疗组合物的量(例如1、2、3、4、5、6、
7、8、910、11、12、13、14,15、16、17、18、19、20Y.U.或更多)以形成单剂。
在一个实施方案中，本发明的酵母-MUC1的单剂为约1x10 至约5x10 酵母细胞等同物每千
7
克施用该组合物的生物的体重。一个酵母单位(Y.U.)是1x10 个酵母细胞或酵母细胞等同
6
物。在一个方面，本发明的单剂酵母媒介物为约0.1Y.U.(1x10 个酵母细胞或酵母细胞等
9 6
同物)至约100Y.U.(1x10 个细胞)每剂(即每生物)，包括任何中间剂量，增量为0.1x10
6 6 6
个细胞(即1.1x10、1.2x10、1.3x10...)。在一个实施方案中，适宜的剂量包括1Y.U.至
40Y.U.的剂量且在一个方面，为10Y.U.至40Y.U或10Y.U.至80Y.U。在一个实施方案中，剂量在个体上不同部位但在同一给药时段内施用。例如，40Y.U.剂量可通过在一个给药阶段内向个体上的4个不同部位注射10Y.U.剂量来施用。本发明包括在个体上1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10或更多个不同部位施用酵母-MUC1免疫治疗组合物的量(例如1、2、3、4、5、6、
7、8、910、11、12、13、14,15、16、17、18、19、20Y.U.或更多)以形成单剂。
[0162] 治疗性组合物的“加强剂(booster/boost)”在例如当针对抗原的免疫应答衰退或需要提供免疫应答或诱导针对特定抗原的记忆应答时施用。加强剂可相隔约1、2、3、4、5、6、7、或8周施用，或每月、每两个月、每季、每年施用、和/或在起始施用后以数年或几年的增量施用，这根据所治疗个体的状态和施用时的治疗目标(例如预防性、活性治疗、维持)。在一个实施方案中，施用方案为，其中在从数周至数月、至数年的时间段内施用酵母-MUC1免疫治疗组合物的剂量至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在一个实施方案中，对于1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10剂以上的剂量，每周或每两周施用剂量，继之以如需要的每两周或每月施用剂量以实现期望的对癌症的预防性或治疗性处理。然后，可以类似或更长的间期(数月或数年)给予额外的加强剂作为维持或缓解疗法，如期望的。
3、4、5、6、7、8、9、10剂以上的剂量，每周或每两周施用剂量，继之以如需要的每两周或每月施用剂量以实现期望的对癌症的预防性或治疗性处理。然后，可以类似或更长的间期(数月或数年)给予额外的加强剂作为维持或缓解疗法，如期望的。
[0163] 在本发明的一个方面，一种或多种另外的治疗剂或治疗方案与酵母-MUC1免疫治疗组合物的施用序贯和/或同时施用或进行，所述另外的治疗剂或治疗方案例如肿瘤的手术切除、化疗的施用、放疗的施用、其他免疫治疗组合物或方案的施用，包括病毒载体疗法和树突细胞/肿瘤融合疗法、细胞因子疗法、过继性T细胞转移(包括已通过抗原和/或免疫治疗组合物离体刺激过的T细胞的过继性转移)、或干细胞移植。在一个例子中，酵母-MUC1免疫治疗连同利用基于病毒载体的免疫治疗的疗法(如记载于PCT公开文本No.WO/00/34494)一起施用。在另一个例子中，酵母-MUC1免疫治疗连同树突细胞/肿瘤细胞融合疗法或用这类树突细胞/肿瘤细胞融合物刺激的免疫系统细胞(例如T细胞)(如记载于PCT公开文本No.WO/2009062001)一起施用。在这类实施方案中，非基于酵母的免疫治疗可靶向MUC1或不同的肿瘤抗原，且这类疗法可包括另外施用其他药剂，如细胞因子、抗体或其他药剂。
[0164] 在一个方面，可在施用第一剂酵母-MUC1免疫治疗组合物之前或之后施用针对癌症的一种或多种疗法(包括本文中描述的或本领域中已知的任意疗法)。在一个实施方案中，可以与酵母-MUC1免疫治疗组合物给药交替的方式施用或实施一种或多种疗法，如在一个方案中，在化疗或其他疗法的一剂或多剂连续剂量之间以指定的间期施用酵母-MUC1组合物。在一个实施方案中，在开始另外的疗法之前的一段时间内施用一剂或多剂酵母-MUC1免疫治疗组合物。换言之，在一段时间内酵母-MUC1免疫治疗组合物作为单一疗法施用，然后加入另外的疗法(例如化疗)，其要么与新的酵母-MUC1免疫治疗剂量同时，要么以与酵母-MUC1免疫治疗交替的方式。或者/另外地，可在开始施用酵母-MUC1免疫治疗组合物之前施用另一种疗法达一段时间，并可以组合概念(例如肿瘤的手术切除，继之以使用酵母-MUC1免疫治疗的单一疗法达数周，继之以交替的化疗和酵母-MUC1免疫治疗剂量达数周或数月，任选地之后是使用酵母-MUC1免疫治疗和/或另一种疗法的单一疗法，或者是序贯、同时或以交替方式提供的疗法的组合的新方案)。使用酵母-MUC1免疫治疗来治疗癌症的各种方案均涵盖在本发明中，且这些例子应视为对各种可能方案的非限制性例子。
[0165] 基于病毒的免疫治疗组合物通常包含包括病毒基因组或其部分的病毒载体(例如重组病毒)和编码至少一种来自致病剂或疾病状态的抗原(例如癌抗原、感染性疾病抗原、和/或其至少一个免疫原性域)的核酸序列。在一些实施方案中，基于病毒的免疫治疗组合物还包含至少一种病毒载体，其包含一种或多种编码一种或多种免疫刺激性分子的核酸序列。在一些实施方案中，将编码免疫刺激性分子和抗原的基因插入同一个病毒载体(同一个重组病毒)。
[0166] 树突细胞/肿瘤细胞融合免疫治疗组合物通常为使用本领域已知的融合方法通过树突细胞与表达肿瘤抗原的非树突细胞(包括肿瘤细胞)之间的融合生成的杂合细胞。融合的细胞具有树突细胞特征且亦表达和呈现来自肿瘤细胞的肿瘤抗原。所述组合物可对个体施用，或用于离体刺激T细胞以用于T细胞转移方法。
[0167] 在本发明的一个方面，使用基于酵母的免疫治疗除了靶向MUC1以外，还靶向MUC1之外的其他抗原。这类其他靶抗原可与MUC1抗原纳入同一个酵母媒介物中，或者可产生靶向不同抗原的另外的基于酵母的免疫治疗组合物，然后根据要治疗的个体、由该癌症类型或个体的特定肿瘤表达的抗原，和/或根据个体中癌症的阶段、或个体的治疗阶段，按期望的组合。例如，抗原的组合可选择为覆盖：(1)牵涉癌症形成中的重要事件的抗原，如突变的Ras，(2)牵涉或与细胞过程失调有关的抗原，如CEA或MUC1，和(3)短尾畸形蛋白，其涉及转移性过程。例如，一种或多种其他基于酵母的免疫治疗组合物可表达一种或多种抗原，包括但不限于癌胚抗原(CEA)、点突变的Ras癌蛋白、短尾畸形蛋白、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、正常和点突变的p53癌蛋白、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤性结肠息肉病(APC)、Myc、von Hippel-Lindau蛋白质(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受体(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、间皮素、NGEP、这类抗原的修饰、这类抗原的剪接变体、和这类抗原的表位激动剂、以及这类抗原的组合、和/或其免疫原性域、其修饰、其变体、和/或其表位激动剂。这些基于酵母的免疫治疗组合物中的1种、2种、3种或更多种可在酵母-MUC1免疫治疗组合物施用之前、与之同时或与之交替、和/或之后施用，从而优化对个体肿瘤中抗原的靶向。如上文，在这类方案中还可使用另外的疗法(例如肿瘤的手术切除、化疗、靶向性癌症疗法、放疗等)。
[0168] 在本发明的一个实施方案中，提供治疗癌症的一种方法。所述方法包括以下步骤：(a)对患有癌症或癌症前期肿瘤的个体施用第一免疫治疗组合物，其包含如本文中描述的酵母媒介物和MUC1抗原；和(b)在第一免疫治疗组合物的施用之前、同时、或之后对个体施用一种或多种另外的免疫治疗组合物，其各自包含酵母媒介物且各自包含并非MUC1抗原的不同癌抗原。另外的癌抗原可以是本领域种已知或本文中描述的任一种，包括但不限于，突变的Ras、癌胚抗原(CEA)、短尾畸形蛋白、EGFR等。如需要的可重复步骤来治疗特定个体的癌症，且可在治疗之前或期间修饰癌抗原以特异性地针对特定个体的癌症。
