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CS1-特异性嵌合抗原受体工程化的免疫效应细胞

阅读：519发布：2020-05-14

专利汇可以提供CS1-特异性嵌合抗原受体工程化的免疫效应细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文中公开了可特异性识别多发性骨髓瘤(MM)细胞上的肿瘤相关抗原 (TAA)的嵌合抗原受体(CAR)。还公开了经工程化以表达这些CAR的免疫效应细胞，诸如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。因此，还公开了在具有MM的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括经工程化以表达公开的CAR的公开的免疫效应细胞的过继转移。，下面是CS1-特异性嵌合抗原受体工程化的免疫效应细胞专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含CS1抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号转导结构域和共刺激信号转导区。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述抗原结合结构域是特异性结合CS1的抗体片段或抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述抗原结合结构域为特异性结合CS1的抗体的Fab或单链可变片段(scFv)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述共刺激信号转导区包含选自由以下组成的组的共刺激分子的胞质结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其任意组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述CAR多肽由下式定义：
SP–CS1–HG–TM–CSR–ISD；或
SP–CS1–HG–TM–ISD–CSR
其中“SP”代表信号肽，
其中“CS1”代表CS1结合区，
其中“HG”代表任选的铰链结构域，
其中“TM”代表跨膜结构域，
其中“CSR”代表共刺激信号转导区，
其中“ISD”代表细胞内信号转导结构域，以及
其中“–”代表二价接头。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述CS1结合区为特异性结合CS1的抗体的Fab或单链可变片段(scFv)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述细胞内信号转导结构域包含CD3ζ(CD3ζ)信号转导结构域。
8.一种分离的核酸序列，其编码权利要求1至7的任一项所述的重组多肽。
10.一种细胞，其包含权利要求9所述的载体。
11.根据权利要求10所述的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：αβT细胞、γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞或其任意组合。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中当所述CAR的抗原结合结构域结合于CS1时，所述细胞展现抗-肿瘤免疫。
13.一种在具有多发性骨髓瘤(MM)的受试者中提供抗-肿瘤免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞，其中所述CAR包含CS1抗原结合结构域、共刺激信号转导区和CD3ζ信号转导结构域，从而在所述哺乳动物中提供抗-肿瘤免疫。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述免疫效应细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述抗原结合结构域为特异性结合CS1的抗体片段或抗原结合片段。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗原结合结构域为特异性结合CS1的抗体的Fab或单链可变片段(scFv)。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号转导区包含选自由以下组成的组的共刺激分子的胞质结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体及其任意组合。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述CAR多肽由下式定义：
SP–CS1–HG–TM–CSR–ISD；或
SP–CS1–HG–TM–ISD–CSR
其中“SP”代表信号肽，
其中“CS1”代表CS1结合区，
其中“HG”代表任选的铰链结构域，
其中“TM”代表跨膜结构域，
其中“CSR”代表共刺激信号转导区，
其中“ISD”代表细胞内信号转导结构域，以及
其中“–”代表二价接头。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述抗-CS1抗原结合结构域为特异性结合CS1的抗体的Fab或单链可变片段(scFv)。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号转导结构域包含CD3ζ(CD3ζ)信号转导结构域。

说明书全文

CS1-特异性嵌合抗原受体工程化的免疫效应细胞

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2013年5月3日提交的美国临时申请第61/819,141号和2013年9月有11日提交的美国临时申请第61/876,492号的权益，所述临时申请由此通过引用整体并入。

[0003] 背景

[0004] 多发性骨髓瘤(MM)是特征在于骨髓内浆细胞(PC)的异常克隆扩增的B细胞恶性肿瘤，2012年在美国据估计有21,700例新病例和10,710例MM造成的死亡被鉴定(Siegel R，等Cancer J Clin 2012 62:10–29)。在2013年，在美国估计有22,350个个体被新诊断为MM以及10,710人将死于其，占所有血液系统恶性肿瘤死亡人数的20％。尽管使用已提高总体存活率的蛋白酶体抑制剂和免疫调节药物(Palumbo A，等Leukemia 2009 23:449–456)，但MM仍然是无法治愈的恶性肿瘤(Podar K，等Leukemia 2009 23:10–24)，对于该疾病迫切需要新型治疗方法。

[0005] 概述

[0006] 本文公开了可与过继细胞转移一起用于靶向并杀死多发性骨髓瘤(MM)细胞的嵌合抗原受体(CAR)多肽。细胞表面糖蛋白CS1高度和普遍地在骨髓瘤细胞的表面上表达，同时以极低水平在大多数免疫效应细胞中表达。因此，公开的CAR多肽在胞外结构域中含有可结合表达CS1的MM细胞的抗CS1结合剂。与其它CAR一样，公开的多肽还可含有跨膜结构域和能够激活免疫效应细胞的胞内结构域。例如，该胞内结构域可含有细胞内信号转导结构域和任选的共刺激信号转导区域。

[0007] 抗CS1结合剂在某些实施方案中是特异性结合CS1的抗体片段或抗原结合片段。例如，抗原结合结构域可以是特异性结合CS1的抗体的Fab或单链可变片段(scFv)。抗CS1结合剂在某些实施方案中是特异性结合CS1的适体。例如，抗CS1结合剂可以是基于其结合CS1的能力从随机序列池中选择的肽适体。抗CS1结合剂还可以是CS1的天然配体、或其变体和/或其能够结合CS1的片段。

[0008] 在一些实施方案中，细胞内信号转导结构域是CD3ζ(CD3ζ)信号转导结构域，并且共刺激信号转导区包含CD28、4-1BB的胞质结构域，或其组合。在某些情况下，共刺激信号转导区含有一个或多个细胞内信号转导和/或共刺激分子的1、2、3或4个胞质结构域。

[0009] 还公开了编码公开的CAR多肽的分离的核酸序列、包括这些分离的核酸的载体，以及含有这些载体的细胞。例如，所述细胞可以是选自由以下组成的组的免疫效应细胞：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。在一些实施方案中，当CRA的抗原结合结构域结合CS1时，所述细胞表现出抗肿瘤免疫。

[0010] 还公开了在具有多发性骨髓瘤(MM)的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，该方法包括向受试者施用有效量的利用公开的CS1特异性CAR遗传修饰的免疫效应细胞。

[0011] 本发明的一个或多个实施方案的细节阐述于附图和以下说明中。根据说明和附图以及权利要求，本发明的其它特征、目的和优点将是显而易见的。

[0012] 附图概述

[0013] 图1A至1C显示CS1特异性CAR的产生及其在CAR-转导的T细胞中的表达。图1A是含有连接于CD28和CD3ζ胞内结构域的针对CS1的scFv的Pinco-CS1-CAR逆转录病毒构建体的示意图。LTR，长末端重复序列；SP，信号肽；VH，可变H链；L，接头；VL，可变L链。在图1B中，用CD3和CD28珠粒活化PBMC(外周血单核细胞)，并用Pinco-CS1-CAR或Pinco构建体进行转导。分选GFP阳性细胞，并在还原条件下使用抗人CD3ζ第一抗体将细胞裂解物经历免疫印迹分析。在图1C中，用生物素标记的山羊抗-小鼠Fab特异性抗体或同种型匹配的对照抗体对来自健康供体的模拟物1或CS1-CAR1转导的T细胞进行染色，随后进行链霉亲和素和CD3抗体染色。

[0014] 图2A至2C显示CS1-重定向T细胞响应于表达CS1的骨髓瘤细胞系比模拟T细胞分泌更多的IFN-γ和IL-2。图2A显示骨髓瘤细胞系表面上的CS1表达的流式细胞术分析。用PE缀合的抗CS1mAb抗体(实线)或同种型匹配的对照抗体(虚线)对指示的4个骨髓瘤细胞系进行染色。图2B和2C是显示单独培养(无靶标)或利用相等数量的表达不同水平CS1的骨髓瘤细胞刺激24小时的模拟物或CS1-CAR转导的健康供体的T细胞5
(2×10个)中的IFN-γ(图2B，ng/ml)和IL-2(图2C，pg/ml)分泌的柱状图。

[0015] 图3A至3D显示CS1-重定向T细胞优先消除明显表达CS1蛋白的骨髓瘤细胞。51
在图3A中，以指定的E/T比将 Cr标记的NCI-H929、IM9、MM.1S和RPMI-8226骨髓瘤细胞
3 51
(5×10个)与模拟物或CS1-CAR转导的T细胞共培养4小时，并测量靶裂解( Cr释放)。
在图3B中，在与NCI-H929细胞共培养4小时后，模拟物-或CS1-CAR转导的T细胞上的脱粒标志物CD107a和T细胞活化标志物CD69的表达用流式细胞术来评估。与模拟物转导的T细胞相比，CS1-CAR-转导的T细胞响应于表达CS1的NCI-H929细胞表现更优的脱粒和更高的T细胞活化。在图3C中，对模拟物-和CS1-CAR-转导的T细胞进行透化，以利用对于颗粒酶B和穿孔素是特异的mAb进行细胞内染色，并通过流式细胞术进行分析。

