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一种自体外周血淋巴细胞的培养方法

阅读：568发布：2020-05-23

专利汇可以提供一种自体外周血淋巴细胞的培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，具体包括以下步骤：(1)从外周血中分离外周血单个核细胞加入适量无血清细胞培养液中，并加入浓度为1000-2000U/ml的干扰素-γ，置于培养箱静置培养3天；(2)将步骤(1)中培养的单个核细胞转移至含细胞表面分子3单克隆抗体与细胞表面分子16单克隆抗体的培养瓶中，并加入浓度为1000-2000U/ml的干扰素-2，静置培养3天；(3)往步骤(2)中补加500-1000mL的细胞培养液，加入1000-2000U/ml的干扰素-2，静置培养3天；(4)往步骤(3)中继续补加500-1000mL的细胞培养液，置于培养箱静置培养3天，重复此步骤2-3次，制得自体外周淋巴细胞。本发明可以培养高扩增率以及高活性的CIK细胞，进而很好的应用至抗肿瘤过继细胞免疫治疗中。，下面是一种自体外周血淋巴细胞的培养方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)首先，从外周血中分离外周血单个核细胞，然后，按照密度1×106加入适量无血清细胞培养液中，并加入浓度为1000-2000U/ml的干扰素-γ，置于培养箱静置培养3天，得到初次培养液；
(2)首先，将细胞表面分子3单克隆抗体与细胞表面分子16单克隆抗体进行预先包被，然后将步骤(1)中培养的单个核细胞转移至含细胞表面分子3单克隆抗体与细胞表面分子
16单克隆抗体的培养瓶中，等倍补加无血清细胞培养液，并加入浓度为1000-2000U/ml的干扰素-2，置于培养箱静置培养3天，得到二次培养液；
(3)首先，将步骤(2)所得二次培养液补加500-1000mL的细胞培养液，然后加入1000-
2000U/ml的干扰素-2，置于培养箱静置培养3天，制得三次培养液；
(4)首先，将步骤(3)所得三次培养液继续补加500-1000mL的细胞培养液，置于培养箱静置培养3天，重复此步骤2-3次，制得自体外周淋巴细胞。
2.如权利要求1所述的一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中外周血的分离方法为：首先，将采集的每50mL外周血加入5IU肝素钠后与新鲜抗凝血
10mL与Hanks液1:1混匀的混合液混合后，置于转速为1800r/min的低速台式离心机离心
15min，然后，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，最后，经洗涤液洗涤2次后，按每毫升血液标本加0.2mL含20％小牛血清的Hank′s液重新混悬细胞37℃、5％CO2孵育箱中培养2h后去除上清，得到贴壁的单核细胞。
3.如权利要求1所述的一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：步骤(1)-(4)中静置培养的条件为温度37℃、相对湿度为100％、CO2含量为5％的CO2培养箱内培养。
4.如权利要求1所述的一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中的无血清培养液添加有以下组分：10％自体血浆、干扰素-γ，1000-2000U/ml、植物凝集素P，500～1000ng、白细胞介素1α、100～200U。
5.如权利要求2所述的一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中细胞表面分子3单克隆抗体添加量为50-100ng，细胞表面分子16单克隆抗体添加量为
50-100ng。
6.如权利要求4所述的一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中制得的自体外周淋巴细胞离心后经洗涤去除培养液后，重悬于保存液中。

说明书全文

一种自体外周血淋巴细胞的培养方法

技术领域

[0001] 发明涉及淋巴细胞体外培养技术领域，具体为一种自体外周血淋巴细胞的培养方法。

背景技术

[0002] 过继性免疫疗法是将致敏淋巴细胞(具有特异免疫力)或其产物输给细胞免疫功能低下者(如肿瘤病人)，使其获得抗肿瘤免疫力，它是用来治疗肿瘤的一种免疫疗法，而CIK是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，对于CIK细胞的良好应用被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案

