用于细胞免疫治疗的方法和组合物
阅读：80发布：2020-05-22
专利汇可以提供用于细胞免疫治疗的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于给予和/或提高免疫应答的核酸、载体、宿主细胞、方法和组合物，所述免疫应答由细胞免疫 治疗 介导，如由过继转移CD8+中枢记忆T细胞或中枢记忆T细胞与基因修饰以表达嵌合受体的CD4+T细胞的组合介导。在某些供选择的方案中，基因修饰的宿主细胞包括核酸，所述核酸包括编码配体结合域的多核苷酸、包括定制的间隔区的多核苷酸、包括跨膜域的多核苷酸和包括胞内 信号 传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域结合于CD171。，下面是用于细胞免疫治疗的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种嵌合受体核酸，包括：
a)编码配体结合域的多核苷酸，其中，所述配体结合域结合于CD171和/或与CD171相互作用；
b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中，所述间隔区是优化的；
c)编码跨膜域的多核苷酸；以及
d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。
2.权利要求1所述的嵌合受体核酸，其中，所述配体结合域是抗体片段。
3.权利要求2所述的嵌合受体核酸，其中，所述配体结合域是单链可变区片段。
4.权利要求1-4中任一项所述的嵌合受体核酸，其中，所述间隔区是15个氨基酸或更少，但不少于1个或2个氨基酸。
5.权利要求1-4中任一项所述的嵌合受体核酸，其中，所述间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。
6.权利要求5所述的嵌合受体核酸，其中，所述间隔区包括人抗体的铰链区的部分。
7.权利要求1-6中任一项所述的嵌合受体核酸，其中，所述胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。
8.权利要求7所述的嵌合受体核酸，其中，所述胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-
1BB的部分。
9.权利要求1-8中任一项所述的嵌合受体核酸，进一步包括编码标记序列的核酸。
10.一种嵌合受体多肽，由权利要求1-9中任一项所述的嵌合受体核酸编码。
11.一种表达载体，包括权利要求1-9中任一项所述的分离的嵌合受体核酸。
12.一种宿主细胞，包括权利要求11所述的表达载体。
13.权利要求12所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。
14.权利要求13所述的宿主细胞，其中，所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，并且其中所述中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。
15.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。
16.权利要求15所述的宿主细胞，其中，所述CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，并且其中所述初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的并且对CD45RO是阴性的。
17.一种组合物，包括在药学上可接受的赋形剂中的权利要求12-16或31-31中任一项所述的宿主细胞。
18.一种组合物，包括权利要求13或14所述的宿主细胞和权利要求15或16所述的宿主细胞。
19.一种用于制备权利要求12-16或30-31中任一项所述的宿主细胞的方法，包括：
a)提供权利要求1-9或11中任一项所述的编码嵌合受体的核酸文库，其中多种核酸中的每一种编码长度不同的嵌合受体；
b)将所述多种核酸中的每一种引入单独分离的T淋巴细胞群并在体外扩增每个T淋巴细胞群；
c)将每个基因修饰的T淋巴细胞群施用于荷瘤动物模型并确定基因修饰的T淋巴细胞群是否具有抗肿瘤应答；以及
d)选择编码提供所述抗肿瘤应答的嵌合受体的核酸。
20.权利要求19所述的方法，进一步包括将选择的编码所述嵌合受体的核酸引入宿主细胞。
21.一种用于制备权利要求12-16或30-31中任一项所述的宿主细胞的方法，包括：
a)将权利要求1-9中任一项所述的核酸或权利要求11所述的表达载体引入具有CD45RA-、CD45RO+和CD62L+表型的淋巴细胞群；以及
b)在抗CD3和/或抗CD28与至少一种内稳态的细胞因子的存在下，培养细胞直到细胞扩增足以用作细胞输注物。
22.权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞是CD8+或CD4+淋巴细胞。
23.权利要求12-16或30-31中任一项所述的宿主细胞或权利要求17或18所述的组合物在治疗或抑制表达CD171的癌症或实体瘤中的用途。
24.权利要求23所述的用途，其中，所述癌症是成神经细胞瘤。
25.权利要求23所述的用途，其中，所述实体瘤选自由乳腺癌、脑癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和卵巢癌组成的组。
26.一种对具有癌症或肿瘤的受试者进行细胞免疫治疗的方法，包括：将权利要求17-
18中任一项所述的组合物或权利要求12-16中任一项所述的宿主细胞施用于所述受试者。
27.权利要求26所述的方法，其中，所述癌症是成神经细胞瘤。
28.权利要求26所述的方法，其中，所述肿瘤选自选自由乳腺癌、脑癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和卵巢癌组成的组。
29.权利要求1所述的方法，其中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加优化所述间隔区。
30.权利要求12所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是前体T细胞。
31.权利要求12所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是造血干细胞。
用于细胞免疫治疗的方法和组合物
[0001] 本申请要求2014年4月10日提交的美国临时专利申请号61/977,751、2014年4月30日提交的美国临时专利申请号61/986,479、2014年10月2日提交的美国临时专利申请号62/058,973、2014年12月5日提交的美国临时专利申请号62/088,363、2014年12月9日提交的美国临时专利申请号62/089,730和2014年12月11日提交的美国临时专利申请号62/090845的优先权的权益。上述申请的全部公开内容特别地通过引用全文并入。
[0003] 本发明连同电子格式的序列表一起提交。序列表提供为2015年4月1日创建的大小为114kb的命名为SCRI-065WO_SEQUENCE_LISTING.TXT的文件。电子格式的序列表的信息通过引用全文并入本文。
技术领域
[0004] 本申请涉及生物医学领域，特别地涉及用于细胞免疫治疗(包括对癌症治疗有用的那些)的方法和组合物。具体地，本发明的供选择的方案涉及用于进行细胞免疫治疗的方法和组合物，所述组合物包含用肿瘤靶向受体修饰的T细胞。
背景技术
[0005] 通过基因修饰T细胞以表达合成嵌合抗原受体(CAR)的癌症免疫治疗的方法是相当重要的早期人临床试验的主题。鉴于在用CD19特异性或CD19靶向的CAR T细胞处理的患者中观察到针对B细胞谱系恶性肿瘤如急性成淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤的显著的抗肿瘤功效，在隐匿实体瘤的患者中获得相似响应的挑战是相当重要的。目前，在癌症患者中CAR重新导向的T细胞过继治疗的发展和临床测试主要是凭经验的，并且受多个技术参数限制，所述技术参数影响执行涉及具有混合难治性肿瘤的已多次治疗的患者的I期临床试验。涉及可以用更大精确度定义的细胞产品的两个参数是T淋巴细胞亚集构成和用于使其抗肿瘤活性最大化的功能性输出的CAR信号传导的调节。在一些供选择的方案中，检测了表达CAR的中枢记忆T细胞的治疗活性，并显示具有干细胞样特征的稳定的T细胞库的抗原刺激(antigen-experienced)组件有能力在过继转移后使寿命长的功能性记忆环境(niches)重新居住(repopulate)。使用免疫磁性选择，经过对CD45RO+CD62L+TCM细胞的富集之后，已经产生了表达抗CD19 CAR的细胞，并且已经在临床上评价了表达抗CD19 CAR的细胞。
[0006] 越过靶向于表达CD19的B细胞恶性肿瘤，对本领域的挑战是肿瘤细胞上的细胞表面靶分子的鉴别和诊疗，所述肿瘤细胞能经受以可耐受“开”靶向“关”肿瘤反应性的CAR T细胞识别。然而，一旦鉴别，调节新的CAR用于信号传导输出的方法还不是完全令人满意的，所述信号传导输出与CD4和CD8 T细胞激活相容。通常被视为CAR发育的中心的参数是靶分子CAR抗原结合域的亲和性，典型地不排除抗体scFv和胞浆域的信号传导组件的亲和性。
[0007] 存在以下需求：鉴别用于确定对治疗活性重要的嵌合受体设计的元件的方法，和提高或改善用于靶向特异性抗原的嵌合受体；和鉴别用于基因修饰和过继转移的细胞群，所述细胞群在体内提供提高的存活和效力。提供的供选择的方案解决了这样的需求。
发明内容
[0008] 尽管嵌合抗原受体的治疗有效性重定向于对白血病和淋巴瘤患者的T细胞免疫治疗，但需要在实体瘤中实现相似的临床响应的方法和组合物。在某些情况下，CAR发育可偏向于选择引起最高程度的T细胞功能性输出的构建体，例如基于体外读出。不同的CAR胞外间隔区和胞浆信号传导域变体可以结合以调节针对裂解肿瘤细胞和分泌细胞因子CD8+CTL激活的程度。在本文描述的研究中，CAR构建体在这样的体外测试中显示了最高活性，也在体内显示出最低抗肿瘤活性，而CAR调节适度的介导肿瘤失活和/或根除的信号传导能力。观察到了递归的CAR触发可致使表达过度活性CAR的CTL诱导细胞死亡(AICD)的激活高度敏感，可能是由于增强了FasL的表达。为了限制AICD，使用胞外间隔区和胞浆信号传导组件的组合，例如通过独立改变这样的部分的性能的CAR调节，可以促进针对实体瘤提高或改善的临床活性。本文描述的是使抗原结合域和跨膜域连接的胞外间隔区的特征的影响，如间隔区的长度，贡献于CART细胞的性能。在一些供选择的方案中，选择CAR间隔区以调整和/或提高或改善表达CAR的细胞(例如T细胞)和靶细胞(例如肿瘤细胞)之间的生物物理突触距离(synapse distance)，例如，以获得与免疫细胞(如T细胞)激活相容和/或对免疫细胞(如T细胞)激活最佳的突触距离。
[0009] 本文描述的供选择的方案涉及胞外间隔区长度和胞浆信号传导部分选择二者各自对CAR性能的贡献，所述CAR可以靶向CD171(L1-CAM)上的肿瘤选择表位和/或对CD171(L1-CAM)上的肿瘤选择表位是特异性的，所述CD171(L1-CAM)被单克隆抗体CE7识别并在临床初步研究中作为第一代CAR被测试。使用对CAR重定向效应物功效的体外功能性测定，在第二和第三代胞浆信号传导域的的情况下，观察到了基于间隔区大小的效应输出的定量层级。在一个供选择的方案中，显示了由于激活诱导的功能上最有能力的CAR格式的细胞死亡(AICD)，CAR T细胞性能在体外与在体内的显著的不一致。这些供选择的方案揭示了在对实体瘤的CAR T细胞免疫治疗的发展中检查的临床相关参数。考虑到每个新的scFv和靶分子限定了与肿瘤细胞质膜的独特的距离，间隔区的调整对每种构建体是独特的并且通过间隔区长度变体文库的经验测试获得。
[0010] 一方面，本公开涉及给予和/或增强由细胞免疫治疗介导的免疫应答的方法和组合物，所述细胞免疫治疗如过继转移肿瘤特异性的基因修饰的免疫细胞群，如基因修饰的单独的或组合的CD8+或CD4+T细胞亚集。本公开提供了嵌合受体核酸，和包括这样的核酸的载体和宿主细胞，以及该核酸编码的嵌合受体。编码这样的嵌合受体的核酸序列通常使许多可以切除并用其他组件替换的模块组件连接在一起，以定制可以靶向效应细胞激活和识别特异性靶分子或靶分子上的表位的嵌合受体和/或对效应细胞激活和识别特异性靶分子或靶分子上的表位特异性的嵌合受体。
[0011] 使用表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞的过继免疫治疗对治疗、改善和/或抑制癌症的增殖可以是有用的。在一些供选择的方案中，使用针对抗原CD171(L1CAM)的表位的CAR。这样的CAR构建体对治疗、改善和/或抑制任何细胞表达CD171的疾病或紊乱或恶性肿瘤是有用的。在一些供选择的方案中，疾病或紊乱是表达CD171(L1CAM)的癌症或肿瘤。一些供选择的方案中，表达CD171的癌症是成神经细胞瘤(NB)。CD171在100％的高风险BN中表达。表达CD171的其他癌症包括黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌和成胶质细胞瘤。
[0012] CD171，又称为L1CAM，是200kDa的跨膜糖蛋白。它是涉及轴突导向和细胞迁移的神经元细胞粘附分子，在治疗难治性癌症中具有重大意义。CD171属于识别分子的免疫球蛋白超家族，并参与到与其他粘附因子如层粘连蛋白、整合蛋白、蛋白聚糖和CD24的嗜异性相互作用。在一些供选择的方案中，CD171包括主要在肿瘤细胞上发现的表位，基本上由主要在肿瘤细胞上发现的表位组成，或由主要在肿瘤细胞上发现的表位组成。在一些供选择的方案中，在糖基化的CD171的胞外域上发现表位，并且不能在非糖基化的CD171上发现该表位。在一些供选择的方案中，表位被称为CE7或被抗体识别的表位被视为CE4。
[0013] 成神经细胞瘤是在婴儿期产生的最常见的颅外实体瘤。它是由成神经细胞(多能交感神经细胞)引起的交感神经系统的胚胎性恶性肿瘤。在发育中的胚胎中，这些细胞内陷并沿神经轴迁移，并居住于交感神经节、肾上腺髓质和其他部位。这些细胞的分布模式与原发性成神经细胞瘤存在的部位相关联。相遇肿瘤细胞的年龄、阶段和生物特征是重要的预后因素，并且用于风险分层和分配疗法。具有成神经细胞瘤的患者的结果中的差异是显著的。具有低风险和中风险成神经细胞瘤的患者具有优秀的预后和结果。然而，即使强化治疗，具有高风险疾病的那些患者仍然具有非常不好的结果。不幸地，约70-80％的年龄大于18个月的患者呈现出转移性疾病，通常在淋巴结、肝、骨和骨髓。小于一半的这些患者被治愈，即使使用高剂量治疗后，使用自体骨髓或干细胞拯救。因此，本文描述的CAR转导的淋巴细胞在对受试者治疗、改善或抑制成神经细胞瘤中是有用的。
[0014] 在一些供选择的方案中，针对CD171的CAR包括提高CAR或表达CAR的细胞在体内的活性和/或存活和/或存留的组件。在一些供选择的方案中，配体结合域包括抗体或抗原结合片段。在一些供选择的方案中，配体结合域包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合和/或靶向于CD171的表位，如比健康细胞更经常在肿瘤细胞上发现的CD171的表位。在其他供选择的方案中，包括了间隔区，其是短的胞外间隔区。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域含有单个共刺激域和单个胞内信号传导域，并排除其他信号传导域。
[0015] 一些供选择的方案涉及嵌合受体核酸和/或由该嵌合受体核酸编码的嵌合受体，所述嵌合受体核酸包括：编码配体结合域的多核苷酸，其中配体是表达于癌症或肿瘤细胞上的分子；编码多肽间隔区的多核苷酸；编码跨膜域的多核苷酸；和编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区连接配体结合域和跨膜域或发现于配体结合域和跨膜域之间。在一些供选择的方案中，多肽间隔区包括铰链区，如来自抗体分子的铰链区，如含有氨基酸序列X1PPX2P的铰链区。这样的铰链区可以连接于包括抗体的一个或多个恒定区的其他氨基酸序列，所述恒定区包括但不限于Ig Fc的CH2和CH3区，例如仅CH3序列。已经惊人地发现可以对个体的靶分子定制间隔区的长度，以获得更好的肿瘤或靶细胞识别和/或效应功能和/或表达受体的细胞的存留，尤其在体内。
[0016] 在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于或是229、200、150、120、119、100、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13或12个氨基酸的长度(但不小于2个或1个氨基酸的长度)或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区长度是
15或12个氨基酸的长度。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是短、中(intermediate)(本文中也称为“中(medium)”)或长的。在一些供选择的方案中，短、中或长的间隔区是如表
7和表8所示的短、中或长的间隔区。
15或12个氨基酸的长度。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是短、中(intermediate)(本文中也称为“中(medium)”)或长的。在一些供选择的方案中，短、中或长的间隔区是如表
7和表8所示的短、中或长的间隔区。
[0017] 在一些供选择的方案中，通过嵌合受体结合的抗原表位相对于靶向的细胞如肿瘤细胞的表面质膜的距离确定或影响接头的长度。
[0018] 在一些供选择的方案中，针对CD171的CAR包括编码短间隔区的多核苷酸，所述短间隔区具有15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)，如15、14、13或12个氨基酸，或15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，短间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，基本上由X1PPX2P的氨基酸序列组成或由X1PPX2P的氨基酸序列组成。在一些供选择的方案中，CAR包括小于
100、50、40、20、15或12个氨基酸长度的间隔区，如具有15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)，如15、14、13或12个氨基酸，或11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度的间隔区，所述CAR针对由CE7识别的CD171的表位，或在相对于表面质膜的CD171上具有相似距离的表位。
100、50、40、20、15或12个氨基酸长度的间隔区，如具有15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)，如15、14、13或12个氨基酸，或11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度的间隔区，所述CAR针对由CE7识别的CD171的表位，或在相对于表面质膜的CD171上具有相似距离的表位。
[0019] 本公开的另一方面提供了分离的嵌合受体核酸，该分离的嵌合受体核酸包括：编码配体结合域的多核苷酸，其中配体是肿瘤特异性抗原，或表达于靶细胞群上的任何其他分子，所述靶细胞群适于介导由淋巴细胞进行的识别、失活和/或清除；编码多肽间隔区的多核苷酸，其中多肽间隔区具有定制的长度，其中间隔区是优化的；编码跨膜域的多核苷酸；以及编码一个或多个胞内信号传导域的多核苷酸。本公开还包括含有如本文描述的分离的嵌合受体的表达载体和宿主细胞。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，优化所述间隔区。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
[0020] 本公开的另一方面提供了包括配体结合域的嵌合受体多肽，其中配体是肿瘤特异性抗原或任何其他分子，所述其他分子表达于靶细胞群上并可以被靶向以介导由淋巴细胞介导的识别和清除；多肽间隔区，其中多肽间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)，如15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度；跨膜域；以及一个或多个胞内信号传导域。在一些供选择的方案中，多肽间隔区包括含有氨基酸序列X1PPX2P的铰链区。
[0021] 另一方面，本公开提供了用于给予和/或提高通过细胞免疫治疗介导的免疫应答的组合物，如通过过继转移肿瘤特异性的，亚集特异性的基因修饰的表达CD4+的T细胞介导的免疫应答，其中表达CD4+的T细胞给予和/或提高表达CD8+的T细胞维持抗肿瘤反应性的能力，并提高和/或使肿瘤特异性增殖最大化。在一些供选择的方案中，表达CD4+的T细胞被基因修饰为表达如本文描述的嵌合受体核酸和/或嵌合受体多肽。
[0022] 另一方面，本公开提供了用于给予和/或提高通过细胞免疫治疗介导的免疫应答的组合物，如通过过继转移肿瘤特异性的，亚集特异性的基因修饰的表达CD8+的T细胞介导的免疫应答。在一些供选择的方案中，表达CD8+的T细胞表达如本文描述的嵌合受体核酸和/或嵌合受体多肽。
[0023] 在另一种供选择的方案中，本发明的方面提供了过继细胞免疫治疗组合物，所述组合物具有：用于给予和/或提高免疫应答的基因修饰的表达CD8+的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂和/或基因修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂，在所述基因修饰的表达CD8+的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂中，细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括表达嵌合受体的表达CD8+的T细胞，所述嵌合受体包括：与疾病或紊乱相关的配体的配体结合域、定制的间隔区、跨膜域以及T细胞或其他受体的胞内信号传导域，所述其他受体如共刺激域；在所述基因修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂中，辅助T淋巴细胞细胞制剂具有表达嵌合受体的表达CD4+的T细胞，所述嵌合受体包括：抗体可变域，所述抗体可变域可靶向与疾病或紊乱相关的配体和/或对与疾病或紊乱相关的配体是特异性的、定制的间隔区、跨膜域以及至少一个或多个胞内信号传导域。
[0024] 在一些供选择的方案中，本公开提供了治疗、改善或抑制患者的癌症如NB的方法，抑制或延迟患者的癌症如NB的进展和/或转移的方法，抑制或减少肿瘤或癌细胞如NB在患者体内存在的方法，和/或抑制或减少有需要的患者体内的表达CD171的靶细胞群的方法。这样的方法涉及将提供细胞免疫应答的基因修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂施用于所述受试者或所述患者，其中细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括：表达CD8+的T细胞，所述表达CD8+的T细胞具有由编码配体结合域的多核苷酸编码的嵌合受体，其中配体是肿瘤特异性抗原或表达于靶细胞群(例如CD171)上的任何其他分子，所述靶细胞群适于介导由淋巴细胞进行的识别和清除；编码多肽间隔区的多核苷酸，其中多肽间隔区具有定制的长度，其中间隔区提供与参比嵌合受体相比提高的T细胞增殖、提高的体内细胞活性和/或细胞因子产生(例如在体内)；编码跨膜域的多核苷酸；以及编码一个或多个胞内信号传导域的多核苷酸。
[0025] 在一些供选择的方案中，配体结合域是胞外抗体可变域，所述胞外抗体可变域靶向与疾病或紊乱相关的配体或对与疾病或紊乱相关的配体是特异性的。供选择的方案包括基因修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂，其中辅助T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的表达CD4+的T细胞，所述嵌合受体包括：编码配体结合域的多核苷酸，其中配体是肿瘤特异性抗原或肿瘤靶向抗原或表达于靶细胞群上的任何其他分子，所述靶细胞群适于介导由淋巴细胞进行的识别和清除；编码多肽间隔区的多核苷酸，其中多肽间隔区具有定制的长度，其中间隔区提供与参比嵌合受体相比提高的T细胞增殖、提高的体内细胞活性和/或细胞因子产生；编码跨膜域的多核苷酸；以及编码一个或多个胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域包括抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段靶向于和/或特异性结合比健康细胞更常在肿瘤细胞上发现的CD171的表位。在其他供选择的方案中，间隔区包括短的胞外间隔区。在一些供选择的方案中，信号传导域含有单个信号传导域并排除其他信号传导域。
[0026] 在一些供选择的方案中，基因修饰的表达CD8+的T细胞群和基因修饰的表达CD4+的T细胞群联合施用。在一些供选择的方案中，T细胞是自体的或同种异体的T细胞。本文描述的方法的多种修改是可能的。例如，由表达CD8+的T细胞和表达CD4+的T细胞表达的嵌合受体可以是不同的或相同的。
[0027] 另一种供选择的方案涉及通过以下方式制备过继免疫治疗组合物的方法，即通过获得嵌合受体修饰的肿瘤特异的或靶向肿瘤的表达CD8+的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂，所述细胞制剂引起细胞免疫应答并表达抗原反应的嵌合受体，其中修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的表达CD8+的T细胞，所述嵌合抗体包括：配体结合域，其中配体是肿瘤特异性抗原或肿瘤靶向抗原或表达于靶细胞群上的任何其他分子，所述靶细胞群适于介导由淋巴细胞进行的识别和清除；多肽间隔区，其中多肽间隔区具有定制的长度，其中间隔区提供与参比嵌合受体相比提高的T细胞增殖、提高的体内细胞活性和/或细胞因子产生；跨膜域；以及一个或多个胞内信号传导域；和/或通过获得修饰的初始或记忆表达CD4+的T辅助细胞，其中修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的表达CD4+的细胞，所述嵌合受体包括：配体结合域，其中配体是肿瘤特异性抗原或肿瘤靶向抗原或表达于靶细胞群上的任何其他分子，所述靶细胞群适于介导由淋巴细胞进行的识别和清除；多肽间隔区，其中多肽间隔区具有定制的长度，其中间隔区是优化的；跨膜域；以及一个或多个胞内信号传导域。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，优化所述间隔区。在一些供选择的方案中，配体结合域包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性结合和/或靶向于比健康细胞更常在肿瘤细胞上发现的CD171的表位。在其他供选择的方案中，间隔区包括短的胞外间隔区，所述短的胞外间隔区可以是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)，如15、14、
13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，信号传导域含有单个信号传导域并排除其他信号传导域。
13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，信号传导域含有单个信号传导域并排除其他信号传导域。
[0028] 一些供选择的方案也涉及编码嵌合受体的核酸。在一些供选择的方案中，所述核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码插入配体结合域与跨膜域之间的多肽间隔区的多核苷酸，c)编码跨膜域的多核苷酸，以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸，其中，当施用于具有表达CD171的肿瘤的受试者时，在免疫细胞群中的嵌合受体的表达导致免疫细胞随着时间的存活和/或存留的提高，接着相遇CD171和/或提高疗效，所述提高是相对于具有更长的多肽间隔区的所述参比嵌合受体的表达。在一些供选择的方案中，随着时间的存活和/或存留的提高包括如体外应力测试分析所测量的抗原诱导的细胞死亡的相对减少，所述体外应力测试分析包括将表达所述嵌合受体的细胞以多个连续的循环暴露于表达CD171的细胞，和/或随着时间的存活和/或存留的提高包括在施用具有表达CD171的肿瘤的患者之后，体内细胞存留增加，和/或所述更长的多肽间隔区是至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的长度。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于或等于200、150、100、50或20个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。
[0029] 一些供选择的方案涉及嵌合受体核酸，其中嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，该配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸小于，该间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7和NKG2C、B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导域部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7和NKG2C、B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导域部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。
[0030] 在一些供选择的方案中，提供了嵌合受体核酸，其中嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。
