一种培养淋巴结内自体CIK细胞的方法及其用途
阅读：502发布：2020-05-24
专利汇可以提供一种培养淋巴结内自体CIK细胞的方法及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属 生物 技术、 微生物 动物细胞系领域，具体涉及一种培养淋巴结内自体CIK细胞的方法及其用途。本发明对 肺 癌患者手术所取得的离体的淋巴结组织进行分离培养获得CIK细胞，将其与离体的外周 血培养 获得的CIK细胞进行比较，观察其生物学特性及对肺腺癌细胞的细胞毒作用，结果表明，离体的手术患者的淋巴结组织完全可以用于CIK培养，其体外杀瘤细胞活性强大，其活性及抑癌作用优于外周血的CIK细胞。本发明所诱导扩增的CIK细胞可用于制备抑制肺腺癌瘤制品，以及与 化疗药物 制成复合物，用于肺癌术后患者的过继性免疫干预，将有利于减低肺癌术后患者复发转移的发生率。，下面是一种培养淋巴结内自体CIK细胞的方法及其用途专利的具体信息内容。
1.一种培养淋巴结内自体CIK细胞的方法，其特征在于，其包括步骤：
1)标本处理
将获取的离体的外周血加入0.9％氯化钠溶液稀释，加入Ficoll液，分离，离心，取外周血单个核细胞层静置培养箱2h后，用悬浮细胞制备CIK细胞；
将患者手术离体的纵隔淋巴结组织，剪碎，剔除脂肪组织及各种纤维成分，经碾磨、
0.9％氯化钠溶液洗涤重悬后，过滤后收集细胞，静置细胞培养箱中培养2h后，收集悬浮细胞并制备CIK细胞；
2)诱导扩增CIK细胞：
将收集获得的外周血单个核细胞和淋巴组织中收集获得的细胞，用含INF-γ和2％自体血清的X-VIVOTM15培养液，在温度为37℃含CO2为5％的培养箱中培养24h；将CD3单克隆抗体、rhIL-2加入培养液中，隔天补充营养因子INF-γ和rhIL-2，培养10天，继续培养细胞至第14天时，收集CIK细胞，使细胞悬浮于生理盐水中，16-20℃下保存；并取两组细胞标记CD3、CD4、CD8、CD16CD56、EpCAM、内毒素的流式抗体，流式上样分析；
3)检测淋巴结组及外周血组CIK细胞表型；
4)用CCK8显色法检测淋巴结组及外周血组CIK细胞对A549细胞株的抗增殖作用；
5)倒置显微镜观察所述两组CIK细胞的形态；
6)不同效靶比较淋巴结组和外周血组的CIK细胞对A549细胞的抑制率。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的离体的纵隔淋巴结组织经石蜡切片染色病理证实无肿瘤细胞转移。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的患者为肺癌患者。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导扩增的CIK细胞在用于制备抑制肺腺癌瘤制品中的用途。
5.按权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的淋巴结组织体外培养获得的CIK细胞抑制肺腺癌细胞株A549的增殖，和杀伤肺腺癌细胞株A549的活性。
6.一种过继性免疫干预的药物复合物，其特征在于，其包括治疗有效量的肺癌患者术后离体的淋巴结所培养的自体CIK细胞和化疗药物。
7.按权利要求6所述的药物复合物，其特征在于，所述的化疗药物选自长春瑞宾联合卡铂方案，其中，NC：民诺宾25mg/m2,d1d8+铂尔定AUC＝5,d1。
一种培养淋巴结内自体CIK细胞的方法及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 据文献报道，肺癌的发病率、死亡率之高居所有恶性肿瘤的首位，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80％，其表现为高发生率、高死亡率、低生存率。目前有关的手术治疗、放疗、化疗等干预措施虽在不断地改进，但肺癌患者的总体生存率并无明显改善，5年生存率不足15％；其中，标准的化疗及放疗虽然可以在一定程度上杀死肿瘤细胞，但其毒性严重，易引起肿瘤患者免疫力低下状态持续存在；而肺癌细胞的免疫原性差，又进一步增加了肿瘤的免疫逃逸，导致肺癌患者的进一步治疗严重受阻。