[0003] 但是，目前对于CIK细胞的体外培养技术存在扩增效率较低，对于癌细胞致死能力较差，主要由于多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等的种类以及剂量，甚至多种细胞因子之间的相互影响，进而对于制得的CIK细胞活性有所影响，进而使得CIK细胞无法很好的应用至抗肿瘤过继细胞免疫治疗中去，为此，我们提出了一种自体外周血淋巴细胞的培养方法。

发明内容

[0004] 发明的目的在于提供一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

[0005] 为实现上述目的，发明提供如下技术方案：一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，具体包括以下步骤：

[0006] (1)首先，从外周血中分离外周血单个核细胞，然后，按照密度1×106加入适量无血清细胞培养液中，并加入浓度为1000-2000U/ml的干扰素-γ，置于培养箱静置培养3天，得到初次培养液；

[0007] (2)首先，将细胞表面分子3单克隆抗体与细胞表面分子16单克隆抗体进行预先包被，然后将步骤(1)中培养的单个核细胞转移至含细胞表面分子3单克隆抗体与细胞表面分子16单克隆抗体的培养瓶中，等倍补加无血清细胞培养液，并加入浓度为1000-2000U/ml的干扰素-2，置于培养箱静置培养3天，得到二次培养液；

[0008] (3)首先，将步骤(2)所得二次培养液补加500-1000mL的细胞培养液，然后加入1000-2000U/ml的干扰素-2，置于培养箱静置培养3天，制得三次培养液；

[0009] (4)首先，将步骤(3)所得三次培养液继续补加500-1000mL的细胞培养液，置于培养箱静置培养3天，重复此步骤2-3次，制得自体外周淋巴细胞。

[0010] 优选的，所述步骤(1)中外周血的分离方法为：首先，将采集的每50mL外周血加入5IU肝素钠后与新鲜抗凝血10mL与Hanks液1:1混匀的混合液混合后，置于转速为1800r/min的低速台式离心机离心15min，然后，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，最后，经洗涤液洗涤2次后，按每毫升血液标本加0.2mL含20％小牛血清的Hank′s液重新混悬细胞37℃、5％CO2孵育箱中培养2h后去除上清，得到贴壁的单核细胞。

[0011] 优选的，步骤(1)-(4)中静置培养的条件为温度37℃、相对湿度为100％、CO2含量为5％的CO2培养箱内培养。

[0012] 优选的，所述步骤(1)中的无血清培养液添加有以下组分：10％自体血浆，干扰素-γ，1000-2000U/ml、植物凝集素P，500～1000ng、白细胞介素1α，100～200U。

[0013] 优选的，所述步骤(2)中细胞表面分子3单克隆抗体添加量为50-100ng，细胞表面分子16单克隆抗体添加量为50-100ng。

[0014] 优选的，所述步骤(4)中制得的自体外周淋巴细胞离心后经洗涤去除培养液后，重悬于保存液中。

[0015] 与现有技术相比，发明的有益效果是：

[0016] 1、该自体外周血淋巴细胞的培养方法，从外周血中提取外周血单个核细胞并以传统的CIK细胞培养方法为基础，改进添加细胞因子的种类以及剂量，进而制得具有高扩增率以及高活性的CIK细胞，进而很好的应用至抗肿瘤过继细胞免疫治疗中；

[0017] 2、该自体外周血淋巴细胞的培养方法，培养过程中采用无血清培养液，排出动物血清携带的外援病毒等其它的干扰因素，不会对CIK细胞体外扩增过程造成影响，保证CIK细胞的质量；

具体实施方式

[0018] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0019] 实施例一：发明提供一种技术方案：一种分离提取外周血单个核细胞的方法，具体包括以下步骤：首先，将采集的每50mL外周血加入5IU肝素钠后与新鲜抗凝血10mL与Hanks液1:1混匀的混合液混合后，置于转速为1800r/min的低速台式离心机离心15min，然后，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，最后，经洗涤液洗涤2次后，按每毫升血液标本加0.2mL含20％小牛血清的Hank′s液重新混悬细胞37℃、5％CO2孵育箱中培养2h后去除上清，得到贴壁的单核细胞。