[0031] 在一些供选择的方案中，提供了嵌合受体多肽，其中嵌合受体多肽由嵌合受体核酸编码。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。
[0032] 在一些供选择的方案中，提供了包括分离的嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。
[0033] 在一些供选择的方案中，提供了包括表达载体的宿主细胞。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助T淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
[0034] 在一些供选择的方案中，提供了包含在药学上可接受的赋形剂中的宿主细胞的组合物。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助T淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含：选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的：
以及另一种宿主细胞，其中宿主细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的；或选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的的的CD4+T辅助淋巴细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。
以及另一种宿主细胞，其中宿主细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的；或选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的的的CD4+T辅助淋巴细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。
[0035] 在一些供选择的方案中，提供了用于制备宿主细胞的方法，其中方法包括：a)提供编码嵌合受体的核酸文库，其中多种核酸中的每一种编码区长度不同的嵌合受体，b)将多种核酸中的每一种引入单独分离的T淋巴细胞群并在体外扩增每个T淋巴细胞群，c)将每个基因修饰的T淋巴细胞群施用于荷瘤动物模型并确定基因修饰的T淋巴细胞群是否具有抗肿瘤效果，以及d)选择编码提供抗肿瘤效果的嵌合受体的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助T淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，方法进一步包括将选择的编码嵌合受体的核酸引入宿主细胞。
[0036] 在一些供选择的方案中，提供了制备权利要求中任一项的宿主细胞的方法，其中方法包括：a)将核酸或表达载体引入具有CD45RA-、CD45RO+和CD62L+表型的淋巴细胞群，以及b)在抗CD3和/或抗CD28及至少一种体内稳态的细胞因子的存在下培养细胞直到细胞扩增足以用作细胞输注物。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助T淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，淋巴细胞是CD8+或CD4+淋巴细胞。
[0037] 在一些供选择的方案中，提供了权利要求中的宿主细胞或组合物的用途，其中用途是用于治疗表达CD171的癌症或实体瘤。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-
1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助T淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，提供了包含在药学上可接受的赋形剂中的宿主细胞的组合物。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-
40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。
在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含：选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞或是中枢记忆T细胞的CD8+T细胞毒性淋巴细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的；和另一种宿主细胞，其中宿主细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的，或选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞或是初始CD4+T细胞的的CD4+T辅助淋巴细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，癌症是成神经细胞瘤。在一些供选择的方案中，实体瘤选自由乳腺癌、脑癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和卵巢癌组成的组。
1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助T淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，提供了包含在药学上可接受的赋形剂中的宿主细胞的组合物。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-
40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。
在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含：选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞或是中枢记忆T细胞的CD8+T细胞毒性淋巴细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的；和另一种宿主细胞，其中宿主细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的，或选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞或是初始CD4+T细胞的的CD4+T辅助淋巴细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，癌症是成神经细胞瘤。在一些供选择的方案中，实体瘤选自由乳腺癌、脑癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和卵巢癌组成的组。
[0038] 在一些供选择的方案中，提供了对具有癌症或肿瘤的受试者进行细胞免疫治疗的方法，其中方法包括将组合物或宿主细胞施用于受试者。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助T淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，提供了包含在药学上可接受的赋形剂中的宿主细胞的组合物。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助T淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含：选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞或为中枢记忆T细胞的CD8+T细胞毒性淋巴细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的；和另一种宿主细胞，其中宿主细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和CD8+是阳性的，或是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞，或是初始CD4+T细胞的的CD4+T辅助淋巴细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和CD4+是阳性的，并对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，癌症是成神经细胞瘤。在一些供选择的方案中，肿瘤选自由乳腺癌、脑癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和卵巢癌组成的组。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，所述间隔区是优化的。
[0039] 另一种供选择的方案涉及由嵌合受体核酸编码的嵌合受体多肽。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸小于，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)、EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-
1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，间隔区提供了针对与参比嵌合受体相比增加的应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生。
1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，间隔区提供了针对与参比嵌合受体相比增加的应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生。
[0040] 另一种供选择的方案涉及包括嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸小于，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：
53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，间隔区提供了针对与参比嵌合受体相比增加的应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生。
53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，间隔区提供了针对与参比嵌合受体相比增加的应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生。
[0041] 在一些供选择的方案中，提供了包括表达载体的宿主细胞。在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸小于，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：
19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，间隔区提供了针对与参比嵌合受体相比应答配体的增加的T细胞增殖和/或细胞因子产生。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，间隔区提供了针对与参比嵌合受体相比应答配体的增加的T细胞增殖和/或细胞因子产生。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
[0042] 在一些供选择的方案中，提供了包含宿主细胞的组合物。在一些供选择的方案中，组合物包含含有表达载体的宿主细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、
13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：
21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在组合物的一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD8+细胞群，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RO、CD62L和CD8呈阳性的CD8+中枢记忆T细胞。在一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD4+细胞群，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RA、CD62L和CD4呈阳性并对CD45RO呈阴性的初始CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：
21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在组合物的一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD8+细胞群，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RO、CD62L和CD8呈阳性的CD8+中枢记忆T细胞。在一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD4+细胞群，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RA、CD62L和CD4呈阳性并对CD45RO呈阴性的初始CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
[0043] 在另一种供选择的方案中，提供了包含宿主细胞的组合物或包含宿主细胞和药学上可接受的赋形剂的组合物。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：
51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性。在一些供选择的方案中，组合物包含含有表达载体的宿主细胞。在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸的多肽间隔区的多核苷酸(但不小于1个或2个氨基酸)，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：
51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在组合物的一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD8+细胞群，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RO、CD62L和/或CD8呈阳性的CD8+中枢记忆T细胞。在一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD4+细胞群，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RA、CD62L和/或CD4呈阳性，和/或对CD45RO呈阴性的初始CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包含：宿主细胞，其中宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞，或CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的；以及另一种宿主细胞，其中宿主细胞是CD4+T辅助淋巴细胞，所述CD4+T辅助淋巴细胞选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组，或CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：
51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性。在一些供选择的方案中，组合物包含含有表达载体的宿主细胞。在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸的多肽间隔区的多核苷酸(但不小于1个或2个氨基酸)，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：
51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在组合物的一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD8+细胞群，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RO、CD62L和/或CD8呈阳性的CD8+中枢记忆T细胞。在一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD4+细胞群，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RA、CD62L和/或CD4呈阳性，和/或对CD45RO呈阴性的初始CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包含：宿主细胞，其中宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞，或CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的；以及另一种宿主细胞，其中宿主细胞是CD4+T辅助淋巴细胞，所述CD4+T辅助淋巴细胞选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组，或CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
[0044] 在另一种供选择的方案中，提供了制备宿主细胞的体外方法。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，方法包括：a)提供包含多种核酸的文库，每种核酸编码嵌合受体，其中由多种核酸编码的多种嵌合受体中的每一种的长度不同，b)将多种核酸中的每一种引入单独的淋巴细胞群，并在体外扩增每个淋巴细胞群，从而产生多个基因修饰的T淋巴细胞群，c)将多个基因修饰的T淋巴细胞群中的每一个施用于荷瘤动物模型并评价抗肿瘤效果的读数，以及d)选择编码在体外和/或在动物模型中展示抗病毒效果的嵌合受体的核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，多种核酸编码表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ IDNO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：
53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：
51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，方法进一步包括将选择的编码嵌合受体的核酸引入宿主细胞。
在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，方法包括：a)提供包含多种核酸的文库，每种核酸编码嵌合受体，其中由多种核酸编码的多种嵌合受体中的每一种的长度不同，b)将多种核酸中的每一种引入单独的淋巴细胞群，并在体外扩增每个淋巴细胞群，从而产生多个基因修饰的T淋巴细胞群，c)将多个基因修饰的T淋巴细胞群中的每一个施用于荷瘤动物模型并评价抗肿瘤效果的读数，以及d)选择编码在体外和/或在动物模型中展示抗病毒效果的嵌合受体的核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，多种核酸编码表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ IDNO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：
53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：
51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，方法进一步包括将选择的编码嵌合受体的核酸引入宿主细胞。
在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
[0045] 在一些供选择的方案中，提供了选择用于靶向于抗原的嵌合受体的体外方法，其中方法包括：将多个细胞群中的每一个与表达抗原的供体细胞温育一系列的连续循环的轮，其中多个细胞群包含编码多种不同长度的嵌合受体的核酸，每种嵌合受体特异地结合于和/或靶向于抗原；评价多个细胞群中的每一个的扩增、激活和/或存活；以及基于所述评价选择嵌合受体。在一些供选择的方案中，一系列的连续轮包括至少3轮的温育，其中在各轮之间收获细胞群。在一些供选择的方案中，通过在连续轮的温育后检测每个群的存活细胞的存活或数量或百分比进行评价，其中通过相对于多个细胞群中的另一个增加存活或细胞数量或百分比的群来表达选择的嵌合受体。在一些供选择的方案中，在每轮开始时，群的细胞和表达抗原的细胞以1∶1的比温育。在一些供选择的方案中，不同长度的嵌合受体包括不同长度的间隔区，每个间隔区连接嵌合受体的抗原结合域和跨膜域；和/或不同长度的嵌合受体包括具有不同数量的胞内共刺激域的嵌合受体，每种胞内域单独地来自不同的天然共刺激分子。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
[0046] 在另一种供选择的方案中，提供了制备宿主细胞的体外方法，其中方法包括：将如上所述的核酸或如上所述的表达载体引入具有CD45RA、CD45RO+和/或CD62L+表型的淋巴细胞群，以及在抗CD3和/或抗CD28和至少一种体内稳态的细胞因子的存在下培养细胞直到细胞扩增足以用作细胞输注物。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括如上所述的表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括如上所述的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：
51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：
17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：
19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，淋巴细胞是CD8+或CD4+淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：
51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：
17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：
19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，淋巴细胞是CD8+或CD4+淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
[0047] 在一些供选择的方案中，提供了治疗或抑制表达CD171的癌症或实体瘤的宿主细胞或组合物的用途。在一些供选择的方案中，癌症是成神经细胞瘤。在一些供选择的方案中，实体瘤选自由乳腺癌、脑癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和卵巢癌组成的组。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括如本文所述的表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、
13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：
21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包含宿主细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含含有如本文前述的表达载体的宿主细胞。在一些供选择的方案中，表达载体包括如本文前述的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：
53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在组合物的一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD8+细胞群，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RO、CD62L和CD8阳性的CD8+中枢记忆T细胞。在一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD4+细胞群，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RA、CD62L和CD4呈阳性，和对CD45RO呈阴性的初始CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：
21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包含宿主细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含含有如本文前述的表达载体的宿主细胞。在一些供选择的方案中，表达载体包括如本文前述的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：
53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在组合物的一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD8+细胞群，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RO、CD62L和CD8阳性的CD8+中枢记忆T细胞。在一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD4+细胞群，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RA、CD62L和CD4呈阳性，和对CD45RO呈阴性的初始CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
[0048] 在一些供选择的方案中，提供了用于对具有癌症或肿瘤的受试者进行细胞免疫治疗的方法，其中方法包括：将权利要求的组合物或宿主细胞施用于受试者。在一些供选择的方案中，癌症是成神经细胞瘤。在一些供选择的方案中，肿瘤选自由乳腺癌、脑癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和卵巢癌组成的组。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括如本文所述的表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括如本文所述的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：
53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包含宿主细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含含有表达载体的宿主细胞。
在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：
51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在组合物的一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD8+细胞群，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RO、CD62L和/或CD8呈阳性的CD8+中枢记忆T细胞。在一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD4+细胞群，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RA、CD62L和/或CD4呈阳性，和/或对CD45RO呈阴性的初始CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
附图说明
53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-
1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包含宿主细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含含有表达载体的宿主细胞。