因此，本领域有关技术人员在不断探索新的肺癌治疗手段，提出提高机体免疫力，建立有效的免疫应答将可能是肺癌治疗的一种有效途径，其中所涉及的过继性免疫治疗可在没有损伤机体免疫系统结构和功能的前提下，直接杀伤肿瘤细胞，并且调节和增强机体的免疫功能，如，Schmidt-Wolf等1991年首次报道的细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)因其在体内外展现出来的强大抗肿瘤活性而备受关注,迅速成为肿瘤免疫治疗的前沿和热点。到目前为止，CIK细胞用于治疗肝癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、肾细胞癌及各类白血病等均取得良好效果；在肺癌治疗方面，Kim，Lin，Wang S等人的研究证据表明外周血培养的CIK细胞自体回输是治疗晚期肺癌良好的过继免疫疗法，可延长患者生存期，改善患者的生活状况，且未见明显的毒副作用，
[0003] 众多研究表明，细胞因子诱导的杀伤细胞又称做NK细胞样T淋巴细胞，其拥有T-NK细胞表型及MHC非限制性杀瘤能力，CIK细胞对于各种实体肿瘤，包括一些耐药细胞的细胞毒作用主要来源于CD3+CD56+T细胞群，CD3+CD56+T细胞比例越高，其杀瘤能力越强。
[0004] 目前，用于研究治疗晚期肺癌的过继免疫疗法的CIK细胞多为来源于外周血培养，然而，由于肺癌患者本身免疫防御能力就低下，尤其对于刚术后的病人，抽取至少50毫升外周血的做法则可能加重病人术后恢复负担，因此，在依从性方面具有一定难度；此外，对于化疗后的病人，由于化疗造成免疫细胞数量及功能的损伤，导致用外周血很难培养出达标数量及高质量的CIK细胞。迄今为止，尚未见有关肺癌手术患者离体的淋巴结组织培养得到CIK细胞并用于过继性免疫干预中的相关研究报道。
[0005] 基于此，本申请的发明人拟提供一种培养淋巴结内自体CIK细胞的方法，进一步，培养的CIK细胞可用于后续的生物免疫干预措施中，因此，本方法能在一定程度上解决患者依从性问题并有助于患者术后快速恢复。
[0006] 与本发明相关的现有技术有：
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发明内容
[0029] 本发明对所取得的肺癌患者手术后的离体的淋巴结组织进行分离培养获得CIK细胞，将其与离体的外周血培养获得的CIK细胞进行比较，观察其生物学特性及对肺腺癌细胞的细胞毒作用，结果表明，离体的患者手术后的淋巴结组织可以用于CIK培养，且培养的CIK细胞其体外抗肿瘤增殖能力强大。
[0030] 具体而言，本发明的一种培养淋巴结内自体CIK细胞的方法，其特征在于，其包括步骤：
[0031] 1)标本处理
[0035] 2)诱导扩增CIK细胞：
[0036] 用INF-γ和2％的自体血清配置所需培养基，在温度为37℃含CO2为5％的培养箱中培养24h；将CD3单克隆抗体、重组人IL-2加入培养基中，隔天补充营养因子，培养10天；培养第14d后，流式细胞仪监测CD3、CD4、CD8、CD16CD56、EpCAM、内毒素；第14d收集CIK细胞，使细胞悬浮于生理盐水中，输液袋储存；
[0037] 3)检测淋巴结组及外周血组CIK细胞表型；
[0038] 4)用CCK8显色法检测淋巴结组及外周血组CIK细胞对A549细胞株的抗增殖作用；
[0039] 5)倒置显微镜观察两组CIK细胞的形态；
[0040] 6)不同效靶比较淋巴结组和外周血组的CIK细胞对A549细胞的抑制率。
[0041] 本发明方法采用离体的肺癌患者手术后的淋巴结组织在体外经细胞因子的诱导获得大量的扩增，培养第14天，CD3+CD56+T细胞比例上升至30％以上，平均水平不低于同期培养外周血组(P>0.05)；两组培养14天所得CIK细胞MTT实验结果显示，均能有效抑制A549肺腺癌细胞增殖，并且淋巴结组CIK细胞对A549肺腺癌细胞的抑制率高于外周血组(P<0.05)，表明取自离体的肺癌患者的淋巴结组织完全可以用于CIK培养，且培养的CIK细胞其体外抗肿瘤增殖能力强大。
[0042] 本发明进一步提供了上述培养的淋巴结内自体CIK细胞在用于制备抑制肺腺癌瘤制品中的用途。