[0016] 图4A至4D显示CS1在MM细胞中的异位过表达在被CS1-CART细胞识别后触发增强的细胞毒性和细胞因子分泌。图4A显示过表达CS1(RPMI-8226-CS1，粗实线)或空载体对照(RPMI-8226-PCDH，浅色实线)的RPMI-8226细胞的表面上的CS1蛋白或IgG同种型对照(虚线)的流式细胞术染色。图4B是显示模拟物-或CS1-CAR-转导的T细胞针对RPMI-8226–CS1和RPMI-8226–PCDH细胞的细胞毒性的图。以指定的E/T比将RPMI-8226-CS1和RPMI-8226-PCDH细胞与模拟物-或CS1-CAR-转导的T细胞一起孵育4
51
小时，并且使用标准 Cr释放测定来测定特异性裂解。图4C和4D是显示单独培养的或用相等数量的RPMI-8226-CS1或RPMI-8226-PCDH细胞刺激的模拟物-或CS1-CAR-转导的T
5
细胞(1×10个)中的IFN-γ(图4C，pg/ml)和IL-2(图4D，pg/ml)的分泌的柱状图。

[0017] 图5A至5D显示CS1-CAR T细胞离体特异性识别并消除表达CS1的人原代骨髓瘤细胞。图5A显示用抗-CD3和抗-CD28珠粒活化的，用Pinco–CS1–CAR或Pinco构建体(模拟物)转导的并用抗-小鼠Fab和抗-人CD3抗体染色的来自具有MM的患者的PBMC的流式细胞术结果。显示来自具有相似数据的4个患者之一的结果。图5B显示从具有MM+
的患者新鲜分离的CD138骨髓瘤细胞中的CS1蛋白的流式细胞术染色。显示来自10个具有相似数据的患者中的3个的结果。图5C是一系列显示以指定的E/T比与(A)中的自体+
模拟物-或CS1–CAR-转导的T细胞共培养4小时的(B)中的CD138骨髓瘤细胞的特异
51
性裂解( Cr释放测定)的图。图5D是显示除E/T比为1:1并且孵育时间被延长至24小时外如(C)中一样处理的细胞的IFN-γ分泌(pg/ml)的柱状图。

[0018] 图6A和6B显示CS1-重定向T细胞在原位MM.1S异种移植小鼠模型中抑制肿瘤生长和延长小鼠存活期。图6A是来自每一个指定组的5只代表性荷MM.1S肿瘤小鼠的背6
部和腹部的一系列生物发光图像。用8×10个表达荧光素酶的MM.1S细胞静脉内接种NSG
6
小鼠(第0天)。在接种后第7和14天，每一只小鼠接受PBS(安慰剂对照组)、10×10个模拟T细胞(模拟物对照组)或CS1-CAR T细胞(CAR处理组)。图6B显示用PBS、模拟T细胞或CS1-CAR T细胞处理的荷MM.1S小鼠的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。

[0019] 图7A至7E显示表达CS1的293T转化细胞容易被CS1-CAR T细胞识别并裂解。图7A显示，293T亲代细胞对于CS1表达呈阴性。用PE缀合的抗CS1 mAb抗体(实线)或同种型匹配的对照Ab(虚线)对293T细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。图7B显示过表达CS1(293T-CS1，深色粗实线)或空载体(293T-PCDH，灰色粗实线)的293T细胞的表面上的CS1蛋白的流式细胞术染色。用IgG同种型(虚线)染色的表达CS1的293T细胞用作非特异性结合对照。图7C显示模拟物-或CS1-CAR转导的T细胞针对293T-CS1和
293T-PCDH细胞的细胞毒性。以指定的E/T比将293T-CS1和293T-PCDH细胞与模拟物-或
51
CS1-CAR-转导的T细胞一起孵育4小时，并使用标准 Cr释放测定来测定特异性裂解。图7D和7E是显示单独培养的或利用293T-CS1或293T-PCDH细胞刺激的模拟物-或CS1-CAR-转导的T细胞中的IFN-γ分泌(图7D，pg/ml)或IL-2分泌(图7E，pg/ml)的柱状图。

[0020] 图8A和8B显示CD4+和CD8+CS1-CAR T细胞响应于骨髓瘤细胞而被活化。在图8A中，单独培养模拟物-或CS1-CAR-转导的T细胞或用NCI-H929和MM.1S细胞刺激所述细胞12小时，随后通过流式细胞术评估CD3和CD8的表面表达，以及细胞内IFN-γ。曲线是针对CD3+淋巴细胞进行门控。显示具有相似结果的3个实验中的一个代表性实验。在图8B中，单独培养或用NCI-H929和MM.1S细胞刺激模拟物-或CS1-CAR-转导的T细胞，进行
4小时，并且通过流式细胞术评估CD3、CD8和脱粒标记物CD107a的表达。曲线是针对活的+
CD3淋巴细胞进行门控。显示了具有相似结果的3个实验中的一个代表性实验。

[0021] 图9A和9B显示CS1-重定向T细胞在原位IM-9异种移植小鼠模型中抑制肿瘤生长和延长小鼠存活期。图9A显示来自每一个指定组的5只代表性荷IM9肿瘤小鼠的背5
部和腹部生物发光图像。用5×10个表达荧光素酶的IM9细胞i.v.接种NSG小鼠(第0
6
天)。在接种后第7和21天，每一只小鼠接受PBS(安慰剂对照组)、10×10个模拟T细胞(模拟物对照组)或CS1-CAR T细胞(CAR处理组)。白色十字“+”代表在成像时PBS处理组中死于MM疾病的小鼠。图9B是用PBS、模拟T细胞或CS1-CAR T细胞处理的荷IM9小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。

[0022] 图10A至10C显示CS1-CAR T细胞在植入了MM.1S细胞的NSG小鼠的骨髓(BM)6 6
中保留和增殖。在第0天用8×10个MM.1S细胞接种NSG小鼠，并在第7天用10×10 个
CS1-CAR T细胞处理小鼠。在第20天，用1.5mg在DPBS溶液中的Brdu i.p.注射小鼠。第二天处死小鼠，并分离BM细胞以用于按照制造商的方案利用CD45和CD3人特异性抗体和/或抗Brdu抗体(BD Biosciences)进行表面染色。图10A显示了代表性小鼠的BM中的人T+ +
细胞(CD45/CD3)的百分比。在图10B中，用IgG(左图)或抗Fab Ab(右图)对被门控的+ +
人T细胞(CD45/CD3)进行染色，以验证CAR表达。在图10C中，用IgG(左图)或抗Brdu + +
Ab对门控的人T细胞(CD45/CD3)进行染色，并且显示掺入了Brdu的T细胞的百分比。

[0023] 图11A至11C显示展示低水平的针对原代NK和T细胞的反应性的CS1-CAR T细51 3
胞。以指定的效/靶(E/T)比将 Cr标记的人原代NK和T细胞(5×10个)与模拟物-或
CS1-CAR-转导的T细胞共培养4小时，并测量NK细胞(图11A)和T细胞(图11B)的靶裂
51
解( Cr释放)。图11C是显示单独培养的或用原代NK细胞、T细胞或骨髓瘤细胞刺激24小时的模拟物-或CS1-CAR-转导的T细胞的IFN-γ分泌的柱状图。

[0024] 图12显示原代NK细胞或T细胞在CS1-CAR T细胞中不触发表观活化诱导的细胞51
死亡(AICD)。将原代NK细胞和T细胞与相等数量的 Cr标记的模拟物-或CS1-CAR-转
51
导的T细胞一起孵育12小时。随后使用 Cr释放测定来测定特异性裂解。

[0025] 图13A至13C显示CS1特异性CAR的产生和其在CAR转导的NK细胞中的表达。图13A是CS1-CAR慢病毒构建体的示意图。图13B显示使用CD3ζ特异性Ab的CS1-CAR表达的免疫印迹分析。所示数据代表具有相似结果的3个实验。图13C显示在用抗myc抗体或IgG1同种型对照对细胞染色后，通过流式细胞术分析的利用CS1-CAR构建体或空载体(EV)转导的FACS分选的NK-92和NKL细胞的表面上的嵌合CS1scFv的表达。所示数据代表具有相似结果的3次实验。

[0026] 图14A至14D显示CS1-CAR NK细胞消除CS1+而非CS1–MM细胞。图14A显示在用抗-CS1 mAb或同种型匹配的对照抗体对细胞进行染色后，通过流式细胞术进行的L363、51
IM9和U266 MM细胞的表面上的CS1表达的测定。图14B至13D显示使用标准 Cr释放测定的模拟物转导的或CS1-CAR转导的NK-92或NKL细胞针对IM9(图14B)、L363(图14C)和U266(图13D)细胞的细胞毒性活性。NK-92-EV和NKL-EV分别表示空载体(EV)对照转导的NK-92和NKL细胞。NK-92-CS1-CAR和NKL-CS1-CAR分别表示利用CS1-CAR构建体对NK-92和NKL细胞的转导。*和**分别表示P<0.05和P<0.01。

[0027] 图15A至15C显示CS1+MM细胞的识别诱导比来自对照NK细胞强的来自CS1-CAR NK细胞的反应。图15A至15C是显示与相等数量的IM9(图15A)、L363(图15B)或U266(图15C)骨髓瘤细胞共培养24小时的模拟物-转导的或CS1-CAR转导的NK-92或NKL效应细胞的IFN-γ分泌的柱状图。NK-92-EV和NKL-EV分别表示空载体(EV)对照转导的NK-92和NKL细胞。NK-92-CS1-CAR和NKL-CS1-CAR分别表示利用CS1-CAR构建体进行的NK-92和NKL细胞的转导。