在一些供选择的方案中，表达载体包括嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171，b)编码长度小于100个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区连接嵌合受体的配体结合域和跨膜域，c)编码嵌合受体的跨膜域的多核苷酸和编码嵌合受体的胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列，其中X1和X2独立地是任意氨基酸。在一些供选择的方案中，X1和/或X2是半胱氨酸。在一些供选择的方案中，间隔区的长度小于15个氨基酸(但不小于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区的长度是12、13、14或15个氨基酸或通过任意两个前述的长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，间隔区包括、由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)、ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)、ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，间隔区由以下序列组成或基本上由以下序列组成：
ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)、ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)、YGPPCPPCP(SEQ ID NO：
51)、KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)或EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域不进一步包括另一种共刺激分子的胞内部分和/或其中胞内信号传导域不包括选自由CD27、CD28、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3组成的组的分子的胞内信号传导部分，和/或其中，胞内信号传导域不包括CD28的胞内信号传导部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在组合物的一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD8+细胞群，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，所述CD8+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RO、CD62L和/或CD8呈阳性的CD8+中枢记忆T细胞。在一些供选择的方案中，所述宿主细胞包括CD4+细胞群，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，所述CD4+细胞群基本上由以下组成或针对以下被富集：对CD45RA、CD62L和/或CD4呈阳性，和/或对CD45RO呈阴性的初始CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO、CD62L和/或CD8是阳性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA、CD62L和/或CD4是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。
附图说明
[0049] 图1显示了从外周血单核细胞中分离中枢记忆T细胞。A)显示了对CD4和CD8标记预分选的细胞的流式细胞术图谱。B)显示了对CD8的存在分选后的细胞的流式细胞术图谱。C)显示了将对CD45RA阳性的细胞的CD8+细胞群贫化后的细胞的流式细胞术图谱。D)显示了将细胞群的对CD8富集，对CD45RA贫化，对CD45RO富集和对CD62L富集的细胞的流式细胞术图谱。
[0050] 图2A显示了用具有短、中或长间隔区的CAR构建体转导的CD8中枢记忆细胞的流式细胞术图谱。通过结合于F(ab)的抗体检测到抗CD171 CAR的表达。每幅图片的插图显示了在每个细胞群中表达CD8和表达在每种构建体中存在的截短的EGFR的细胞百分比。图片1是模拟感染的细胞并展示F(ab)或EGFRt没有表达。图片2显示了如由CD8、EGFRt和F(ab)的表达确定的短构建体的表达。图片3显示了如由CD8、EGFRt和F(ab)的表达确定的中等构建体的表达。图片4显示了如由CD8、EGFRt和F(ab)的表达确定的长构建体的表达。无论构建体中存在的是短(图片2)、中(图片3)或长间隔区(图片4)，在CD8细胞中的每种构建体的表达是相似的。
[0051] 图2B显示了使用针对CD3ζ链的抗体进行蛋白印迹(western blot)，显示在转导的CD8细胞中具有短、中或长间隔区的每种构建体的等价表达。泳道2显示短构建体的表达。泳道3显示中等构建体的表达。泳道4显示长构建体的表达。
[0052] 图2C显示了模拟感染的CD8细胞(●)或用具有短间隔区(■)、中间隔区(▲)或长间隔区 的构建体转导的CD8细胞对抗SK-N-BE 2成神经细胞瘤细胞系(Be2)或对照细胞系TML(如之前描述的从PBMC制备EBV转化的TMLCL(Pelloquin F，Lamelin JP，Lenoir GM.In vitro cell dev biol 1986；22(12)：689-694))的细胞裂解活性。图片1显示了任意CD8细胞对抗对照细胞系TML的细胞裂解活性。插图显示对照TML细胞系不表达CD171。图片2显示了用长构建体 转导的细胞对杀伤表达CD171的成神经细胞瘤细胞比用中(▲)或短(■)间隔区转导的细胞更有效。插图显示成神经细胞瘤细胞系Be2表达CD171。图片3显示了尽管存在构建体，与可以靶向于抗原CD3(Okt3)或对抗原CD3(Okt3)特异的CD8细胞温育并且用每种构建体转导的TML对照细胞被靶向于CD3和/或对CD3特异的效应细胞杀伤。
[0053] 图2D显示了当CD8细胞与Be2成神经细胞瘤细胞或对照TML接触时，由用具有短间隔区、中等间隔区或长间隔区的构建体转导的CD8细胞产生的细胞因子。图片1显示了当CD8细胞与Be2成神经细胞瘤细胞接触时，用长间隔区(L)转导的CD8细胞比用中(I)和短间隔区(S)转导的CD8细胞产生更多的IFNγ。图片2显示了当CD8细胞与Be2成神经细胞瘤细胞接触时，用长间隔区(L)转导的CD8细胞比用中等间隔区(I)和短间隔区(S)转导的CD8细胞产生更多的IL-2。图片3显示了当CD8细胞与Be2成神经细胞瘤细胞接触时，用长间隔区(L)转导的CD8细胞比用中等间隔区(I)和短间隔区(S)转导的CD8细胞产生更多的TNFα。
[0054] 图2E显示了NSG小鼠的颅内成神经细胞瘤异种移植肿瘤模型的肿瘤细胞存活率和增殖。左图显示了用短构建体转导的CD8细胞处理的小鼠的标签的成神经细胞瘤细胞显示与用长构建体转导的CD8细胞(从上开始的第二条线)或用假转导的T细胞(上线)处理的对照小鼠相比标签的表达非常低(下线)。右图显示用具有短、中或长间隔区转导的CD8细胞处理的、具有异种移植成神经细胞瘤肿瘤的小鼠的存活率。用具有短间隔区(上线)构建体转导的CD8细胞处理的小鼠远远比用具有中等间隔区(第二条线)或长间隔区(从上部的第三条线)构建体转导的CD8细胞处理的小鼠存活更久。
[0055] 图2F显示了来自用具有长间隔区的构建体转导的CD8细胞处理的小鼠的肿瘤展示肿瘤中更多数量的CD3+细胞。
[0056] 图2G显示了来自用具有长间隔区的构建体转导的CD8细胞处理的小鼠的肿瘤在肿瘤中表达更多的半胱天冬酶3。
[0057] 图3A、3B和3C显示了转导的CAR T细胞在暴露于肿瘤细胞24小时后的激活状态和生活力(第1轮)；然后从第1轮细胞培养物中收获T细胞并转移至新的培养物中持续另外的24小时(第2轮)；然后从第2轮细胞培养物中收获T细胞并转移至新的培养物中持续另外的
24小时(第3轮)。在转移之间，不同T细胞系之间的有生活力的T细胞的量保持相同。
24小时(第3轮)。在转移之间，不同T细胞系之间的有生活力的T细胞的量保持相同。
[0058] 图3A显示了在每轮转移时，与用具有短间隔区(S)的构建体转导的CD8细胞相比，用具有长间隔区(L)的构建体转导的CD8细胞中具有激活的细胞表面标记CD25/CD69的细胞的％更大。
[0059] 图3B显示了与用具有短间隔区(■)的构建体转导的CD8细胞相比，用具有长间隔区 或中等间隔区(▲)的构建体转导的CD8细胞(上部2条线)具有更大的死亡细胞％。
[0060] 图3C显示了与用具有短间隔区的构建体转导的CD8细胞相比，用具有长间隔区或中等间隔区的构建体转导的CD8细胞在肿瘤细胞中引起更多的FasR的表达。
[0061] 图4A、4B、4C、4D、4E和4F显示了用具有短间隔区但还具有另外的来自CD28的胞内信号传导域的CAR构建体转导的CD8中枢记忆T细胞，如此构建体包括来自CD28和4-1BB的共刺激信号传导域以及CD3ζ信号传导域。
[0062] 图4A显示了用具有CD28cyto/4-1BB共刺激域的CAR构建体和具有4-1BB共刺激域的构建体转导的CD8中枢记忆细胞的流式细胞术图谱。通过结合于F(ab)的抗体检测抗CD171 CAR的表达。每张图片的插图显示在每个细胞群中表达CD8和表达在每种构建体中存在的截短的EGFR的细胞的百分比。图片1是模拟感染的细胞，展示了F(ab)或EGFRt没有表达。图片2显示了如通过CD8、EGFRt和F(ab)的表达确定的、具有4-1BB共刺激域的短构建体的表达。图片3显示了如通过CD8、EGFRt和F(ab)的表达确定的、具有CD28cyto/4-1BB共刺激域的短构建体的表达。在CD8细胞中每种构建体的表达是相似的。
[0063] 图4B显示了用包括短间隔区、共刺激域4-1BB和信号传导域CD3ζ的构建体和包括短间隔区、共刺激域CD28cyto和信号传导域CD3ζ的构建体转导的CD8细胞对抗SK-N-BE 2成神经细胞瘤细胞系(Be2)的细胞裂解活性。该图显示了用具有共刺激域CD28cyto(上线◆)的构建体转导的细胞比用缺少CD28cyto(从上部开始的第二条线 )的构建体转导的细胞对杀伤表达CD171的细胞更有效。
[0064] 图4C显示了在与成神经细胞瘤细胞或对照TML接触时，通过转导的T细胞产生的细胞因子。使Be2或TML细胞与包括短间隔区、共刺激域4-1BB和信号传导域CD3ζ的构建体和包括短间隔区、共刺激域CD28cyto、共刺激域4-1BB和信号传导域CD3ζ的构建体转导的CD8细胞接触。该图显示用与Be2细胞接触的具有CD28cyto共刺激域的构建体(CD28cyto)转导的CD8细胞比用不具有CD28cyto共刺激域的构建体转导的CD8细胞(4-1BB)产生更多IFNγ。
[0065] 图4D显示了NSG小鼠中的颅内成神经细胞瘤异种移植肿瘤模型的肿瘤细胞存留率和增殖。该图显示了用包括短间隔区、共刺激域4-1BB和信号传导域CD3ζ的构建体(4-1BB)和包括短间隔区、共刺激域CD28cyto、共刺激域4-1BB和信号传导域CD3ζ的构建体(CD28cyto)转导的CD8细胞处理的、具有异种移植成神经细胞瘤肿瘤的小鼠的存活率。用不具有CD28cyto共刺激域的构建体(4-1BB)转导的CD28细胞处理的小鼠比用具有CD28cyto共刺激域的构建体(CD28cyto)转导的细胞处理的小鼠具有更大的存活率百分比。
[0066] 图4E显示了转导的CAR T细胞在暴露于肿瘤细胞24小时后的激活状态和生活力(第1轮)；然后从第1轮细胞培养物中收获T细胞并转移至新的培养物中，持续另外的24小时(第2轮)；然后从第2轮细胞培养物中收获T细胞并转移至新的培养物中，持续另外的24小时(第3轮)。该图显示了与用不具有CD28cyto共刺激域的构建体(4-1BB)转导的细胞相比，用具有CD28cyto共刺激域的构建体(CD28cyto)转导的CD8细胞具有中具有激活的细胞表面标记CD25/CD69的细胞的％更大。
[0067] 图4F显示了与用不具有CD28cyto共刺激域构建体转导的细胞(■)相比，用具有CD28cyto共刺激域的构建体转导的CD8细胞(▲)具有更大的死亡细胞％。
[0068] 图5显示了Ce7scFv-IgG4铰链-CH2-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(长构建体)的序列(SEQ ID NO：54)。波浪线表示构建体的每个组件的编码序列的起始和终止。
[0069] 图6显示了包括Ce7scFv-IgG4铰链-CH2-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(长构建体)的序列的质粒图谱。
[0070] 图7显示了CE7scFv-IgG4铰链-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(中)的序列(SEQ ID NO：55)。波浪线显示了构建体的每个组件的编码序列的起始和终止。
[0071] 图8显示了包括CE7scFv-IgG4铰链-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(中)的序列的质粒图谱。
[0072] 图9显示了CE7scFv-IgG4铰链-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(短)的序列(SEQ ID NO：56)。波浪线显示了构建体的每个组件的编码序列的起始和终止。
[0073] 图10显示了CE7scFv-IgG4铰链-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(短)的序列的质粒图谱。
[0074] 图11显示了具有两个共刺激域的构建体CE7scFv-IgG4铰链-CD28tm/cyto-4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(短)的序列(SEQ ID NO：57)。波浪线显示构建体的每个组件的编码序列的起始和终止。
[0075] 图12显示了包括具有两个共刺激域的构建体CE7scFv-IgG4铰链-CD28tm/cyto-4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(短)的序列的质粒图谱。
[0076] 图13A-13H显示了CAR胞外间隔区调节表达CD8+的CTL的抗肿瘤效应物输出。图13A显示了CD171特异性或靶向CD171的2G-CAR胞外域间隔区变体。图13B了显示分别用抗鼠FAB和西妥昔单抗检测的2G SS、MS或LS间隔区变体和EGFRt的人CD8+TE(CM)细胞表面表达。图13C显示了通过CD3-ζ特异性蛋白印迹检测的2G-CAR表达水平。图13D显示当与CD171+Be2成神经细胞瘤肿瘤细胞以E∶T比为1∶1共培养时(每种条件n≥3)，磷-ERK的2G-CAR诱导的水平。图13E显示了在如图13D的肿瘤共培养时，2G-CAR激活诱导的CD137表面表达。图13F显示了通过4小时铬释放测定确定的间隔区变体2G-CAR CTL的抗肿瘤裂解活性。在E∶T比为10∶1时，LS和MS间隔区相对于SS 2G-CAR CTL的特异性裂解倍数。图13G显示了在混合了2G-CAR CTL的肿瘤(Be2)培养物中细胞因子分泌的刺激(每个条件n≥5)。如图13所示，细胞因子产生的倍数比较是相对于SS 2G-CAR的。
[0077] 图14A-14H显示了CAR间隔区依赖性的CTL功能性体外效果和体内抗肿瘤活性呈负相关。图14A显示颅内NSG小鼠成神经细胞瘤异种移植治疗模型图解和在立体定向植入后第6天ffLuc+Be2肿瘤的生物光子信号。图14B显示了对瘤内输注的2G-CAR CD8+TE(CM)间隔区变体应答的生物光子Be2肿瘤信号(每组n＝6只小鼠)。由于肿瘤相关的动物痛苦，在第20天将LS 2G-CAR组处死。图14C显示了来自图14B的处理组的Kaplan Meier存活率。图14D显示了在有症状的肿瘤进展时，对瘤内2G-CAR T细胞的定量。通过对人CD3+细胞计数确定T细胞密度，将T细胞密度报道为总数量/40hpf(数据代表个体的肿瘤分析)。图14E显示了负荷(bearing)颅内异种移植Be2并用2G-CAR CTL处理，随后检查IHC/IF的NSG小鼠的肿瘤恢复时间轴。图14F1和14F2显示了对CD3、Ki67和激活的半胱天冬酶3共定位的SS 2G-CAR CTL的共染色的代表性肿瘤和对侧半球IF图像。图14G显示了存留的2G-CAR间隔区变体CTL在瘤内移植后3天的IF定量。在图14D中，N＝总人CD3+细胞/40hpf。图14H显示了CD3+T细胞的百分比，所述CD3+T细胞共表达颗粒酶B(左侧图片)、Ki67(中间图片)和激活的半胱天冬酶3(右侧图片)(n＝来自对两个个体移植小鼠的分析的平均细胞数/40hpf)。
[0078] 图15A-15H显示了基于CAR间隔区尺寸在不同的FasL介导的AICD中在体外循环的抗原暴露的结果。图15A显示了在用肿瘤细胞重复刺激时，对CAR T细胞功能性状态和生活力分析的体外应力测试测定的图解。图15B显示在连续几轮2G-CAR转移后对剩余的有生活力的fLuc+Be2肿瘤细胞的定量(肿瘤生活力％＝3次独立实验的平均值)。图15C显示了在连续几轮与Be2细胞以1∶1的效应物∶刺激物(E∶S)比共培养后CD25和CD69表面表达的流式细胞术定量(CD25+CD69+值％＝2次独立实验的平均值)。图15D显示了在每轮后通过Guava Viacount测定确定的2G-CAR T细胞生活力。得到的死亡％T细胞值如图15C所示。图15E显示了在与Be2共培养8小时之前和之后的FasL+2G-CAR CTL的频率(E∶S为1∶1；每个数据点得自独立的实验)。图15F显示了在MS和LS 2G-CAR间隔区变体共培养时，通过rt-qPCR测量的标准化为β-肌动蛋白的FasL mRNA转录相对于SS 2G-CAR CTL的诱导倍数(5次独立实验的平均值)。图15G显示了与Be2共培养16小时后，激活的半胱天冬酶3+2G-CAR CTL的频率(E∶S为1∶1；值＝4次独立实验的平均值)。图15H显示了Fas或FasL的siRNA敲低对3轮后LS 2G-CAR CTL中的细胞凋亡诱导的效果。通过Guava Viacount测定确定的平均生活力以3次独立实验进行(“|+”条件是模拟的电穿孔T细胞，“scr”条件是杂乱siRNA作为阴性对照(scrambled siRNA))。
[0079] 图16A-16F显示了通过第三代CD28：4-1BB：ζ胞浆域进行的提高的共刺激，导致提高的体外效应物功能输出。图16A显示了2G-CAR组合与3G-CAR组合的示意图。图16B显示了分别用抗鼠FAB和西妥昔单抗检测的2G-CAR(SS)与3G-CAR(SS)以及EGFRt的人CD8+TE(CM)细胞表面表达。图16C显示了通过CD3-ζ特异的蛋白印迹检测的2G-CAR(SS)和3G-CAR(SS)表达水平。图16D显示了在肿瘤共培养时2G-CAR(SS)与3G-CAR(SS)激活诱导的CD137表面表达的对比。图16E显示了通过4小时铬释放测定确定的2G-CAR(SS)CTL与3G-CAR(SS)CTL的抗肿瘤裂解活性的对比。以10∶1的E∶T比，SS-3G CTL相对于SS-2G CTL的特异性裂解的倍数(3次独立实验的平均值)。图16F显示了2G-CAR(SS)CTL与3G-CAR(SS)CTL肿瘤(Be2)共培养物中的细胞因子分泌的刺激(每个条件n≥6)。细胞因子产生的对比是相对于如(E)中的2G-CAR(SS)。
[0080] 图17A-17D显示了3G-CAR(SS)CTL不展示提高的体内抗肿瘤活性。图17A显示了用2G-CAR(SS)CTL与3G-CAR(SS)CTL处理的移植Be2的NSG小鼠的Kaplan Meier存活曲线(n＝
5-6每组，假转导的CTL对照为黑色)。图17B显示了如图17A处理的移植SK-N-DZ的小鼠的Kaplan Meier存活曲线。图17C显示了过继转移后3天2G-CAR(SS)T细胞与3G-CAR(SS)T细胞的瘤内存留。N＝两个独立来源的肿瘤样本中CD3+细胞的数量/40hpf。图17D显示了如图17C所述颗粒酶B(左侧图片)和激活的半胱天冬酶3+(右侧图片)+的CD3+CTL的IF检测。
5-6每组，假转导的CTL对照为黑色)。图17B显示了如图17A处理的移植SK-N-DZ的小鼠的Kaplan Meier存活曲线。图17C显示了过继转移后3天2G-CAR(SS)T细胞与3G-CAR(SS)T细胞的瘤内存留。N＝两个独立来源的肿瘤样本中CD3+细胞的数量/40hpf。图17D显示了如图17C所述颗粒酶B(左侧图片)和激活的半胱天冬酶3+(右侧图片)+的CD3+CTL的IF检测。
[0081] 图18A-18E显示了在短间隔区胞外域的情况下基于CAR胞浆信号传导在体外的循环抗原暴露导致不同的FasL介导的AICD。图18A显示了在连续几轮与Be细胞以E∶S为1∶1共+培养后，2G-CAR(SS)CTL与3G-CAR(SS)CTL的CD25和CD69表面表达的流式细胞术定量(CD25CD69+值％源自两次独立实验的平均值)。图18B显示了在每轮肿瘤共培养后，通过Guava Viacount测定确定的2G-CAR(SS)T细胞与3G-CAR(SS)T细胞的生活力。死亡T细胞值％如上文所述得到。图18C显示了在与Be细胞以E∶S为1∶1共培养8小时之前和之后FasL+2G-CAR(SS)与3G-CAR(SS)的频率(每种2G-CAR间隔区变体的5个数据点中的每个数据点源自独立进行的实验)。图18D显示了在2G-CAR(SS)与3G-CAR(SS)共培养时，通过rt-qPCR测量的标准化为β-肌动蛋白的FasL mRNA转录的诱导倍数(平均值获得自5次独立进行的实验)。图18E显示了与Be2以E∶S为1∶1共培养16小时后，胞浆激活的半胱天冬酶3+2G-CAR(SS)CTL与3G-CAR(SS)CTL的频率(4次独立实验的平均值)。+(图18D)和激活的半胱天冬酶3+(图18E)CD3+CTL如图18C所描述。
[0082] 图19A-19C显示了在用间隔区变体2G-CA进行的慢病毒转导后扩增的经分离的CD45RO+CD62L+人Tcm的表型相似性。图19A显示了在实验性使用之前，将CD8 TCM分离、转导和扩增的的时间轴。图19B显示了从PBMC进行的CD8+TCM(CD45RO+CD62L+)的免疫磁性分离方法和纯度。图19C显示了在实验性使用时用不同间隔区变体2G-CAR转导的CD8+TE(CM)的表型。
[0083] 图20A-20D显示了CD171特异性和/或靶向CD171的2G-CAR间隔区变体CD8+TE(CM)CLTs对抗CD171low SK-N-DZ人成神经细胞瘤异种移植物的体外和体内抗肿瘤活性。图20A显示了4小时CRA中2G-CAR间隔区变体对抗SK-N-DZ的裂解效果。图20B显示了通过间隔区变体2G-CAR CTL分泌的IFNγ的SK-N-DZ刺激。图20C显示了应答瘤内输注的2G-CAR(SS、MS或LS)+
CD8TE(CM)的生物光子SK-N-DZ肿瘤信号(n＝5/组)。图20D显示了处理的组的Kaplan Meier存活曲线。
CD8TE(CM)的生物光子SK-N-DZ肿瘤信号(n＝5/组)。图20D显示了处理的组的Kaplan Meier存活曲线。
[0084] 图21显示了在siRNA敲低后的Fas和FasL的表达。图片A显示了相对于用scr siRNA处理的LS 2G-CAR CTLs，Fas的siRNA敲低后的Fas+LS2G-CAR CTL的频率(Fas+值％源自4次+独立实验的平均值)。图片B显示了如图片A所描述的FasL的siRNA敲低后的FasLLS 2G-CAR CTL的频率。
具体实施方式
[0085] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的意义。
[0086] 如本文使用的“激活”是指被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖、细胞因子产生或细胞表面标记如CD69和CD25的表达，或可检测的效应功能的T细胞的状态。
[0087] 如本文使用的“激活诱导的细胞死亡”是指被激活但不能增殖多于2代并展示细胞凋亡标记的T细胞的状态。
[0088] 如本文使用的“抗原”或“Ag”指引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的激活，或上述两者。显而易见的是抗原可以是合成产生的，重组产生的或可以来源于生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
[0089] 如本文描述的“抗肿瘤作用”指可以表现为肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数量的减少、转移数量的减少、预期寿命的增加或与癌症病症相关的各种生理症状的减少的生物作用。“抗肿瘤作用”也可以表现为复发减少或复发前时间的增加。
[0090] 如本文描述的“嵌合受体”是指合成设计的受体或其他受体如共刺激域，所示合成设计的受体包括抗体或其他蛋白序列的配体结合域，所述其他蛋白序列结合于疾病或紊乱相关的分子，并且通过间隔区连接于T细胞的一个或多个胞内信号传导域。嵌合受体也可以指人工T细胞受体、嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体或嵌合抗原受体(CAR)。这些CAR是工程化的受体，该工程化的受体可以将任意的特异性移植于免疫受体细胞上。一些研究者也认为嵌合抗原受体或“CAR”包括抗体或抗体片段、间隔区、信号传导域和跨膜区。然而，因为修饰CAR的不同组件或域如表位结合区(例如，抗体片段，scFv或其部分)、间隔区、跨膜域和/或信号传导域的惊人作用，在某些情况下，在本公开中，CAR的组件是独立描述的。CAR的不同元件的变化例如可以导致对特异性表位更强的结合亲和性。
[0091] 如本文使用的术语“共刺激域”是指向T细胞提供信号的信号传导部分，所述信号除了由例如TCR/CD3复合物的CD3ζ链提供的初级信号以外，介导T细胞应答，包括但不限于激活、增殖、分化、细胞因子分泌等。共刺激域可以包括但不限于：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和/或特异地结合于CD83和/或靶向于CD83的配体中的全部或一部分。在一些供选择的方案中，共刺激域是与其他胞内介质相互作用以介导包括激活、增殖、分化和细胞因子分泌等的细胞应答的胞内信号传导域。
[0092] 本文使用的“编码”是指在如基因、cDNA或mRNA的多核苷酸中核苷酸的用作模板用于合成其他大分子如定义的氨基酸序列的特异性序列的性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。“编码多肽的核酸序列”包括所有彼此的简并形式和编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
[0093] 如本文使用的“细胞毒性T淋巴细胞”(CTL)是指在其表面上表达CD8的T淋巴细胞(例如，表达CD8+的T细胞，也称为CD8+T细胞或CD8 T细胞，所有这些可以交换地使用)。在一些供选择的方案中，这样的细胞优选为抗原刺激过的“记忆”T细胞(TM细胞)。以相似的方式，表达CD4+的T细胞可以交换地称为CD4+T细胞或CD4T细胞。
[0094] 如本文使用的“中枢记忆”T细胞(“TCM”)是指在其表面上表达CD62L或CCR-7和/或CD45RO，而与初始细胞相比不表达CD45RA或CD45RA表达减少的抗原刺激过的(antigen experienced)CTL。在一些供选择的方案中，中枢记忆细胞对CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和/或CD95的表达呈阳性，和/或与初始细胞相比具有减少的CD45RA表达。
[0095] 如本文使用的“效应记忆”T细胞(或“TEM”)是指与中枢记忆细胞相比在其表面不表达CD62L或CD62L的表达减少，并且与初始细胞相比不表达CD45RA或CD45RA的表达减少的抗原刺激过的T细胞。在一些供选择的方案中，与初始细胞或中枢记忆细胞相比，效应记忆细胞对于CD62L和/或CCR7的表达呈阴性，并具有可变的CD28和/或CD45RA的表达。
[0096] 如本文使用的“初始”T细胞是指与中枢记忆细胞或效应记忆细胞相比表达CD62L和/或CD45RA，和/或不表达CD45RO的未经抗原刺激过的T淋巴细胞。在一些供选择的方案中，初始CD8+T淋巴细胞被表征为表达初始T细胞的表型标记(包括CD62L、CCR7、CD28、CD127和/或CD45RA)。
[0097] 如本文使用的“效应”“TE”T细胞是指与中枢记忆T细胞或初始T细胞相比，具有减少的CD62L、CCR7、CD28或CD62L、CCR7、CD28表达，和/或对于颗粒酶B和/或穿孔素呈阳性的抗原刺激过的细胞毒性T淋巴细胞。
[0098] 如本文描述的“T细胞前体”指可以迁移至胸腺并成为不表达T细胞受体的T细胞前体的淋巴样前体细胞。所有T细胞来源于骨髓中的造血干细胞。来自造血干细胞的造血祖细胞(淋巴系祖细胞)位于胸腺并通过细胞分裂扩增以产生一大群不成熟的胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，并且因此被分类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着胸腺细+ + + -胞通过发育进展，它们成为双阳性胸腺细胞(CD4CD8)，并且最终成熟为单阳性(CD4 CD8或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放至外周组织。
[0099] 大约98％的胸腺细胞在胸腺中的发育过程中通过阳性选择或阴性选择失败而死亡，而其他2％的胸腺细胞存活并离开胸腺成为成熟的免疫活性T细胞。
[0100] 前体T细胞的双阴性(DN)阶段集中于产生功能性β-链，而双阳性(DP)阶段集中于产生功能性α-链，最终产生功能性αβT细胞受体。由于发育中的胸腺细胞进展经过4个DN阶段(DN1、DN2、DN3和DN4)，T细胞表达不变的α-链但是重排β-链基因座。如果重排的β-链成功地与不变的α-链配对，产生停止β-链的重排(并沉默交互等位基因)，并且导致产生细胞增殖的信号。虽然这些信号需要在细胞表面处的这种前-TCR，但是他们依赖于结合于前-TCR的配体。这些胸腺细胞然后将表达CD4和CD8两者并进展至发生α-链选择的双阳性(DP)阶段。如果重排的β-链没有导致任意信号传导(例如由于不能与不变的α-链配对)，细胞可能由于被忽略而死亡(缺少信号传导)。