[0169] 在本发明的方法中，可对任何动物，包括任何脊椎动物，且具体地对脊椎动物哺乳纲(Mammalia)的任何成员施用组合物和治疗性组合物，所述哺乳纲包括但不限于灵长类、啮齿类、家畜和驯养宠物。家畜包括要消费的或产生可用产品的哺乳动物(例如绵羊用于羊毛生产)。要利用本发明治疗或保护的哺乳动物包括人、非人灵长类、犬、猫、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马和猪。
[0170] “个体”是脊椎动物，如哺乳动物，包括但不限于人。哺乳动物包括但不限于，农场动物、运动动物、宠物、灵长类、小鼠和大鼠。术语“个体”可与术语“动物”、“受试者”或“患者”交换使用。
[0171] 本发明中可用的通用技术
[0172] 除非另外指示，本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术，其为本领域技术人员公知的。这类技术在文献中得到完全解释，如Methods of Enzymology,Vol.194,Guthrie等 编 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；Biology and activities of yeasts,Skinner 等 编 ,Academic Press(1980)；Methods in yeast genetics:a laboratory course manual,Rose 等,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；The Yeast Saccharomyces:Cell Cycle and Cell Biology,Pringle等编,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)；The Yeast Saccharomyces:Gene Expression,Jones等编,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993)；The Yeast Saccharomyces:Genome Dynamics,Protein Synthesis,and Energetics,Broach 等 编 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second
edition(Sambrook 等 ,1989)and Molecular Cloning:A Laboratory Manual,third edition(Sambrook和Russel,2001),(本文中统称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编,1987,包括到2001年的增刊)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等编,1994)；Harlow和Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(本文中统称为“Harlow和Lane”),Beaucage等编,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)；Casarett和Doull的Toxicology The Basic Science of Poisons,C.Klaassen编,6th edition(2001),and Vaccines,S.Plotkin,W.Orenstein和P.Offit编,Fifth Edition(2008)。
edition(Sambrook 等 ,1989)and Molecular Cloning:A Laboratory Manual,third edition(Sambrook和Russel,2001),(本文中统称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编,1987,包括到2001年的增刊)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等编,1994)；Harlow和Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(本文中统称为“Harlow和Lane”),Beaucage等编,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)；Casarett和Doull的Toxicology The Basic Science of Poisons,C.Klaassen编,6th edition(2001),and Vaccines,S.Plotkin,W.Orenstein和P.Offit编,Fifth Edition(2008)。
[0173] 通用定义
[0174] “ ”(GlobeImmune,Inc.,Louisville,Colorado)一般指胞外(在其表面上)、胞内(内部或胞质溶胶地)或既胞外也胞内表达一种或多种异源抗原的酵母媒介物。已一般性描述了 (参见例如美国专利No.5,830,463)。某
些基于酵母的免疫治疗组合物，和制备及一般使用其的方法，亦详细记载于例如，美国专利No.5,830,463、美国专利No.7,083,787、美国专利No.7,736,642、Stubbs等,Nat.Med.7:625-629(2001)、Lu 等 ,Cancer Research64:5084-5088(2004) 和 Bernstein等,Vaccine2008Jan24;26(4):509-21，其各自通过提述完整并入本文。
些基于酵母的免疫治疗组合物，和制备及一般使用其的方法，亦详细记载于例如，美国专利No.5,830,463、美国专利No.7,083,787、美国专利No.7,736,642、Stubbs等,Nat.Med.7:625-629(2001)、Lu 等 ,Cancer Research64:5084-5088(2004) 和 Bernstein等,Vaccine2008Jan24;26(4):509-21，其各自通过提述完整并入本文。
[0175] 如本文中使用的，术语“类似物”指结构与另一种化合物类似但在组成上稍微不同的化学化合物(如在一种原子被不同元素的一种原子替换或在存在特定官能团的情况中，一种官能团被另一种官能团替换)。如此，类似物是一种相对于参照化合物在功能和表观上类似或可比的，但具有不同结构或起源的化合物。
[0176] 术语“取代的”、“经取代的衍生物”和“衍生物”，当用于描述一种化合物时，意指结合未经取代化合物的至少一个氢被不同的原子或化学模块替换。
[0177] 尽管衍生物具有与亲本化合物类似的物理结构，但衍生物可具有与亲本化合物不同的化学和/或生物学特性。这类特性可包括但不限于，增加或降低的亲本化合物的活性，相比于亲本化合物的新活性，增强或降低的生物利用度，增强或降低的功效，增强或降低的体外和/或体内稳定性，和/或增强或降低的吸收特性。
[0178] 一般地，术语“生物学活性”指示化合物(包括蛋白质或肽)具有至少一种可检测的活性，该活性对细胞、组织或生物体的代谢、生理学、化学或其他过程具有影响，如体内(即自然的生理学环境中)或体外(即实验室条件下)测量或观察到的。
[0179] 依照本发明，术语“调控”可与“调节”交换使用且一般指特定活性的上调或下调。如本文中使用的，术语“上调”可一般用于描述以下任一种：对特定活性的引发(elicitation)、启动(initiation)、增加、增大、加强、改进、增强、扩增、促进或提供。类似地，术语“下调”可一般用于描述以下任一种：对特定活性的降低、减少、抑制、改善、减小、变少、阻断或阻止。