[0028] 图16A至16C显示NK-92-CS1-CAR细胞的增强的靶识别依赖于CS1在MM细胞上的表达。图16A显示过表达CS1(U266-CS1，粗实线)或空载体对照(U266-载体，浅色实线)的U266细胞表面上的CS1蛋白或IgG对照(虚线)的流式细胞术染色。图16B显示模拟物-或CS1-CAR转导的NK-92细胞(分别为NK-92-EV和NK-92-CS1-CAR)针对U266载体和U266-CS1细胞的细胞毒性。以不同的效/靶(E/T)比将U266-载体或U266-CS1细胞与
51
NK-92-CS1-CAR或NK-92-EV细胞一起孵育4小时。使用标准 Cr释放测定来测定特异性裂解。*表示P<0.05。(c)将NK-92-CS1-CAR或NK-92-EV细胞与相等数量的U266-载体或U266-CS1骨髓瘤细胞共培养24小时。随后收获上清液以使用ELISA测量IFN-γ分泌。

[0029] 图17A至17C显示CS1-CAR修饰的NK细胞的表型表征。在图17A中，单独培养或用IM9MM细胞培养模拟物-或CS1-CAR转导的NK-92细胞(分别为NK-92-EV和
NK-92-CS1-CAR)，进行4小时。在用对应的mAb染色后，通过流式细胞术评估NKp30、NKp46、NKG2C、NKG2D、CD69和HLA-DR的表面表达，并且记录平均荧光强度(MFI)。*表示P<0.05。
在图17B中，对NK-92-EV和NK-92-CS1-CAR细胞进行透化，以利用对于穿孔素和颗粒酶B是特异的mAb进行细胞内染色，并通过流式细胞术进行分析。虚线代表利用对照IgG抗体对NK-92-EV对照细胞进行染色，粗实线表示利用穿孔素或颗粒酶B抗体对NK-92-CS1-CAR细胞进行染色，浅色实线表示利用穿孔素或颗粒酶B抗体对NK-92-EV对照细胞进行染色。
图17C显示图17B显示的MFI的直方图。*表示P<0.05。

[0030] 图18A至18C显示CS1-CAR转导的NK-92细胞增强原代人骨髓瘤细胞的杀伤。图+18A显示CS1蛋白或IgG同种型对照的流式细胞术染色，表明CD138原代骨髓瘤细胞高度表达CS1。空心和实心直方图表示分别利用同种型匹配的对照抗体和抗CS1抗体进行的染
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色。所显示的数据代表具有相似结果的6个患者样品中的两个。图18B显示使用标准 Cr释放测定的模拟物-或CS1-CAR转导的NK-92细胞(分别为NK-92-EV和NK-92-CS1-CAR)+
针对来自具有相似结果的6个患者中的3个的CD138原代骨髓瘤细胞的细胞毒性活性。E/T表示效/靶比。*表示P<0.05。图18C显示以5:1的E/T比与NK-92-EV或NK-92-CS1-CAR+
细胞共培养24小时的CD138原代骨髓瘤细胞的IFN-γ分泌。所示的数据代表具有相似结果的3个患者样品中的一个。

[0031] 图19A至19D显示CS1-CAR NK细胞在体内抑制原位人MM细胞的生长，并且延长荷MM小鼠的存活期。图19A(左)是显示在用IM9细胞i.v.注射后，一只表现后腿瘫痪的代表性小鼠的腰椎骨病变中的人IM9细胞的大量浸润(通过苏木精-伊红(H&E)染色检测的)的图像。图19A(右)显示利用抗人CD138mAb对小鼠腰椎骨病变的免疫组织化学染5
色。图19B显示荷IM9肿瘤的小鼠的背部生物发光成像。利用5×10个表达荧光素酶的IM9细胞经由尾静脉注射接种NSG小鼠(第0天)。接种后7天，用模拟物转导的NK-92细胞(NK-92-EV)、CS1-CAR转导的NK-92细胞(NK-92-CS1-CAR)或磷酸盐缓冲盐水(阴性对照)处理小鼠。图19C是显示来自图19B的每只小鼠每秒的光子单位的定量总和的柱状图。*表示P<0.05；**表示P<0.01。图19D显示相较于利用NK-92-EV细胞处理的小鼠，利用NK-92-CS1-CAR细胞处理的荷IM9小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。*表示P<0.05。

[0032] 图20显示CS1CAR的引入不导致NK细胞系的大量细胞凋亡。用7AAD和膜联蛋白V-V450对模拟物-或CS1-CAR转导的NK92或NKL细胞进行染色，随后进行流式细胞术分析。NK-92-EV和NKL-EV分别表示空载体(EV)对照转导的NK-92和NKL细胞。NK-92-CS1-CAR和NKL-CS1-CAR分别表示利用CS1-CAR构建体进行的NK-92和NKL细胞的转导。

[0033] 详述

[0034] 本文中公开了可特异性识别多发性骨髓瘤(MM)细胞上的肿瘤相关抗原(TAA)的嵌合抗原受体(CAR)。还公开了经工程化以表达这些CAR的免疫效应细胞，诸如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。因此，还公开了用于在具有MM的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，该方法包括过继转移经工程化以表达公开的CS1-特异性CAR的公开的免疫效应细胞。

[0035] CS1-特异性嵌合抗原受体(CAR)

[0036] CAR通常包含来自具有参与淋巴细胞活化的跨膜信号转导基序的单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)的抗原识别结构域(Sadelain M，等Nat Rev Cancer 20033:35–45)。细胞表面糖蛋白CS1在骨髓瘤细胞的表面上高度且普遍地表达(Hsi ED，等Clin Cancer Res 2008 14:2775–84)。CS1以极低的水平在大多数免疫效应细胞，包括自然杀伤细胞(NK)细胞、某些亚组的T细胞和正常B细胞中表达，并且在骨髓细胞上几乎是不可检测的(Hsi ED，等Clin Cancer Res 2008 14:2775–84)。值得注意地，CS1在人造血干细胞中极微弱地表达(Hsi ED，等Clin Cancer Res 2008 14:2775–84)，所述造血干细胞可用于干细胞移植来治疗血液恶性肿瘤，包括MM。CS1在MM中的功能仍未完全理解，并且据记载，CS1在骨髓瘤细胞附着、克隆形成生长和致肿瘤性中起作用(Benson DM Jr，等J Clin Oncol 2012 30:2013–5；Tai YT，等Blood 2009 113:4309–18)。利用人源化mAb依洛珠单抗(elotuzumab)靶向CS1在临床上已被证明是安全的(Benson DM Jr，等J Clin Oncol 2012 30:2013–5；Tai YT，等Blood 2009 113:4309–18)。临床前研究显示该抗体抑制骨髓瘤细胞至骨髓基质细胞的附着，诱导NK细胞介导的抗体依赖性细胞的细胞毒性，并且在免疫缺陷型小鼠中消除由人骨髓瘤细胞起始的异种移植肿瘤(Benson DM Jr，等J Clin Oncol 2012 30:2013–5；Tai YT，等Blood 2009 113:4309–18；Tai YT，等Blood
2008 112:1329–37)。因此，本文中公开了CS1-特异性嵌合抗原受体(CAR)，其可在免疫效应细胞中表达以增强针对人多发性骨髓瘤的抗肿瘤活性。

[0037] 公开的CAR通常由3个结构域组成：胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域包含CS1-结合区并且负责抗原识别。其通常还含有信号肽(SP)，以便CAR可被糖基化和锚定在免疫效应细胞的细胞膜中。跨膜结构域(TD)正如其名称所暗示的，连接胞外结构域与胞内结构域并且当由细胞表达时驻留在细胞膜内。胞内结构域是在抗原识别后将活化信号传递至免疫效应细胞的CAR的作用端。例如，胞内结构域可含有细胞内信号转导结构域(ISD)和任选的共刺激信号转导区(CSR)。

[0038] 在一些实施方案中，公开的CAR通过下式定义：

[0039] SP–CS1–HG–TM–CSR–ISD；或

[0040] SP–CS1–HG–TM–ISD–CSR

[0041] 其中“SP”代表信号肽，

[0042] 其中“CS1”代表CS1结合区，

[0043] 其中“HG”代表任选的铰链结构域，

[0044] 其中“TM”代表跨膜结构域，

[0045] 其中“CSR”代表共刺激信号转导区，

[0046] 其中“ISD”代表细胞内信号转导结构域，以及

[0047] 其中“–”代表二价接头。

[0048] 公开的CAR的抗原识别结构域通常是scFv。然而存在许多替代方案。来自天然T细胞受体(TCR)α和β单链的抗原识别结构域已被描述为具有简单的胞外结构域(例如识别HIV感染的细胞的CD4胞外结构域)和更多外来识别组分诸如连接的细胞因子(其导致具有细胞因子受体的细胞的识别)。事实上以高亲和力结合给定靶标的几乎任何区域可用作抗原识别区。

[0049] 胞内结构域是在抗原识别(即，CS1)将信号传递至免疫效应细胞后，激活至少一种免疫效应细胞的正常效应子功能的CAR的作用端。T细胞的效应子功能例如可具有细胞溶解活性或辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。因此，胞内结构域可包含T细胞受体(TCR)和任选的共受体的“细胞内信号转导结构域”。虽然通常可使用完整的细胞内信号转导结构域，但在许多情况下，不必使用完整链。就使用细胞内信号转导结构域的截短的部分而言，可将此类截短的部分用于替代完整链，只要其转导效应子功能信号。

[0050] 调节以刺激性方式作用的TCR复合物的初级活化的胞质信号转导序列可含有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的信号转导基序。含有胞质信号转导序列的ITAM的实例包括来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。然而，在优选实施方案中，细胞内信号转导结构域来源于CD3ζ(CD3ζ)。