[0101] 如本文描述的“造血干细胞”或“HSC”，是可以引起骨髓系细胞的前体细胞，所述骨髓系细胞例如巨噬细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞和淋巴系(例如T细胞、B细胞、NK细胞)。HSC具有异源群体，其中存在三类干细胞，通过他们的在血液中淋巴系与骨髓系后代的比例(L/M)区分他们。
[0102] 如本文描述的“靶向(Targeting)”，“靶向(target)”是指结合于配体的能力，其中分子对其是特异性。“特异性的”或“特异性”可以指用于结合配偶体的配体的特征，或可替换地用于配体的结合配偶体的配体的特征，并且可以包括用于结合的互补形状、电荷和疏水特异性。结合的特异性可以包括立体特异性、区域选择性和化学选择性。
[0103] 如本文使用的“富集的”和“贫化的”用于描述在混合物中的细胞类型的量，是指使细胞的混合物经历方法或步骤，导致“富集的”类型细胞的数量的增加，以及“贫化的”细胞的数量减少。因此，根据经历富集方法的细胞的原始群的来源，混合物或组合物可含有60、70、80、90、95％或99％或更多(数量或计数)的“富集的”细胞和40、30、20、10、5％或1％或更少(数量或计数)的“贫化的”细胞。
[0104] 如本文使用的“表位”指被包括抗体、T细胞和/或B细胞的免疫系统识别的抗原或分子的一部分。表位通常具有至少7个氨基酸，并且可以是线性的或构象的。
[0105] 当“分离的”用于描述本文公开的不同的多肽时，意思是已经从其自然环境的组分中鉴别和分开和/或回收的多肽或核酸。优选地，分离的多肽或核酸不与所有与其自然关联的组分关联。其自然环境的污染组分是将典型地干扰多肽或核酸的诊断或治疗用途并且可以包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质的物质。
[0106] 如本文使用的“胞内信号传导域”指提供淋巴细胞的激活的分子(这里是嵌合受体分子)的一个或多个域的全部或部分。这样的分子的胞内域通过与胞内介质相互作用介导信号，导致增殖、分化、激活和其他效应功能。在一些供选择的方案中，这样的分子包括CD28、CD3或4-1BB的全部或部分或其组合。胞内信号传导域包括共刺激域。
[0107] 如本文使用的“配体”指特异性结合另一种物质以形成复合物和/或靶向于另一种物质的物质。配体的例子包括抗原上的表位，结合于受体、底物、抑制剂、激素和/或激活剂的分子。如本文使用的“配体结合域”指结合于配体的物质或物质的一部分。配体结合域的例子包括抗体的抗原结合部分、受体的胞外域和/或酶的活性位点。
[0108] 如本文使用的“可操作地连接”指调控序列和异源核酸序列间的功能性连接导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列以功能性关系放置时，则第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。比如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接于编码序列。一般地，可操作地连接的DNA是连续的，并且，必要时在相同的读码框内连接两个蛋白编码区。
[0109] 关于本文鉴别的嵌合受体多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列一致性”被定义为在比对序列，并如需要引入空缺以获得最大百分比序列一致性，并不考虑任意保守置换作为序列一致性的一部分之后，在与配体结合域、间隔区、跨膜域和/或淋巴细胞激活域中的每一个的参比序列中的氨基酸残基一致的候选序列中氨基酸残基的百分比。以确定百分比氨基酸序列一致性的为目的的比对，可以以多种本领域技术中的方法完成比对，比如，使用公开可获得的电脑软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。
[0110] 本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适的参数，包括用于获得对要比较的序列的全长的最大对比需要的任意算法。例如，使用WU-BLAST-2计算机程序[Altschul等人，Methods in Enzymology，266：460-480(1996)]产生的％氨基酸序列一致性值使用数个搜索参数，其中大多数设置为缺省值。不设置为缺省值的那些值(即可调参数)设置为以下值：重叠跨距＝1，重叠分数＝0.125，词阈值(T)＝11以及打分矩阵＝BLOSUM62。通过将(a)表2中提供的参比嵌合受体序列的每个或所有多肽氨基酸序列与通过WU-BLAST-2测量的感兴趣的对比氨基酸序列之间的匹配一致的氨基酸残基的数量除以(b)感兴趣的多肽的氨基酸残基总数来确定％氨基酸序列一致性值。
[0111] 如本文使用的“嵌合受体变体多肽”或“嵌合受体变体核酸序列”是指如下定义的编码多肽的核酸分子，即该核酸分子与图5、7、9或11所示的多核苷酸序列或其特异地衍生的片段，如编码抗原结合域的多核苷酸、编码间隔区的多核苷酸、编码跨膜域的多核苷酸和/或编码淋巴细胞刺激域的多核苷酸具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列一致性。通常，多肽或其片段的嵌合受体变体与如图5、7、9或11中所示的核酸序列或其衍生的片段具有至少80％、85％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列一致性，更优选至少81％的核酸序列一致性，更优选至少82％的核酸序列一致性，更优选至少83％的核酸序列一致性，更优选至少84％的核酸序列一致性，更优选至少85％的核酸序列一致性，更优选至少86％的核酸序列一致性，更优选至少87％的核酸序列一致性，更优选至少88％的核酸序列一致性，更优选至少89％的核酸序列一致性，更优选至少90％的核酸序列一致性，更优选至少91％的核酸序列一致性，更优选至少92％的核酸序列一致性，更优选至少93％的核酸序列一致性，更优选至少94％的核酸序列一致性，更优选至少95％的核酸序列一致性，更优选至少96％的核酸序列一致性，更优选至少97％的核酸序列一致性，更优选至少98％的核酸序列一致性以及又更优选至少99％的核酸序列一致性。变体不涵盖天然的核苷酸序列。就这一点而言，因为遗传密码的简并性，本领域普通技术人员会立刻认识到大量与图5、7、9或11的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列一致性的嵌合受体变体多核苷酸。
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列一致性，更优选至少81％的核酸序列一致性，更优选至少82％的核酸序列一致性，更优选至少83％的核酸序列一致性，更优选至少84％的核酸序列一致性，更优选至少85％的核酸序列一致性，更优选至少86％的核酸序列一致性，更优选至少87％的核酸序列一致性，更优选至少88％的核酸序列一致性，更优选至少89％的核酸序列一致性，更优选至少90％的核酸序列一致性，更优选至少91％的核酸序列一致性，更优选至少92％的核酸序列一致性，更优选至少93％的核酸序列一致性，更优选至少94％的核酸序列一致性，更优选至少95％的核酸序列一致性，更优选至少96％的核酸序列一致性，更优选至少97％的核酸序列一致性，更优选至少98％的核酸序列一致性以及又更优选至少99％的核酸序列一致性。变体不涵盖天然的核苷酸序列。就这一点而言，因为遗传密码的简并性，本领域普通技术人员会立刻认识到大量与图5、7、9或11的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列一致性的嵌合受体变体多核苷酸。
[0112] 基本上纯化的”指基本上没有其他分子类型的分子或基本上没有其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指已经从在其处于天然存在状态时与其通常相关的其他细胞类型中分离的细胞。在某些情况下，基本上纯化的细胞群指细胞的同源群体。
[0113] 当“大体上没有发现”用于参比中时，在正常细胞上的肿瘤抗原或其他分子的存在指具有抗原或分子的正常细胞类型的百分比和/或在细胞上的抗原的密度。在一些供选择的方案中，大体上没有发现的意思是与在肿瘤细胞或其他疾病细胞上发现的细胞的量或抗原的量相比，抗原或分子在小于50％的正常细胞类型上发现，和/或小于50％的密度。
[0114] 如本文使用的“T细胞”或“T淋巴细胞”可以来自任意哺乳动物物种，优选灵长类动物物种，包括猴子、狗和人。在一些供选择的方案中，T细胞是同种异体的(来自同物种但不同供体)作为受体受试者；在一些供选择的方案中，T细胞是自体的(供体和受体相同)；在一些供选择的方案中，T细胞是同源的(供体和受体不同但是同卵双胞胎)。
[0115] “特异性的”或“特异性”可以指用于结合配偶体的配体的特征，或可替换地用于配体的结合配偶体的配体的特征，并且可以包括用于结合的互补形状、电荷和疏水特异性。结合的特异性可以包括立体特异性、区域选择性和化学选择性。
[0116] 在一些供选择的方案中，描述了间隔区，这样的间隔区对配体是特异性的。对配体特异性的间隔区可指可以使配体结合域对特异的或靶向的配体的结合或靶向提高的特异性多肽长度，以使间隔区提供应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生增加。
[0117] 如本文描述的“靶向”是指对外来靶标如蛋白表位的独特部分的识别。靶向也可以指结合或识别也被称为抗原的蛋白特异性区域。相似的抗原位点也可以通过靶向抗体被识别，可导致抗体能够与不同蛋白上的相似抗原位点反应，由此导致产生交叉反应抗体。
[0118] “细胞活性”可以指体液应答、基于细胞的免疫应答、细胞应答、成熟途径、生长途径和/或具体细胞群的应答性。在一些供选择的方案中，提供了嵌合抗原受体，其中嵌合抗原受体包括间隔区。在一些供选择的方案中，间隔区提供了提高的或改善的T细胞增殖，提高的和/或改善的体内细胞活性，和/或细胞产生。
[0119] 本文提供的是嵌合受体核酸和包括这样的核酸的载体和宿主细胞。嵌合受体核酸包括大量的可以切除和用其他组件替换以定制靶向特异性靶分子的嵌合受体的模块组件。本公开提供模块组件中的一种是间隔区组件。惊人地发现间隔区的长度影响修饰为表达嵌合受体的T细胞在体内的效果，并可以针对个体的靶分子定制以提高治疗活性。
[0120] 在一个方面，提供了方法和核酸构建体以设计嵌合受体，所述嵌合受体与参比嵌合受体相比具有应答配体的提高或改善的肿瘤识别，增加的细胞增殖和/或细胞因子产生，尤其在体内，和/或与参比嵌合受体相比，所述嵌合受体在特异性结合于抗原受体或靶向于抗原受体后，导致承载嵌合受体的细胞的存活率增加。
[0121] 在一些供选择的方案中，参比嵌合受体是在其他方面与主题嵌合受体相同的嵌合受体，除了在间隔区具有一个或多个修饰以外，如在连接受体的配体结合域如抗体片段和受体的跨膜部分和/或胞内部分的多肽间隔区。例如，在一些供选择的方案中，参比嵌合受体与主题受体相同，除了具有长度或序列不同的间隔区以外，例如，与主题嵌合受体相比更长的间隔区，如是主题嵌合受体的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍数量的氨基酸的长度的间隔区。
[0122] 在一些供选择的方案中，提供了核酸文库，其中每种核酸编码与其他间隔区在序列和/或长度上不同的间隔区。每种核酸可以用于形成可在体内(在动物模型中)和/或在体外测试的嵌合受体核酸构建体，以便可选择提供针对配体应答的提高或改善的肿瘤识别，增加的T细胞增殖和/或细胞因子产生的间隔区。
[0123] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括编码配体结合域的多核苷酸，其中配体是肿瘤抗原，编码定制的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，所述间隔区是优化的。
[0124] 嵌合受体的设计可以根据肿瘤的类型、肿瘤上存在的靶抗原或分子、抗体对靶分子的亲和性、抗原结合域所需的柔性和/或胞内信号传导域定制。在一些供选择的方案中，在体外和在体内模型中测试大量嵌合受体构建体以确定用受体修饰的T细胞在免疫缺陷小鼠中杀伤肿瘤细胞的能力和过继转移后增殖和存留的能力。
[0125] 根据靶分子是否存在于受试者的肿瘤细胞上，嵌合受体包括特异性结合于和/或靶向于该靶分子的配体结合域。在一些供选择的方案中，受试者的肿瘤细胞以细胞表面肿瘤分子为特征。基于对在具体受试者的肿瘤细胞上存在的靶分子的确定，可选择靶分子。在一些供选择的方案中，选择是显著地在肿瘤细胞上发现并且未在正常组织以任何大量的程度发现的细胞表面分子的靶分子或其表位。在一些供选择的方案中，选择抗体以结合于靶细胞表面分子上的表位。在一些供选择的方案中，靶分子是CD171。在一些供选择的方案中，嵌合受体特异性结合于和/或靶向于由称为CE7的抗体识别的CD171上的表位，和/或CD171的表位或另一种抗原的表位，所述表位具有与CD171+细胞的表面质膜相同或相似的距离。在一些供选择的方案中，抗原具有与CD171的胞外部分相似大小或长度的胞外部分，并由此相似的嵌合受体构型是合适的。
[0126] 另外，可以使嵌合受体的间隔区改变以提高或改善T细胞对靶细胞上的配体的识别。在一些供选择的方案中，间隔区选自15个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)的短间隔区，如15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸或根据任意两个前述的长度限定的范围内的氨基酸的数量的短间隔区。在一些供选择的方案中，间隔区选自119个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)的中等间隔区，如119、115、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20或15个氨基酸或根据任意两个前述的长度限定的范围内的氨基酸的数量的中等间隔区。在一些供选择的方案中，间隔区选自229个氨基酸或更少(但不小于1个或2个氨基酸)的长间隔区，如229、225、220、215、210、205、200、195、190、
185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125或120个氨基酸或根据任意两个前述的长度限定的范围内的氨基酸的数量的长间隔区。在一些供选择的方案中，间隔区是Fc受体的铰链区或修饰的铰链区。在一些供选择的方案中，间隔区是与CH2或CH3或两者结合的铰链区。在一些供选择的方案中，间隔区包括氨基酸序列X1PPX2P。在供选择的方案中，间隔区不包括全长的Fc受体，和/或不包括CH2和/或CH3域。在某些这样的供选择的方案中，间隔区包括抗体铰链区。
185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125或120个氨基酸或根据任意两个前述的长度限定的范围内的氨基酸的数量的长间隔区。在一些供选择的方案中，间隔区是Fc受体的铰链区或修饰的铰链区。在一些供选择的方案中，间隔区是与CH2或CH3或两者结合的铰链区。在一些供选择的方案中，间隔区包括氨基酸序列X1PPX2P。在供选择的方案中，间隔区不包括全长的Fc受体，和/或不包括CH2和/或CH3域。在某些这样的供选择的方案中，间隔区包括抗体铰链区。
[0127] 可采用各种初级胞内信号传导域和共刺激胞内信号传导域的组合以提高嵌合受体的在体内的效果。在一些供选择的方案中，可以在体内动物模型中测试嵌合受体的不同的构建体以确定对肿瘤杀伤的效果。在一些供选择的方案中，共刺激胞内信号传导域选自由CD28和其修饰的形式、4-1BB和其修饰的形式和/或其组合组成的组。可以将其他共刺激域，如OX40并入。在一些供选择的方案中，受体的共刺激胞内信号传导部分仅包括源自单个共刺激分子的胞内域，如仅4-1BB或仅CD28，并且不进一步含有来自另一种这样的分子的这样的域。
[0128] 在一些供选择的方案中，在CD4+嵌合受体修饰的细胞，例如CD171特异性和/或靶向CD171的嵌合受体修饰的T细胞的存在或不存在下，施用嵌合受体修饰的，例如CD171特异性和/或靶向CD171的嵌合受体修饰的细胞，例如由分类纯化的CD8+中枢记忆T细胞制备的细胞毒性T细胞。在一些供选择的方案中，肿瘤特异性或靶向肿瘤的表达CD4+的T细胞发挥抗肿瘤反应性并在体外和在体内对肿瘤特异性的表达CD8+的T细胞提供帮助。在特定的方案中，肿瘤特异性或靶向肿瘤的表达CD4+的T细胞或选自初始亚集或中枢记忆亚集的表达CD4+的T细胞被单独使用或与CD8+TCM联合使用。
[0129] 在一些供选择的方案中使用表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继免疫疗法对治疗或抑制癌症是有用的。在一些供选择的方案中，制备了针对抗原CD171(L1CAM)的表位的CAR。这样的CAR构建体对治疗或抑制表达CD171(L1CAM)的任何癌症是有用的。在一些供选择的方案中，一种表达CD171的癌症是成神经细胞瘤(NB)。CD171在100％的高风险NB中表达。被认为过表达CD171的其他癌症包括黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌和成胶质细胞瘤。
[0130] 本公开提供了对转化或转导淋巴细胞以用于过继免疫治疗有用的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，核酸含有大量提供核酸元件容易置换的模块组件。不意图限定本公开的范围，认为每种肿瘤抗原的嵌合受体根据组件希望地被定制以提供在哺乳动物细胞中的的体内效果和有效表达。例如，在特定的实施方式中，对于包括结合于CD171L1CAM表位的scFV的嵌合受体的有效性，如与识别被视为CE7的抗体的表位相同或相似的表位，或CD171或距表面质膜相同的相对距离的其他抗原上的表位，采用15个氨基酸或更小(但不小于1个或2个氨基酸)的间隔区。在一些供选择的方案中，表达载体包括如本文描述的嵌合核酸。由嵌合受体核酸的所有或部分编码的多肽也包括在本文中。
[0131] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括编码配体结合域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域特异地结合于和/或靶向于CD171或CD171的肿瘤限制性表位。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体或其片段。可以容易地确定编码抗体或其结合片段的核酸序列。在特定的供选择的方案中，多核苷酸编码特异性结合和/或靶向CD171(L1CAM)的单链Fv。示例性抗体是CE7抗体。在图5中提供了CE7scFv的示例性核酸序列。其他抗体的序列是已知的或可以容易地由本领域技术人员确定的。
[0132] 肿瘤抗原是由引起免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的配体结合域的选择将取决于要治疗或抑制的癌症的类型，并可靶向于肿瘤抗原或其他肿瘤细胞表面分子。来自受试者的肿瘤样品可以某些生物标记或细胞表面标记的存在为特征。例如，来自受试者的成神经细胞瘤细胞以CD171(L1CAM)的存在为特征。其他癌症或肿瘤细胞也可以CD171(L1CAM)的存在为特征并用本文描述的组合物治疗或抑制。在一些供选择的方案中，靶分子是在肿瘤细胞上发现的细胞表面分子，并且是在正常组织上基本不能发现，或对其在非关键正常组织的表达是受限制的。
[0133] 一旦鉴别了可以用嵌合受体靶向的肿瘤细胞表面分子，则选择和表征靶分子的表位。L1CAM是涉及神经元的细胞粘附的细胞膜分子。L1CAM具有数个域，包括第1-19位氨基酸的信号肽、第35-125位氨基酸的Ig样C2类型1、第139-226位氨基酸的Ig样C2类型2、第240-328位氨基酸的Ig样C2类型3、第333-420位氨基酸的Ig样C2类型4、第425-507位氨基酸的Ig样C2类型5、第518-607位氨基酸的Ig样C2类型6、第615-712位氨基酸的纤链蛋白类型III1、第717-810位氨基酸的纤链蛋白类型III2、第814-916位氨基酸的纤链蛋白类型III3、第
920-1015位氨基酸的纤链蛋白类型III4和第1016-1115位氨基酸的纤链蛋白类型III5。在任意的这些域中可以发现表位。已经被表征的一个表位被称为CE7表位。CE7表位是与正常组织相比更常在肿瘤细胞上被发现的表位。在一些供选择的方案中，选择在肿瘤细胞上比在健康细胞上更常发现的CD171的表位。
920-1015位氨基酸的纤链蛋白类型III4和第1016-1115位氨基酸的纤链蛋白类型III5。在任意的这些域中可以发现表位。已经被表征的一个表位被称为CE7表位。CE7表位是与正常组织相比更常在肿瘤细胞上被发现的表位。在一些供选择的方案中，选择在肿瘤细胞上比在健康细胞上更常发现的CD171的表位。
[0134] 可以使用获得单克隆抗体的方法、噬菌体展示的方法、产生人抗体或人源化抗体的方法或使用工程化为产生人抗体的转基因动物或植物的方法制备特异地结合和/或靶向于肿瘤细胞表面分子的抗体。部分或完全合成抗体的噬菌体展示文库是可获得的，并且可筛选用于可结合于靶分子的抗体或其片段。人抗体的噬菌体展示文库也是可获得的。在一些供选择的方案中，抗体特异地结合和/或靶向于肿瘤细胞表面分子，并且不与非特异性组分如牛血清白蛋白或其他不相关抗原交叉反应。一旦鉴别，可以分离和/或确定编码抗体的氨基酸序列或多核苷酸序列。
[0135] 抗体或抗原结合片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微体和线性抗体中的全部或部分。抗体片段包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区，并且可以被容易地制备。抗体片段的例子包括：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双价抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。许多抗CD171抗体是已知的并且可商购获得。
[0136] 在一些供选择的方案中，可以分离和表征大量结合于具体肿瘤细胞表面分子的不同抗体。在一些供选择的方案中，基于靶分子的表位特异性和/或靶向表征抗体。另外，在某些情况下，可以基于抗体对表位的亲和性选择结合于相同表位的抗体。在一些供选择的方案中，抗体具有至少1mM以及优选＜50nM的亲和性。在一些供选择的方案中，选择与其他抗体相比对表位具有更大亲和性的抗体。在一些供选择的方案中，选择亲和性为结合于相同表位的参比抗体的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至少50倍的抗体。
[0137] 在一些供选择的方案中，编码配体结合域的多核苷酸可操作地连接至编码间隔区的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码配体结合域的多核苷酸也可以在编码序列的5’和/或3’端具有一个或多个限制性酶切位点，以用编码不同抗原的或具有不同结合特征的、编码配体结合域的另一个多核苷酸提供该多核苷酸的容易的切除和替换。例如，在前导序列的上游编码限制性酶切位点NheI；以及位于铰链区内的3’RsrII使得将任何希望的scFv亚克隆至嵌合受体载体。在一些供选择的方案中，针对在哺乳动物细胞中的表达密码子优化多核苷酸。
[0138] 在一些供选择的方案中，编码配体结合域的多核苷酸可操作地连接于信号肽。在一些供选择的方案中，信号肽是用于粒细胞集落刺激因子的信号肽。可以利用编码其他信号肽如CD8α的多核苷酸。
[0139] 一些供选择的方案中，编码配体结合域的多核苷酸可操作地连接于启动子。选择提供在哺乳动物细胞中表达嵌合抗原受体的启动子。在具体的供选择的方案中，启动子是延长生长因子启动子(EF-1)。适用的启动子的另一个例子是立早巨细胞病毒(CMV)启动子序列。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV 40)早期启动子、小鼠乳瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MuMoLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒立早启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子如，但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。诱导型启动子也是预期的。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、黄体酮启动子和四环素启动子。编码配体结合域的多核苷酸的具体的供选择的方案作为来自特异地结合和/或靶向于CD171上的表位的抗体的scFv示于图5。
[0140] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括编码间隔区的多核苷酸。已经惊人地发现间隔区的长度影响修饰为表达嵌合受体的T细胞的体内效率，并且可以针对个体靶分子定制以具有最优的肿瘤或靶细胞识别。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括编码可定制的间隔区的多核苷酸，所述多核苷酸选自编码间隔区的多核苷酸文库。在一些供选择的方案中，基于表位的位置、抗体对表位的亲和性和/或表达嵌合受体的T细胞应答抗原识别在体外和/或体内增殖的能力，选择间隔区长度。
[0141] 典型地，在嵌合受体的配体结合域和跨膜域之间发现间隔区。在一些供选择的方案中，间隔区提供配体结合域的柔性并使得在淋巴细胞中高表达水平。具有229个氨基酸的间隔区的CD171特异性和/或靶向CD171的嵌合受体具有比具有由15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)组成的短间隔区的CD171特异性和/或靶向CD171的嵌合受体低的体内抗肿瘤活性。
[0142] 在一些供选择的方案中，间隔区具有至少10至229个氨基酸、10至200个氨基酸、10至175个氨基酸、10至150个氨基酸、10至125个氨基酸、10至115个氨基酸、10至100个氨基酸、10至75个氨基酸、10至50个氨基酸、10至40个氨基酸、10至30个氨基酸、10至20个氨基酸或10至15个氨基酸或通过任意两个前述的氨基酸长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区具有15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)、119个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)或229个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。
[0143] 在一些供选择的方案中，间隔区源自免疫球蛋白样分子的铰链区。在一些供选择的方案中，间隔区包括来自人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4或其修饰的变体的铰链区的全部或部分，并且可以含有一个或多个氨基酸置换。在表6中提供了铰链区的示例性序列。在一些供选择的方案中，铰链区的部分包括在可变区重链和核心之间发现的上部铰链氨基酸和包括聚脯氨酸区的核心铰链氨基酸。典型地，上部的铰链区具有3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在某些情况下，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。在一些供选择的方案中，X1是半胱氨酸、甘氨酸或精氨酸，以及X2是半胱氨酸或苏氨酸。
[0144] 在一些供选择的方案中，可以用一个或多个氨基酸修饰铰链区序列以避免不希望的结构性相互作用如二聚化。在具体的供选择的方案中，间隔区包括来自IgG4的修饰的人铰链区的部分，例如如表1或表6所示。在表1中提供了编码修饰的IgG4铰链区的部分的多核苷酸的代表。在一些供选择的方案中，铰链区可以与表1或表6中鉴别的铰链区氨基酸序列具有至少90％、92％、95％或100％的序列一致性。在具体的供选择的方案中，来自IgG4的人铰链区的部分在从CPSP至CPPC的核心氨基酸中具有氨基酸置换。
[0145] 在一些供选择的方案中，铰链区的全部或部分与免疫球蛋白的恒定区的一个或多个域结合。例如铰链区的部分可以与CH2或CH3域的部分或其变体结合。在一些供选择的方案中，间隔区不包括来自CD8α、全长Fc受体和/或由CD28分子的胞外部分组成的间隔区的第47-48位氨基酸的铰链区序列。
[0146] 在一些供选择的方案中，短间隔区具有15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)，并包括IgG4铰链区序列的全部或部分或其变体，中等间隔区具有119个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)，并包括IgG4铰链区序列的全部或部分和CH3区或其变体，以及长间隔区具有229个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)，并包括IgG4铰链区序列的全部或部分、CH2区和CH3区或其变体。
[0147] 可以容易地通过合成或重组方法由氨基酸序列制备编码间隔区的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码间隔区的多核苷酸可操作地连接于编码跨膜区的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码间隔区的多核苷酸也可以在编码序列的5’和/或3’端具有一个或多个限制性酶切位点，以用另一种编码不同间隔区的多核苷酸提供该多核苷酸的容易的切除和替换。在一些供选择的方案中，针对在哺乳动物细胞，优选人细胞中的表达密码子优化编码间隔区的多核苷酸。