[0043] 本发明将培养制得的淋巴结内自体CIK细胞用于制备抑制肺腺癌瘤制品，本发明的实施例中，将制备的抑制肺腺癌瘤制品用于肺癌术后患者过继性免疫干预研究，其中，将CD8+T淋巴细胞，FOX-P3+T淋巴细胞的数量对应传统病理分期代表肿瘤大小的T，将CD45RO+记忆性T细胞对应传统病理分期代表远处转移的M；从而将肺癌传统的病理TNM分期，跨越到代表机体抗瘤免疫状态的TNM分期；研究结果显示，所培养的淋巴结内自体CIK细胞有利于减低肺癌术后患者复发转移的可能。
[0044] 本发明将为肺癌手术后的患者提供一种新的预防术后复发转移的免疫干预策略，进一步有助于探索肺癌的免疫分期以及与传统的病理分期之间的对应关系，为揭示机体的免疫系统失衡程度决定肺癌患者的生存这一理论提供强有力的佐证。
[0045] 更进一步的，本发明将治疗有效量的所培养的淋巴结内自体CIK细胞和化疗药物制成复合物，用于肺癌术后患者的过继性免疫干预，将有利于减低肺癌术后患者复发转移的发生率。所述的化疗药物通常采用术后化疗方案所用的化疗药物，如，长春瑞宾联合卡铂方案(NC：民诺宾25mg/m2,d1d8+铂尔定AUC＝5,d1)。
[0046] 本发明的优点在于：
[0047] 1，实验证实了取得的肺癌患者手术离体的淋巴结组织可用做体外CIK细胞培养，其增殖速度不低于外周血组，而且较外周血组对肺腺癌细胞株A549具有更高效的杀伤活性；
[0048] 2，本发明为肺癌手术患者淋巴结分离培养诱导CIK细胞用作过继性免疫干预提供了有价值的体外实验依据，尤其是手术中取得的离体的肺癌患者的淋巴结培养后回输的CIK细胞，其安全性和无肿瘤细胞污染方面是可控的。附图说明
[0049] 图1，显示同时源于淋巴结和外周血中培养的CIK(CD3+CD56+细胞)细胞，其中，A：肺癌患者外周血培养CIK(30.2％)；B：肺癌患者淋巴结中培养的CIK(37.3％)。
[0050] 图2，显示了源于淋巴结中培养14天的CIK细胞形态(×200)。
[0051] 图3.显示CCK8法检测CIK细胞对A549抑制率(A5491*10^5/ml)(n＝3)。
具体实施方式
[0052] 本实验中采用的实验材料如下述：
[0053] 无血清培养基：X-VIVOTM15(lonza(美国)合综生物有限公司)；一次性细胞滤网(上海前尘生物科技公司)；鼠抗人CD3单克隆抗体(法国Immunotech公司)，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的CD3(鼠抗人CD3单克隆抗体)，多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)标记的CD4(鼠抗人CD4单克隆抗体)，多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)标记的CD45(鼠抗人CD45单克隆抗体)，藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)标记的CD16CD56(鼠抗人CD56单克隆抗体)(美国BD公司)，上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,Ep-CAM)抗体(C-10)(Santa Cruz公司)，重组人白细胞介素-2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)、干扰素(interferon，IFNγ)和CCK-8试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)
[0054] A549细胞(购自中科院上海生化所)；
[0055] 患者一般资料：
[0056] 选取2012年10月-2014年10月于上海市胸科医院手术的肺癌患者；根据IASLC第7版分类，入选IIb期2人，III期4人；病理类型为肺腺癌5例，鳞癌1例，男性5人，女性1人，入组患者中位年龄为(63±3.08)岁，术中摘除手术部位引流淋巴结，满足常规病理诊断要求后，淋巴结体外培养CIK细胞；术后化疗方案均为长春瑞宾联合卡铂方案(NC：民诺宾25mg/m2,d1d8+铂尔定AUC＝5,d1)，入选患者均签署知情同意书；体力评价采用美国东部协作肿瘤组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)评分标准均≤1。