[0051] T细胞表面糖蛋白CD3ζ(CD3ζ)链，也称为T细胞受体T3ζ链或CD247(分化群247)，是在人中由CD247基因编码的蛋白质。

[0052] 第一代CAR通常具有来自CD3ζ链的细胞内结构域，其为来自内源TCR的信号的主要递质。第二代CAR将来自各种共刺激蛋白质受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的细胞内信号转导结构域添加至CAR的胞内结构域以向T细胞提供另外的信号。临床前研究已表明第二代CAR设计提高T细胞的抗肿瘤活性。最近，第三代CAR组合多个信号转导结构域来进一步增强效力。利用这些CAR移植的T细胞已显示不依赖于共刺激受体/配体相互作用的提高的扩增、活化、保留和肿瘤消除功效(Imai C，等Leukemia 2004 18:676–84；Maher J，等Nat Biotechnol 2002 20:70–5)。

[0053] 例如，CAR的胞内结构域可被设计来通过自身或与任何其它所需的用于本发明的CAR的上下文中的胞质结构域组合来包含CD3ζ信号转导结构域。例如，CAR的胞质结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号转导区。共刺激信号转导区是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的部分。共刺激分子是除抗原受体或它们的配体外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的高效应答所需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。因此，虽然CAR主要以CD28作为共刺激信号转导元件来进行举例说明，但也可单独或与其它共刺激信号转导元件组合来使用其它共刺激元件。

[0054] 在一些实施方案中，CAR包含铰链序列。铰链序列是促进抗体柔性的氨基酸的短序列(参见，例如，Woof等，Nat.Rev.Immunol.,4(2):89-99(2004))。铰链序列可被置于抗原识别部分(例如，抗-CS1 scFv)与跨膜结构域之间。铰链序列可以是从任何适当的分子衍生或获得的任何适当的序列。在一些实施方案中，例如，铰链序列衍生自CD8a分子或CD28分子。

[0055] 跨膜结构域可衍生自天然或合成来源。当来源是天然时，结构域可衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜区可衍生自(即包含下述的至少跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在该情况下其将主要包含疏水残基诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些情况下，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将见于合成的跨膜结构域的每一个末端。短的寡肽或多肽接头(诸如长度为2至10个氨基酸)可在CAR的跨膜结构域与胞质结构域之间形成键联。

[0056] 二价接头可以是适合于将化合物或核酸与多核苷酸序列连接的任何分子。用于缀合生物分子诸如多核苷酸的方法和组合物描述于G.T.Hermanon,Bioconjugate Techniques(第2版),Academic Press(2008)(其通过引用整体(关于这些技术的教导)并入)中。在一些情况下，二价接头包含一个或多个氨基酸。然而，其还可包含直接连接公开的结构域的肽键。

[0057] 在一些实施方案中，公开的CS1-特异性CAR包含如下的一个或多个：表1中所示的SP、CS1、HG、TM、CSR、ISD和/或接头组分，或与表1中所示的序列具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的其变体。

[0058]

[0059]

[0060]

[0061] 因此，在一些实施方案中，公开的CS1-特异性CAR包含氨基酸序列SEQ ID NO：1(下文中显示的)或与SEQ ID NO：28具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的其变体。

[0062] CS1-CD28-CD3Z构建体：

[0063] MGWSSIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTTYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYWGQGTSVTVSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSQKSMSTSVGDRVSITCKASQDVITGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELKLEPKSCDKTHTCPPCPDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：28)。

[0064] 核酸和载体

[0065] 还公开了编码公开的CS1-特异性CAR的多核苷酸和多核苷酸载体，所述多核苷酸或多核苷酸载体允许CS1-特异性CAR在公开的免疫效应细胞中表达。

[0066] 例如，在一些实施方案中，公开的CS1-特异性CAR由核苷酸序列SEQ ID NO：28(下文中显示的)或与SEQ ID NO：29具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的其变体编码。

[0067] PCDH-CS1-scFv-myc标签-CD28-CD3ζ(PCDH-CS1-CAR)构建体：

[0068] ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGGTACTCCTTCACCACCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCGTTGAGTGGATTGGCATGATTCATCCTTCCGATAGTGAAACTAGGTTAAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCTACTATGATTGCGACGAGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCAGAAATCCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTTATTACTGGTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAATTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAATGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCTCTCACTTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCGGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCA

[0069] GGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO：29)。

[0070] 编码公开的CAR及其区域的核酸序列可使用本领域中已知的重组方法来获得，诸如，例如使用标准技术，通过筛选来自表达所述基因的细胞的文库，通过从已知包括所述基因的载体衍生所述基因，或通过从含有所述基因的细胞和组织直接分离。或者，可通过合成而非克隆来产生目标基因。

[0071] 编码CAR的核酸的表达通常通过可操作地将编码CAR多肽的核酸与启动子连接，并将所述构建体整合进表达载体来实现。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调控所需核酸序列的表达的启动子。

[0072] 可将公开的核酸克隆进许多类型的载体。例如，可将核酸克隆进载体，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别受关注的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

[0073] 此外，可以以病毒载体的形式给细胞提供表达载体。病毒载体技术在本领域中是公知的并且描述于例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)中，以及其它病毒学和分子生物学手册中。用作载体的病毒包括，但不限于，逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常地，合适的载体含有在至少一个生物体中具有功能的复制起始点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记。在一些实施方案中，多核苷酸载体是慢病毒或逆转录病毒载体。

[0074] 许多基于病毒的系统已被开发用于将基因转移至哺乳动物细胞内。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供方便的平台。可使用本领域中已知的技术将所选定的基因插入载体和包装在逆转录病毒颗粒中。随后可分离重组病毒，并将其体内或离体递送至受试者的细胞。

[0075] 合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接其的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、MND(骨髓增生肉瘤病毒)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，诸如，但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。所述启动子可选择地是诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括，但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

[0076] 额外的启动子元件，例如，增强子调节转录起始的频率。通常地，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已证明许多启动子也在起始位点下游含有功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，以便当元件被倒置或相对于彼此地移动时，该启动子功能被保留。

[0077] 为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入至细胞中的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群体鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可在分开的DNA片段上携带选择标记，并且将用于共转染方法。可用适当的调控序列侧接选择性标记和报告基因以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素抗性基因。

[0078] 报告基因用于鉴定潜在地转染的细胞并用于评估调控序列的功能性。一般地，报告基因是不存在于受体生物或组织中或由其表达的编码多肽的基因，所述多肽的表达通过一些可容易检测的性质例如酶活性表现出来。在DNA已被引入到受体细胞后适当的时间上测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因。合适的表达系统是公知的，并且可使用已知的技术来制备或商购获得。一般地，显示最高水平的报告基因表达的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。可将此类启动子区域连接于报告基因并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。

[0079] 将基因引入细胞和在其中表达基因的方法在本领域中是已知的。在表达载体的情况下，可通过本领域中的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物学方法将表达载体转移入宿主细胞。

[0080] 用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、微粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。参见，例如，Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。

[0081] 用于将目标多核苷酸引入宿主细胞的生物方法包括DNA和RNA载体的使用。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物例如人细胞的最广泛使用的方法。

[0082] 用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜小囊泡)。

[0083] 在其中使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。在另一个方面，可将核酸与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可被封装在脂质体的含水内部、散布在脂质体的脂双层内、通过与脂质体和寡核苷酸缔合的连接分子附接于脂质体、捕获在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束内或与胶束复合，或另外地与脂质缔合。与组合物缔合的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可存在于双层结构如胶束中，或具有“塌陷”结构。它们还可简单地分散在溶液中，可能形成在尺寸或形状上不均一的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪烃及其衍生物诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇及醛的化合物的种类。适合于使用的脂质可获自商业来源。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可获自Sigma,St.Louis,Mo.；磷酸十六烷酯(“DCP”)可获自K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)；胆固醇(“Choi”)可获自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可获自Avanti Polar Lipids,Inc,(Birmingham,Ala.)。

[0084] 免疫效应细胞

[0085] 还公开了经工程化以表达公开的CAR的免疫效应细胞。这些细胞优选地获自待治疗的受试者(即为自体的)。然而，在一些实施方案中，使用免疫效应细胞系或供体效应细胞(同种异体的)。免疫效应细胞可获自许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。可使用本领域TM技术人员已知的许多技术诸如Ficoll 分离从自受试者收集的血液获得免疫效应细胞。例如，可通过血浆分离置换法获得来自个体的循环血的细胞。在一些实施方案中，通过裂解血TM
红细胞和耗竭单核细胞，例如利用通过PERCOLL 梯度的离心或通过对流离心洗脱法从外周血淋巴细胞分离免疫效应细胞。可通过阳性或阴性选择技术进一步分离免疫效应细胞的特定亚群体。例如，可使用针对对于阳性选择的细胞是独特的表面标志物的抗体的组合，例如通过用抗体缀合的珠粒孵育足以阳性选择所需免疫效应细胞的时间段来分离免疫效应细胞。或者，可使用针对对于阴性选择的细胞是独特的表面标志物的抗体的组合，通过阴性选择来实现免疫效应细胞群体的富集。

[0086] 在一些实施方案中，免疫效应细胞包含参与保护身体抵御感染性疾病和外来物质的任何白细胞。例如，免疫效应细胞可包含淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其任意组合。例如，免疫效应细胞可包含T淋巴细胞。

[0087] T细胞或T淋巴细胞与其它淋巴细胞诸如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的相异之处在于细胞表面上T细胞受体(TCR)的存在。它们被称为T细胞，因为它们在胸腺成熟(尽管一些也在扁桃体中成熟)。存在几个亚组的T细胞，每一个亚组具有独特的功能。