[0148] 在一些供选择的方案中，提供了每种编码不同间隔区的多核苷酸文库。在一些供选择的方案中，间隔区选自由来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其部分的铰链区序列，来自与CH2区或其变体的全部或部分组合的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区序列，来自与CH3区或其变体的全部或部分组合的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区序列和来自与CH2区或其变体和CH3区或其变体的全部或部分组合的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区序列组成的组。在一些供选择的方案中，短间隔区是具有15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)的修饰的IgG4铰链序列，中等间隔区是具有119个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)的具有CH3序列的IgG4铰链序列(SEQ ID NO：49)；或具有229个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)的具有CH2和CH3区的IgG4铰链序列。
[0149] 在一些供选择的方案中，本文提供了针对嵌合受体选择间隔区的方法。惊人地，一些嵌合受体构建体虽然对激活T细胞和指导其对体外肿瘤细胞的杀伤是有效的，但是在体内是无效的。另外，嵌合受体修饰的T细胞的副作用谱可以如导致更多细胞经历激活诱导的细胞死亡或引起体内细胞因子的增加。在一些供选择的方案中，方法包括：提供多种嵌合受体核酸，其中嵌合受体核酸区别仅在于间隔区；将每种嵌合受体核酸引入单独的T淋巴细胞群；在体外扩增每个单独的淋巴细胞群；以及将每个淋巴细胞群引入荷瘤动物以确定每种嵌合受体当在T细胞中表达时的抗肿瘤效果；以及选择与用每种其他嵌合受体修饰的每个其他单独的淋巴细胞群相比，提供抗肿瘤效果的嵌合受体。
[0150] 不同肿瘤的动物模型是已知的。通过鉴别肿瘤体积的减小，通过确定动物死亡、基因修饰的T细胞的体内存留、基因修饰的T细胞的激活(例如通过检测CD25和/CD69的表达的增加)和/或基因修饰的T细胞的体内增殖，可以测量抗肿瘤效果。在一些供选择的方案中，选择如通过一个或多个这些参数确定的提供最佳体内抗肿瘤效果的嵌合受体。通过基因修饰的淋巴细胞在体内的存留、动物死亡、如通过半胱天冬酶-3诱导的增加测量的细胞凋亡增加和/或基因修饰的淋巴细胞增殖的减少，可以确定抗肿瘤效果的缺乏。
[0151] 在一些供选择的方案中，选择提供通过在体内和/或体外两代增殖的至少30％的细胞的嵌合受体。在其他供选择的方案中，如果嵌合受体导致72小时内至少50％的细胞经历激活诱导的细胞死亡，则不选择该嵌合受体。
[0152] 在一些供选择的方案中，提供多种嵌合受体核酸，其中嵌合受体核酸区别仅在于间隔区，所述嵌合受体核酸包括提供包括编码配体结合域的多核苷酸的嵌合受体构建体，其中配体是肿瘤特异性和/或肿瘤靶向抗原，或表达于靶细胞群上的任何其他分子，所述靶细胞群适于介导由淋巴细胞进行的识别和清除；编码具有定义的限制性位点的第一多肽间隔区的多核苷酸，所述限制性位点在第一多肽间隔区的编码序列的5’和3’端；编码跨膜域的多核苷酸；以及编码一个或多个胞内信号传导域的多核苷酸。
[0153] 在一些供选择的方案中，方法进一步包括提供一种或多种多核苷酸，每种多核苷酸编码不同的间隔区。在图5、7和9中提供了示例性构建体。在一些供选择的方案中，方法进一步包括用编码不同间隔区的多核苷酸替换编码间隔区的多核苷酸，以形成具有不同间隔区的嵌合受体核酸。可以重复方法以形成任何数量的嵌合受体核酸，每种嵌合受体核酸区别在于间隔区。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸与另一种嵌合受体核酸区别仅在于间隔区。
[0154] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括编码跨膜域的多核苷酸。跨膜域提供嵌合受体在膜中的锚定。在一些供选择的方案中，使用与嵌合受体中的域中的一个天然相关的跨膜域。在一些情况下，可以通过氨基酸置换选择或修饰跨膜域以避免这样的域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜域结合以使与受体复合物的其他膜的相互作用最小化。
[0155] 跨膜域可以源自天然来源或合成来源。当来源是天然的时，域可以源自任意膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区至少包括T细胞受体CD28、CD3、CD45、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154的α、β或ζ链的跨膜区。在具体的供选择的方案中，跨膜域包括如表1所示的CD28跨膜域的氨基酸序列。编码CD28跨膜域的代表性多核苷酸序列显示于表1(SEQ ID NO：5)中。
[0156] 跨膜域可以是合成的或天然存在的跨膜域的变体。在一些供选择的方案中，合成跨膜域或变体跨膜域主要包括疏水残基如亮氨酸和缬氨酸。在一些供选择的方案中，跨膜域与如表1或表3所示的跨膜域可以具有至少80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸序列一致性。变体跨膜域优选具有如由Kyte Doolittle计算的至少50的疏水分数。
[0157] 可以通过合成或重组方法制备编码跨膜域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码跨膜域的多核苷酸可操作地连接于编码胞内信号传导区的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码跨膜域的多核苷酸也可以在编码序列的5’和/或3’端具有一个或多个限制性酶切位点，以用另一种编码不同跨膜域的多核苷酸提供编码跨膜域的多核苷酸的容易的切除和替换。在一些供选择的方案中，针对在哺乳动物细胞中的表达密码子优化编码跨膜域的多核苷酸。
[0158] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括编码胞内信号传导域的多核苷酸。胞内信号传导域提供在结合于肿瘤细胞上表达的配体时，激活表达嵌合受体的转导细胞的一个功能。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域含有一个或多个共刺激域。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域是提供激活转导细胞的至少一个功能的胞内信号传导域的部分和/或变体。
[0159] 用于本公开的嵌合受体的胞内信号传导域的例子包括CD3ζ链的胞浆序列，和/或共同起作用以在嵌合受体衔接后起始信号转导的共受体，以及这些序列的任意衍生物或变体和具有相同功能能力的任意合成序列。T细胞激活可以被认为通过两个不同类别的胞浆信号传导序列介导的起始抗原依赖性初级激活并提供T细胞受体样信号的那些胞浆信号传导序列(初级胞浆信号传导序列)和以抗原依赖性方式起作用以提供二级信号或共刺激信号的那些胞浆信号传导序列(二级胞浆信号传导序列)。以刺激方式起作用的初级胞浆信号传导序列可以含有被称为受体酪氨酸基激活基序或ITAM的信号传导基序。含有初级胞浆信号传导序列的ITAM的例子包括源自CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和/或CD66d的那些ITAM。在一些供选择的方案中，初级信号传导胞内域与具有表1中所提供的序列的CD3ζ可以具有至少80％、85％、90％或95％的序列一致性。在一些供选择的方案中，CD3ζ的变体保持如表5所示的至少1个、2个、3个或全部的ITAM区。
[0160] 在优选的供选择的方案中，嵌合受体的胞内信号传导域可以设计为包括单独的CD3-ζ信号传导域或与任意其他希望的胞浆域组合的CD3-ζ信号传导域。例如，嵌合受体的胞内信号传导域可以包括CD3-ζ链和共刺激信号传导区。
[0161] 共刺激信号传导区指包括共刺激分子的胞内域的嵌合受体的部分。共刺激分子是不同于淋巴细胞对抗原应答需要的抗原受体或其配体的细胞表面分子。这样的分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD 137)、OX40、CD30、CD40、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和/或特异性结合于CD83和/或靶向于CD83的配体。在一些供选择的方案中，共刺激信号传导域与如表3所示的CD28的胞内域或与具有表4中提供的序列的4-1BB可以具有至少80％、85％、90％或95％的氨基酸序列一致性。在一些供选择的方案中，CD28胞内域的变体包括在第186-187位的氨基酸置换，其中用GG置换LL。
[0162] 嵌合受体的胞内信号传导序列可以以随机或特定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选长度为2至10个氨基酸，可以形成连键。在一种供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3-ζ或其变体的信号传导域的全部或部分和CD28或其变体的信号传导域的全部或部分。在另一种供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3-ζ或其变体的信号传导域的全部或部分和4-1BB或其变体的信号传导域的全部或部分。在又一种供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3-ζ或其变体的信号传导域的全部或部分、CD28或其变体的信号传导域的全部或部分和4-1BB或其变体的信号传导域的全部或部分。在具体的供选择的方案中，包括CD3ζ的变体和4-1BB胞内信号传导域的部分的胞内信号传导域的氨基酸序列提供于表1中。在表1中提供了代表性的核酸序列。
[0163] 在一些供选择的方案中，编码胞内信号传导域的多核苷酸包括连接于CD3-ζ域的一部分的4-1BB胞内域。在其他供选择的方案中，胞内信号传导域包括仅单个共刺激域，并且不包括双共刺激域，如与4-1BB共刺激域结合的CD28域(cyto)。
[0164] 在一些供选择的方案中，在图11中提供了编码胞内信号传导域的多核苷酸，所述胞内信号传导域包括连接于4-1BB胞内域的CD28域，4-1BB胞内域连接于CD3-ζ域的部分。可以通过合成或重组方法由氨基酸序列容易地制备编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码胞内信号传导域的多核苷酸也可以在编码序列的5’和/或3’端具有一个或多个限制性酶切位点，以用另一种编码不同胞内信号传导域的多核苷酸提供编码胞内信号传导域的多核苷酸的容易的切除和替换。在一些供选择的方案中，针对在哺乳动物细胞，优选人细胞中的表达密码子优化编码胞内信号传导域的多核苷酸。
[0165] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸任选地进一步包括编码标记的多核苷酸序列。标记序列优选编码可以允许选择转导细胞和/或鉴别转导细胞的细胞表面表达的标记。在一些供选择的方案中，标记序列可操作地连接于编码接头序列的多核苷酸序列。在一些供选择的方案中，接头序列是可切割的接头序列。
[0166] 可以采用大量不同的标记序列。典型地，标记序列具有允许选择转导细胞和/或检测转导细胞的功能性特征。在一些供选择的方案中，标记序列与人淋巴细胞的转导相容。
[0167] 阳性的选择性标记可以是基因，该基因在引入宿主细胞时表达允许对携带该基因的细胞的阳性选择的显性表型。该类型的基因是本领域已知的，并且包括尤其是给予潮霉素B抗性的潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)、来自Tn5的编码抗生素G418抗性的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、腺苷脱氨酶基因(ADA)和/或多药抗性(MDR)基因。
[0168] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记的多核苷酸。在一些供选择的方案中，标记序列编码在细胞表面表达的截短的表皮生长因子受体。在供选择的方案中，截短的表皮生长因子受体的示例性多核苷酸示于表1中。在一些供选择的方案中，编码标记的多核苷酸可操作地连接于编码接头序列的多核苷酸。在具体的供选择的方案中，接头序列是可切割的接头序列T2A，如表1所示。在表1中提供了编码T2A接头的示例性多核苷酸序列。
[0169] 可以通过合成或重组方法从氨基酸序列容易地制备编码标记的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码标记的多核苷酸可操作地连接于编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码标记的多核苷酸序列也可以在编码序列的5’和/或3’端具有一个或多个限制性酶切位点，以用另一种编码不同标记的多核苷酸提供编码标记的多核苷酸的容易的切除和替换。在一些供选择的方案中，针对在哺乳动物细胞中的表达密码子优化编码标记的多核苷酸。
[0170] 本文描述的组合物提供CD4+和/或CD8+T淋巴细胞。可以根据已知的技术收集T淋巴细胞，并且可以通过已知的技术富集或贫化细胞，如亲和性结合于抗体如流式细胞术和/或免疫磁性选择。在富集和/或贫化步骤之后，可以根据已知的技术进行希望的T淋巴细胞的体外扩增(包括但不限于Riddell等人的美国专利号6,040,177)或对于本领域技术人员来说明显的其改变进行体外扩增希望的T淋巴细胞。在一些供选择的方案中，T细胞是获得自患者的自体T细胞。
[0171] 例如，可以通过以下方法扩增希望的T细胞群或亚群，即在体外将初始T淋巴细胞群添加至培养基中，然后添加至培养基饲养细胞如不分裂的外周血单核细胞(PBMC)，(例如，这样使得产生的细胞群对于要扩增的初始群中的每个T淋巴细胞含有至少5、10、20或40或更多个PBMC饲养细胞)；以及温育培养物(例如，温育足以扩增T细胞的数量的时间)。不分裂的饲养细胞可以包括γ-辐射的PBMC饲养细胞。在一些供选择的方案中，用γ射线以3000至3600拉德的范围辐射PBMC以防止细胞分裂。如需要，T细胞和饲养细胞添加至培养基的顺序可以颠倒。可以典型地在适于T淋巴细胞生长的温度等的条件下温育培养物。例如对于人T淋巴细胞的生长，温度一般会在至少25℃，优选至少30℃，更优选37℃。
[0172] 扩增的T淋巴细胞包括可对人肿瘤或病原体上存在的抗原具有特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助T淋巴细胞。任选地，扩增方法可以进一步包括添加不分裂的EBV转化的淋巴样干细胞(LCL)作为饲养细胞的步骤。可以用γ射线以6000至10,000拉德辐射LCL。可以以任何适当的量提供LCL饲养细胞，如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞比为至少10∶1。任选地，扩增方法可以进一步包括将抗CD3和/或抗CD28抗体添加至培养基(例如，浓度为至少0.5ng/ml)的步骤。任选地，扩增方法可以进一步包括将IL-2和/或IL-15添加至培养基(例如，其中IL-2的浓度为至少10个单位/ml)的步骤。在分离T淋巴细胞后，无论在扩增前还是扩增后均可以将细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞两者都分选为初始T细胞、记忆T细胞和效应T细胞亚群。
[0173] 可以通过使用标准方法获得CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，通过鉴别与CD8+T细胞的那些类型中的每一种相关的细胞表面抗原将CD8+T细胞进一步分选为初始细胞、中枢记忆细胞和效应记忆细胞。在一些供选择的方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个亚集中。在用抗CD8和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分。在一些供选择的方案中，中枢记忆TCM的表型标记的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127，并且对颗粒酶B和/或CD45RA呈阴性性或是低的。在一些供选择的方案中，中枢记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+或CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，效应TE对CD62L、CCR7、CD28和/或CD127呈阴性，并且对颗粒酶B和/或穿孔素呈阳性。在一些供选择的方案中，初始CD8+T淋巴细胞被表征为初始T细胞的包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和/或CD45RA的表型标记的表达。
[0174] 可以通过使用对表面标记特异的抗体和同种型匹配对照抗体染色的流式细胞术确定细胞或细胞群对具体的细胞表面标记是否呈阳性。对标记呈阴性的细胞群指不存在高于同种型对照的用特异性抗体进行的细胞群的显著染色，阳性指细胞群的统一染色高于同种型对照。在一些供选择的方案中，一个或多个标记的表达的减少指平均荧光强度损失1log10和/或与参比细胞群相比显示出标记的细胞的百分比减少至少20％的细胞、25％的细胞、30％的细胞、35％的细胞、40％的细胞、45％的细胞、50％的细胞、55％的细胞、60％的细胞、65％的细胞、70％的细胞、75％的细胞、80％的细胞、85％的细胞、90％的细胞、95％的细胞和100％的细胞和20至100％之间的任何％。在一些供选择的方案中，对一个或标记呈阳性的细胞群指与参比细胞群相比显示标记的细胞的百分比为至少50％的细胞、55％的细胞、60％的细胞、65％的细胞、70％的细胞、75％的细胞、80％的细胞、85％的细胞、90％的细胞、95％的细胞和100％的细胞和50至100％之间的任何％。
[0175] 通过鉴别具有细胞表面抗原的细胞群将CD4+T辅助细胞分选为初始细胞、中枢记忆细胞和效应细胞。通过标准方法可以获得CD4+淋巴细胞。在一些供选择的方案中，初始CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+和/或CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和/或CD45RO+。在一些供选择的方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和/或CD45RO-。
[0176] 在一些供选择的方案中，可通过用抗原刺激初始T淋巴细胞或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性CD4+群和CD8+群。例如，可以通过从感染的受试者中分离T细胞并在体外用相同抗原刺激产生针对巨细胞病毒抗原的抗原特异性T细胞系或克隆。也可以使用初始T细胞。可以使用来自肿瘤细胞的任意数量的抗原作为靶标以引起T细胞应答。在一些供选择的方案中，过继细胞免疫治疗组合物在对包括实体瘤、恶性血液肿瘤、乳腺癌或黑色素瘤的疾病或紊乱的治疗中是有用的。
[0177] 在一些供选择的方案中，根据本发明将功能性基因引入待用于免疫治疗的T细胞可以是希望的。例如，引入的基因或多种基因可以通过促进转移的T细胞的生活力和/或功能提高或改善治疗的效果；或所述基因可以提供遗传标记以允许在体内存活或迁移的选择和/或评价；或所述基因可以合并提高或改善免疫治疗的安全性的功能，例如通过使细胞易受到体内阴性选择的影响，如Lupton S.D.等人，分子和细胞生物学(Mol.and Cell Biol.)，11：6(1991)；和Riddell等人，人基因治疗(Human Gene Therapy)3：319-338(1992)描述；也参见Lupton等人的公开PCT/US9I/08442和PCT/US94/05601，描述了源自显性阳性选择标记与阴性选择标记融合的双功能选择性融合基因的用途。这可以根据基于本发明对本领域技术人员来说显而易见的已知技术(见例如，Riddell等人的美国专利号6,040,177，第14-17栏)和其变化进行。
[0178] 在一些供选择的方案中，用如本文描述的嵌合受体修饰T细胞。在一些供选择的方案中，T细胞获得自要治疗的受试者，在其他供选择的方案中，淋巴细胞获得自同种异体的人供体，优选健康的人供体。优选地，含有如本文描述的嵌合抗原受体的T细胞源自胸腺细胞(人体中天然产生的)，以及源自工程化前体，如iPS细胞的那些T细胞。
[0179] 在一些供选择的方案中，如本文描述，嵌合受体包括特异性结合和/或靶向肿瘤细胞表面分子的配体结合域、多肽间隔区区域、跨膜域和胞内信号传导域。在一些供选择的方案中，配体结合域是源自单克隆抗体(mAb)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的单链抗体片段(scFv)。经通过将CD28和/或4-1BB的共刺激域融合于CD3ζ链的嵌合受体也可提供共刺激信号。嵌合受体对与HLA独立的细胞表面分子是特异性和/或靶向细胞表面分子，因此克服了TCR识别的局限，包括HLA限制性和在肿瘤细胞上低水平的HLA表达。
[0180] 在一些供选择的方案中，可以将相同或不同的嵌合受体引入CD4+和/或CD8+T淋巴细胞的每个群中。在一些供选择的方案中，在这些群中的每一个中的嵌合受体具有特异性结合于和/或靶向于在肿瘤细胞或感染的细胞上的相同配体的配体结合域。细胞信号传导组件可以不同。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T细胞的胞内信号传导域与CD4+辅助T细胞的胞内信号传导域相同。在其他供选择的方案中，CD8+细胞毒性T细胞的胞内信号传导域与CD4+辅助T细胞的胞内信号传导域不同。
[0181] 在一些供选择的方案中，如本文描述的在转导之前可以将CD4或CD8 T淋巴细胞中的每一个分选为初始细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞或效应细胞。在供选择的方案中，在转导之后可以将CD4或CD8 T淋巴细胞中的每一个分选为初始细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞或效应细胞。
[0182] 已经开发了各种转导技术，所述转导技术利用用于基因递送的重组感染病毒颗粒。这代表当前优选的转导本发明的T淋巴细胞的方法。已经用于该方法的病毒载体包括源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、慢病毒载体和/或反转录病毒的病毒载体。因此，基因转移和表达方法是很多的但是在哺乳动物细胞中引入和表达遗传物质的基本功能。数种上述的技术已经用于转导造血细胞或淋巴样细胞，所述技术包括磷酸钙转染；原生质体融合；电穿孔；和/或用重组腺病毒、腺伴随病毒和反转录病毒载体感染。通过电穿孔和/或通过反转录病毒或慢病毒感染已经成功转导了原代T淋巴细胞。
[0183] 反转录病毒和慢病毒载体提供了用于将基因转移至真核细胞的高效的方法。此外，反转录病毒或慢病毒的整合以控制的方式发生，并导致每个细胞中一个或几个拷贝的新遗传信息的稳定整合。
[0184] 在一些供选择的方案中，在T细胞中包括使在体外选择阴性选择性表型的细胞成为可能的阳性标记可能是有用的。阳性选择性标记可以是基因，该基因在引入宿主细胞时，表达允许对携带该基因的细胞阳性选择的显性表型。该类型的基因是本领域已知的，并且包括尤其是给予潮霉素B抗性的潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)、来自Tn5的编码抗生素G418抗性的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、腺苷脱氨酶基因(ADA)和/或多药抗性(MDR)基因。
[0185] 如本领域熟知的可以采用各种方法转导T淋巴细胞。在一些供选择的方案中，使用慢病毒载体进行转导。在一些供选择的方案中，CD4+和CD8+细胞各自可以分别用编码嵌合受体的表达载体修饰以形成定义的群。在一些供选择的方案中，然后通过分选对那些细胞群中的每一个独特的细胞表面抗原，将这些细胞进一步分选为如上文描述的初始细胞、中枢记忆细胞和效应细胞的亚群。另外，可以通过CD4+或CD8+细胞群的细胞因子谱或增殖活性选择CD4+或CD8+T细胞群。例如，可以选择当用抗原刺激时，与假转导细胞或转导CD8+细胞相比细胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、TNFα和/或IFNγ的产生提高的CD4+T淋巴细胞。在其他供选择的方案中，选择IL-2和/或TNFα的产生提高的初始或中枢记忆CD4+T细胞。同样地，选择与假转导CD8+细胞相比IFNγ产生提高的CD8+细胞。
[0186] 在一些供选择的方案中，选择了应答抗原或肿瘤靶标增殖的CD4+和CD8+T细胞。例如，当用抗原和肿瘤靶标刺激时，与假转导细胞相比，选择快速增殖的CD4+T细胞，或选择CD8+转导的细胞。在一些供选择的方案中，选择对承载抗原的细胞有细胞毒性的CD4+和CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，预期与CD8+T细胞相比CD4+T细胞是弱细胞毒性的。
[0187] 在优选的供选择的方案中，使用针对特定类型的癌症建立的动物模型选择在体内提供杀伤肿瘤细胞的转导淋巴细胞如CD8+中枢记忆细胞。这样的动物模型对本领域技术人员是已知的并且排除人类。如本文描述，不是所有转导至淋巴细胞的嵌合受体构建体都提供体内杀伤肿瘤细胞的能力，虽然这种能力能被激活并在体外杀伤肿瘤细胞。具体地，对于一些靶分子，与具有短间隔区嵌合受体的T细胞相比，具有长间隔区嵌合受体构建体的T细胞在体内杀伤肿瘤细胞不太有效。
[0188] 本公开预期将在组合物中使用CD4+和CD8+T细胞的组合。在一种供选择的方案中，可以将嵌合受体转导的CD4+细胞的组合与相同配体特异性的嵌合受体转导的CD8+细胞组合，或与对有区别的肿瘤配体特异性和/或靶向有区别的肿瘤配体的CD8+T细胞组合。在其他供选择的方案中，将嵌合受体转导的CD8+细胞与对表达于肿瘤上的不同配体特异性和/或靶向表达于肿瘤上的不同配体的嵌合受体转导的CD4+细胞组合。在又一种供选择的方案中，将嵌合受体修饰的CD4+和CD8+细胞组合。在一些供选择的方案中，可以以不同的比组合CD8+和CD4+细胞，例如CD8+与CD4+的比为1∶1，CD8+与CD4+的比为10∶1或CD8+与CD4+的比为100∶1。在一些供选择的方案中，在体外和/或在体内测试组合的群的细胞增殖并且选择提供细胞增殖的细胞的比。
[0189] 如本文描述，本公开预期CD4+和CD8+T细胞可以进一步被分隔为亚群，如初始细胞、中枢记忆细胞和效应记忆细胞群。如本文描述，在一些供选择的方案中，初始CD4+细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+阳性T细胞。在一些供选择的方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L阳性的和CD45RO阳性的。在一些供选择的方案中，效应CD4+细胞是CD62L阴性的和CD45RO阳性的。这些群中的每一个可以被嵌合受体独立修饰。
[0190] 在对承载嵌合受体的细胞转导和/或选择后，细胞群优选在体外扩增直到获得足够数量的细胞以提供对人受试者的至少一次输注典型地为约104个细胞/kg至109个细胞/kg。在一些供选择的方案中，在抗原承载细胞、抗CD3、抗CD28、和IL 2、IL-7、IL 15或IL-21或其组合的存在下培养转导细胞。
[0191] 可以将CD4+和CD8+细胞的每一个亚群彼此组合。在具体的供选择的方案中，将修饰的初始或中枢记忆CD4+细胞与修饰的中枢记忆CD8+T细胞组合以对抗原承载细胞如肿瘤细胞提供协同的细胞毒性作用。
[0192] 本公开提供了过继细胞免疫治疗组合物，该组合物包含如本文描述的基因修饰的T淋巴细胞细胞制剂。
[0193] 在一些供选择的方案中，T淋巴细胞制剂包括具有嵌合受体的CD4+T细胞，所述嵌合受体包括如本文所述的对与疾病或紊乱相关的配体特异的胞外抗体可变域、定制的间隔区、跨膜域和T细胞受体或其他受体的胞内信号传导域。在其他供选择的方案中，过继细胞免疫治疗组合物进一步包含提供细胞免疫应答的嵌合受体修饰的肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂，其中细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD8+T细胞，所述嵌合受体包括如本文所述的对与疾病或紊乱相关的配体特异的胞外单链抗体、定制的间隔区、跨膜域和T细胞受体的胞内信号传导域。
[0194] 在一些供选择的方案中，过继细胞免疫治疗组合物包含嵌合受体修饰的肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂，所述CD8+细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂提供细胞免疫应答，其中细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括与源自CD45RO-CD62L+CD4+T细胞的抗原反应嵌合受体修饰的初始CD4+T辅助细胞组合的具有嵌合受体的CD8+T细胞，以及药学上可接受的载体，所述嵌合受体包括可以靶向与疾病或紊乱相关的配体或对与疾病或紊乱相关的配体是特异性的胞外单链抗体、定制的间隔区、跨膜域和T细胞受体的胞内信号传导域。
[0195] 在其他供选择的方案中，过继细胞免疫治疗组合物包含与提高CD8+免疫应答的抗原反应嵌合受体修饰的初始CD4+T辅助细胞组合的抗原特异性和/靶向抗原的CD8+细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂，所述细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂提供源自患者的细胞免疫应答，其中辅助T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD4+T细胞，所述嵌合受体包括可以靶向与疾病或紊乱相关的配体或对与疾病或紊乱相关的配体是特异性的胞外抗体可变域、定制的间隔区、跨膜域和T细胞受体的胞内信号传导域。