[0057] 实施例1
[0058] 1)诱导与扩增淋巴结内CIK细胞与外周血CIK细胞
[0059] (1)将获得的离体的肺癌患者静脉血外周血50mL,于16-20℃下保存，外周血采用Ficoll密度梯度离心法(密度1,077g/mL)：外周血50ml+生理盐水40ml成倍稀释血样，Ficoll分离离心(2000转/分，670(×g)20min)，取中间层薄雾状的外周血单个核细胞层静置培养箱2h后用悬浮细胞制备CIK；
[0060] (2)将获得的离体的肺癌患者纵隔淋巴结组织约10g(石蜡切片染色病理证实无转移)，16-20℃下保存，剪碎，剔除脂肪组织及各种纤维成分，再经碾磨、0.9％氯化钠溶液洗涤重悬后采用细胞滤网过滤后收集细胞，细胞静置于细胞培养箱中培养2h后，收集悬浮细胞并制备CIK细胞；
[0061] (3)CIK的诱导扩增：将从外周血中收集获得的外周血单个核细胞和淋巴组织中收集获得的细胞，用含INF-γ(1000u/ml)和2％患者自体血清的X-VIVOTM15培养液，在温度为37℃含CO2为5％的培养箱中培养24h，将CD3单克隆抗体(500ng/ml)、rhIL-2(1000U/mL)加入培养液中，隔天补充营养因子(INF-γ和rhIL-2)，共培养10d；继续培养细胞至第14天时，开始收集CIK细胞，使细胞悬浮于50mL的生理盐水中，储存在输液袋中(16-20℃下保存)；并取两组细胞标记CD3、CD4、CD8、CD16CD56、EpCAM、内毒素的流式抗体，流式上样分析；
[0062] 2)CCK8法细胞活性测定
[0063] 取培养14天的外周血组和淋巴结组CIK细胞作为效应细胞，靶细胞为A549肺腺癌细胞，A549细胞浓度1*10^5/ml(1*10^4/孔)，分别以效靶比为12.5：1，25：1，50：1，100：1的比例加入96孔板(实验组)，另设单独靶细胞孔(单独靶细胞组)和单独效应细胞孔(单独效应细胞组)，每组设3个复孔，37度、5％CO2培养箱中培养48h，用CCK8显色法测波长450nm处吸光度(A)值；
[0064] 抑制率(％)＝【单独效应细胞组A值-实验组A值/单独靶细胞组A值】*100％；实验重复3次；
[0065] 3)倒置显微镜观察细胞形态
[0066] 取培养14天后的外周血组及淋巴结组培养的CIK细胞在倒置显微镜下观察细胞形态；
[0067] 4)淋巴结组及外周血组培养的CIK细胞表型测定
[0068] 培养第14d用流式细胞仪检测外周血组及淋巴结组培养的CIK细胞表面分子CD3、CD4、CD8、CD16CD56、EpCAM；
[0069] 淋巴结组及外周血组CIK细胞表型分析结果显示，外周血组与淋巴结组CD3+CD56+(CD3+CD16CD56+)细胞比例分别为32.9±0.1％，31.8±3.0％，两组间无显著性差异(P>0.05，如表1所示)；来源于淋巴结培养的CIK细胞EpCAM流式表达阴性，提示肿瘤未累及肺癌引流区域的淋巴结；
[0070] 表1.培养14d外周血组及淋巴结组CIK表型情况(x±s)(％)(n＝6)
[0071]
[0072] 培养14d后外周血组及淋巴结组细胞形态显示，分离出的单个核细胞悬浮于培养基中，细胞体积较小，大小及折光性较一致，培养第5-6天时，细胞体积增大，可成团生长，培养第14天，倒置显微镜下淋巴结组和外周血组CIK细胞均呈圆形或椭圆形，体积增大，有细胞集落，胞膜光滑，胞浆增多、饱满，透亮，折光性好(如图2所示)。
[0073] 实施例2对A549细胞抗增殖及细胞毒作用试验
[0074] 分别将每位患者术前取得的外周血和术中取得的淋巴结按1.3.2方法培养14天获得CIK细胞，从第15天开始连续回输4天，(淋巴结组d1+外周血组d2)交替2次回输；分别在第14天和回输结束后7天抽取外周血检测癌胚抗原(CEA)、血常规(评估骨髓抑制发生率)，观察皮疹,发热,过敏性事件的发生率；