[0088] T辅助细胞(TH细胞)在免疫过程中帮助其它白细胞，包括B细胞至浆细胞和记忆B细胞的成熟，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。这些细胞也被称为CD4+T细胞，因为它们在其表面上表达CD4糖蛋白。当通过在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达的MHC II类分子为辅助T细胞呈递肽抗原时，所述辅助T细胞被活化。一旦被活化，它们即可迅速分裂并分泌称为细胞因子的小蛋白质，这些细胞因子调节或辅助主动免疫应答。这些细胞可分化成几个亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、TH9或TFH，所述亚型分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。

[0089] 细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也参与移+植排斥。这些细胞也称为CD8T细胞，因为它们在其表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与MHC I类分子缔合的抗原来识别它们的靶标，所述靶标存在于所有有核细胞的表面上。通过由调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷和其它分子，CD8+细胞可被灭活至无变应性状态，这防止了自身免疫性疾病。

[0090] 记忆T细胞是一个亚组的抗原特异性T细胞，其在感染已消退后长期保留。当再暴露于它们的同源抗原时，它们迅速扩增至大量效应T细胞，从而为免疫系统提供抗过去的+ +感染的“记忆”。记忆细胞可以是CD4或CD8 。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。

[0091] 调节性T细胞(Treg细胞)(先前称为抑制性T细胞)对于维持免疫耐受性是至关重要的。它们的主要作用是关闭T细胞介导的朝向免疫反应结束的免疫并抑制逃脱胸腺中+的阴性选择过程的自身反应性T细胞。已描述了两个主要种类的CD4Treg—天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。

[0092] 自然杀伤T(NKT)细胞(不要与自然杀伤(NK)细胞混淆)使适应性免疫系统与先天性免疫系统桥连一起。与识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞不同，NKT细胞识别由称为CD1d的分子呈递的糖脂抗原。

[0093] 在一些实施方案中，T细胞包含CD4+细胞的混合物。在其它实施方案中，基于细+胞表面表达富集T细胞的一个或多个亚组。例如，在一些情况下，T包含细胞毒性CD8T淋巴细胞。在一些实施方案中，T细胞包含γδT细胞，其拥有具有一个γ链和一个δ链而非α和β链的独特的T细胞受体(TCR)。

[0094] 自然杀伤(NK)细胞为CD56+CD3–大颗粒淋巴细胞，其可杀死病毒感染和转化的细胞，并且构成先天性免疫系统的至关重要的细胞亚组(Godfrey J，等Leuk Lymphoma 2012 +53:1666–1676)。与细胞毒性CD8T淋巴细胞不同，NK细胞引发抗肿瘤细胞的细胞毒性而无需预先敏化，并且还可根除MHC-I-阴性细胞(Narni-Mancinelli E，等Int Immunol 2011
23:427–431)。NK细胞是更安全的效应细胞，因为它们可避免细胞因子风暴的潜在致死并发症(Morgan RA，等Mol Ther 2010 18:843–851)、肿瘤裂解综合征(Porter DL，等N Engl J Med 2011 365:725–733)以及中靶、脱肿瘤效应(off-tumor effect)。虽然NK细胞具有作为癌细胞的杀手的公知的作用，并且NK细胞损伤已被广泛地记录为对于MM的进展是至关重要的(Godfrey J，等Leuk Lymphoma 2012 53:1666–1676；Fauriat C，等Leukemia
2006 20:732–733)，但人们可能籍以增强NK细胞介导的抗-MM活性的方法在所公开的CAR之前一直未被大量开发。

[0095] 治疗方法

[0096] 表达所公开的CAR的免疫效应细胞可引发针对MM细胞的抗肿瘤免疫应答。由公开的CAR修饰的免疫效应细胞引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可以是其中经CAR-修饰的免疫效应细胞诱导对于CS1是特异的免疫应答的过继免疫疗法的部分。

[0097] 表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的过继转移是有前景的抗癌治疗。在收集患者的免疫效应细胞后，可将细胞进行遗传工程化以表达公开的CS1-特异性CAR，随后输注回患者。

[0098] 可单独施用公开的CAR修饰的免疫效应细胞，或可将其作为与稀释剂和/或与其它组分诸如IL-2、IL-15或其它细胞因子或细胞群体组合的药物组合物来施用。简言之，药物组合物可包含与一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的靶细胞群体。此类组合物可包含缓冲液诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖类诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施方案中将用于公开的方法的组合物配制用于静脉内施用。可以以任何适合治疗MM的方式施用药物组合物。虽然可通过临床试验来确定适当的剂量，但施用的量和频率将根据诸如患者的病状以及患者的疾病的严重度的此类因素来决定。

[0099] 当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明的组合物的精确量可由医生通过考虑在患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤尺寸、4 9
感染或转移的程度以及病状方面的个体差异来确定。一般来说，可以以10至10 个细胞/
5 6
kg体重，诸如10至10 个细胞/kg体重(包括这些范围内的所有整数值)的剂量施用包含本文所述的T细胞的药物组合物。还可以以这些剂量多次施用T细胞组合物。通过使用在免疫治疗中是众所周知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。用于特定患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域中的技术人员通过监测患者的疾病体征和相应地调整治疗来容易地确定。

[0100] 在某些实施方案中，可能期望向受试者施用活化的T细胞，随后重新抽取血液(或进行血浆分离置换法)、按照公开的方法使来自其的T细胞活化，并将这些活化的和扩增的T细胞再输注患者。每隔数周进行该过程多次。在某些实施方案中，从10cc至400cc的血液抽取物使T细胞活化。在某些实施方案中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取物使T细胞活化。使用该多个血液抽取物/多个再输注方案可用于选择出T细胞的某些群体。

[0101] 可以以任何方便的方式，包括通过注射、输血或植入进行公开的组合物的施用。可皮下、皮内、瘤内、关节内、髓内、肌内，通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内途径向患者施用本文所述的组合物。在一些实施方案中，通过皮内或皮下注射向患者施用公开的组合物。在一些实施方案中，通过i.v.注射施用公开的组合物。还可将组合物直接注射进肿瘤、淋巴结或感染部位。

[0102] 在某些实施方案中，将公开的经CAR修饰的免疫效应细胞与(例如，之前、同时或之后)许多相关治疗方式，包括但不限于沙利度胺、地塞米松、硼替佐米和来那度胺结合向患者施用。在其它实施方案中，可将经CAR修饰的免疫效应细胞与化学疗法、辐照、免疫抑制剂，诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体或其它免疫清除剂诸如CAM PATH、抗-CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、甾类、FR901228、细胞因子和辐照组合使用。在一些实施方案中，将经CAR修饰的免疫效应细胞与(例如，之前、同时或之后)骨髓移植、使用化学治疗剂例如氟达拉滨的T细胞清除疗法、外照射放疗(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH结合向患者施用。在另一个实施方案中，在B细胞清除疗法诸如与CD20反应的试剂例如利妥昔单抗后，施用本发明的细胞组合物。例如，在一些实施方案中，受试者可经历利用高剂量化疗法，随后外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

[0103] 定义

[0104] 术语“氨基酸序列”是指一列代表氨基酸残基的缩写、字母、字符或单词。本文中使用的氨基酸缩写是氨基酸的常规单字母代码，并且被如下表示：A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷酰酸盐、谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸。

[0105] 术语“抗体”是指选择性结合靶抗原的天然或合成的抗体。该术语包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子以外，还包括在术语“抗体”中的是那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及免疫球蛋白分子的人或人源化形式，所述片段或聚合物以及所述形式选择性地结合靶抗原。

[0106] 术语“适体”是指结合于特定靶分子的寡核酸或肽分子。这些分子通常选自随机序列池。选定的适体能够适应独特的三级结构和以高亲和力和特异性识别靶分子。“核酸适体”是通过其构象结合于靶分子，从而抑制或压制此类分子的功能的DNA或RNA寡核酸。核酸适体可由DNA、RNA或其组合构成。“肽适体”是具有插入在恒定支架蛋白内的可变肽序列的组合的蛋白分子。通常在严格酵母双杂交条件下进行肽适体的鉴定，所述杂交条件增加所选择的肽适体在细胞内环境中被稳定地表达并正确折叠的概率。

[0107] 术语“载体”意指一类化合物、组合物、物质或结构，当与化合物或组合物组合时，其有助于或促进所述化合物或组合物的制备、储存、施用、递送、功效、选择性或任何其它特征，以用于其期望的用途或目的。例如，载体可被选择来使活性成分的任何降解降至最低，并使受试者中的任何不良副作用降至最低。

[0108] 术语“嵌合分子”是指通过连接两个或更多个以它们的天然状态单独存在的分子而生成的单个分子。单个嵌合分子具有所有其构成分子的期望的功能。一种类型的嵌合分子是融合蛋白。

[0109] 术语“融合蛋白”是指通过连接(通过一个多肽的氨基末端与另一个多肽的羧基末端之间形成的肽键)两个或更多个多肽而形成的多肽。融合蛋白可以通过组成多肽的化学偶联来形成，或其可从编码单个连续融合蛋白的核酸序列表达为单个多肽。单链融合蛋白是具有单个连续多肽主链的融合蛋白。融合蛋白可使用分子生物学中的常规技术将两个框内基因连接成单个核酸，随后在其中产生融合蛋白的条件下于适当的宿主细胞中表达所述核酸来进行制备。