[0180] 在本发明的一个实施方案中，本文中描述的任一种氨基酸序列可产生为具有至少1个多达约20个额外的异源氨基酸，其侧接指定氨基酸序列的每个C和/或N末端端。所得蛋白质或多肽可称为“基本由”指定的氨基酸序列“组成”。依照本发明，所述异源氨基酸是非天然发现(即未在自然界中体内发现)侧接指定氨基酸序列的氨基酸的序列，或不涉及指定氨基酸功能的，或不会由侧接编码指定氨基酸序列的天然存在的核酸序列的核苷酸(如其存在于基因中的)编码的，倘若使用得到给定氨基酸序列的生物体的标准密码子使用来翻译该天然存在的序列中的这类核苷酸的话。类似地，术语“基本由…组成”当述及本文中的核酸序列时，指编码指定氨基酸序列的核酸序列，在编码指定氨基酸序列的核酸序列的每个5'和/或3'端可由至少一个，且多达约60个另外的异源核苷酸侧接。所述异源核苷酸不是天然发现的(即未在自然界中体内发现)侧接编码指定氨基酸序列的核酸序列(如其存在于天然基因中的)且不编码赋予该蛋白以任何额外功能或改变具有指定氨基酸序列的蛋白质的功能的蛋白质。
[0181] 依照本发明，术语“选择性结合”指本发明的抗体、抗原结合片段或结合伴侣优先结合指定蛋白质的能力。更具体地，术语“选择性结合”指一种蛋白质对另一种(例如抗体、其片段或结合伴侣对抗原)的特异性结合，其中如通过任何标准测定法(例如免疫测定法)测量的结合水平统计学显著地高于该测定法的背景对照。例如，当实施免疫测定法时，对照通常包括含有单独的抗体或抗原结合片段(即没有抗原)的反应孔/管，其中在缺少抗原时抗体或其抗原结合片段的反应性(例如对孔的非特异性结合)的量视为背景。结合可使用本领域中标准的多种方法测量，包括酶免疫测定法(例如ELISA、免疫印迹测定法等)。
[0182] 对本发明中使用的蛋白质或多肽的一般性提述包括给定蛋白质的全长蛋白质、或任何片段、域(结构性、功能性或免疫原性)、构象表位、或同源物或变体。融合蛋白也可以一般性称为蛋白质或多肽。依照本发明，分离的蛋白质是已从其天然环境移出(即已经过人操作)的蛋白质(包括多肽或肽)且可包括例如纯化的蛋白质、部分纯化的蛋白质、重组产生的蛋白质、和合成产生的蛋白质。如此，“分离的”不反映蛋白质纯化的程度。优选地，本发明的分离的蛋白质是重组产生的。依照本发明，术语“修饰”和“突变”可交换使用，特别是关于本文中所述蛋白质或其部分的氨基酸序列(或核酸序列)的修饰/突变。
[0183] 如本文中使用的，术语“同源物”或“变体”用于指通过对参照蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白质)的微小修饰而与参照蛋白或多肽不同，但维持了天然存在形式的基本蛋白质和侧链结构的蛋白质或肽。这类变化包括但不限于：一个或几个氨基酸侧链中的变化；一个或几个氨基酸的变化，包括缺失(例如蛋白质或肽的截短型)、插入和/或取代；一个或几个原子的立体化学中的变化；和/或微小的衍生化，包括但不限于：甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、十四酰化、异戊二烯化(prenylation)、棕榈化(palmitation)、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇。同源物或变体相比于参照蛋白或肽可具有增强、降低或几乎类似的特性。同源物或变体可包括蛋白质的激动剂或蛋白质的拮抗剂。同源物或变体可使用本领域中已知的针对蛋白质生成的技术产生，包括但不限于，对分离的参照蛋白的直接修饰，直接的蛋白质合成，或对编码蛋白质的核酸序列的修饰，其使用例如经典的或重组DNA技术来引起随机或靶向性诱变，导致编码蛋白质变体。另外，可能存在参照蛋白的天然存在的变体(例如同等型、等位变体或可能在个体之间存在的其他天然变体)且可在本发明中分离、产生和/或利用。
[0184] 给定的蛋白质的同源物或变体可包含与参照蛋白的氨基酸序列(例如本文中指定的氨基酸序列、或指定蛋白质的氨基酸序列)至少约45%、或至少约50%、或至少约55%、或至少约60%、或至少约65%、或至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约86%相同、或至少约87%相同、或至少约88%相同、或至少约89%相同、或至少约90%、或至少约91%相同、或至少约92%相同、或至少约93%相同、或至少约94%相同、或至少约95%相同、或至少约96%相同、或至少约97%相同、或至少约98%相同、或至少约99%相同(或45%至99%的任何百分比同一性，以全整数增量)的氨基酸序列，基本由所述氨基酸序列组成或由其组成。在一个实施方案中，所述同源物或变体包含与参照蛋白的氨基酸序列低于100%相同、低于约99%相同、低于约98%相同、低于约97%相同、低于约96%相同、低于约95%相同，诸如此类，以1%的增量至低于约70%相同的氨基酸序列，基本由所述氨基酸序列组成或由其组成。
[0185] 如本文中使用的，除非另外指定，提到百分比(%)同一性指使用如下方法进行的同源性评估：(1)Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)基础同源性搜索，使用blastp进行氨基酸搜索而使用blastn进行核酸搜索，其中使用标准缺省参数，其中以缺省方法(by default)对检索序列过滤低复杂性区域(如记载于Altschul,S.F.,Madden,T.L., A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.&Lipman,D.J.(1997)"Gapped BLASTand PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs."Nucleic Acids Res.25:3389-3402，通过提述完整并入本文)；(2)两条序列的BLAST比对(例如使用下文描述的参数)；(3)和/或使用标准缺省参数的PSI-BLAST(Position-Specific Iterated BLAST)。注意到，由于对于两条序列Basic BLAST与BLAST之间标准参数的一些差异，在使用BLAST程序时可能将两条特定序列认定为具有显著同源性，而使用序列之一作为检索序列以Basic BLAST进行的搜索可能没有在上等匹配中鉴定到第二条序列。另外，PSI-BLAST提供了自动化的、易于使用的“序型”(profile)搜索型式，这是一种寻找序列同源物的灵敏方法。该程序首先进行带缺口的BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序利用来自任何返回的显著比对的信息来构建位置特异性得分矩阵，它取代了检索序列用于下一轮数据库搜索。因此，应当理解，百分比同一性可以使用这些程序中的任一种来测定。
[0186] 两条特定序列可以使用BLAST彼此比对，如记载于Tatusova和Madden,(1999),"Blast2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences",FEMS Microbiol Lett.174:247-250，其通过提述完整并入本文。这类序列比对以blastp或blastn进行，其使用BLAST2.0算法在两条序列之间进行Gapped BLAST搜索(BLAST2.0)，允许在所得比对中引入缺口(缺失和插入)。为了表述清楚，使用如下标准缺省参数进行两条序列的BLAST序列比对。
[0187] 对于blastn，使用0BLOSUM62矩阵：
[0188] 匹配奖分=1
[0189] 错配罚分=-2
[0190] 开放缺口(5)和延伸缺口(2)罚分
[0191] 缺口x_落选(dropoff)(50)期望(10)词长(11)滤器(开)
[0192] 对于blastp，使用0BLOSUM62矩阵：
[0193] 开放缺口(11)和延伸缺口(1)罚分
[0194] 缺口x_落选(50)期望(10)词长(3)滤器(开)。