[0076] 淋巴结CIK细胞与外周血CIK细胞对A549细胞抗增殖及细胞毒作用结果显示，当A549细胞取1*10^5/ml时，检测CIK细胞对A549细胞不同效靶比的抑制率，随着效靶比的增高，对CIK细胞抑制率呈上升趋势；不同效靶比淋巴结组CIK细胞对A549肺腺癌细胞的抑制能力均高于外周血组(P<0.05，如图3所示)，回输后评估：手术当日，患者淋巴结获取，培养CIK细胞，常规进行病毒学，病原学检测，符合质控要求，淋巴结中CIK细胞混悬于生理盐水250毫升，静脉回输，回输前半小时吲哚美辛栓剂半枚纳肛，异丙嗉(非那更)半支肌注；术后化疗于手术一月内进行，每月一次，四次后结束；分别于术后当日及回输CIK后检测CEA，结果显示受试的4名患者出现不同程度下降(下降幅度超过25％定义为CEA下降)；淋巴结培养的CIK细胞回输肺癌患者安全性高，不良反应少，仅出现皮疹和发热，并且都可以耐受(如表2所示)；
[0077] 表2肺癌患者淋巴结中培养CIK细胞回输后CEA变化及副反应
[0078]
[0079] 实施例3临床干预实验
[0080] 针对肺癌患者体内失衡的免疫系统，采用肺癌手术患者自体淋巴结培养激活的杀伤T细胞联合树突状细胞(CIK-DC)，以及联合化疗的干预策略，抑制肺癌患者的复发转移，提高患者的抗癌免疫，从而提高肺癌患者的无病生存期和总生存期。
[0081] 依据肺癌的免疫分期观点，将CD8+T淋巴细胞，FOX-P3+T淋巴细胞的数量对应传统病理分期代表肿瘤大小的T；将CD45RO+记忆性T细胞对应传统病理分期代表远处转移的M；从而将肺癌传统的病理TNM分期，跨越到代表机体抗瘤免疫状态的TNM分期；
[0082] 受试患者入选标准：
[0083] 1)病理组织学证实的非小细胞肺癌；
[0084] 2)手术切除3站6组以上纵隔淋巴结；
[0085] 3)分期为IB-IIIA；
[0086] 4)年龄：18-75岁；
[0087] 5)一般状况好，卡氏评分(Karnofsky performance scores，KPS)≥70分；
[0088] 6)患者或其法定代理人签署知情同意书；
[0089] 排除标准
[0090] 1)爱滋病病毒抗体阳性,或患有其它获得性、先天性免疫缺陷疾病，或有器官移植史；
[0093] 4)尚未控制的严重内科临床问题(如严重的精神、神经、心血管、呼吸管系统疾病)；
[0094] 分组：随机分组为化疗组，免疫联合化疗组，免疫组三组；
[0095] 化疗组采用标准的术后化疗干预方案：长春瑞宾(25mg/m2,D1、D8)联合顺铂(75mg/m2，D1)；免疫联合化疗干预组在每周期化疗间隙接受自体淋巴结中培养的免疫细胞；单纯免疫干预组为每月接受自体淋巴结中的免疫细胞治疗；任意一种干预模式均为四个周期，术前，末次干预前分别采集患者的外周血进行流式分析CD8+T淋巴细胞，FOX-P3+T淋巴细胞，CD45RO+记忆性T细胞；
[0096] 免疫干预流程：术中淋巴结保存，待淋巴结病理石蜡报告为阴性结果；
[0097] 1)DC及CIK前体细胞分离a:将淋巴结研墨，过滤，去除杂质和红细胞，淋巴细胞分离液提取淋巴细胞；b:重悬细胞于培养液中,调整细胞浓度，贴壁培养4小时后，收集悬浮细胞,作为CIK前体细胞；c:粘附细胞用37℃预温的生理盐水轻轻洗涤3次,作为DC前体细胞；
[0098] 2)DC细胞培养a:加入重组人GM-CSF及重组人IL-4；b:每隔2天半量换液,同时添加GM-CSF及IL-4；c:5天后收集悬浮的成熟DC细胞；
[0099] 3)CIK细胞培养a:每瓶加入重组人INF-γ,37℃,5％CO2培养箱培养24小时；b:加入抗人CD3单抗及重组人IL-2；c:每隔3天半量换液,同时添加IL-2。d:12天后将细胞按1：3比例传代,培养3天后取1/3细胞继续培养；收集细胞进行第二次回输干预；
[0100] 建立患者CIF表格：主要内容包括：患者姓名，年龄，肺癌的病理分期，手术摘取淋巴结数目，治疗干预模式，随访时间，有无复发转移；
[0101] 实验结果显示，本发明由肺癌患者手术离体的淋巴结内成功培养的CIK-DC细胞淋能结合化疗干预方案，并显示出术后化疗联合免疫干预方案较单纯的免疫干预以及单纯化疗组更能降低肺癌复发转移的危险度；并证实了肺癌手术后的病理分期与免疫细胞对应的分期具有对应关系。
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