[0110] 术语“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。同一性可以通过比较每个序列中可出于比较目的而被对齐的位置来确定。当所比较的序列中的位置被相同碱基占据时，则所述分子在该位置是同一的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性的程度是在由核酸序列共享的位置上的同一的或匹配的核苷酸的数目的函数。各种比对算法和/或程序可用于计算两个序列之间的同一性，包括FASTA或BLAST，其可作为GCG序列分析包(University of Wisconsin,Madison,Wis.)的一部分而获得，并且可结合例如默认设置来使用。例如，设想了与本文所述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优先表现出基本相同的功能的多肽，以及编码此类多肽的多核苷酸。除非另有指示，否则相似性得分将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，百分比相似性基于BLASTP正数得分，而百分比序列同一性基于BLASTP同一性得分。BLASTP“同一性”显示同一的高得分序列对中总残基的数目和分数；并且BLASTP“正数”显示针对其的比对评分具有正值并且彼此相似的残基的数量和分数。本公开设想并涵盖了具有这些程度的与本文公开的氨基酸序列的同一性或相似性或任何中间程度的同一性或相似性的氨基酸序列。类似多肽的多核苷酸序列可使用遗传密码推导，并可通过常规方法，尤其是使用遗传密码通过逆翻译其氨基酸序列来获得。

[0111] 术语“核酸”是指天然或合成的分子，其包含单个核苷酸或通过一个核苷酸的3'位置上的磷酸基团连接于另一个核苷酸的5'末端的两个或更多个核苷酸。核酸不受长度的限制，因此核酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

[0112] 术语“可操作地连接于”是指一种核酸与另一种核酸序列的功能关系。启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其它信号序列是可操作地连接于其它序列的核酸序列的实例。例如，DNA至转录控制元件的可操作地连接是指DNA与启动子之间的物理和功能关系，使得此类DNA的转录通过特异性识别、结合所述DNA并且转录所述DNA的RNA聚合酶来从启动子起始。

[0113] 术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用，是指包含通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α氨基连接的两个或更多个氨基酸的天然或合成的分子。

[0114] 术语“药学上可接受的”是指这些化合物、物质、组合物和/或剂型，其在合理医学判断的范围内适用于接触人类和动物的组织，而没有与合理的效益/风险比相当的过度的毒性、刺激性、过敏性响应或其它问题或并发症。

[0115] 术语“蛋白质结构域”是指显示结构完整性的蛋白质的一部分、蛋白质的部分或完整蛋白质；该确定可基于蛋白质的一部分、蛋白质的部分或完整蛋白质的氨基酸组成。

[0116] 如本文中所用，“间隔区”是指连接蛋白质(包含融合蛋白)的肽。一般地，间隔区不具有除连接蛋白质或在它们之间保持一定的最小距离或其它空间关系外的特定生物活性。然而，可选择间隔区的组成氨基酸来影响该分子的某些性质诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。

[0117] 如本文中所用，术语“特异性结合”，当提及多肽(包括抗体)或受体时，是指决定蛋白质或多肽或受体在蛋白质和其它生物制品的异质群体中的存在的结合反应。因此，在指定条件(例如抗体的情况下免疫测定条件)下，指定的配体或抗体“特异性结合”于其特定的“靶”(例如抗体特异性结合内皮抗原)，此时其不以显著的量结合存在于样品中的其它蛋白质或配体或抗体可在生物体中接触的其它蛋白质。通常，“特异性结合”第二分子的5 –1 6 –1 7 –1 8 –1 9 –1 10 –1 11 –1 12 –1
第一分子具有大于约10M (例如，10M 、10M 、10M 、10M 、10 M 、10 M 和10 M或更多)的与该第二分子的亲和常数(Ka)。

[0118] 如本文中所用，术语“特异性递送”是指分子与具有特定靶分子或标志物的细胞或组织而非与缺乏该靶分子的细胞或组织的优先缔合。当然，要认识到，一定程度的非特异性相互作用可发生在分子与非靶细胞或组织之间。然而，特异性递送，可被辨别为通过靶分子的特异性识别介导的。通常地，特异性递送导致被递送的分子与具有靶分子的细胞之间相较于被递送的分子与缺乏靶分子的细胞之间的强得多的缔合。

[0119] 术语“受试者”是指作为施用或治疗的靶的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如，哺乳动物。因此，受试者可以是人或兽医学患者。术语“患者”是指在临床医生，例如，内科医生的治疗下的受试者。

[0120] 术语“治疗有效的”是指所使用的组合物的量是足够以改善疾病或病症的一个或多个病因或症状的量。此类改善只要求降低或改变，不一定消除。

[0121] 术语“转化”和“转染”意指核酸(例如表达载体)至受体细胞的引入，包括核酸至所述细胞的染色体DNA的引入。

[0122] 术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症的患者的医疗管理。该术语包括积极治疗，即明确朝向疾病、病理状况或病症的改善的治疗，并且还包括病因治疗，即，朝向除去相关疾病、病理状态或病症的病因的治疗。另外，该术语包括姑息性治疗，即，被设计用于症状的缓解而非疾病、病理状况或病症的治愈的治疗；预防性治疗，即朝向使相关疾病、病理状况或病症的发展降至最低或部分或完全抑制所述发展的治疗；和支持性治疗，即，用于补充朝向相关疾病、病理状况或病症的改善的另一特定疗法的治疗。

[0123] 术语“变体”是指具有保守氨基酸取代、非保守氨基酸取代(即简并变体)、在每一个编码氨基酸的密码子(即DNA和RNA)的摆动位置内的取代的氨基酸或肽序列、添加至肽的C-末端的氨基酸，或与参照序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的肽。

[0124] 术语“载体”是指能够将已连接于载体序列的另一个核酸转运至细胞内的核酸序列。术语“表达载体”包括以适合于被细胞表达的形式(例如，连接于转录控制元件)含有基因构建体的任何载体(例如，质粒、粘粒或噬菌体染色体)。

[0125] 本发明的许多实施方案已被描述。然而，应理解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下做出各种改变。因此，其它实施方案在下列权利要求的范围内。实施例

[0126] 实施例1：朝向CS1的重定向的T细胞的遗传修饰增强骨髓瘤细胞的消除

[0127] 在本研究中，操纵T细胞以表达包含CD28–CD3ζ信号转导部分的CS1-特异性CAR，从而证明CS1-特异性CAR T细胞介导增强的响应于表达CS1的骨髓瘤细胞的细胞因子释放和细胞毒性，这以CS1依赖性方式发生。此外，在原位MM异种移植小鼠模型中，CS1-重定向T细胞高效地消除人骨髓瘤细胞并且显著延长小鼠存活期。综上所述，这些数据表明具有装备有CS1-特异性CAR的T细胞的过继疗法代表了抗复发性MM的有前景的策略。

[0128] 材料和方法

[0129] 细胞培养

[0130] 人多发性骨髓瘤细胞系IM9、NCI-H929、MM.1S和RPMI-8226获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且被维持在补充有10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Invitrogen)中。将293T和phoenix包装细胞培养在含10％FBS 的 DMEM 培养基 (Invitrogen) 中。通过 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,PA)密度梯度离心分离来自健康供体和多发性骨髓瘤患者的人外周血单核细胞(PBMC)，并且通过塑性贴壁(plastic adherence)耗竭单核细胞。按照制造商的说明书，使用人抗-CD138微珠(MicroBead)和磁体辅助细胞分选(MACS,Miltenyi +
Biotech)从患者的骨髓穿刺液阳性选择原代CD138骨髓瘤细胞。根据由俄亥俄州立大学伦理审查委员会(The Ohio State University Institutional Review Board)批准的方案从骨髓瘤患者获得知情同意书。

[0131] 小鼠

[0132] 6至8周龄雄性NOD–scid IL-2Rγ裸(NSG)小鼠获自Jackson实验室。经常监测小鼠的MM疾病的进展，并且当它们具有后肢瘫痪、昏睡或明显体重减轻的症状即将死亡时，将它们杀死。所有动物研究由俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会(The Ohio State University Animal Care and Use Committee)批准。

[0133] CS1-特异性CAR逆转录病毒构建体的产生

[0134] 抗-CS1scFv来源于杂交瘤细胞系Luc90。通过重叠PCR反应使用接头单独扩增重链(VH)和轻链(VL)可变区的编码结构域序列，并将其重组。将VH-接头-VL片段与CD28-CD3ζ部分整合到框内。随后将完整的抗CS1-scFv-CD28-CD3ζ片段连接进称为Pinco的逆转录病毒载体(Yu J，等Immunity 2006 24:575–90；Becknell B，等J Immunol Methods 2005 296:115–23)以产生Pinco-CS1-CAR构建体。

[0135] T淋巴细胞的逆转录病毒转导

[0136] 如先前所述(Becknell B，等J Immunol Methods.2005 296(1-2):115-123；Yu J，等Immunity.2006 24(5):575-590)，从利用Pinco-或Pinco-CS1-CAR构建体瞬时转染48小时的phoenix包装细胞收集逆转录病毒上清液。将PBMC培养在含有10％FBS的RPMI1640培养基中，并用人T-Activator CD3/CD28 Dynabead(Invitrogen)和150IU/mL人重组白细胞介素-2(IL-2,Hoffman-La Roche Inc.)刺激2天。随后将细胞重悬于感染上清液中并按照制造商的方案施加至RETRONECTIN(Clontech Laboratories)涂覆的非组织培养物处理的6孔板中。第二天重复感染过程一次。然后将细胞转移进组织培养物处理的烧瓶中，并在150IU/mL IL-2存在的情况下维持。使用基于由Pinco载体编码的细胞表面上的GFP标志物的表达的FACSARIA II细胞分选仪(BD Biosciences)来纯化转导的T细胞。