[0195] 分离的核酸分子是已从其天然环境移出的(即已进行人为操作的)核酸分子，其天然环境指在自然界中发现该核酸分子所在的基因组或染色体。因此，“分离的”不必然反映该核酸分子已经纯化的程度，但是指明该分子不包括在自然界中发现该核酸分子所在的整个基因组或整个染色体或含有超过一个基因的基因组区段。分离的核酸分子可以包括完整基因。包含基因的分离的核酸分子不是包含这类基因的染色体片段，而是包含与该基因有关的编码区和调控区，但是没有在同一染色体上天然发现的别的基因。分离的核酸分子还可以包含基因的部分。分离的核酸分子还可以包含侧接(即在序列的5'和/或3'末端)别的核酸的指定核酸序列，所述别的核酸在自然界中通常不在指定核酸序列的侧翼(即异源序列)。分离的核酸分子可以包括DNA、RNA(例如mRNA)、或DNA或RNA任一种的衍生物(例如cDNA)。尽管术语“核酸分子”主要指物理上的核酸分子，而术语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，但是这两个术语可以互换使用，尤其对于能够编码蛋白质或蛋白质域的核酸分子或核酸序列而言。
[0196] 重组核酸分子是可包含编码本文中描述的任意一种或多种蛋白质的任意核酸序列中的至少一种可操作地连接至能有效调节该核酸分子在要转染的细胞中表达的任意转录调控序列中的至少一种的分子。尽管术语“核酸分子”主要指物理核酸分子而术语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，但这两个术语可交换使用，尤其是对于能编码蛋白质的核酸分子或核酸序列而言。另外，术语“重组分子”主要指核酸分子可操作地连接至转录调控序列，但可与术语“核酸分子”(对动物施用的)交换使用。
[0197] 重组核酸分子包括重组载体，其是任何核酸序列(通常为异源序列)，其可操作地连接至编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子，其能使得能够重组产生融合蛋白，且其能够将核酸分子投递到依照本发明的宿主细胞中。这类载体可含有不天然可见临近于要插入载体中的分离的核酸分子的核酸序列。载体可以是RNA或DNA，原核或真核的，且优选在本发明中，是可用于转染酵母的质粒。重组载体可用于克隆、测序和/或操作核酸分子，且可用于投递这类分子(例如如在DNA组合物或基于病毒载体的组合物中)。优选地，将重组载体用于表达核酸分子，其亦可称为表达载体。优选的重组载体能在转染的宿主细胞如酵母中表达。
[0198] 在本发明的重组分子中，核酸分子可操作地连接至含有调控性序列的表达载体，所述调控性序列如转录调控序列、翻译调控序列、复制起点、和其他与宿主细胞相容且控制本发明核酸分子表达的调控性序列。具体地，本发明的重组分子包括可操作地连接至一种或多种表达调控序列的核酸分子。术语“可操作地连接”指核酸分子以在转染(即转化、转导或转染)到宿主细胞中时表达该分子的方式连接至表达调控序列。
[0199] 依照本发明，术语“转染”用于指外源核酸分子(即重组核酸分子)可插入细胞中的任何方法。当这类术语用于指核酸分子导入微生物细胞，如藻类、细菌和酵母中时，术语“转化”可与术语“转染”交换使用。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物获得外源核酸所致的遗传性变化，且基本与术语“转染”同义。因此，转染技术包括但不限于，转化、化学处理细胞、颗粒轰击、电穿孔、微注射、脂转染、吸附、感染和原生质体融合。
[0200] 提供以下实验结果来例示但不意图限制本发明的范围。实施例
[0201] 实施例1
[0202] 以下实施例描述称为GI-6101的酵母-MUC1免疫治疗组合物的产生。
[0203] 在本实验中，将酵母(酿酒酵母)工程化为在铜可诱导的启动子CUP1或组成性启动子TEF2的控制下表达人MUC1抗原，产生酵母-MUC1免疫治疗组合物。在每一情况中，包含MUC1抗原的融合蛋白作为单一多肽产生，其具有符合阅读框地从N至C末端融合的以下序列元件，由SEQ ID NO:15代表：(1)MUC1SEA/ED区段(SEQ ID NO:15的位置1-59)；(2)包含两个VNTR域的VNTR区段(SEQ ID NO:15的位置60-100)；(3)MUC1TM域(SEQ ID NO:15的位置101-128)；和(4)MUC1CD(SEQ ID NO:15的位置129-200)。该融合蛋白还包含MUC1信号序列(SEQ ID NO:14的位置1-30)，其可用不同的N-末端序列取代(该末端序列设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性和/或稳定表达)，如由SEQ ID NO:21代表的肽，或来自酵母alpha前导序列的N-末端肽如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20。包含N-末端MUC1信号序列和6组氨酸C-末端标签以协助蛋白质的鉴定和/或纯化的完整的融合蛋白是单一多肽，其具有符合阅读框地从N至C末端融合的以下序列元件，由SEQ ID NO:14代表：(1)MUC1信号序列(SEQ ID NO:14的位置1-30)；(2)MUC1SEA/ED区段(SEQ ID NO:14的位置31-89)；(3)包含两个VNTR域的VNTR区段(SEQ ID NO:14的位置90-130)；(4)MUC1TM域(SEQ ID NO:14的位置131-158)；(5)MUC1CD(SEQ ID NO:14的位置159-230)；和(6)6肽组氨酸标签(SEQ ID NO:14的位置231-236)。SEQ ID NO:14由SEQ ID NO:13代表的核苷酸序列(针对酵母表达优化过密码子)编码。
[0204] 简言之，合成编码MUC1抗原的DNA，然后插入酵母2μm表达载体中CUP1启动子(载体pGI-100)或TEF2启动子(载体plu011)后的EcoRI和NotI克隆位点处。向质粒载体添加编码C-末端6组氨酸肽的核苷酸序列以编码由SEQ ID NO:14代表的完整融合蛋白。将所得质粒转化到DH5α中用于质粒储存，转化到酿酒酵母W303α中用于产生酵母-MUC1免疫治疗组合物。
[0205] 到酿酒酵母中的转化通过醋酸锂/聚乙二醇转染实施，且在缺少尿嘧啶的固体最小板(UDM；尿苷缺失培养基)上选择初始转染体。通过在30℃在U2(尿苷缺失培养基)或UL2(尿苷和亮氨酸缺失培养基)培养基中生长来选择菌落。
[0206] 所述酵母-MUC1免疫治疗组合物在本文中亦称为GI-6101，其包含在TEF2启动子调控下的编码由SEQ ID NO:14代表的人MUC1融合蛋白的多核苷酸。
[0207] 将缺少尿苷(U2)或缺少尿苷和亮氨酸(UL2)的液体培养物使用上文描述的板和起始培养物接种，并在30℃、250rpm生长约24h。还将含有4.2g/LBis-Tris的pH缓冲的UL2培养基(BT-UL2)从冷冻酵母库接种以评估在中性pH生产条件下产生的酵母-MUC1免疫治疗物(数据未显示)。在pH缓冲的UL2培养基中培养暴露酵母细胞壁上的β-葡聚糖且认为改变了酵母诱导的细胞免疫应答，这是改变了与抗原提呈细胞上dectin受体相互作用的结果。其它培养条件不管使用U2、UL2还是BT-UL2均相同。使用原代培养物来接种具有相同配方的最终培养物。
[0208] U2液体培养基的配方：
[0209] 15g/L葡萄糖
[0210] 6.7g/L含硫酸铵的酵母氮基
[0211] 各0.04g/L的组氨酸、色氨酸、腺嘌呤和0.06g/L亮氨酸
[0212] UL2液体培养基的配方：
[0213] 15g/L葡萄糖
[0214] 6.7g/L含硫酸铵的酵母氮基
[0215] 各0.04g/L的组氨酸、色氨酸和腺嘌呤
[0216] 在比较不同启动子调控下酵母-MUC1免疫治疗组合物的初始实验中，在2步骤或3步骤培养中产生CUP1驱动的(可诱导的表达)酵母-MUC1表达；在起始或中间培养物达到对数中期(1.5-4Y.U./ml)之后，从中间培养物最终稀释成0.1或0.2Y.U./mL的培养物，通过添加0.375mM硫酸铜来启动表达并持续直至培养物达到1.5-3Y.U.的密度。TEF2驱动的酵母-MUC1表达是组成性的，且这些细胞的生长持续直至培养物达到1.1至4.0Y.U./ml的密度。然后收获来自每种培养物的细胞，在PBS中清洗并于56℃加热杀伤1小时。
[0217] 在培养物的加热杀伤后，将细胞在PBS中清洗3次。通过TCA沉淀/硝化纤维结合测定法和通过使用抗his标签单克隆抗体和抗MUC1(VNTR)抗体(sc-7313，Santa Cruz)的Western印迹来测量总蛋白质表达。蛋白质含量使用半定量的数字成像方法定量。预期GI-6101将MUC1融合蛋白表达为约25kDa的膜联合蛋白。