[0196] 在进一步的供选择的方案中，过继细胞免疫治疗组合物包含提高CD8+免疫应答的抗原反应嵌合受体修饰的初始CD4+T辅助细胞，其中辅助T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD4+T细胞，所述嵌合受体包括可以靶向与疾病或紊乱相关的配体或对与疾病或紊乱相关的配体是特异性的胞外抗体可变域、定制的间隔区、跨膜域和T细胞受体的胞内信号传导域。
[0197] 在一些供选择的方案中，CD4+T辅助淋巴细胞选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞或混合CD4+T细胞组成的组。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞包括CD45RO-、CD45RA+和/或CD62L+CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，CD8+T细胞毒性淋巴细胞选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞组成的组。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞包括CD45RO+、CD62L+和/或CD8+T细胞。在其他的供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，以及CD4+辅助T淋巴细胞是初始或中枢记忆CD4+T细胞。
[0198] 本公开提供了制备过继免疫治疗组合物的方法和使用这些组合物对患有疾病或紊乱的受试者进行细胞免疫治疗的用途或方法。可通过使用疾病或紊乱的动物模型和施用细胞并确定转移细胞的存留和/或增殖能力来确定嵌合受体修饰的T细胞的增殖和存留。在其他供选择的方案中，可以通过用抗原承载细胞进行的多周期激活来测试增殖和激活。
[0199] 在一些供选择的方案中，制备组合物的方法包括：获得修饰的初始CD4+T辅助细胞，其中修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD4+T细胞，所述嵌合受体包括如本文所述的可以靶向肿瘤细胞表面分子和/或对肿瘤细胞表面分子特异性的配体结合域、定制的间隔区、跨膜域和胞内信号传导域。
[0200] 在另一种供选择的方案中，方法进一步包括获得修饰的CD8+细胞毒性T细胞，其中修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD8+细胞，所述嵌合受体包括如本文描述的靶向肿瘤细胞表面分子和/或对肿瘤细胞表面分子特异性的配体结合域、定制的间隔区、跨膜域和胞内信号传导域。
[0201] 在另一种供选择的方案中，方法包括获得修饰的CD8+细胞毒性T细胞，其中修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD8+细胞，所述嵌合受体包括如本文描述的靶向肿瘤细胞表面分子和/或对肿瘤细胞表面分子特异性的配体结合域、定制的间隔区、跨膜域和胞内信号传导域，并进一步包括将修饰的CD8+细胞毒性T细胞与CD4+辅助细胞淋巴细胞细胞制剂组合。
[0202] 在上文以及在实例中已经描述了用嵌合受体修饰的CD4+和CD8+细胞的制剂。抗原特异性或靶向抗原的T淋巴细胞可以获得自患有疾病或紊乱的患者，或可以通过在抗原存在下在体外刺激T淋巴细胞制备。未选择用于抗原特异性或靶向抗原的CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群也可以如本文描述被分离并且在制备方法中组合。在一些供选择的方案中，可以通过至少两代评价细胞群的组合的细胞表面标记的一致性、增殖能力以具有一致的细胞分化状态。通过将表达靶配体的细胞系与嵌合受体修饰的T细胞共培养进行质量控制，以确定嵌合受体修饰的T细胞是否使用本领域已知的细胞毒性、增殖或细胞因子产生测定识别细胞系。可以通过流式细胞术确定嵌合受体修饰的T细胞上的细胞分化状态和细胞表面标记。在一些供选择的方案中，CD8+细胞上的标记和细胞分化状态包括CD3、CD8、CD62L、CD28、CD27、CD69、CD25、PD-1、CTLA-4、CD45RO和/或CD45RA。在一些供选择的方案中，CD4+细胞上的标记和细胞分化状态包括CD3、CD4、CD62L、CD28、CD27、CD69、CD25、PD-1、CTLA-4CD45RO和/或CD45RA。
[0203] 在一些供选择的方案中，本文提供了针对嵌合受体选择间隔区的方法。惊人地，一些嵌合受体构建体虽然对在体外激活T细胞是有效的，但是在体内是无效的。在一些供选择的方案中，方法包括提供多种嵌合受体核酸，其中嵌合受体核酸区别仅在于间隔区；将每种嵌合受体核酸引入单独的T淋巴细胞群；在体外扩增每个单独的淋巴细胞群，以及将每个淋巴细胞群引入荷瘤动物以确定每种嵌合受体修饰的T细胞的抗肿瘤效果，以及选择与用每种其他嵌合受体修饰的T细胞的每个其他单独的淋巴细胞群相比，提供抗肿瘤效果的嵌合受体。
[0204] 不同肿瘤的动物模型是已知的。通过鉴别肿瘤体积的减小，通过确定动物死亡、基因修饰的T细胞的体内存留、基因修饰的T细胞的激活(例如通过检测CD25和/CD69的表达的增加)和/或基因修饰的T细胞的体内增殖，可以测定抗肿瘤效果。在一些供选择的方案中，选择如通过一个或多个这些参数确定的提供最佳体内抗肿瘤效果的嵌合受体。通过基因修饰的淋巴细胞的体内存留、动物死亡、如通过半胱天冬酶-3诱导的增加测量的细胞凋亡增加和/或基因修饰的淋巴细胞增殖的减少，可以确定抗肿瘤效果的缺乏。
[0205] 在一些供选择的方案中，提供多种嵌合受体核酸，其中嵌合受体核酸区别仅在于间隔区，包括提供包括编码配体结合域的多核苷酸的嵌合受体构建体，其中配体是肿瘤特异性和/或肿瘤靶向抗原(例如CD171)，或表达于靶细胞群上的任何其他分子，所述靶细胞群适于介导由淋巴细胞进行的识别和清除；编码具有定义的限制性位点的第一多肽间隔区的多核苷酸，所述限制性位点在第一多肽间隔区的编码序列的5’和3’端；编码跨膜域的多核苷酸；以及编码胞内信号传导域的多核苷酸。
[0206] 在一些供选择的方案中，本公开提供了对有需要的患者治疗或抑制癌症的方法、或抑制或延迟癌症的进展和/或转移的方法、抑制或减少肿瘤或癌细胞存在的方法和/或抑制或减少表达CD171的靶细胞群的方法。这样的方法涉及将提供细胞免疫应答的基因修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂施用于有需要的受试者或患者，其中细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD8+T细胞，所述嵌合受体包括编码配体结合域的多核苷酸，其中配体是肿瘤特异性或肿瘤靶向抗原或表达于靶T细胞群(例如CD171)上的任意其他分子，所述靶细胞群适于通过淋巴细胞介导识别和清除；编码多肽间隔区的多核苷酸，其中多肽间隔区具有定制的长度，其中间隔区提供与参比嵌合受体相比提高的T细胞增殖和/或细胞因子产生；编码跨膜域的多核苷酸；和编码一个或多个胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，受试者被鉴别为或选择为需要抑制或治疗癌症的疗法的受试者。可以通过临床评价或诊断评价进行这样的选择或鉴别。
[0207] 本公开也提供了在患有疾病或紊乱的受试者中进行细胞免疫治疗的方法，所述方法包括：施用在如本文描述的表达嵌合受体的淋巴细胞的组合物。在其他供选择的方案中，所述方法包括：向受试者施用提供细胞免疫应答的基因修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂，其中细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD8+T细胞，所述嵌合受体包括：如本文描述的可以靶向肿瘤细胞表面分子和/或对肿瘤细胞表面分子特异性的配体结合域、定制的间隔区、跨膜域和胞内信号传导域；以及基因修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂，所述基因修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂引起直接肿瘤识别和提高基因修饰的细胞毒性T淋巴细胞基因细胞制剂介导细胞免疫应答的能力，其中辅助T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD4+T细胞，所述嵌合受体包括：如本文描述的可以靶向肿瘤细胞表面分子和/或对肿瘤细胞表面分子特异性的配体结合域、定制的间隔区、跨膜域和胞内信号传导域。在一些供选择的方案中，受试者被鉴别为或选择为需要抑制或治疗癌症的疗法的受试者。通过临床评价或诊断评价进行这样的选择或鉴别。
[0208] 虽然不限制本公开的范围，认为在施用前选择可以在体内存留和增殖的嵌合受修饰的T细胞群可导致能够使用低剂量的T细胞并提供更均一的治疗活性。在一些供选择的方案中，T细胞的剂量可以减少至少10％、20％或30％或更多。T细胞的剂量的减少可有利地减少风险或肿瘤溶解综合征和细胞因子风暴。
[0209] 在另一种供选择的方案中，在患有疾病或紊乱的受试者中进行细胞免疫治疗的方法包括：将基因修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂施用于受试者，其中修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD4+T细胞，所述嵌合受体包括如本文描述的可以靶向肿瘤细胞表面分子和/或对肿瘤细胞表面分子特异性的配体结合域、定制的间隔区、跨膜域和胞内信号传导域。在一些供选择的方案中，方法进一步包括将基因修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂施用于受试者，其中修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD8+细胞，所述嵌合受体包括如本文描述的可以靶向肿瘤细胞表面分子和/或对肿瘤细胞表面分子特异性的配体结合域、定制的间隔区、跨膜域和胞内信号传导域。在一些供选择的方案中，受试者被鉴别为或选择为需要抑制或治疗癌症的疗法的受试者。可以通过临床评价或诊断评价进行这样的选择或鉴别。
[0210] 另一种供选择的方案描述了对患有疾病或紊乱的受试者进行细胞免疫治疗的方法，所述方法包括：分析受试者的生物样品的与疾病或紊乱相关的靶分子(例如CD19)的存在，并施用本文描述的过继免疫治疗组合物，其中嵌合受体特异地结合于和/或靶向于靶分子。在一些供选择的方案中，受试者被鉴别为或选择为需要抑制或治疗癌症的疗法的受试者。可以通过临床评价或诊断评价进行这样的选择或鉴别。
[0211] 在一些供选择的方案中，所述CD4+T辅助淋巴细胞在引入嵌合受体之前选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞或混合CD4+T细胞组成的组。在具体的供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞包括CD45RO-、CD45RA+和/或CD62L+CD4+T细胞。在另一种供选择的方案中，CD8+T细胞毒性淋巴细胞在引入嵌合受体之前选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞组成的组。在具体的供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞包括CD45RO+、CD62L+和/或CD8+T细胞。在具体的供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞和CD4+辅助T淋巴细胞细胞是初始CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，受试者被鉴别为或选择为需要抑制或治疗癌症的疗法的受试者。可以通过临床评价或诊断评价进行这样的选择或鉴别。
[0212] 在一些供选择的方案中，CD8+T细胞和CD4+T细胞均是用嵌合受体基因修饰的，所述嵌合受体包括特异性结合于和/或靶向于细胞表面分子的抗体重链域。在其他供选择的方案中，CD8细胞毒性T细胞的胞内信号传导域与CD4辅助T细胞的胞内信号传导域相同。在另一种供选择的方案中，CD8细胞毒性T细胞的胞内信号传导域与CD4辅助T细胞的胞内信号传导域不同。
[0213] 可以被提供本文描述的组合物的受试者一般是人和其他灵长类受试者，如用于兽医目的猴子和猿类；然而，技术也预期与家畜动物如马猪、绵羊、牛和山羊的使用，以及对伴侣动物如狗和猫的使用。受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何适当的年龄，包括婴幼儿、少年、青少年、成年和老年受试者。
[0214] 在治疗或抑制如承载CD171的癌症或肿瘤细胞中，该方法是有用的。在一些供选择的方案中，CD171癌症或肿瘤细胞包括成神经细胞瘤、黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌和成胶质细胞瘤。
[0215] 可以根据基于本公开对本领域技术人员来说显而易见的已知的技术或其变体在用于过继免疫治疗的方法和组合物中利用如上文制备的嵌合抗原T细胞。在一些供选择的方案中，通过以下方式配制T细胞，即首先从细胞培养基中收获T细胞，然后洗涤并在适于以治疗有效量施用的介质和容器系统(“药学上可接受的”载体)中浓缩细胞。适当的输注介质可以是任何等渗介质制剂，典型为生理盐水、Normosol R(Abbott)或勃脉力A(Plasma-Lyte A)(Baxter)，而且也可以利用5％葡萄糖的水溶液或乳酸林格氏液。可以用人血清白蛋白、胎牛血清或其他人血清组分补充输注介质。
[0216] 在一些供选择的方案中，组合物中的细胞的治疗有效的量是至少2个细胞亚集(例如1个CD8+中枢记忆T细胞亚集和1个CD4+辅助T细胞亚集)或是更典型地大于102个细胞以及高达106，高达以及包括108或109个细胞，以及可以大于1010个细胞。细胞的数量如同组合物中包括的细胞的类型一样，将取决于组合物预期的最终用途。例如，如果可以靶向具体抗原和/或对具体抗原特异的细胞是希望的，那么群体将含有大于70％，一般大于80％、85％和90-95％的这样的细胞。对于本文提供的使用，细胞一般是以升或更少的体积计，可以是4
500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少的体积。因此希望的细胞的密度典型地大于10 个细胞/ml，以及一般为大于107个细胞/ml，一般地108个细胞/ml或更大。可以将临床相关数量的免疫细胞分配至多次输注物中，所述输注物累积地等于或超过106、107、108、108、109、1010或1011个细胞。
500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少的体积。因此希望的细胞的密度典型地大于10 个细胞/ml，以及一般为大于107个细胞/ml，一般地108个细胞/ml或更大。可以将临床相关数量的免疫细胞分配至多次输注物中，所述输注物累积地等于或超过106、107、108、108、109、1010或1011个细胞。
[0217] 在一些供选择的方案中，本发明的淋巴细胞可用于赋予个体免疫性。“免疫性”的意思是与对病原体导致的感染的应答或对淋巴细胞应答针对的肿瘤的应答相关的一个或多个身体症状的减少。施用的细胞的量通常在存在于对病原体具有免疫性的正常个体的范围内。因此，通常通过输注施用细胞，每次输注在2个细胞、高达至少106至3×1010个细胞的7 9
范围内，优选在至少10至10个细胞的范围内。通过单次输注或通过在一段时间内的多次输注施用T细胞。然而，因为预计不同个体在应答能力上的变化，输注的细胞的类型和量以及多次输注给予的输注的数量和时间范围由主治医师确定并可以由常规检查确定。使用如本文例示的本发明的快速扩增方法可容易获得充足水平的T淋巴细胞(包括细胞毒性T淋巴细胞和/或辅助T淋巴细胞)的代次。见例如Riddell等人的美国专利号6,040,177第17栏，据此特别地通过引用全文并入。
范围内，优选在至少10至10个细胞的范围内。通过单次输注或通过在一段时间内的多次输注施用T细胞。然而，因为预计不同个体在应答能力上的变化，输注的细胞的类型和量以及多次输注给予的输注的数量和时间范围由主治医师确定并可以由常规检查确定。使用如本文例示的本发明的快速扩增方法可容易获得充足水平的T淋巴细胞(包括细胞毒性T淋巴细胞和/或辅助T淋巴细胞)的代次。见例如Riddell等人的美国专利号6,040,177第17栏，据此特别地通过引用全文并入。
[0218] 在一些供选择的方案中，如本文描述的组合物经静脉内、腹腔内、瘤内、骨髓内、淋巴结内和/或脑脊髓液内施用。在一些供选择的方案中，将嵌合受体工程化组合物递送至肿瘤部位。供选择地，可将如本文描述的组合物与将细胞靶向于肿瘤或免疫系统区室并避免比如肺的部位的化合物组合。在一些供选择的方案中，如本文描述的组合物与化学治疗剂和/或免疫抑制剂施用。在一些供选择的方案中，首先用抑制或破坏其他免疫细胞的化学治疗剂治疗患者，然后用本文描述的组合物治疗。在某些情况下，可以完全避免化学治疗。
[0219] 在下文所述的另外的供选择的方案中进一步说明本发明。
[0220] 供选择的方案
[0221] 下面的供选择的方案旨在说明，但并非以任何方式、形状或形式明确地或含蓄地限定本发明。虽然它们是可以使用的那些的典型，但是本领域技术人员已知的其他步骤、方法或技术是可供选择地使用的。
[0222] 用嵌合受体修饰的T细胞定制CD171的最佳识别的间隔区长度
[0223] 构建了可靶向于CD171分子和/或对CD171分子特异性的嵌合受体，所述CD171分子表达于包括成神经细胞瘤的大量人恶性肿瘤上。从CD171特异性和/或靶向CD17的scFV设计CD171嵌合受体并且所述CD171嵌合受体含有不同长度的胞外间隔区，所述scFV特异地结合于和/或靶向于CD171上的表位CE7。Ce7scFv-IgG4铰链-CH2-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(长构建体)的序列(SEQ ID NO：54)示于图5和图6。CE7scFv-IgG4铰链-CH3-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(中)的序列(SEQ ID NO：55)示于图7和图8。CE7scFv-IgG4铰链-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(短)的序列(SEQ ID NO：56)示于图9和图10。具有两个共刺激域的构建体CE7scFv-IgG4铰链-CD28tm/cyto-4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV的序列7(SEQ ID NO：57)示于图11和图12。分析了表达每种CD171特异性和/或靶向CD171的嵌合受体的T细胞在体外识别CD171成神经细胞瘤肿瘤并清除被移入免疫缺陷小鼠的成神经细胞瘤肿瘤细胞的能力。
[0224] 人受试者
[0225] 根据研究方案在签署知情同意书后从健康供体和患者获得外周血单核细胞(PBMC)。
[0226] 细胞系
[0227] SK-N-BE 2成神经细胞瘤细胞系(Be2)获得自美国菌种保藏中心。EBV转化的TMLCL由如本文所述的PBMC制备，Pelloquin F，Lamelin JP，Lenoir GM.In vitro cell dev biol 1986；22(12)：689-694。
[0228] 免疫表型分型
[0229] 用下面的缀合的mAb对PBMC和细胞系染色：CD4、CD8、CD28、CD45RA和CD62L，和相配的同种型对照(BD Biosciences)。通过使用免疫磁珠，分离CD8+细胞和将CD45RA细胞的CD8+细胞群贫化，从PBMC分离中枢记忆T细胞。使用免疫磁珠针对CD62L富集CD45RA的贫化的CD8+细胞，如图1所示。使用多克隆山羊抗鼠IgG抗体(Fab-特异的)(Jackson ImmunoResearch)分析CD171嵌合受体的表面表达。在 上完成流式分析，在
(Becton Dickinson)上完成分选纯化，以及使用 软件(Treestar)
分析数据。
(Becton Dickinson)上完成分选纯化，以及使用 软件(Treestar)
分析数据。
[0230] 载体构建和编码嵌合受体的慢病毒的制备
[0231] 使用CE7mAb(CD171)的VL和VH链片段构建了CD171特异性和/或靶向CD171的嵌合受体。(图5、7、9和11中提供了CE7的可变区序列)。每个scFV连接于源自IgG4-Fc(Uniprot数据库：P01861；表2)的间隔区，所述间隔区包括“铰链-CH2-CH3”(长：229AA)，“铰链-CH3”(中：119个AA)或仅“铰链”(短：12个AA)序列(表6)。所有间隔区在位于天然IgG4-Fc蛋白的第108位的“铰链”域含有S→P置换，并连接于人CD28(Uniprot：P10747，表3)的27个AA跨膜域以及连接于信号传导组件，所述信号传导组件包括：(i)在位于天然CD28蛋白的第186-187位具有LL→GG置换的人CD28的41个AA的胞浆域(表3)，该41个AA的胞浆域连接于人4-
1BB的42个AA的胞浆域(Uniprot：P07011，表4)，或(ii)单独的人4-1BB的胞浆域，每个组件连接于人CD3ζ的同种型3的112个AA的胞浆域(Uniprot：P20963，表5)。构建体在嵌合受体的下游编码T2A核糖体跳跃元件(ribosomal skip element)(表1)和tEGFR序列(表1)。合成了编码每种转基因的人密码子优化的核苷酸序列(Life Technologies)并将其克隆至epHIV7慢病毒载体中。
1BB的42个AA的胞浆域(Uniprot：P07011，表4)，或(ii)单独的人4-1BB的胞浆域，每个组件连接于人CD3ζ的同种型3的112个AA的胞浆域(Uniprot：P20963，表5)。构建体在嵌合受体的下游编码T2A核糖体跳跃元件(ribosomal skip element)(表1)和tEGFR序列(表1)。合成了编码每种转基因的人密码子优化的核苷酸序列(Life Technologies)并将其克隆至epHIV7慢病毒载体中。
[0233] 表达CD171嵌合受体的T细胞系的产生
[0234] 将CD8+CD45RA-CD62L+中枢记忆T细胞(TCM)从正常供体的PBMC分选(见图1)，用抗CD3/CD28珠(Life Technologies)激活，并在激活后第3天通过在32℃下以800g离心45分钟，用补充1μg/mL聚凝胺(Millipore)的慢病毒上清(MOI＝3)转导。在含有10％人血清、2mM L-谷氨酰胺(CTL培养基)的、补充重组人IL-2至终浓度为50U/mL的RPMI中扩增T细胞。通过使用生物素缀合的抗EGFR mAb(ImClone Systems)和链霉亲和素-珠(Miltenyi)免疫磁性选择富集每个T细胞系的tEGFR+亚集。
[0235] 细胞毒性，和细胞因子分泌
[0236] 将靶细胞Be2细胞或TML CL用51Cr(PerkinElmer)标记，洗涤并一式三份地以1-2x103个细胞/孔用效应物嵌合受体修饰的T细胞以不同的效应物与靶标(E∶T)比温育。将上清在4小时的温育后收获以用于γ-计数，并使用标准公式计算特异性裂解。对于细胞因子
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分泌的分析，将5×10个T细胞与靶细胞以30∶1、10∶1、3∶1或1∶1的E∶T比，一式三份地铺板，并且在24小时的温育后，在移出的上清中通过ELISA或多重细胞因子免疫测定(Luminex)测量IFN-γ、TNF-α和IL-2。
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分泌的分析，将5×10个T细胞与靶细胞以30∶1、10∶1、3∶1或1∶1的E∶T比，一式三份地铺板，并且在24小时的温育后，在移出的上清中通过ELISA或多重细胞因子免疫测定(Luminex)测量IFN-γ、TNF-α和IL-2。
[0237] NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠中的实验
[0238] 6至8周龄的雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠获得自杰克逊实验室(the Jackson Laboratory)或内部培育。用0.2×106成神经细胞瘤肿瘤细胞颅内注射小鼠，并在7天后使小鼠接受颅内注射2×106嵌合受体修饰的T细胞或对照T细胞。对于肿瘤生长的生物发光成像，小鼠接受重悬于PBS(15μg/g体重)中的荧光素底物(Caliper Life Sciences)的注射。将小鼠用异氟烷麻醉，并在注射荧光素15分钟后用Xenogen IVIS成像系统(Caliper)在小或中合并模式(binning mode)下，以1秒至1分钟的收集时间成像以获得非饱和图像。使用活体成像软件(Caliper)分析荧光素酶活性，并在涵盖整个躯体的感兴趣的区域内分析光子通量。
[0239] 统计分析
[0240] 使用Prism软件 进行统计分析。用95％的置信区间以双尾配对检验进行学生t检验，并且p值为p＜0.05的结果被认为是显著的。通过对数秩检验完成存活的统计分析，并且p值为p＜0.05的结果被认为是显著的。
[0241] CD171嵌合受体的长间隔区在体内提供优越的细胞毒性和细胞因子分泌
[0242] 使用CE7scFV设计CD171特异性和/或靶向CD171的嵌合受体是已知的(Park J等人，Molecular Therapy 2007，April 15(4)：825-33)。该嵌合受体提供在体外对CD171肿瘤的特异性识别和/或靶向，但是假定调整间隔区会提高肿瘤识别和T细胞信号传导。因此，构建嵌合受体，其中间隔区选自“铰链-CH2-CH3”(229个氨基酸，长)、“铰链-CH3”(119个氨基酸，中)和仅“铰链”(12个氨基酸，短)变体。每种新受体含有相同的CE7scFV，和4-1BB和CD3ζ信号传导组件。转基因盒包括截短的EGFR(tEGFR)作为用于嵌合受体修饰的T细胞的转导、选择和体内追踪标记。
[0243] 用含有不同长度的间隔区的CD171嵌合受体，以及用tEGFR对照载体转导纯化的CD8+TCM。通过用F(ab)特异性抗体染色确认每种嵌合受体的表面表达(图2A)。用对CD3ζ特异性的抗体转导的细胞的蛋白印迹显示短、中和长构建体的表达(图2B)。在短、中或长间隔区的每一个中发现F(ab)和EGFRt的相似的表达。
[0244] 修饰以表达每种CD171嵌合受体的CD8+T细胞的体外功能的分析证明了每种受体提供天然表达CD171的Be2的特异性裂解，但不提供识别对照TML CL。表达长CD171嵌合受体的T细胞具有最大的细胞裂解活性并且针对CD171肿瘤靶标肿瘤裂解的层级(长＞＞中＞＞短)非常明显(图2C)。
[0245] 应答Be2细胞刺激的细胞因子产生的定量分析显示表达每种CD171嵌合受体的T细胞产生IFN-γ、TNF-α和IL-2。如细胞毒性测定观察到的，具有长间隔区构建体的T细胞在肿瘤识别后介导细胞因子分泌中是优越的(图2D)。
[0246] CD171特异性和/或靶向CD171的CAR需要短的胞外间隔区用于体内活性
[0247] 仍然不确定用具有长间隔区的CD171嵌合受体修饰的T细胞的优越的体外活性是否会转化为提高的或改善的体内抗肿瘤活性。为了解决这些问题，用成神经细胞瘤细胞通过颅内注射接种免疫缺陷的NSG小鼠队列，7天后用单次颅内剂量的具有短、中或长间隔区+的CD171特异性的嵌合受体CD8T细胞处理小鼠。用tEGFR T细胞处理对照小鼠或不处理对照小鼠。未处理的NSG/NB小鼠在肿瘤接种后大约4周发展出有必要处死的成神经细胞瘤(图
2E，右侧图片)。
2E，右侧图片)。
[0248] 在所有用具有短间隔区的CD171嵌合受体T细胞处理的小鼠中观察到肿瘤消退和提高或改善的存活率。用具有短间隔区的CD171嵌合受体T细胞处理的小鼠与用具有长间隔区的CD171嵌合受体T细胞处理的小鼠相比具有优越的抗肿瘤应答和存活率(图2E，右侧图片)。测量来自负载荧光素底物的肿瘤细胞的总通量显示用具有短或中间隔区的构建体转导的CD8细胞处理的小鼠显示出通量远远低于与未处理小鼠或用具有长间隔区的构建体转导的CD8细胞。(图2E，左图)。
[0249] 通过免疫组织化学，与来自用模拟，表达短或中间隔区CD171 CAR的CD8 Tcm处理的小鼠相比，来自用表达长间隔区CD171 CAR的CD8 Tcm处理的小鼠的肿瘤显示更高百分比的CD3+细胞(图2F)。通过用不同CD8 Tcm的免疫组织化学检测到Ki67无区别，但在T细胞注射3天后在表达长间隔区CD171 CAR的CD8 Tcm中发现了比表达短或中间隔区CD171 CAR的CD8Tcm更高水平的半胱天冬酶3和颗粒酶B(图2G)。
[0250] 具有长胞外间隔区的CD171特异性和/或靶向CD171的CAR显示更多激活诱导的细胞死亡
[0251] 为了确定表达具有长间隔区的CD171嵌合受体的T细胞的差的体内抗肿瘤活性的潜在机制，考虑了通过体内肿瘤细胞未能有效激活T细胞，或相反地，它们相遇体内的激活诱导的T细胞死亡的可能性。
[0252] 将用具有短、中或长间隔区的CD171 CAR构建体转导的CD8中枢记忆细胞在体外暴露于成神经细胞瘤细胞24小时(第1轮)。将CD8中枢记忆细胞从培养物中移出，并表征表型，然后与肿瘤细胞温育另外的24小时(第2轮)。将CD8细胞从培养物中移出，并表征表型，然后置于具有肿瘤细胞的培养物中，保持另外的24小时(第3轮)。然后将CD8细胞移出并表征表型。
[0253] 用流式细胞术表征了来自每轮的细胞的激活标记CD25和CD69的表达。通过Guava Viacount确定了来自每轮的细胞中死亡细胞的百分比。表征了第1轮后NB细胞的FasR表达。
[0254] 结果显示在连续的肿瘤细胞共培养攻击(challenge)后，相对于表达长间隔区CAR的细胞，短间隔区CAR细胞展示了更低的激活和更好的生活力(第III轮：CD25+CD69+42％(短)相对于66％(长)(图3A)，死细胞％15％(短)相对于60％(长)(图3B))。表达长间隔区CAR的细胞在NB细胞中诱导FasR表达的程度大于短间隔区CAR细胞表达的程度(图3C)。
[0255] 共同地，数据提供了以下证据，即针对CD171的具有长胞外间隔区的嵌合受体尽管在体外介导等价或优越的效应功能，但在体内诱导高水平的激活诱导的细胞死亡，并且不能清除已建立的成神经细胞瘤。