[0137] 流式细胞术分析

[0138] 为检测细胞表面上的CS1-CAR表达，用含有4％牛血清白蛋白的PBS洗涤转导的T细胞，并用生物素标记的山羊抗-小鼠(Fab)2多克隆抗体或正常多克隆山羊免疫球蛋白G(IgG)抗体(Jackson ImmunoResearch)(作为同种型对照)孵育所述细胞。随后用别藻蓝蛋白(APC)缀合的链霉亲和素(Jackson ImmunoResearch)和缀合于V450的抗-CD3抗体(BD Biosciences)对细胞进行染色。为了确定CS1在骨髓瘤细胞表面上的表达，用藻红蛋白(PE)缀合的小鼠抗-CS1 mAb(eBiosciences)和APC缀合的小鼠抗-CD138 mAb(Miltenyi Biotec)对细胞进行染色。利用BD LSRII流式细胞仪监测抗体染色。使用FLOWJO 软件(Tree Star Inc.)进行数据分析。

[0139] 免疫印迹

[0140] 在laemmli缓冲液中裂解细胞。利用SDS-PAGE凝胶来分离裂解物，并将其转移至硝酸纤维素膜(Millipore)。利用小鼠抗-人CD3ζmAb(BD Pharmingen)，然后用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgG抗体来探测膜。通过使用增强化学发光试剂(GE Healthcare Biosciences)显示抗体结合。

[0141] 稳定表达CS1的RPMI-8226细胞的产生

[0142] 从IM9 cDNA PCR扩增全长人CS1编码序列，并将其插入称为PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(PCDH,System Biosciences)的慢病毒载体中，产生PCDH-CS1。为了产生慢病毒，使用磷酸钙转染试剂(Promega)，利用PCDH-CS1质粒或PCDH空载体质粒加包装的质粒pCMV-VSVG和pCMV-dr9来共转染293T细胞。随后，收获慢病毒上清液，并使用先前公布的方案(Becknell B，等J Immunol Methods.2005 296(1-2):115-123；Yu J，等Immunity.2006
24(5):575-590)，将其用于感染RPMI-8226细胞。

[0143] 细胞毒性测定

[0144] 如先前所述(Yu J，等Blood 2010 115:274–81)进行标准4小时51Cr释放测定。51
简言之，利用 Cr来标记靶细胞，并在37℃下于96孔V型底板的孔中以不同的效/靶比(E/T)将其与T细胞共培养4小时。收获上清液，并将其转移进含有液体闪烁混合液(Fisher
51
Scientific)的闪烁瓶内，并在TOPCOUNT计数器(Canberra Packard)上测量 Cr的释放。
51
将在完全培养基或1％SDS中孵育的靶细胞用于测定自发或最大 Cr释放。使用标准公式：
100x(cpm实验性释放–cpm自发释放)/(cpm最大释放–cpm自发释放)来计算特异性裂解的百分比。

[0145] 细胞因子释放测定

[0146] 将靶细胞在37℃下于96孔V型底板中与相等数量的效应细胞共培养24小时。收获无细胞上清液，并按照制造商的方案，使用来自R&D系统的相应ELISA试剂盒通过ELISA来评估IFN-g和白细胞介素(IL)-2分泌。

[0147] CD107a脱粒测定

[0148] 如先前所述(He S，等Blood 2013 121:4663–71)，通过加以某些改进来进行5
CD107a测定。简言之，以每孔0.2mL将MM靶细胞(2.5×10个)与相等数量的效应细胞在
96孔V型底板中共培养。对照细胞是不与靶细胞一起孵育的模拟物-或CS1–CAR-转导的T细胞。添加缀合于APC的抗-CD107a或IgG1同种型抗体(BD Biosciences)与1mL莫能菌素(BD Biosciences)，在37℃下孵育4小时。利用PE缀合的CD69和V450缀合的CD3抗体对细胞进一步染色，并使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)进行分析。

[0149] 颗粒酶B和穿孔素的细胞内染色

[0150] 洗涤模拟物-或CS1–CAR-转导的T细胞，并用V450缀合的抗-人CD3mAb进行染色。随后，使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)固定和透化细胞，用APC缀合的抗-颗粒酶B(Invitrogen)、APC缀合的抗-穿孔素抗体(eBiosciences)或小鼠APC缀合的同种型抗体对细胞进行标记，随后在BD LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。

[0151] 荷MM小鼠的体内处理和生物发光成像

[0152] 利用表达萤火虫荧光素酶的Pinco-pGL3-luc/GFP病毒对MM.1S和IM9骨髓瘤细胞进行逆转录病毒转导，并使用上述方法对GFP阳性细胞进行分选，分别产生MM.1S-GL36
和IM9-GL3细胞。在第0天经由尾静脉利用400μL PBS中的8×10个MM.1S-GL3细胞或
5
5×10个IM9-GL3细胞静脉内注射雄性NSG小鼠，以建立异种移植原位MM模型。在第7和
6
14天(MM.1S)或第21天(IM-9)，经由尾静脉向小鼠静脉内施用400mL PBS中的10×10个效应细胞、CS1–CAR-转导的T细胞或模拟物-转导的对照细胞。在利用MM细胞接种后5周，用D-荧光素(150mg/kg体重；Gold Biotechnology)腹膜内输注小鼠，随后用异氟烷麻醉小鼠，并使用体内成像系统(IVIS)，利用Living Image软件(PerkinElmer)进行成像。

[0153] 统计分析

[0154] 如果是正态分布的话，将未配对学生t检验用于比较两个独立组的连续终点。当比较3个或更多个独立的组时，使用单因素ANOVA。对于存活数据，绘制卡普兰-迈耶曲线，并使用时序检验进行比较。所有测试是双侧的。使用Bonferroni法调整用于多重比较的P值。<0.05的P值被认为是统计上显著的。

[0155] 结果

[0156] 表达CS1-特异性CAR的原代T细胞的产生

[0157] 构建编码CS1-特异性CAR的Pinco逆转录病毒载体(Pinco–CS1–CAR)，其由抗-CS1scFv、CD8分子的铰链和跨膜区、CD28共刺激信号转导部分和CD3ζ分子的细胞质组分组成(图1A)。用编码CS1–CAR的逆转录病毒颗粒或空载体(模拟物)转导来自健康供体的抗-CD3/CD28抗体激活的原代T细胞，并就由逆转录病毒构建体编码的GFP的表达分选所述细胞。为了确定CS1–CAR是否被成功转移，裂解分选的细胞并将其经历利用抗-CD3ζmAb的免疫印迹。如图1B中所示，与仅表达内源CD3ζ蛋白的模拟物-转导的T细胞相反，除了天然CD3ζ以外，CS1–CAR-转导的T细胞还以预定尺寸表达嵌合的CS1–scFv–CD28–CD3ζ融合蛋白。CS1–CAR在细胞表面上的表达通过用识别抗-CS1的scFv部分的山羊抗-小鼠Fab抗体对转导的T细胞进行染色来显示，这在70.3％的CS1–CAR-转导的T细胞上检测到scFV的表达，然而在模拟物-转导的T细胞上的表达仍然是几乎不可检测的(图1C)。

[0158] CS1-特异性CAR T细胞对CS1+骨髓瘤细胞系的识别

[0159] 通过流式细胞术在4个常用骨髓瘤细胞系NCI-H929、IM9、MM.1S和RPMI-8226中评估CS1的表面表达，这显示CS1蛋白在这些细胞系中被可变地表达，在NCI-H929、IM9和MM.1S细胞中的表达比在具有最低CS1表达的RPMI-8226细胞中高得多(图2A)。作为阴性对照，转化的人肾细胞系293T在其表面上不表达CS1(图7A)。为了测定CS1–CAR T细胞识别内源地表达CS1的骨髓瘤细胞的能力，通过ELISA测量在每一个骨髓瘤细胞系存在或不存在的情况下，来自模拟物-转导的T细胞或CS1–CAR-转导的T细胞的上清液中的IFN-γ和IL-2分泌。模拟物-转导的T细胞和CS1–CAR-转导的T细胞各自单独地产生可忽略水平的IFN-γ和IL-2(图2B和C)；然而，在暴露于表达高水平CS1的NCI-H929和IM9细胞后，由CS1–CAR T细胞而非由模拟T细胞分泌显著更大量的IFN-γ和IL-2蛋白。响应于具有高水平CS1表达的MM.1S细胞，CS1–CAR-转导的T细胞还产生比模拟物-转导的T细胞更高量的IFN-γ(图2B)，然而，由于未知原因，CS1–CAR-转导的T细胞未被该细胞系触发来分泌比模拟物-转导的T细胞更高水平的IL-2(图2C)。另外，与对应的+ – +
模拟物-转导的T细胞亚组相比较，CD4(CD8 )和CD8CS1–CAR T细胞显示增加的响应于NCI-H929或MM.1S细胞的IFN-g分泌(图8A)。对于具有极低水平的CS1表达的RPMI-8226细胞，模拟物-转导的T细胞和CS1–CAR-转导的T细胞都产生可与本底相比较的低水平的IFN-g和IL-2(图2B和C)。这些发现表明，与模拟物-转导的T细胞相比较，CS1–CAR-转导的T细胞可更加特异性地识别具有高水平的内源CS1表达的MM细胞，并且在识别这些MM细胞后变得更加活化。