[0218] 图2A显示GI-6101中MUC1抗原的表达，其使用抗MUC1(VNTR)和抗His抗体来检测。这些结果显示MUC1蛋白的较好的表达。图2B显示在用EdoH或PNGaseF去糖基化后GI-6101的MUC1抗原。该图显示GI-6101融合蛋白表达为糖基化的产物，因为融合蛋白的大小大于在去糖基化之前评估的，但在通过EdoH或PNGaseF去糖基化后减小至预期的大小(25kDa)。
[0219] 将在标准培养条件下生长的GI-6101中抗原表达的定量与在中性条件下生长的GI-6101相比较，如上文描述的。使用任一过程，抗原表达水平大概相同(数据未显示)，证明中性pH过程不改变该酵母的MUC1抗原表达的水平。实施例2
[0220] 以下实施例描述了称为GI-6104的酵母-MUC1免疫治疗组合物的产生。
[0221] 在本实验中，将酵母(酿酒酵母)工程化为在铜可诱导的启动子CUP1或组成性启动子TEF2的控制下表达人MUC1抗原，产生酵母-MUC1免疫治疗组合物。在每一情况中，包含MUC1抗原的融合蛋白作为单一多肽产生，其具有符合阅读框地从N至C末端融合的以下序列元件，由SEQ ID NO:18代表：SEQ ID NO:18包含以下多种MUC1抗原，其从N至C末端为以下次序：(1)第一MUC1CD(SEQ ID NO:18的位置1-72)；(2)第二MUC1CD(SEQ ID NO:18的位置73-144)；和(3)第三MUC1CD(SEQ ID NO:18的位置145-216)。该融合蛋白还包含设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性和/或稳定表达的N-末端序列(在此融合蛋白中由SEQ ID NO:21代表)。或者，融合蛋白可设计为使用MUC1信号序列(例如SEQ ID NO:14的位置1-30)，其为如本文中描述的另一种合成性N-末端肽，或使用来自酵母alpha前导序列的N-末端肽如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20。包含N-末端肽和6组氨酸C-末端标签(以协助蛋白质的鉴定和/或纯化)的完整的融合蛋白是单一多肽，其具有符合阅读框地从N至C末端融合的以下序列元件(由SEQ ID NO:17代表)：(1)由SEQ ID NO:21代表的合成肽(SEQ ID NO:17的位置1-6)；(2)第一MUC1CD(SEQ ID NO:17的位置7-78)；(3)第二MUC1CD(SEQ ID NO:17的位置79-150)；(4)第三MUC1CD(SEQ ID NO:17的位置151-222)；和(5)6组氨酸标签(SEQ ID NO:17的位置223-228)。SEQ ID NO:17由SEQ ID NO:16代表的核苷酸序列(针对酵母表达优化过密码子)编码。
[0222] 简言之，合成编码MUC1抗原的DNA，然后插入酵母2μm表达载体中CUP1启动子(载体pGI-100)或TEF2启动子(载体plu011)后的EcoRI和NotI克隆位点处。向质粒载体添加编码C-末端6组氨酸肽的核苷酸序列以编码由SEQID NO:17代表的完整融合蛋白。将所得质粒转化到DH5α中用于质粒储存，转化到酿酒酵母W303α中用于产生酵母-MUC1免疫治疗组合物。
[0223] 到酿酒酵母中的转化通过醋酸锂/聚乙二醇转染实施，且在缺少尿嘧啶的固体最小板(UDM；尿苷缺失培养基)上选择初始转染体。通过在30℃在U2(尿苷缺失培养基)或UL2(尿苷和亮氨酸缺失培养基)培养基中生长来选择菌落。
[0224] 所述酵母-MUC1免疫治疗组合物在本文中亦称为GI-6104，其包含在CUP1启动子调控下的编码由SEQ ID NO:17代表的人MUC1融合蛋白的多核苷酸。
[0225] 将缺少尿苷(U2)或缺少尿苷和亮氨酸(UL2)的液体培养物(培养基配方在实施例1中提供)使用上文描述的板和起始培养物接种，并在30℃、250rpm生长约24h。还将含有4.2g/L Bis-Tris的pH缓冲的UL2培养基(BT-UL2)从冷冻酵母库接种以评估在中性pH生产条件下产生的酵母-MUC1免疫治疗物(数据未显示)。在pH缓冲的UL2培养基中培养暴露了酵母细胞壁上的β-葡聚糖且认为改变了酵母诱导的细胞免疫应答，这是改变了与抗原提呈细胞上dectin受体相互作用的结果。其它培养条件不管使用U2、UL2还是BT-UL2均相同。使用原代培养物来接种具有相同配方的最终培养物。
[0226] 在比较不同启动子调控下的酵母-MUC1免疫治疗组合物的初始实验中，在2步骤或3步骤培养中产生CUP1驱动的(可诱导的表达)酵母-MUC1表达；在起始或中间培养物达到对数中期(1.5-4Y.U./ml)之后，从中间培养物稀释成0.1或0.2Y.U./mL的最终培养物，通过添加0.375mM硫酸铜来启动表达并持续直至培养物达到1.5-3Y.U.的密度。CUP1驱动的(可诱导的表达)酵母-MUC1表达也通过在最终酵母-MUC1培养物达到约2Y.U./ml的密度之后添加0.375mM硫酸铜来启动，并诱导4-6小时。TEF2驱动的酵母-MUC1表达是组成性的，且这些细胞的生长持续直至培养物达到1.1至4.0Y.U./ml的密度。然后收获来自每种培养物的细胞，在PBS中清洗并于56℃加热杀伤1小时。
[0227] 在培养物的加热杀伤后，将细胞在PBS中清洗3次。通过TCA沉淀/硝化纤维结合测定法和通过使用抗his标签单克隆抗体和抗MUC1(C末端)抗体(sc-6827，Santa Cruz)的Western印迹来测量总蛋白质表达。蛋白质含量使用半定量的数字成像方法定量。预期GI-6104将MUC1融合蛋白表达为约25kDa的胞质溶胶蛋白。
[0228] 图2C显示GI-6104中MUC1抗原的表达，其使用抗MUC1(C末端)和抗His抗体来检测。这些结果显示MUC1蛋白的较好的表达。图2B显示在用EdoH去糖基化后GI-6104的MUC1抗原。该图显示GI-6104融合蛋白不表达为糖基化产物，因为在用EdoH去糖基化之前和之后融合蛋白的大小相同。
[0229] 将在标准培养条件下生长的GI-6104中抗原表达的定量与在中性条件下生长的GI-6104相比较，如上文描述的。使用任一过程，抗原表达水平大致相同(数据未显示)，证明中性pH过程不改变该酵母的MUC1抗原表达的水平。实施例3
[0230] 以下实施例描述了称为GI-6105的酵母-MUC1免疫治疗组合物的产生。
[0231] 在本实验中，将酵母(酿酒酵母)工程化为在铜可诱导的启动子CUP1的控制下表达人MUC1抗原，产生酵母-MUC1免疫治疗组合物。使用来自GI-6101的酵母-MUC1免疫治疗组合物的抗原(见实施例1)作为模板来设计MUC1激动剂抗原。简言之，包含MUC1激动剂抗原的融合蛋白作为单一多肽产生，其具有符合阅读框地从N至C末端融合的以下序列元件，由SEQ ID NO:23代表：(1)MUC1信号序列(SEQ ID NO:23的位置1-30)；(2)MUC1SEA/ED区段(SEQ ID NO:23的位置31-89)；(3)包含两个VNTR域的VNTR区段(SEQ ID NO:23的位置90-130)；(4)MUC1TM域(SEQ ID NO:23的位置131-158)；(5)MUC1CD(SEQ ID NO:23的位置159-230)；(6)MUC1激动剂表位(SEQ ID NO:23的位置231-246)和(7)6肽组氨酸标签(SEQ ID NO:23的位置247-252)。SEQ ID NO:23由SEQ ID NO:22代表的核苷酸序列(针对酵母表达优化过密码子)编码。MUC1信号序列(SEQ ID NO:23的位置1-30)可用设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性和/或稳定表达的不同N-末端序列取代，如由SEQ ID NO:21代表的肽，或来自酵母alpha前导序列的N-末端肽如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20。6组氨酸C-末端标签是任选的，且有助于蛋白质的鉴定和/或纯化。与GI-6101中的抗原(例如SEQ ID NO:14或15)相比，GI-6105中的序列含有以下氨基酸取代以创建多种激动剂表位(取代位置参照SEQ ID NO:23给出，进一步参照由登录号NP_001191214代表的野生型MUC1中取代的位置)：A96Y(野生型MUC1中的位置161)、P97L(野生型MUC1中的位置