[0020] 实施例二：

[0021] 发明提供一种技术方案：一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，具体包括以下步骤：

[0022] (1)首先，按照实施例一中的一种分离提取外周血单个核细胞的方法从100mL的外6
周血中分离外周血单个核细胞，然后，按照密度1×10加入适量含有10％自体血浆、植物凝集素P，500ng、白细胞介素1α，100U的无血清细胞培养液中，并加入浓度为的干扰素-γ，置于温度37℃、相对湿度为100％、CO2含量为5％的CO2培养箱内培养培养3天，得到初次培养液；

[0023] (2)首先，将50ng细胞表面分子3单克隆抗体与50ng细胞表面分子16单克隆抗体进行预先包被，然后将步骤(1)中培养的单个核细胞转移至含50ng细胞表面分子3单克隆抗体与50ng细胞表面分子16单克隆抗体的培养瓶中，等倍补加无血清细胞培养液，并加入浓度为1000U/ml的干扰素-2，置于温度37℃、相对湿度为100％、CO2含量为5％的CO2培养箱内静置培养培养3天，得到二次培养液；

[0024] (3)首先，将步骤(2)所得二次培养液补加500mL的细胞培养液，然后加入1000U/ml的干扰素-2，置于温度37℃、相对湿度为100％、CO2含量为5％的CO2培养箱内培养静置培养3天，制得三次培养液；

[0025] (4)首先，将步骤(3)所得三次培养液继续补加500mL的细胞培养液，置于置于温度37℃、相对湿度为100％、CO2含量为5％的CO2培养箱内静置培养3天，重复此步骤3次，制得自体外周淋巴细胞；

[0026] (5)2周后，将步骤(4)中制得的自体外周淋巴细胞离心后经洗涤去除培养液后，重悬于保存液中。

[0027] 实施例二：

[0028] 发明提供一种技术方案：一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，具体包括以下步骤：

[0029] (1)首先，按照实施例一中的一种分离提取外周血单个核细胞的方法从100mL的外周血中分离外周血单个核细胞，然后，按照密度1×106加入适量含有10％自体血浆、植物凝集素P，1000ng、白细胞介素1α，200U的无血清细胞培养液中，并加入浓度为的干扰素-γ，置于温度37℃、相对湿度为100％、CO2含量为5％的CO2培养箱内培养培养3天，得到初次培养液；

[0030] (2)首先，将100ng细胞表面分子3单克隆抗体与100ng细胞表面分子16单克隆抗体进行预先包被，然后将步骤(1)中培养的单个核细胞转移至含100ng细胞表面分子3单克隆抗体与100ng细胞表面分子16单克隆抗体的培养瓶中，等倍补加无血清细胞培养液，并加入浓度为2000U/ml的干扰素-2，置于温度37℃、相对湿度为100％、CO2含量为5％的CO2培养箱内静置培养培养3天，得到二次培养液；

[0031] (3)首先，将步骤(2)所得二次培养液补加1000mL的细胞培养液，然后加入2000U/ml的干扰素-2，置于温度37℃、相对湿度为100％、CO2含量为5％的CO2培养箱内培养静置培养3天，制得三次培养液；

[0032] (4)首先，将步骤(3)所得三次培养液继续补加1000mL的细胞培养液，置于置于温度37℃、相对湿度为100％、CO2含量为5％的CO2培养箱内静置培养3天，重复此步骤3次，制得自体外周淋巴细胞；

[0033] (5)2周后，将步骤(4)中制得的自体外周淋巴细胞离心后经洗涤去除培养液后，重悬于保存液中。

[0034] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

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