[0256] 由于CD171表达于许多癌的表面上，因此CD171作为癌症免疫治疗潜在靶标已引起兴趣。通过胞外间隔区的修饰提高或改善了CD171嵌合受体的设计和功能。结果显示，与用针对CD171的具有铰链-CH3(中)或铰链-CH2-CH3(长)间隔区的CAR转导的T细胞相比，用针对CD171的具有仅铰链短间隔区的CAR转导的中枢记忆T细胞对成神经细胞瘤体内模型的肿瘤清除表现更佳。
[0257] 共刺激域的修饰
[0258] 构建了可靶向于或特异于CD171分子的嵌合受体，所述CD171分子表达于包括成神经细胞瘤的大量人恶性肿瘤上。从CD171特异性和/或靶向CD171的scFV设计CD171嵌合受体，所述scFV特异地结合于和/或靶向于CD171上的表位CE7，所述CD171嵌合受体含有短胞外间隔区。一种构建体含有连接于CD3ζ域的共刺激域4-1BB(4-1BB)，另一种构建体包括双共刺激域，所述双共刺激域包括CD28cyto和连接于CD3ζ的4-1BB(CD28cyto)。具有两个共刺激域的构建体CE7scFv-IgG4铰链-CD28tm/cyto-4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7的序列示于图11-12。CE7scFv-IgG4铰链-CD28tm/4-1BB-ζ-T2A-EGFRt-epHIV7(短)的序列示于图9-10。分析了表达每种CD171特异性嵌合受体的T细胞在体外识别CD171成神经细胞瘤肿瘤并清除被移入免疫缺陷小鼠的成神经细胞瘤肿瘤细胞的能力。
[0259] 人受试者
[0260] 根据研究方案在签署知情同意书后从健康供体和患者获得外周血单核细胞(PBMC)。
[0261] 细胞系
[0262] SK-N-BE 2成神经细胞瘤细胞系(Be2)获得自美国菌种保藏中心。EBV转化的TMLCL由如本文所述的PBMC制备，Pelloquin F，Lamelin JP，Lenoir GM.In vitro cell dev biol 1986；22(12)：689-694。
[0263] 免疫表型分型
[0264] 用下面的缀合的mAb对PBMC和细胞系染色：CD4、CD8、CD28、CD45RA和CD62L，和相配的同种型对照(BD Biosciences)。通过使用免疫磁珠，分离CD8+细胞和将CD45RA细胞的CD8+细胞群贫化，从PBMC分离中枢记忆T细胞。使用免疫磁珠针对CD62L富集CD45RA的贫化的CD8+细胞，如图1所示。使用多克隆山羊抗鼠IgG抗体(Fab-特异的)(Jackson ImmunoResearch)分析CD171嵌合受体的表面表达。在 上完成流式分析，在
(Becton Dickinson)上完成分选纯化，以及使用 软件(Treestar)
分析数据。
(Becton Dickinson)上完成分选纯化，以及使用 软件(Treestar)
分析数据。
[0265] 载体构建和编码嵌合受体的慢病毒的制备
[0266] 使用CE7mAb(CD171)的VL和VH链片段构建了CD171特异性和/或靶向CD171的嵌合受体。(图5、7、9和11中提供了CE7的可变区序列)。每个scFV连接于源自IgG4-Fc(Uniprot数据库：P01861；表2)的间隔区，所述间隔区包括“铰链-CH2-CH3”(长：229AA)，“铰链-CH3”(中：119个AA)或仅“铰链”(短：12个AA)序列(表6)。所有间隔区在位于天然IgG4-Fc蛋白的第108位的“铰链”域含有S→P置换，并连接于人CD28(Uniprot：P10747，表3)的27个AA跨膜域以及连接于信号传导组件，所述信号传导组件包括：(i)在位于天然CD28蛋白的第186-187位具有LL→GG置换的人CD28的41个AA的胞浆域(表3)，该41个AA的胞浆域连接于人4-
1BB的42个AA的胞浆域(Uniprot：P07011，表4)，或(ii)单独的人4-1BB的胞浆域，每个组件连接于人CD3ζ的同种型3的112个AA的胞浆域(Uniprot：P20963，表5)。一种构建体含有包括人4-1BB的42个AA的胞浆域的共刺激域组件(Uniprot：Q07011，SEQ ID NO：15)，所述42个AA的胞浆域连接于人CD3ζ同种型3的112个AA的胞浆域(Uniprot：P20963，SEQ ID NO：16)。构建体在嵌合受体的下游编码T2A核糖体跳跃元件(ribosomal skip element)(SEQ ID NO：
8)和tEGFR序列(SEQ ID NO：9)。合成了编码每种转基因的人密码子优化的核苷酸序列(Life Technologies)并克隆至epHIV7慢病毒载体。使用包装载体pCHGP-2、pCMV-Rev2和pCMV-G，以及 转染试剂(Clontech)在293T细胞中产生CD171嵌合受体或编码
tEGFR的慢病毒。
1BB的42个AA的胞浆域(Uniprot：P07011，表4)，或(ii)单独的人4-1BB的胞浆域，每个组件连接于人CD3ζ的同种型3的112个AA的胞浆域(Uniprot：P20963，表5)。一种构建体含有包括人4-1BB的42个AA的胞浆域的共刺激域组件(Uniprot：Q07011，SEQ ID NO：15)，所述42个AA的胞浆域连接于人CD3ζ同种型3的112个AA的胞浆域(Uniprot：P20963，SEQ ID NO：16)。构建体在嵌合受体的下游编码T2A核糖体跳跃元件(ribosomal skip element)(SEQ ID NO：
8)和tEGFR序列(SEQ ID NO：9)。合成了编码每种转基因的人密码子优化的核苷酸序列(Life Technologies)并克隆至epHIV7慢病毒载体。使用包装载体pCHGP-2、pCMV-Rev2和pCMV-G，以及 转染试剂(Clontech)在293T细胞中产生CD171嵌合受体或编码
tEGFR的慢病毒。
[0267] 表达CD171嵌合受体的T细胞系的产生
[0268] 将CD8+CD45RA-CD62L+中枢记忆T细胞(TCM)从正常供体的PBMC分类(见图1)，用抗CD3/CD28珠(Life Technologies)激活，并在激活后第3天通过在32℃下以800g离心45分钟，用补充1μg/mL聚凝胺(Millipore)的慢病毒上清(MOI＝3)转导。在含有10％人血清、2mM L-谷氨酰胺(CTL培养基)的、补充重组人IL-2至终浓度为50U/mL以及补充IL-15至终浓度为10ng/μl的RPMI中扩增T细胞。通过使用生物素缀合的抗EGFR mAb(ImClone Systems)和链霉亲和素-珠(Miltenyi)免疫磁性选择富集每个T细胞系的tEGFR+亚集。
[0269] 细胞毒性，和细胞因子分泌
[0270] 将靶细胞Be2细胞或TML CL用51Cr(PerkinElmer)标记，洗涤并一式三份地以1-2x103个细胞/孔用效应物嵌合受体修饰的T细胞以不同的效应物与靶标(E∶T)比温育。将上清在4小时的温育后收获以用于γ-计数，并使用标准公式计算特异性裂解。对于细胞因子分泌的分析，将5×104个T细胞与靶细胞以30∶1、10∶1、3∶1或1∶1的E∶T比，一式三份地铺板，并且在24小时的温育后，在移出的上清中通过ELISA或多重细胞因子免疫测定(Luminex)测量IFN-γ、TNF-α和IL-2。
[0271] NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠中的实验
[0272] 6至8周龄的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠获得自杰克逊实验室或内部培育的。小鼠用0.2×106成神经细胞瘤肿瘤细胞颅内注射，并使小鼠接受颅内注射26
×10嵌合受体修饰的T细胞或对照T细胞。对于肿瘤生长的生物发光成像，小鼠接受重悬于PBS(15μg/g体重)中的荧光素底物(Caliper Life Sciences)的注射。将小鼠用异氟烷麻醉，并在注射荧光素15分钟后用Xenogen IVIS成像系统(Caliper)在小或中合并模式(binning mode)下，以1秒至1分钟的收集时间成像以获得非饱和图像。使用活体成像软件(Caliper)分析荧光素酶活性，并在涵盖整个躯体的感兴趣的区域内分析光子通量。
×10嵌合受体修饰的T细胞或对照T细胞。对于肿瘤生长的生物发光成像，小鼠接受重悬于PBS(15μg/g体重)中的荧光素底物(Caliper Life Sciences)的注射。将小鼠用异氟烷麻醉，并在注射荧光素15分钟后用Xenogen IVIS成像系统(Caliper)在小或中合并模式(binning mode)下，以1秒至1分钟的收集时间成像以获得非饱和图像。使用活体成像软件(Caliper)分析荧光素酶活性，并在涵盖整个躯体的感兴趣的区域内分析光子通量。
[0273] 统计分析
[0274] 使用Prism Software 进行统计分析。用95％的置信区间以双尾配对检验进行学生t检验，并且p值为p＜0.05的结果被认为是显著的。通过对数秩检验完成存活的统计分析，并且p值为p＜0.05的结果被认为是显著的。
[0275] 具有短间隔区和两个共刺激域的CD171嵌合受体在体内提供优越的细胞毒性和细胞因子分泌
[0276] 我们用含有不同共刺激域的CD171嵌合受体和用tEGFR对照载体转导纯化的CD8+TCM。通过用F(ab)特异性抗体染色确认每种嵌合受体的表面表达(图4A)。用具有单个4-1BB共刺激域的构建体(图片2)和具有CD28cyto/4-1BB共刺激域的构建体(图片3)的每一个发现F(ab)和EGFRt的相似的表达。修饰以表达每种CD171嵌合受体的CD8+T细胞的体外功能的分析证明了每种受体提供天然表达CD171的Be2细胞的特异性裂解，但不提供识别对照TML CL(图4B)。表达具有CD28cyto/4-1BB共刺激域的CD171嵌合受体的T细胞具有跟更高的细胞裂解活性。应答Be2细胞刺激的细胞因子产生的定量分析显示表达每种CD171嵌合受体的T细胞产生IFN-γ。如细胞毒性测定观察到的，具有CD28cyto/4-1BB共刺激域的构建体在肿瘤识别后介导细胞因子分泌中是优越的(图4C)。
[0277] 具有CD28cyto/4-1BB共刺激域的CD171特异性和/或靶向CD171的CAR在体内有效性较低
[0278] 仍然不确定用具有CD28cyto/4-1BB共刺激域的CD171嵌合受体修饰的T细胞的优越的体外活性是否会转化为提高或改善的体内抗肿瘤活性。为了解决这些问题，我们用成神经细胞瘤细胞通过颅内注射接种免疫缺陷的NSG小鼠队列，7天后用单次颅内剂量的具有短、中或长间隔区的CD171特异性和/或靶向CD171的嵌合受体CD8+T细胞处理小鼠。用tEGFR T细胞处理对照小鼠或不处理对照小鼠。未处理的NSG/NB小鼠在肿瘤接种后大约4周发展出有必要处死的成神经细胞瘤(图4D)。
[0279] 我们在所有用含有具有单个4-1BB共刺激域的构建体的CD171嵌合受体T细胞处理的小鼠中观察到肿瘤消退和改善的存活率。与用具有具有CD28cyto/4-1BB共刺激域的CD171嵌合受体T细胞处理的小鼠相比，用含有具有单个4-1BB共刺激域的构建体的CD171嵌合受体T细胞处理的小鼠具有优越的抗肿瘤应答和存活(图4D)。
[0280] 具有长胞外间隔区的CD171特异性和/或靶向CD171的CAR显示更多的激活诱导的细胞死亡
[0281] 我们寻求确定表达具有CD28cyto/4-1BB共刺激域的CD171嵌合受体的T细胞的差的体内抗肿瘤活性的潜在机制。我们考虑了通过体内肿瘤细胞未能有效激活T细胞，或相反地，它们相遇体内的激活诱导的T细胞死亡的可能性。
[0282] 将用具有CD28cyto/4-1BB共刺激域或4-1BB共刺激域的CD171 CAR构建体转导的CD8中枢记忆细胞在体外暴露于成神经细胞瘤细胞24小时(第1轮)。将CD8中枢记忆细胞从培养物中移出，并表征表型，然后与肿瘤细胞温育另外的24小时(第2轮)。将CD8细胞从培养物中移出，并表征表型，然后置于具有肿瘤细胞的培养物中，保持另外的24小时(第3轮)。然后将CD8细胞移出并表征表型。用流式细胞术表征了来自每轮的细胞的激活标记CD25和CD69的表达。通过Guava Viacount确定了来自每轮的死亡细胞的百分比。
[0283] 结果显示在连续的肿瘤细胞共培养攻击后，相对于表达具有CD28/cyto/4-1BB共刺激域的CAR的细胞具有单独4-1BB共刺激域的CAR的细胞展示了更低的激活和更好的生活力(第III轮：CD25+CD69+40％(4-1BB)相对于60％(CD28cyto/4-1BB)(图4E)，死细胞％20％(4-1BB)相对于45％(CD28cyto/4-1BB)(图4F))。共同地，数据提供了以下证据，即针对CD171的具有双CD28cyto/4-1BB共刺激域的嵌合受体尽管在体内介导等价或优越的效应功能，但在体内诱导高水平的激活诱导的细胞死亡，并具有降低的清除已建立的成神经细胞瘤的能力。
[0284] 通过共刺激域的修饰提高或改善了CD171嵌合受体的设计和功能。结果显示，用针对CD171的具有单个4-1BB共刺激域的CAR转导的中枢记忆T细胞在成神经细胞瘤的体内模型清除中远远好于针对CD171的具有双CD28cyto/4-1BB共刺激域的CAR转导的T细胞。
[0285] 胞外间隔区长度和胞浆信号传导域对靶向于CD171的CAR在体外和体内性能的作用
[0286] 在体内和在体外评价了胞外间隔区长度和胞浆信号传导域对靶向于CD171的CAR性能的作用。在体外，集中于使用标准测定和采用多次连续循环的肿瘤细胞暴露的新CAR T细胞应力测试分析细胞毒性、细胞因子分泌、激活状态和细胞死亡。使用不同的供体T细胞多次进行每项研究，最终分析包括对样品重复两次或更多次的合并的数据或代表性实验。体内实验通过活体成像、存活率和免疫组织化学分析了抗肿瘤活性。所有小鼠实验被设计为每组具有至少2只小鼠。数据分析中包括了所有异常值。
[0287] CAR构建和慢病毒产生
[0288] 使用连接CE7(抗CD171)IgG2单克隆抗体的VL和VH片段的(G4S)3肽构建CD171特异性和/或靶向CD171的CAR。scFv是密码子优化的并且随后连接于基于源自人IgG4-Fc的12个AA(短间隔区(SS)/“仅铰链”)、119个AA(中间隔区(MS)/“铰链-CH3”)或229个AA(长间隔区(LS)/“铰链-CH2-CH3”)的可变长度的间隔区。所有间隔区在位于IgG4-Fc蛋白的第108位的“铰链”域内含有S→P置换，并且所有间隔区连接于人CD28跨膜域并连接于信号传导组件，所述信号传导组件包括(i)单独的4-1BB的胞浆域(2G CAR)或(ii)CD28(突变体)和4-1BB的胞浆域(3G CAR)，每个信号传导组件在信号传导组件的羧基末端与人CD3-ζ内在域(endodomain)融合。构建体中使用的CD28的胞浆域部分含有位于天然CD28蛋白的第186至187位的LL→GG置换。编码CAR变体的cDNA克隆连接于下游T2A核糖体跳跃元件和截短的EGF受体(EGFRt)，克隆至epHIV7慢病毒载体，在293T细胞中产生CD171-CAR慢病毒。
[0289] 实时PCR
[0290] 使用RNeasy Minikit，根据制造商说明(Qiagen)从T细胞中抽提总RNA。使用第一链试剂盒(First Strand Kit)(Life Technologies)通过反转录合成cDNA。使用对FasL(IDT)的实时引物和CFX96实时检测系统(Biorad)对特定基因进行RNA定量。肌动蛋白用作管家基因。使用CFX管理软件第3.0版分析数据。
[0291] 蛋白表达
[0292] 将蛋白印迹(WB)T细胞收获，用PBS洗涤两次并用蛋白酶抑制剂(Millipore)裂解。根据制造商说明，使用SDS/PAGE，随后通过使用抗CD247(CD3-ζ，BD Biosciences)抗体进行蛋白印迹分析蛋白。使用Odyssey Infrared Imager检测到信号，并使用Odyssey v2.0软件(LI-COR)定量谱带强度。
[0293] 流式细胞术
[0294] 使用荧光团缀合的mAbs：CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7(Biolegend)进行免疫表型分型。使用荧光团缀合的mAb(Clone014，Sino Biological)分析L1CAM的细胞表面表达。使用生物素化西妥昔单抗(Bristol-Myers-Squibb)和荧光团缀合的链霉亲和素二级试剂分析EGFRt的表达。为了评价激活和AICD，使用针对CD25、CD69、CD137、C178(Fas配体)和CD95(Fas，均为Biolegend产品)的荧光团缀合的mAB。根据制造商的方案，使用CaspGlow(eBioscience)测量了半胱天冬酶3活性。在LSRFortessa(Biosciences)上进行流式分析，使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。
[0295] 表达CD171 CAR的T细胞系的产生
[0296] 在签署知情同意书后根据经西雅图儿童研究所机构审查委员会(SCRI IRB#13795)批准的研究方案从健康供体获得肝素化全血样品。使用聚蔗糖(GE Healthcare Life Sciences)通过标准方案分离外周血单核细胞，使用免疫微磁珠，根据制造商说明(Miltenyi Biotec)分离CD8+CD45RO+CD62L+中枢记忆T细胞(TCM)。首先，通过使用CD8 T细胞分离试剂盒和CD45RA珠负选择获得CD8+CD45RO+细胞，然后针对CD62L富集细胞，用抗CD3/CD28珠以3∶1的珠与细胞比激活细胞(Life Technologies，Thermo Fisher Scientific)，以及在第3天使用补充了1mg/mL硫酸鱼精蛋白(APPPharmaceuticals)的慢病毒上清(感染复数[MOI]＝5)在32℃下以800g离心30分钟转导细胞。在含有10％热失活胎牛血清(Atlas，Fort Collins，CO)、2mmol/L L-谷氨酰胺(Cellgro)，补充了重组人白介素(IL)-2(Chiron Corporation)至终浓度为50U/ml和10ng/μl IL-15(Miltenyi Biotec)的RPMI(Cellgro)中扩增T细胞。使用生物素缀合的爱必妥(Bristol-Myers-Squibb)和链霉亲和素微珠(Miltenyi Biotec)通过免疫磁性选择富集每个T细胞系的EGFRt+亚集。使用快速扩增方案扩增CD171-CAR和模拟对照T细胞(将用于体内测定的T细胞在S1R2D14冷冻并在注射日解冻)。
[0297] 细胞系
[0298] NB细胞系Be2和SK-N-DZ获得自美国菌种保藏中心(ATCC)。Be2GFP-ffLuc_epHIV7和SK-N-DZ GFP-ffLuc_epHIV7通过用萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，ffLuc)基因得到，并通过对GFP分选纯化。用CD19t-2A-IL2_pHIV7进一步转导两个细胞系以产生通过对CD19t分选纯化的分泌IL-2的成神经细胞瘤细胞系。在补充了10％热失活胎牛血清和2mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM(Cellgro)中培养所有NB细胞系。在补充了10％热失活胎牛血清和2mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI 1640中培养EBV转化的类淋巴母细胞系(TMLCL)和表达源自OKT3 mAb的膜粘连的CD3ε特异性scFvFc的TMLCL(TMLCL-OKT3)。
[0299] CAR T细胞受体信号传导
[0300] 共培养1×106个效应细胞和靶细胞4-8分钟后，根据7-Plex T细胞受体信号传导试剂盒(Millipore)处理细胞以测量Erk/MAP激酶1/2活性。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific)测量蛋白浓度。
[0301] 体外T细胞测定
[0302] 通过铬释放测定测量细胞毒性。将靶细胞用51Cr(Perkin Elmer)标记、洗涤并一式三份地以5×103个细胞/孔与T细胞(S1R2D12-14)以不同的效应物与靶标(E∶T)比温育。在4小时的温育后收获上清以使用Top CountNTX(Perkin Elmer)进行γ-计数，如上所述计算特异性裂解。
[0303] 通过生物光子荧光素酶测定测量细胞毒性
[0304] 将含有GFP-ffLuc_epHIV7的NB细胞系与效应细胞以5∶1的E∶T比共培养。如上所述效应细胞与肿瘤细胞进行第一轮、第二轮或第三轮相遇。为了评价T细胞相遇后剩下的有生活力的肿瘤细胞的数量，添加D-荧光素并在5分钟后使用IVIS光谱成像系统(Perkin Elmer)测量来自NB细胞的生物光子信号。
[0305] 细胞因子释放
[0306] 将总共5×105个T细胞与刺激细胞以2∶1的E∶T比铺板24小时。使用Bio-plex细胞因子测定和Bioplex-200系统(Bio-rad Laboratories)测量上清中的IFN-γ、TNF-α和IL-2。
[0307] 应力测试
[0308] 为了模仿循环的抗原相遇，开始以1∶1的E∶T比共培养附着的靶细胞和新鲜解冻的非附着的效应细胞。24小时(第I轮)和48小时(第II轮)后，使用Guava ViaCount测定(Millipore)评价T细胞生活力，将非附着的效应细胞以1∶1的E∶T比移至附着的靶细胞的新集。在第I轮、第II轮和第III轮(72小时)之后，收获T细胞并在进一步分析前用死亡细胞移除试剂盒(Miltenyi)处理。
[0309] 免疫组织化学
[0310] 在小鼠死亡后收获小鼠的大脑，在10％中性缓冲福尔马林(Thermo)中固定24小时，处理，石蜡包埋并切成5μm的切片。使用Diva decloaker RTU(Biocare Medical)进行抗原修复。将一抗与切片在4℃下温育过夜，并用封闭缓冲液稀释如下：大鼠单克隆抗人CD3(Clone CD3-12，AbD Serotec/Bio-rad)1∶100，小鼠单克隆抗人Ki67(Clone MIB-1，Dako)1∶200，兔多克隆抗人切割的半胱天冬酶-3(Biocare Medical)1∶100，兔多克隆抗人颗粒酶B(Biocare Medical)1∶200。二抗(Life technologies)与切片在室温下温育2小时，并用含0.2％BSA的PBS以1∶500稀释。
[0311] 在配备了多光谱成像系统(Perkin Elmer)的Eclipse Ci直立荧光显微镜(Nikon)上以40×放大倍率使载玻片成像。通过使用InForm分析软件(Perkin Elmer)分析成像数据。
[0312] NOD/SCID/γc-/-小鼠中的实验
[0313] 在SCRI IACUC批准的方案下进行NSG小鼠肿瘤模型。
[0314] 颅内NSG小鼠人成神经细胞瘤异种移植模型
[0315] 成年雄性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ[NOD scid gamma(NSG)]小鼠获得自杰克逊实验室或内部培育。在第0天，用2×105分泌IL-2，表达ffLuc的Be2或SK-N-DZ肿瘤细胞在前囱的侧向2mm，前方0.5mm，以及距硬脑膜2.5mm深处对小鼠颅内注射。小鼠在7天(治疗响应模型)或14天(应力测试模型)后接受随后的瘤内注射2×106CAR修饰的CD8+TE(CM)。在应力测试模型中，T细胞注射后3天处死小鼠，收获大脑用于IHC分析。为了肿瘤生长的生物发光成像，小鼠接受腹膜内(i.p.)注射D-荧光素(Perkin Elmer；4.29mg/小鼠)。将小鼠用异氟烷麻醉并在注射D-荧光素后15分钟用IVIS光谱成像系统(Perkin Elmer)成像。使用活体成像软件4.3版(Perkin Elmer)分析荧光素酶活性，并在感兴趣的区域分析光子通量。
[0316] 统计分析
[0317] 使用Prism软件 进行统计分析。如上文的图例所述，数据表示为平均值±SD或SEM。以95％的置信区间按双尾配对检验进行学生t检验，并且p值为p＜0.05的结果被认为是显著的。通过对数秩检验完成存活的统计分析，并且p值为p＜0.05的结果被认为是显著的。
[0318] 可以基于CAR胞外间隔区大小增加地调节CAR引起的细胞裂解和细胞因子功能性输出的量级
[0319] 相对于距肿瘤细胞的质膜距离的肿瘤细胞表面靶分子的表位位置影响表达CAR的T细胞和肿瘤细胞间的生物物理突触。假设调整至适应功能性信号传导突触的CAR胞外间隔区大小是对工程化生物活性CAR的关键属性。为了评价CD171特异性和/或靶向CD171的CAR胞外间隔区的大小的影响，使用人IgG4的模块域组装如下的一组间隔区：“长间隔区”(LS)IgG4铰链-CH2-CH3，“中间隔区”(MS)IgG4铰链-CH3融合，和“短间隔区”(SS)IgG4铰链。将每种间隔区变体融合于CD28跨膜域，后面跟随第二代(2G)4-1BB：ζ内在域，该内在域转而用T2A核糖体跳远肽连接于细胞表面EGFRt标签(图13A)。由通过免疫磁性选择纯化的CD8+CD45RO+CD62L+中枢记忆前体产生间隔区变体2G-CAR+/EGFRt+人CD8+中枢记忆来源的效应T细胞系(TE(CM))集(图19A和B)。在慢病毒转导的TE(CM)扩增后，通过西妥昔单抗免疫磁性阳性选择针对均一水平的EGFRt表达进一步富集细胞系(18)。确认了通过抗鼠F(ab)特异性流式细胞术染色和EGFR特异性流式细胞术染色进行的每种CAR间隔区变体相似的表面表达水平，并确认了通过对每种T细胞系的CD3ζ蛋白印迹定量的蛋白表达(图13B和C)。
[0320] 获得结果后，确定间隔区的大小是否影响2G-CAR触发的CD8+TE(CM)的体外激活的量级。由CD171+人成神经细胞瘤(NB)肿瘤细胞激活后，CD171-特异性和/或靶向CD171的2G-CAR(LS)CD8+T E(CM)表现出磷-ERK的水平是它们的CD171-CAR(SS)相对物的3.1倍(p＝0.003)，以及表达激活标记CD137的细胞的百分比是它们的CD171-CAR(SS)相对物的5.7倍(p＝0.015)(图13D和E)。2G-CAR(MS)表现出与LS和SS 2G-CAR相比中等水平的磷-ERK和CD137诱导。接下来，确定间隔区大小是否也以LS＞MS＞SS的模式调节抗肿瘤细胞裂解活性的量级。使用4小时的铬释放测定，遵循针对CD171高Be2和CD171低SK-N-DZ两种NB细胞系的相同效力梯度LS＞MS＞SS，观察到CD171+NB靶细胞的裂解(图13F和图20A)。进一步，对细胞因子分泌的激活遵循相同增量的输出层级，使得2G-CAR(LS)产生的IFN-γ的量是2G-CAR(SS)的8.4倍(p＝0.003)，IL-2的量是2G-CAR(SS)的6.3倍(p＜0.0001)和TNF-α的量是2G-CAR(SS)的8.4倍(p＝0.005；图13G)，2G-CAR(MS)落在两个极端值之间。这些数据证明可以通过间隔区大小调节CAR产生的生物物理突触，使得获得激活和功能性输出的增量水平。基于本领域中典型地使用的标准CAR开发条件，2G-CAR(LS)间隔区变体将是用于进一步开发临床应用的领先候选物。
[0321] 间隔区调节的CAR重定向CTL的体外功能性效果与体内抗肿瘤活性呈负相关[0322] 为了描述观察到的基于体外测定的CAR信号传导的效力与体内治疗活性的关系，用建立的人NB异种移植物立体定向移植于大脑半球对小鼠进行了过继转移实验(图14A)。惊人地，用瘤内注射2G-CAR(LS)处理的Be2肿瘤移植的小鼠未展示出治疗活性，使得动物在肿瘤接种后约3周被处死(图14B和C)。相比之下，在用2G-CAR(SS)CAR CD8+TE(CM)处理的小鼠中生物光子肿瘤信号减少了，并且存活率提高，在用2G-CAR(MS)变体处理的小鼠中提高至中等程度(p＝0.001；不同组的存活中值：LS＝20d，模拟＝21d，MS＝59.5d，SS＝76d)。SK-N-DZ肿瘤植入的小鼠展示具有一致的肿瘤清除的肿瘤响应的SS＞MS＞＞LS层级，以及用2G-CAR(SS)CD8+TE(CM)处理的动物展示100％的存活率(图20C和D)。直接注射于移植肿瘤中的
2G-CAR(LS)重定向的CTL的失败不能归因于其使过继转移存活和原位激活的失败，因为通过过继转移后早期(第3天)的IHC观察到表达颗粒酶B和Ki67的转移的T细胞具有等价的瘤内密度(图14D-G)。虽然没有统计学上的显著性(p＝0.34)，检测到激活半胱天冬酶3的2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)为的频率是2G-CAR(SS)相对物的12.1倍。这些数据显示通过胞外间隔区描述的CAR重定位的T细胞在体外的抗肿瘤效力与其在体内的抗肿瘤治疗活性之间的出乎意料的不一致。
2G-CAR(LS)重定向的CTL的失败不能归因于其使过继转移存活和原位激活的失败，因为通过过继转移后早期(第3天)的IHC观察到表达颗粒酶B和Ki67的转移的T细胞具有等价的瘤内密度(图14D-G)。虽然没有统计学上的显著性(p＝0.34)，检测到激活半胱天冬酶3的2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)为的频率是2G-CAR(SS)相对物的12.1倍。这些数据显示通过胞外间隔区描述的CAR重定位的T细胞在体外的抗肿瘤效力与其在体内的抗肿瘤治疗活性之间的出乎意料的不一致。
[0323] 在循环抗原暴露时增高的激活诱导的细胞死亡伴随长间隔区形式的第二代CAR的过度活性信号传导输出
[0324] 假设鉴于在4小时CRA中对细胞裂解的体外激活是CAR介导信号传导的有限持续的结果，体内肿瘤模型需要循环数轮的激活以达到肿瘤的清除。因此体外显示优越指标的具体CAR形式的信号传导性能不能在体内显示信号传导幅度的结果。为了在体外复制循环的连续刺激，因此每24小时进行CAR T细胞肿瘤细胞共培养“应力测试”测定，将CAR T细胞收获并循环地转移至接种了肿瘤细胞的培养皿，调整恒定的有生活力T细胞∶肿瘤细胞比为1∶1(图15A)。使用修饰以表达萤火虫荧光素酶的Be2以在三轮中的每轮连续转移时同时追踪肿瘤细胞杀伤。2G-CAR间隔区变体细胞系的循环激活导致在第III轮抗肿瘤活性的等价损失(图15B)。另外，在每轮流式细胞术测试后表达每种间隔区变体的效应细胞的分析揭示与
2G-CAR(SS)相对物相比，2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)显示更高频率的表达激活标记CD25和CD69的细胞(第I轮79.4对比46.8％，p＝0.007；第II轮74.0对比47.6％；第III轮65.7对比42.1％，p＝0.037)(图15C)。