162)、G104V(野生型MUC1中的位置169)、S105Y(野生型MUC1中的位置170)、T106L(野生型MUC1中的位置171)、A147Y(野生型MUC1中的位置392)、C161V(野生型MUC1中的位置
406)、T199L(野生型MUC1中的位置444)、D200F(野生型MUC1中的位置445)、S215Y(野生型MUC1中的位置460)和T239L(野生型MUC1中的位置93)。
162)、G104V(野生型MUC1中的位置169)、S105Y(野生型MUC1中的位置170)、T106L(野生型MUC1中的位置171)、A147Y(野生型MUC1中的位置392)、C161V(野生型MUC1中的位置
406)、T199L(野生型MUC1中的位置444)、D200F(野生型MUC1中的位置445)、S215Y(野生型MUC1中的位置460)和T239L(野生型MUC1中的位置93)。
[0232] 将含有GI-6105的MUC1激动剂抗原(SEQ ID NO:23)的质粒转染到W303α酵母中，并在尿苷缺失琼脂(UDA)上于30℃生长3天后选择转化体。将单一菌落重划线到尿苷和亮氨酸缺失琼脂(ULDA)板上，并在30℃再温育4天来选择具有增加的质粒拷贝数的细胞。
[0233] 从ULDA板取出GI-6105的单个菌落并用于接种25mL的UL2液体培养基(起始培养物)。将起始培养物在30℃伴随摇动温育至3.7YU/mL的密度，然后用于接种中间培养物至0.3YU/mL。中间培养物生长至3.0YU/mL的密度，然后用于接种最终培养物至密度为0.04YU/mL。将最终培养物生长至3.6YU/mL的密度，然后用0.5mM硫酸铜在30℃处理3h以诱导Muc1激动剂v1.0抗原表达。
[0234] 将诱导的细胞用PBS清洗1次，在56℃加热杀伤1h，然后在PBS中清洗3次。通过Amidoschwarz测定法测量热杀伤细胞的总蛋白质含量，并通过western印迹测量抗原含量，其使用识别C-末端6组氨酸表位标签的单克隆抗体。通过对由带his标签的HCV NS3蛋白构成的标准曲线内插来测定抗原量。如图3中显示的，酵母表达该抗原，且经评估GI-6105的抗原含量为约2801Ng/YU。
[0235] 实施例4
[0236] 以下实施例描述了称为GI-6106的酵母-MUC1激动剂免疫治疗组合物的产生。
[0237] 在本实验中，将酵母(酿酒酵母)工程化为在铜可诱导的启动子CUP1的控制下表达人MUC1激动剂抗原，产生酵母-MUC1激动剂免疫治疗组合物。使用具有登录号NP_001191214的全长野生型MUC1抗原来设计MUC1激动剂抗原，尽管也可利用其他野生型MUC1蛋白来设计类似的激动剂。简言之，包含MUC1激动剂抗原的融合蛋白作为单一多肽产生，其具有符合阅读框地从N至C末端融合的以下序列元件，由SEQ ID NO:25代表：(1)本文中别处通过SEQ ID NO:19公开的alpha因子前导序列(SEQ ID NO:25的位置1-89)；(2)Thr-Ser的接头序列(SEQ ID NO:25的位置90-91)；(3)除了引入11个激动剂表位以外对应于野生型蛋白质的全长MUC1激动剂蛋白质(SEQ ID NO:25的位置92-566)和(7)6肽组氨酸标签(SEQ ID NO:25的位置567-572)。SEQ ID NO:25由SEQ ID NO:24代表的核苷酸序列(针对酵母表达优化过密码子)编码。alpha前导序列(SEQ ID NO:25的位置
1-89)可用设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性和/或稳定表达的不同N-末端序列取代，如由SEQ ID NO:21，或来自不同酵母alpha前导序列的N末端肽如SEQ ID NO:20，或MUC1信号序列代表的肽。6组氨酸C-末端标签是任选的，且有助于蛋白质的鉴定和/或纯化。与用作模板的野生型MUC1蛋白相比，GI-6106中的序列含有以下氨基酸取代以创建多种激动剂表位(取代位置参照SEQ ID NO:25给出，进一步参照由登录号NP_001191214代表的野生型MUC1中取代的位置)：T184L(野生型MUC1中的位置93)、A232Y(野生型MUC1中的位置
161)、P233L(野生型MUC1中的位置162)、G240V(野生型MUC1中的位置169)、S241Y(野生型MUC1中的位置170)、T242L(野生型MUC1中的位置171)、A483Y(野生型MUC1中的位置
392)、C497V(野生型MUC1中的位置406)、T535L(野生型MUC1中的位置444)、D536F(野生型MUC1中的位置445)和S551Y(野生型MUC1中的位置460)。
1-89)可用设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性和/或稳定表达的不同N-末端序列取代，如由SEQ ID NO:21，或来自不同酵母alpha前导序列的N末端肽如SEQ ID NO:20，或MUC1信号序列代表的肽。6组氨酸C-末端标签是任选的，且有助于蛋白质的鉴定和/或纯化。与用作模板的野生型MUC1蛋白相比，GI-6106中的序列含有以下氨基酸取代以创建多种激动剂表位(取代位置参照SEQ ID NO:25给出，进一步参照由登录号NP_001191214代表的野生型MUC1中取代的位置)：T184L(野生型MUC1中的位置93)、A232Y(野生型MUC1中的位置
161)、P233L(野生型MUC1中的位置162)、G240V(野生型MUC1中的位置169)、S241Y(野生型MUC1中的位置170)、T242L(野生型MUC1中的位置171)、A483Y(野生型MUC1中的位置
392)、C497V(野生型MUC1中的位置406)、T535L(野生型MUC1中的位置444)、D536F(野生型MUC1中的位置445)和S551Y(野生型MUC1中的位置460)。
[0238] 将含有GI-6106的MUC1激动剂抗原的质粒转染到W303α酵母中，并在尿苷缺失琼脂(UDA)上于30℃生长3天后选择转化体。将单一菌落重划线到尿苷和亮氨酸缺失琼脂(ULDA)板上，并在30℃再温育4天来选择具有增加的质粒拷贝数的细胞。
[0239] 从ULDA板取出GI-6106的单个菌落并用于接种25mL的UL2液体培养基(起始培养物)。将起始培养物在30℃伴随摇动温育至～3YU/mL的密度，然后用于接种中间培养物至0.3YU/mL。中间培养物生长至3YU/mL的密度，然后用于接种最终培养物至0.04YU/mL的密度。将最终培养物生长至3YU/mL的密度，然后用0.5mM硫酸铜在30℃处理3h以诱导Muc1激动剂v2.0抗原表达。
[0240] 将诱导的细胞用PBS清洗1次，在56℃加热杀伤1h，然后在PBS中清洗3次。通过Amidoschwarz测定法测量热杀伤细胞的总蛋白质含量，并通过western印迹测量激动剂抗原含量，其使用识别C-末端6组氨酸表位标签的单克隆抗体。通过对由带his标签的HCV NS3蛋白构成的标准曲线内插来测定抗原量。结果显示，GI-6106酵母表达抗原(数据未显示)；经评估GI-6106的抗原含量为约2940Ng/YU。
[0241] 实施例5
[0242] 以下实施例描述了酵母-MUC1免疫治疗组合物对人树突细胞影响的表型和功能分析。
[0243] 为了评估实施例1和2中描述的酵母-MUC1免疫治疗组合物对树突细胞表型和功能的影响，实施以下实验。
[0244] 在第一项实验中，将人树突细胞(DC)与以下培养48小时：(1)仅培养基(未处理)，(2)CD40L(1μg/ml)加上配体的增强剂(1μg/ml)作为阳性对照；(3)对照酵母(对照酵母；包含空载体(无MUC1抗原插入)的酵母)；(4)称为GI-6101的酵母-MUC1免疫治疗组合物，在如实施例1中描述的标准生长条件下生长(GI-6101)；(5)称为GI-6101的酵母-MUC1免疫治疗组合物，在如实施例1中描述的中性pH生长条件下生长(GI-6101(DEC))；(6)称为GI-6104(GI-6104)的酵母-MUC1免疫治疗组合物，在如实施例2中描述的标准生长条件下生长；或(7)称为GI-6104的酵母-MUC1免疫治疗组合物，在如实施例2中描述的中性pH生长条件下生长(GI-6104(DEC))。树突细胞和酵母以1:10(DC:
酵母)的比率混合。收获DC并通过流式细胞术分析DC表面标志物表达。结果在下表1中显示为阳性细胞的百分比和MFI(括号)。
酵母)的比率混合。收获DC并通过流式细胞术分析DC表面标志物表达。结果在下表1中显示为阳性细胞的百分比和MFI(括号)。
[0245] 表1
[0246]
[0247] 结果显示，与未处理细胞的相比，不管哪种生长方式的酵母(对照酵母和表达MUC1抗原的酵母)均上调树突细胞上CD80和CD83的表达。CD80，或B7.1是T细胞活化和存活所需的共刺激分子，其在活化的树突细胞上上调。CD83是树突细胞成熟的标志。因此，该实验显示酵母-MUC1免疫治疗组合物能上调DC成熟标志。
[0248] 在第二项实验中，在与酵母-MUC1免疫治疗物培养后评估树突细胞的细胞因子和趋化因子的产生。简言之，将来自正常供体(认为没有癌症的供体)的人DC与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)一起培养5天，或用CD40L(1μg/ml，Enzo Life Sciences)加上配体的增强剂(1μg/ml，Enzo Life Sciences)处理24小时，或用对照酵母(空载体)、在标准生长条件下培养的GI-6101(GI-6101)、在中性pH条件下培养的GI-6101(GI-6101(DEC))、在标准生长条件下培养的GI-6104(GI-6104)、或在中性pH条件下培养的GI-6104(GI-6104(DEC))处理48小时(DC:酵母比=1:10)。收集培养的上清并通过多重细胞因子/趋化因子试剂盒筛选细胞因子和趋化因子的产生。结果表示为pg/ml，且显示在表2中。
[0249] 表2
[0250]
[0251] 表2中的结果显示，将来自正常供体的树突细胞用实施例1和2中描述的酵母-MUC1免疫治疗组合物处理增加了这些细胞的细胞因子和趋化因子的产生。特别是，干扰素-γ(IFN-γ)的产生在暴露于中性pH条件下生长的酵母-MUC1免疫治疗组合物(预期其增强TH1和CD8+T细胞应答)后增加。另外，在中性pH条件下生长的酵母-MUC1免疫治疗组合物诱导DC的更高水平的细胞因子和趋化因子的产生，其中称为GI-6101的酵母-MUC1免疫治疗组合物(中性pH)显示对DC细胞因子和趋化因子的产生的最高刺激。粗体突出显示的数字显示比未处理的对照有统计学显著改进的细胞因子/趋化因子的产生(数据未显示)。
[0252] 使用从另一正常供体分离的树突细胞重复表2的实验。结果(数据未显示)与表2中显示的那些可比，且确认了酵母-MUC1免疫治疗组合物诱导树突细胞的细胞因子和趋化因子的产生，且在每种条件下生长的两种酵母-MUC1组合物中，在中性pH生长条件下生长的称为GI-6101的酵母-MUC1组合物诱导树突细胞的最高水平的细胞因子和趋化因子的产生。
[0253] 总之，这些结果显示酵母-MUC1免疫治疗组合物能活化树突细胞并诱导与生产性免疫应答有关的细胞因子和趋化因子产生。
[0254] 实施例6
[0255] 以下实施例显示本发明的酵母-MUC1免疫治疗组合物能活化MUC1特异性T细胞。
[0256] T-3-P93L是一种在HLA-A2的背景中特异性识别MUC1激动剂肽(称为P93L)的MUC-1特异性T细胞系。P93L是跨越全长MUC1蛋白的位置92-101的肽(例如ATWGQDVTSV；SEQ ID NO:11的位置92-101)，只不过该肽位置2(SEQ ID NO:11位置92-101中的位置93)的苏氨酸被亮氨酸取代，从而创建了激动剂肽。P93L以比天然(野生型)肽更高的水平结合HLA-A2，而且是比天然肽更好的MUC1特异性T细胞的诱导物(更高的TH1细胞因子产生水平(参见美国专利申请公开文本No.2008/0063653))。T细胞系T-3-P93L能在体外特异性地裂解HLA-A2阳性、MUC1阳性的肿瘤靶物(数据未显示)。此T细胞系对于MUC1-N亚基内的一部分MUC1为特异性的。
[0257] 在本实验中，将如实施例5所述制备的来自正常供体的DC用实施例1和2中描述的酵母-免疫治疗组合物、或用对照酵母(空载体)、CD40L(阳性对照)或未处理(阴性对照)使用上文实施例5中描述的条件处理。经对照酵母或CD40L处理的DC在有或无P93L肽(以10μg/ml使用P93L)的情况下被脉冲。然后，将经处理的DC用作抗原提呈细胞(APC)来评估其刺激MUC1特异性T细胞系T-3-P93L(T细胞:DC比=10:1)的能力。收集24小时培养上清并筛选干扰素-γ(IFN-γ)的分泌。结果显示于表3，表示为由T细胞产生的IFN-γ的量，以pg/ml计。
[0258] 表3
[0259]
[0260]
[0261] 结果显示用在标准和中性pH条件下产生且表达MUC1-N亚基的VNTR域的GI-6101处理的树突细胞能刺激MUC1-N特异性T细胞产生显著量的IFN-γ。不表达来自MUC1-N蛋白的抗原的GI-6104(GI-6104仅表达来自细胞质域(CD)的MUC1抗原)不刺激MUC1-N特异性T细胞。
[0262] 在第二项实验中，将称为T-15-P1240(1Y)的MUC1-C特异性T细胞系用已经过上文实验处理的DC刺激来测定本发明的酵母-MUC1免疫治疗组合物是否能刺激这些T细胞。T-15-P1240(1Y)细胞系是一种在HLA-A2的背景中特异性识别MUC1激动剂肽(称为P1240(1Y)，为MUC1-C肽)的MUC-1特异性T细胞系。P1240(1Y)是跨越全长MUC1蛋白的位置1240-1248的肽(例如SLSYTNPAV；SEQ ID NO:11的位置1240-1248)，只不过该肽位置1(SEQ ID NO:11位置1240-1248中的位置1240)的丝氨酸被赖氨酸取代，从而创建了激动剂肽。P1240(1Y)与天然(野生型)肽一样好或更好地结合HLA-A2，而且是比天然肽更好的MUC1特异性T细胞的诱导物(更高的TH1细胞因子产生水平)。T细胞系T-15-P1240(1Y)能在体外特异性地裂解HLA-A2阳性、MUC1阳性的肿瘤靶物(数据未显示)。此T细胞系对于MUC1-C亚基内的一部分MUC1，具体即细胞质域(CD)为特异性的。
[0263] 在本实验中，DC自健康的HLA-A2阳性供体的PBMC生成，并如实施例5中所述制备。将DC用实施例1和2中描述的酵母-免疫治疗组合物，或用CD40L(阳性对照)使用上文实施例5中描述的条件处理或未处理(阴性对照)。经CD40L处理的DC在有或无P1240(1Y)肽(以10μg/ml使用该肽)的情况下被脉冲。然后，将经处理的DC用作抗原提呈细胞(APC)来评估其刺激MUC1特异性T细胞系T-15-P1240(1Y)(T细胞:DC比=10:1)的能力。收集24小时培养上清并筛选干扰素-γ(IFN-γ)的分泌。结果显示于表4，表示为由T细胞产生的IFN-γ的量，以pg/ml计。
[0264] 表4
[0265]
[0266] 结果显示，在标准或中性pH条件下生长的GI-6101和GI-6104均能刺激MUC1-C特异性T细胞产生显著量的IFN-γ。在中性pH条件下生长的酵母-MUC1免疫治疗组合物(GI-6101和GI-6104两者)比在标准条件下生长的酵母-MUC1免疫治疗组合物刺激T细胞产生更高水平的IFN-γ。
[0267] 在第三项实验中，重复上表4中描述的实验，但对于用酵母-MUC1免疫治疗组合物GI-6101和GI-6104处理的DC使用不同的DC:T细胞比。结果呈现于下表5中。
[0268] 表5
[0269]
[0270]
[0271] 结果再次显示，在标准或中性pH条件下生长的GI-6101和GI-6104均能刺激MUC1-C特异性T细胞产生显著量的IFN-γ，且在中性pH条件下生长的组合物比在标准条件下生长的酵母-MUC1免疫治疗组合物刺激T细胞产生更高水平的IFN-γ。结果还显示随着DC数目相对于T细胞数而言增加时的剂量应答。