2G-CAR(SS)相对物相比，2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)显示更高频率的表达激活标记CD25和CD69的细胞(第I轮79.4对比46.8％，p＝0.007；第II轮74.0对比47.6％；第III轮65.7对比42.1％，p＝0.037)(图15C)。
[0325] 与在模仿早期体外分析的第I轮中激活标记上调的LS＞MS＞SS模式相反，观察到T细胞生活力的LS/MS＞SS的损失，该损失在第III轮中最显著(第三轮死亡细胞百分比LS 58.7％，MS 62.6％对比SS 21.1％，LS对比SS p＝0.024和MS对比SS p＝0.007)(图15D)。为证实伴随循环激活发生的2G-CAR(LS)CTL的T细胞生活力的不对等损失是由过度的AICD导致的，集中于FasL-Fas介导的T细胞之间的互相杀伤(fratricide)评价了细胞死亡机制。观察到肿瘤诱导的CAR激活依赖性FasL上调遵循LS＞MS＞SS层级，因为2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)显示FasL表面表达分别是短或中间隔区CAR T细胞的4.8和2.5倍，FasL的mRNA丰度分别是短或中间隔区CAR T细胞的5.5和3.3倍(长对比短：p＜0.0001和p＝0.002，长对比中：p＜
0.0001和p＝0.002)(图15E和F)。为将FasL表达与增加的Fas介导的细胞凋亡联系在一起，分析了半胱天冬酶3的活性，观察到在2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)中切割的半胱天冬酶3的水平是其SS相对物的13.2倍(p＜0.0001)(图15G)。最后使2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)遭受Fas或FasL的siRNA敲低，然后暴露于肿瘤，观察到第III轮后T细胞生活力分别增加到1.4倍(Fas)(p＝
0.005)和1.6倍(FasL)(p＝0.0001)(图15H)。为证实siRNA敲低导致Fas/FasL的减少，评价了Fas/FasL在2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)上的表面表达，观察到与用杂乱siRNA处理的2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)相比，Fas+CTL中减少91.3％(p＜0.0001)，FasL+CTL中减少80.1％(p＜
0.0001)(图21A和B)。总的来说，这些数据证明CAR间隔区大小的调整可调节下游信号传导事件，不仅导致不同程度的抗肿瘤功能性输出，还导致对AICD敏感性的协调增加。如通过
2G-CAR(LS)和2G-CAR(SS)结构变体的比较例证的，通过调整间隔区以达到高水平的CAR信号传导输出不能一直达到使体内抗肿瘤活性优化的两个过程之间平衡。
0.0001和p＝0.002)(图15E和F)。为将FasL表达与增加的Fas介导的细胞凋亡联系在一起，分析了半胱天冬酶3的活性，观察到在2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)中切割的半胱天冬酶3的水平是其SS相对物的13.2倍(p＜0.0001)(图15G)。最后使2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)遭受Fas或FasL的siRNA敲低，然后暴露于肿瘤，观察到第III轮后T细胞生活力分别增加到1.4倍(Fas)(p＝
0.005)和1.6倍(FasL)(p＝0.0001)(图15H)。为证实siRNA敲低导致Fas/FasL的减少，评价了Fas/FasL在2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)上的表面表达，观察到与用杂乱siRNA处理的2G-CAR(LS)CD8+TE(CM)相比，Fas+CTL中减少91.3％(p＜0.0001)，FasL+CTL中减少80.1％(p＜
0.0001)(图21A和B)。总的来说，这些数据证明CAR间隔区大小的调整可调节下游信号传导事件，不仅导致不同程度的抗肿瘤功能性输出，还导致对AICD敏感性的协调增加。如通过
2G-CAR(LS)和2G-CAR(SS)结构变体的比较例证的，通过调整间隔区以达到高水平的CAR信号传导输出不能一直达到使体内抗肿瘤活性优化的两个过程之间平衡。
[0326] 在循环肿瘤相遇时CAR胞浆内在域组成的增多使短间隔区CD171-CAR回复为倾向于AICD的变体
[0327] 第三代CAR含有与CD3-ζ激活组件相连的两个共刺激内在域组件，并被报道比其第二代相对物提高了细胞裂解的程度和细胞因子产生水平。通过将CD28内在域添加至2G 4-1BB：ζ内在域组装CD171-特异性和/或靶向CD171的3G-CAR(图16A)。表达相当水平的2G-CAR(SS)和3G-CAR(SS)的CD8+TE(CM)通过免疫磁性选择来源自纯化的TCM前体(图16B和C)。3G-CAR(SS)CD8+TE(CM)证明了在肿瘤接触时，CD137表达的诱导是其第二代相对物的8.4倍(p＜
0.0001)(图16D)，针对Be2靶标的细胞裂解活性增加1.3倍(效应物与靶标比1：10，p＝
0.0001)(图16E)和IL-2分泌是其第二代相对物的5.1倍和TNF-α分泌是其第二代相对物的
2.5倍(p＜0.0001和p＝0.003)(图16F)。
0.0001)(图16D)，针对Be2靶标的细胞裂解活性增加1.3倍(效应物与靶标比1：10，p＝
0.0001)(图16E)和IL-2分泌是其第二代相对物的5.1倍和TNF-α分泌是其第二代相对物的
2.5倍(p＜0.0001和p＝0.003)(图16F)。
[0328] 接下来在胞外短间隔区的情况下，评价了通过3G内在域介导的增加的CAR提高的T细胞激活是否能够选择性地提高体内抗肿瘤活性而不使AICD恶化。惊人地，Be2(图17A)和SK-N-DZ(图17B)比2G-CAR(SS)对应物差，虽然没有达到统计学上显著的程度。基于过继转移后3天检测到的人CD3+T细胞的相似密度，这些发现不能归因于CAR T细胞在肿瘤内的短期存留的差别(图17C)。尽管发现颗粒酶B+3G-CAR(SS)T细胞与2G-CAR(SS)T细胞相比频率更高，但再次观察到具有激活的半胱天冬酶3的第三代T细胞的数量增高，说明在第三代CAR中通过CD28和4-1BB的联合作用增高的共刺激能够过度刺激，导致提高的AICD，尽管是在短间隔区胞外域的情况下(图17)。这可通过用体外应力测试测定比较他们的性能来确定。在每轮肿瘤刺激后，在3G-CAR(SS)T细胞群中观察到更高频率的CD25+CD69+T细胞(图18A)，伴随经过连续几轮的激活后死亡T细胞的频率增加(图18B)。通过表面染色和mRNA含量，增高的AICD再次与FasL表达水平的提高相关，这转而与激活的半胱天冬酶3的水平提高相一致(图18C-E)。这些数据证明基于胞内信号传导域组成的CAR信号传导输出的过度调节以组合的方式通过提高FasL介导的T细胞AICD负面影响调节的短间隔区尺寸。
[0329] CAR能够介导触发重定向的抗肿瘤T细胞效应功能的多路信号传递输出。尽管在具有急性成淋巴细胞性白血病的患者中CAR T细胞重定向于CD19的不可辩驳的治疗效果，该类合成受体的生物物理结构功能属性仍不能完全被理解。虽然理所当然针对有效的T细胞抗肿瘤活性调整CAR在实体瘤应用中会是更严格的，但基于它们的组成对体内抗肿瘤功能的影响的有限理解，经验性设计CAR会仅妨碍在人临床应用中的进展。这里，系统地了解在胞浆信号传导组件组成的情况下，聚焦于胞外间隔区尺寸的组合作用的人中枢记忆细胞来源的CD8+效应CTL中的CAR结构-功能。通过使用体外测定测量CAR信号传导强度，辨别CAR结构变体的效力层级。这些分析揭示了允许用于上文体内抗肿瘤活性的一系列CAR信号输出，其中体内效力通过AICD衰减。
[0330] CAR设计的演变至今已通过大量经验性方法继续进行，并主要集中于通过共刺激受体胞浆域的组合组件串联地融合于含有激活域(如CD3复合体的ζ链)的ITAM以增强信号输入。表达第一、第二或第三代CAR的CTL的功能的比较典型地在通过具体实验优选的“储备(stock)”胞外间隔区的情况下进行，其范围是从全长IgG至相对短的CD8α铰链或CD28的膜近端部分。许多人研究了间隔区尺寸对CAR信号传导和功能活性的影响。不同于与负载I类或II类HLA的肽接触的TcR，其定义了T细胞质膜与允许超分子激活复合物(SMAC)组装的靶细胞质膜之间形成(scripted)的生物物理间隙，由于靶分子的结构尺寸、位于靶分子上的scFv表位和CAR的间隔区大小，CAR不符合这种尺寸关系。SMAC通过CAR的分子组装相对未知，但是迄今为止的分析说明它没有复制TcR SMAC有秩序的结构。虽然前两种尺寸对于每个选择的抗原和抗体结合域选项是独特的，但CAR间隔区是可调节大小的并可以在使CAR T细胞和靶细胞之间的正交突触距离正常化中在某种程度上抵消。这种T细胞和靶细胞之间的免疫学突触的形貌(topography)也限定了距离，所述距离由于细胞表面靶分子上的膜远端表位而不能通过CAR功能性桥接，所述细胞表面靶分子具有短间隔区CAR，也不能使突触距离得到用于信号传导的近似值。同样地，描述了临近膜的CAR靶抗原表位，其中信号传导输出仅在长间隔区的情况下被观察到。
[0331] 首先使用源自CE7mAb的CD171特异性和/或靶向CD171的scFv结合域，评价了胞外间隔区大小对从4-1BB：ζ第二代CAR的信号传导输出的影响。观察到基于体外测定，随着间隔区大小从短IgG4铰链间隔区增加至中等铰链：CH3，至全长IgG4铰链：Fc间隔区，在信号传导输出中功能获得增加。出乎意料地，在体内针对NSG小鼠中已建立的立体定向移植的脑实质脑成神经细胞瘤异种移植物测试时，瘤内注射的CAR CD8+CTL的抗肿瘤效力效果与间隔区大小(即SS＞MS＞＞LS)和体外功能性效力呈负相关。使用T细胞施用的直接瘤内途径以清除对T细胞迁移或与能影响存活的小鼠Fc+细胞的相互作用的潜在间隔区影响。考虑到这些发现，假设通常采用的评价CAR T细胞功能(即肿瘤细胞的细胞裂解，细胞因子分泌的刺激，和增殖)的体外测定在单个有限持续时间的肿瘤细胞相遇时，不能检测到随后的在循环的肿瘤暴露时的CAR T细胞的命运，如同在体内的实体瘤中被预测发生。为了更好地评价这种可能性，设计了体外测定，其中CAR T细胞循环地暴露于相等数量的表达生物光子报告基因的肿瘤细胞。因此，可以用生物光子定量肿瘤细胞杀伤，并且可以在每轮肿瘤共培养后，了解恢复的CAR T细胞的激活状态、生活力和半胱天冬酶活性。观察到在体外三次循环肿瘤相遇时，相比于2G-CAR(SS)T细胞，2G-CAR(LS)T细胞中经历凋亡的T细胞的频率不成比例地增加。相对于SS CAR，增加的AICD与提高的LS CAR诱导的FasL表达和激活的半胱天冬酶3相关。在暴露于肿瘤细胞之前，通过siRNA敲低FAS或FasL降低在LS CAR T细胞中的AICD。这些体外发现与肿瘤异种移植物中LS CAR T细胞与SS CAR T细胞相比的有限的瘤内存留相关。总的来说，这些数据证明了非信号传导胞外间隔区是主要的可调整CAR设计元件，其不仅影响信号传导活性还影响实体瘤中CAR T细胞的存留。
[0332] 考虑到在4-1BBζ第二代(2G)CAR的情况下间隔区尺寸和体内存活率之间的关系，进行了以下努力，即确定在增加第三代(3G)CD28：4-1BB：ζCAR内在域形式的信号传导输出的情况下短间隔区尺寸是否是一般地优化的。与通过多个其他组进行的观察一致，在体外肿瘤刺激时，与2G-CAR(SS)相比，CD171-特异性和/或靶向CD171的3G-CAR(SS)刺激提高水平的细胞裂解活性和细胞因子合成。然而，短间隔区情况下的3G-CAR信号传导输出的增高也使FasL表达增加，如通过激活的半胱天冬酶3的水平增加所表明的使细胞凋亡恶化，并导致高频率的细胞死亡。相对地，与2G-CAR(SS)相比，观察到了由于体内肿瘤内存活的衰减导致的3G-CAR(SS)T细胞的体内抗肿瘤效果减弱。虽然CD28在初始抗原激活时共刺激T细胞，并通过NFAT调控的cFLIP短(cFLIPshort)的提高使AICD偏转来提高T细胞生活力，但已发表的研究也揭示了之前激活的T细胞的循环CD28共刺激可通过增高的FasL表达和因而提高的AICD减少后续的T细胞存活。因此，有趣的是，推测由抗CD19 CD28：ζCAR T细胞介导的循环CD28信号传导是否是与报道的临床试验中抗CD194-1BB：ζ治疗的患者的通常延长的存留相比，在治疗的ALL患者治疗中相对短的存留持续时间的原因(2，35)。总的来说，这些数据证明CAR重定向的T细胞的体内效力部分地依赖于在具体的胞浆信号传导域组成的情况下，鉴别优化大小的胞外间隔区的允许的组合。而且，描述了在循环激活的情况下用于评价在原代人CD8+CTL中CAR构建体倾向于诱导AICD的体外测定。这些研究揭示基于间隔区大小的组合净效应和胞浆信号传导组件选择的CAR的“过度调节”的提示。
[0333] 尚没有可以可靠地指向基于靶分子表位相对于肿瘤细胞质膜的位置应如何建立CAR的先验的预测性结构模型。此外，通常使用的替代的体外生物测定可引导远离CAR组成的限定性选择，导致高水平功能性抗肿瘤CAR T细胞输出和低水平AICD之间的最大差别。本文的工作证实了使用体外应力测试测定的CAR结构文库筛选技术可以是有价值的整合入CAR工程化中的另外参数。可以构思，基因策略可以限制过度活性的CAR构建体经历AICD的敏感性，如使cFLIP或Toso过表达，或敲低FasL或Fas的siRNA的载体指向合成。对经历细胞凋亡的T细胞敏感性的操作会需要相当严格的安全特征，如包括诱导型自杀构建体或在临床控制下转基因表达控制变阻器(rheostats)，如小分子调控的转录或翻译控制系统。CAR过调节的另外的次要结果也需要了解，如过度活性CAR对触发抑制性受体的表达增高的偏好，所述抑制受体如PD-1能够在PD-L1内强制执行耗尽的T细胞功能状态。数据证明：1.)使用通常采用的功能性测定的CAR结构功能体外测试可以误导候选构建体的选择，因为通常的实践是集中于显示最高功能活性的构建体；2.)调节重定向CAR的效应CTL的效力具有如上的上限，所述上限增加效应输出的量级，在通过CAR循环触发时通过增加AICD使效应输出无效。对于具有复发性/难治性成神经细胞瘤的儿童的I期研究，这些结果引导CD171-特异性和/或靶向CD171的短间隔区CAR的选择。
[0334] 另外的供选择的方案
[0335] 在一些供选择的方案中，提供了嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码可靶向于配体和/或对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，所述间隔区是优化的。
[0336] 在一些供选择的方案中，提供了嵌合受体多肽。在一些供选择的方案中，由嵌合受体核酸编码嵌合受体多肽。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，所述间隔区是优化的。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。
[0337] 在一些供选择的方案中，提供了包括分离的嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，所述间隔区是优化的。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。
[0338] 在一些供选择的方案中，提供了宿主细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，提供了包括分离的嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，所述间隔区是优化的。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。
[0339] 在一些供选择的方案中，提供了组合物。在一些供选择的方案中，组合物包括在药学上可接受的赋形剂中的宿主细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，提供了包括分离的嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包括：宿主细胞，其中宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞，或其中CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的；以及另一种宿主细胞，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞，或其中CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的，和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，所述间隔区是优化的。
[0340] 在一些供选择的方案中，提供了制备宿主细胞的体外方法。在一些供选择的方案中，用于制备宿主细胞的体外方法包括：a)提供编码嵌合受体的核酸文库，其中多种核酸中的每一种编码长度不同的嵌合受体，b)将多种核酸中的每一种引入单独分离的T淋巴细胞群并体外扩增每个T淋巴细胞群，c)将每个基因修饰的T淋巴细胞群施用于荷瘤动物模型并确定基因修饰的T淋巴细胞群是否具有抗肿瘤效果以及d)选择编码在体外和/或动物模型中提供抗肿瘤效果的嵌合受体的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，提供了包括分离的嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，优化所述间隔区。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的和对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，编码嵌合受体的核酸包括表达载体。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，所述间隔区是优化的。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，方法进一步包括将选择的编码嵌合受体的核酸引入宿主细胞。
[0341] 在一些供选择的方案中，提供了制备宿主细胞的体外方法。在一些供选择的方案中，方法包括：a)将嵌合受体核酸或表达载体引入具有CD45RA-、CD45RO+和/或CD62L+表型的淋巴细胞群，以及b)在抗CD3和/或抗CD28和至少一种体内稳态的细胞因子的存在下培养细胞直到细胞扩增足以用作细胞输注物。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，提供了包括分离的嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，所述间隔区是优化的。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，优化所述间隔区。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，表达载体包括分离的嵌合受体核酸。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，优化所述间隔区。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，淋巴细胞是CD8+或CD4+淋巴细胞。
[0342] 在一些供选择的方案中，提供了宿主细胞或组合物在治疗表达CD171的癌症或实体瘤中的用途。在一些供选择的方案中，组合物包括在药学上可接受的赋形剂中的宿主细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，提供了包括分离的嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，优化所述间隔区。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包括：宿主细胞，其中宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞，或其中CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的；以及另一种宿主细胞，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞，或其中CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，提供了包括分离的嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，优化所述间隔区。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，癌症是成神经细胞瘤。在一些供选择的方案中，实体瘤选自由结肠癌、肾癌、胰腺癌和卵巢癌组成的组。
[0343] 在一些供选择的方案中，提供了对具有癌症或肿瘤的受试者进行细胞免疫治疗的方法。在一些供选择的方案中，所述方法包括将组合物或宿主细胞施用于受试者。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，提供了包括分离的嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，针对与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加，优化所述间隔区。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包括在药学上可接受的赋形剂中的宿主细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括表达载体。在一些供选择的方案中，提供了包括分离的嵌合受体核酸的表达载体。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括：a)编码配体结合域的多核苷酸，其中配体结合域结合于和/或靶向于CD171，b)编码对配体特异的一定长度的多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区是优化的，c)编码跨膜域的多核苷酸以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体片段。在一些供选择的方案中，配体结合域是单链可变区片段。在一些供选择的方案中，间隔区是15个氨基酸或更少(但不少于1个或2个氨基酸)。在一些供选择的方案中，间隔区包括X1PPX2P的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，间隔区包括人抗体的铰链区的部分。
在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-
1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包括：宿主细胞，其中宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞，或其中CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的；以及另一种宿主细胞，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞或其中CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，癌症是成神经细胞瘤。在一些供选择的方案中，肿瘤选自由结肠癌、肾癌、胰腺癌和卵巢癌组成的组。
在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括全部的与共刺激域结合的CD3ζ的部分，所述共刺激域选自由CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、NKG2C和B7-H3或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3ζ的部分和4-
1BB的部分。在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸进一步包括编码标记序列的核酸。在一些供选择的方案中，宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的。在一些供选择的方案中，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，组合物包括：宿主细胞，其中宿主细胞是选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞组成的组的CD8+T细胞毒性淋巴细胞，或其中CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞对CD45RO+、CD62L+和/或CD8+是阳性的；以及另一种宿主细胞，其中宿主细胞是选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞组成的组的CD4+T辅助淋巴细胞或其中CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞对CD45RA+、CD62L+和/或CD4+是阳性的和/或对CD45RO是阴性的。在一些供选择的方案中，癌症是成神经细胞瘤。在一些供选择的方案中，肿瘤选自由结肠癌、肾癌、胰腺癌和卵巢癌组成的组。
[0344] 表1示例性序列
[0345] IgG4铰链
[0346]
[0347]
[0348]
[0349] 表2示例性序列Uniprot P0861 IgG4-Fc(SEQ ID NO：13)
[0350]
[0351] 1-98 CH1
[0352] 99-110 铰链
[0353] 111-220 CH2
[0354] 221-327 CH3
[0355] 第108位S→P
[0356] 表3示例性序列/Uniprot P10747 CD28(SEQ ID NO：14)
[0357]
[0358] 1-18 信号肽
[0359] 19-152 胞外域
[0360] 153-179 跨膜域
[0361] 180-220 胞内域
[0362] 第186-187位LL→GG
[0363] 表4示例性序列/Uniprot Q07011 4-1BB(SEQ ID NO：15)
[0364]
[0365] 1-23 信号肽
[0366] 24-186 胞外域
[0367] 187-213 跨膜域
[0368] 214-255 胞内域
[0369] 表5示例性序列/Uniprot P20963人CD3ζ同种型3(SEQ ID NO：16)
[0370]
[0371] 1-21 信号肽
[0372] 22-30 胞外域
[0373] 31-51 跨膜域
[0374] 52-164 胞内域
[0375] 61-89 ITAM1
[0376] 100-128 ITAM2
[0377] 131-159 ITAM3
[0378] 表6示例性铰链区序列
[0379] 人IgG1 EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：17)
[0380] 人IgG2 ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：18)
[0381] 人IgG3 ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：19)
[0382] 人IgG4 ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：20)
[0383] 修饰的人IgG4 ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：21)
[0384] 修饰的人IgG4 YGPPCPPCP(SEQ ID NO：51)
[0385] 修饰的人IgG4 KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：52)
[0386] 修饰的人IgG4 EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：53)
[0387] 表7
[0388] 中等间隔区IgG4铰链-CH3(SEQ ID NO：37)
[0389] IgG4间隔区
[0390]
[0391] CH3
[0392] GGCCAGCCTCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG
[0393] 长间隔区IgG4铰链-CH2-CH3(SEQ ID NO：58)
[0394] IgG4间隔区
[0395]
[0396] CH2
[0397] GCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAG
[0398] CH3
[0399]GGCCAGCCTCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCC
AGAAGAGCCTGAGCCTGTCCC TGGGCAAG
AGAAGAGCCTGAGCCTGTCCC TGGGCAAG
[0400] 表8
[0401] 短间隔区(SEQ ID NO：21)
[0402] 铰链间隔区
[0403] ESKYGPPCPPCP
[0404] 中等间隔区(SEQ ID NO：59)
[0405] 铰链间隔区
[0406] ESKYGPPCPPCP
[0407] CH3
[0408]
[0409] 长间隔区(SEQ ID NO：60)
[0410] 铰链间隔区
[0411] ESKYGPPCPPCP
[0412] CH2
[0413]
[0414] CH3
[0415]
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