[0272] 总之，这些结果显示酵母-MUC1免疫治疗组合物能以抗原特异性方式活化MUC1特异性T细胞，如经酵母-MUC1免疫治疗组合物处理的DC所刺激的T细胞的IFN-γ释放所例示的。这些结果还显示因在中性pH条件下生长的酵母-MUC1免疫治疗组合物而导致的在对T细胞的IFN-γ生成方面的优点。
[0273] 实施例7
[0274] 以下实施例显示本发明的酵母-MUC1组合物能扩增并刺激来自癌症患者的MUC1特异性T细胞。
[0275] 在本实验中，从癌症患者(用可包括化疗或病毒疫苗治疗在内的癌症疗法治疗后，和/或治疗前)的PBMC制备DC。在GM-CSF和IL-4存在下以5天培养来制备DC，接着在存在酵母(GI-6101和/或GI-6104，在标准或中性pH条件下培养)的情况下温育。在48小时共培养后，将DC用作APC来刺激自体T细胞，测量CD4+T细胞的细胞因子产生和/或增殖。预期酵母-MUC1免疫治疗组合物扩增并活化来自癌症患者的T细胞。
[0276] 在第二项实验中，从癌症患者(用可包括化疗或病毒疫苗治疗在内的癌症疗法治疗后，和/或治疗前)的PBMC制备DC。在GM-CSF和IL-4存在下以5天培养来制备DC，接着在存在酵母(GI-6101和/或GI-6104，在标准或中性pH条件下培养)的情况下温育。在48小时共培养后，将DC用作APC来刺激自体T细胞。每轮IVS组成为在缺乏IL-2的情况下3天，接着在存在20U/ml重组IL-2的情况下再4天。将特异于MUC1肽的四聚体用于检测通过用酵母-MUC1免疫治疗组合物处理而扩增的CD8+T细胞的百分数。预期酵母-MUC1免疫治疗组合物扩增并活化来自癌症患者的T细胞。
[0277] 在第三项实验中，将酵母-MUC1免疫治疗组合物用于生成能裂解MUC1表达型靶物的来自PBMC的MUC1特异性CTL。在本实验中，体外扩增来自正常供体和/或癌症患者(用可包括化疗或病毒疫苗治疗在内的癌症疗法治疗后，和/或治疗前)的MUC1特异性T细胞，其使用与酵母-MUC1免疫治疗组合物(GI-6101或GI-6104)温育的DC进行2轮体外刺激+(IVS)。在第5天，分离CD8T细胞并用于针对表达MUC1的肿瘤细胞的过夜CTL测定法。预期这些实验证明酵母-MUC1免疫治疗组合物能生成能够杀死表达MUC1的肿瘤细胞的MUC1特异性CTL。
[0278] 实施例8
[0279] 以下实施例证明用酵母-MUC1免疫治疗组合物免疫减少体内表达MUC1的肿瘤。
[0280] 在本实验中，小鼠经由尾部静脉接受表达重组人MUC1蛋白的肿瘤细胞(第0天)。在肿瘤植入后4天，动物接受使用酵母对照(YVEC，或空载体酵母)对酵母-MUC1(GI-6101或GI-6104)的每周疫苗接种，以每部位1YU的剂量在4个不同部位施用(每剂共4YU)。在肿瘤移植后40天时，杀死动物并评估肺肿瘤小结的数目。与仅接受酵母(无MUC1抗原)的小鼠相比，预期酵母-MUC1免疫治疗组合物能减少小鼠中的表达MUC1的肿瘤。
[0281] 实施例9
[0282] 以下实施例描述了在患有MUC1阳性癌症的受试者中的1期临床试验。
[0283] 运行一项开放标签的剂量扩大的1期临床试验，其使用实施例1中描述的称为GI-6101的酵母-MUC1免疫治疗组合物或实施例2中描述的GI-6104(在标准生长条件或中性pH条件下生长)。对患有MUC1阳性肿瘤的12-24名受试者以连续剂量分组扩大方案施用酵母-MUC1免疫治疗组合物，利用4Y.U.(1Y.U.x4部位)、16Y.U.(4Y.U x4部位)和40Y.U.(10Y.U.x4部位)的剂量范围，皮下施用。酵母-MUC1免疫治疗以2周间期施用3个月，然后每月施用。选择在最大耐受剂量(MTD)或观察到的最佳剂量的扩大患者分组(n=10)用于另外的研究。结果监测安全性为主要终点，抗原特异性T细胞应答(例如在治疗时显+现或扩增的MUC1特异性CD8T细胞)以及临床活性为次要终点。
[0284] 预期GI-6101和GI-6104是安全和较好耐受的，无显著毒性。另外，预期GI-6101或GI-6104在统计学显著的患者数中产生治疗显现的MUC1特异性T细胞应答或之前存在的MUC1特异性基线T细胞应答中的改进。还预期一些患者疾病稳定化。
[0285] 实施例10
[0286] 以下实施例描述了使用酵母-MUC1免疫治疗组合物的临床试验(P1/P2)。
[0287] 在～70%的急性髓细胞样白血病(AML)病例中观察到增加的MUC1表达，表明升高的MUC1水平可能牵涉调节不成熟的白血病区室的增殖潜力。
[0288] 在第一项临床试验中，在MUC1阳性AML背景中执行称为GI-6101的基于酵母的免疫治疗产品(见实施例1)的一线使用(该临床设计也适用于其他酵母-MUC1免疫治疗组合物如GI-6104)。GI-6101的使用设计为补充已有的护理方案阿糖胞苷和蒽环类抗生素(例如道诺霉素(daunorubicin))的细胞毒性标准，其为通过促进对MUC1阳性白血病细胞的免疫杀伤以及消除能逃脱末端分化(细胞凋亡)途径的MUC1白血病细胞进行的附加办法。终点包括缓解诱导中的改进以及总体存活(移植前和移植后)。
[0289] 在第二项试验中，将GI-6101用于骨髓移植(BMT)背景来预防患有MUC1阳性疾病的患者中AML的复发(该试验设计也适用于其他酵母-MUC1免疫治疗组合物如GI-6104)。使用评估移植后时间段内骨髓供体(过继性转移)的疫苗接种和/或骨髓受体的疫苗接种的临床策略来降低BMT后的复发率。
[0290] (A)用GI-6101加阿糖胞苷和道诺霉素相对于单独的标准护理进行MUC1阳性AML患者的一线治疗的临床研究设计
[0291] 患者接受诱导化疗，其由每天以100-200mg/m2连续静脉内输注阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)达7天，加上在阿糖胞苷疗法的第1、2和3天45mg/m2的静脉内道诺霉素(或daunomycin cerubidine)，或公认的该方案的变体，继之以在完成化疗的诱导周期后GI-6101(或安慰剂)施用14天。然后，在再诱导疗法后14天或化疗的每个随后的巩固周期后14天施用GI-6101(或安慰剂)。在诱导、再诱导和巩固疗法后，每月施用GI-6101(或安慰剂)长达3年，主要目标是预防缓解的复发。
[0292] 预期GI-6101的使用增强了患者中缓解的复发，如相比于接受安慰剂的那些患者的。
[0293] (B)用GI-6101相对于安慰剂对MUC1阳性AML的BMT后治疗的临床研究设计
[0294] 对于需要清髓性(myelo-ablative)疗法继之以骨髓移植的MUC1阳性AML患者，在捐献骨髓之前7-14天对骨髓供体施用GI-6101(或安慰剂)，且在骨髓移植发生后在每月基础上对骨髓受体施用GI-6101(或安慰剂)长达3年。主要目标是降低AML的复发率。
[0295] 预期GI-6101的使用降低AML患者中的复发率，如相比于施用安慰剂的那些患者的。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 重定向T细胞以治疗HIV感染的方法 | 2020-05-20 | 157 |
| 新型高亲和性肿瘤杀伤细胞(T-AK细胞)制剂 | 2020-05-21 | 221 |
| 一种CD40联合PD-L及细胞因子扩增PBMC的方法 | 2020-05-21 | 926 |
| 用于过继细胞治疗的工程改造的细胞 | 2020-05-11 | 445 |
| 用于过继细胞疗法的肿瘤浸润淋巴细胞 | 2020-05-20 | 709 |
| 作为早期治疗选择的过继细胞疗法 | 2020-05-11 | 743 |
| 分离、培养和遗传工程改造用于过继治疗的免疫细胞群的方法 | 2020-05-13 | 857 |
| 个性化癌症疫苗和过继免疫细胞治疗 | 2020-05-12 | 81 |
| 使用精氨酸耗竭剂的组合癌症免疫疗法 | 2020-05-18 | 964 |
| 过继细胞转移与溶瘤病毒组合疗法 | 2020-05-17 | 45 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