[0160] 由CS1-特异性CAR触发的抗骨髓瘤细胞的体外细胞溶解潜能

[0161] 为了确定增强的CS1–CAR T细胞对CS1+骨髓瘤细胞的识别是否可导致更高效的肿瘤细胞裂解，进行标准4小时铬-51释放测定。表达高水平CS1的NCI-H929、IM9和MM.1S细胞，即使在高至20:1的E/T比上，亦对模拟物-转导的T细胞介导的杀伤具有抗性；然而，在所有测试的E:T比上，这些细胞被CS1–CAR T细胞高效裂解(图3A，左三)。然而，相较于模拟物-转导的T细胞，表达低水平CS1的RPMI-8226细胞的细胞溶解活性在与CS1–CAR-转导的T细胞共孵育后，仅可被略微升高(图3A，右一)。T细胞的脱粒和活化通过在用或不用NCI-H929骨髓瘤细胞孵育后评估模拟物-转导的T细胞和CS1–CAR-转导的T细胞中的CD107a和CD69的表达来进一步表征，所述NCI-H929骨髓瘤细胞，如上所述，触发CS1–CAR T细胞在细胞因子释放和细胞溶解活性上的强应答。与上述关于细胞因子释放和细胞溶解活性的数据一致，响应于NCI-H929细胞的脱粒和活化在CS1–CAR T细胞中发生的程度高于在模拟T细胞中的程度，如通过动员的CD107a和活化标志物CD69的表面共表达的上调所证明(图3B)。

[0162] 此外，相较于对应的模拟物-转导的T细胞亚组，当通过NCI-H929或MM.1S细胞+ – +刺激时，CD4(CD8 )和CD8CS1–CAR T细胞展现升高水平的脱粒(图8B)。另外，使用细胞内染色法，相较于模拟物-转导的T细胞，CS1–CAR-转导的T细胞，即使在靶细胞不存在的情况下，表达显著更高水平的颗粒酶B而非穿孔素(图3C和D)，这表明颗粒酶B可能主要参与介导CS1-重定向T细胞的细胞溶解活性。该发现与先前的报告一致，该报告显示移植有整合到组合的CD28–CD3ζ信号转导部分的癌胚抗原特异性CAR的T细胞具有相较于未经修饰的T细胞的升高水平的颗粒酶B(Koehler H，等Cancer Res 2007 67:2265–73)。

[0163] CS1在靶细胞中的强制过表达增强通过CS1-特异性CAR T细胞的识别和杀伤[0164] 当利用表达高水平的CS1的骨髓瘤细胞刺激时，CS1–CAR T细胞在细胞因子释放和细胞毒性上强得多的应答，促进研究CS1在具有内源性低水平的CS1表达的骨髓瘤细胞中的CS1的异位表达是否可引发细胞因子释放和细胞溶解的增加。为此目的，用编码人CS1的慢病毒或PCDH空载体(作为模拟物-转导的对照)转导具有低水平的内源CS1表达的RPMI-8226骨髓瘤细胞。通过检测由慢病毒编码的GFP蛋白来监测转导效率，并且通过流式细胞术分析，GFP阳性细胞的百分比超过90％。通过用PE缀合的抗-CS1抗体对转导的细胞表面进行染色来确认CS1的过表达(图4A)。铬-51释放测定表明强制CS1表达导致RPMI-8226细胞对由CS1–CAR-转导的T细胞产生的裂解的易感性的可辨别的增加，与模拟物-转导的T细胞相反(图4B)。随后通过ELISA评估IFN-γ和IL-2产生，从而显示，相较于模拟物-转导的T细胞，CS1–CAR-转导的T细胞响应于过表达CS1的RPMI-8226细胞，产生显著更高量的IFN-γ和IL-2；同时，当将CS1–CAR T细胞与经空载体修饰的RPMI-8226细胞共培养时，仅存在IFN-γ分泌的适度增加并且IL-2分泌无变化(图4C和–D)。同样地，CS1在CS1 293T(转化的细胞系)中的过表达也触发增强的细胞因子释放和由CS1–CAR T细胞产生的细胞溶解(图7B–7D)。这与关于靶向其它肿瘤抗原的CAR T细胞的其它报告一致(Sanchez C，等Prostate Cancer Prostatic Dis 2013 16:123–31；
Chinnasamy D，等J Clin Invest 2010 120:3953–68)。这些发现证实了CS1–CAR T细胞对靶细胞的增强的识别和杀伤以CS1依赖性方式发生。

[0165] 自体CS1-特异性CAR T细胞对原代骨髓瘤细胞的增强的识别和杀伤

[0166] 为了在更加临床相关的环境中研究CS1-特异性CAR T细胞的作用，研究CS1–CAR-转导的自体T细胞是否可高效地识别和杀伤从骨髓瘤患者新鲜分离的肿瘤细胞。与来自健康供体的T细胞一样，来自复发性骨髓瘤患者的T细胞被成功扩增，并且通过逆转录病毒感染操纵其来表达CS1–CAR，如通过60.7％的对于抗-小鼠Fab和抗-人CD3抗体呈阳性的T细胞染色(通过流式细胞术测定的)所表现的(图5A)。使用正磁选择来分离来自+患者的原代CD138骨髓瘤细胞，并且使用流式细胞术观察到原代骨髓瘤细胞对于CS1的表面表达呈均一阳性(图5B)。通过铬-51释放测定，观察到来自患者的骨髓瘤细胞对由自体模拟物-转导的T细胞产生的裂解具有高度抗性，但甚至在低(2.5:1)(E/T)比下变得对自体CS1–CAR-转导的T细胞易感(图5C)。与这些细胞毒性结果一致，自体CS1–CAR T细胞响应于骨髓瘤细胞产生相较于自体模拟物-转导的T细胞的显著更高量的IFN-γ(图
5D)。这些发现表明装配有CS1–CAR的T细胞可离体在自体环境中高效地识别并且消除骨髓瘤细胞。

[0167] CS1-定向的T细胞在原位异种移植骨髓瘤模型中在体内抑制肿瘤生长并且延长荷瘤小鼠的存活期

[0168] 在MM.1S-移植的NSG小鼠模型中评估CS1–CAR T细胞的治疗潜能。MM.1S细胞的静脉内注射已被广泛用于建立MM的小鼠异种移植模型，因为这可导致骨髓和骨中的移植，以及多病灶骨损伤的一致建立，这紧密地概括了人MM(Mitsiades CS，等Cancer Cell 20045:221–30；Runnels JM，等J Biomed Opt 2011 16:011006)。为了促进肿瘤生长的监测，+
通过逆转录病毒感染使MM.1S细胞工程化以表达GFP和萤火虫荧光素酶，分选GFP细胞，并将其静脉内移植入NSG小鼠中以起始肿瘤生长。随后用模拟物-转导的T细胞、CS1–CAR-转导的T细胞或PBS静脉内输注这些小鼠。与先前的报告(Mitsiades CS，等Cancer Cell 2004 5:221–30；Runnels JM，等J Biomed Opt 2011 16:011006)一致，使用IVIS的生物发光成像显示PBS处理组中的荷MM.1S的NSG小鼠在颅骨、椎骨、骨盆和股骨中形成散播性的肿瘤病变(图6A)，并且大部分小鼠在肿瘤细胞接种后5周展现后腿瘫痪。CS1–CAR T细胞的输注显著减小肿瘤负荷，如通过荷MM.1S的NSG小鼠的生物发光成像以及延长的总存活期测定的，然而模拟物-感染的T细胞的输注不能导致小鼠的高效肿瘤消除和改善的存活(图6A和B)。

[0169] 为了进一步验证CS1–CAR T细胞的体内抗MM能力，使用IM9-移植的NSG小鼠模型评估CS1–CAR T细胞的影响。观察到与使用MM.1S显示的那些数据相似的数据。生物发光成像表明CS1–CAR-转导的T细胞的输注可高效地消除在荷IM9小鼠中建立的肿瘤，然而模拟物-转导的T细胞的输注不能减少肿瘤负荷(图9A)。在初始处理后44天，对于接受CS1–CAR T-细胞输注的荷IM9小鼠观察到100％存活率，然而对于接受模拟T细胞和PBS的对照小鼠存活率分别仅为28.6％和16.7％(图9B)。

[0170] 实施例2:CS1-特异性嵌合抗原受体(CAR)-工程化的自然杀伤细胞在体外和体内增强抗人多发性骨髓瘤的抗肿瘤活性

[0171] 在本研究中，使人NK细胞工程化以表达为CS1特异性的并且包含CD28-CD3ζ共刺激信号转导结构域的CAR。在MM的体外和体内原位异种移植小鼠模型中评估这些细胞的抗-MM功能。结果显示CS1-CAR的表达可将NK细胞重定向以在体外和体内特异性地且高效地消除表达CS1的MM细胞，并且该消除是CS1依赖性的。数据表明该CAR策略适合用于将有效的基于NK细胞的免疫疗法开发为治疗具有难治性或复发性MM的患者的工具。另外，与CAR T细胞相反，CAR NK细胞允许使用同种异体NK细胞来源，这不太可能引起移植物抗宿主病并且可能甚至帮助抑制移植物抗宿主病(Olson JA，等Blood 2010 115:4293–4301)，同时还因错配的杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)(Ruggeri L，等Science 2002 295:2097–2100)而加强细胞毒性的增强。

[0172] 材料和方法

[0173] 细胞培养

[0174] 将人多发性骨髓瘤细胞系L363(德国微生物和细胞培养物保藏中心，Braunschweig,Germany)、IM9[美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,VA,USA]和U266(ATCC)维持在含有10％胎牛血清(FBS)(Life Technologies,Grand Island,NY,USA)的RPMI 1640培养基中。将人IL-2依赖性NK细胞系NK-92(ATCC)和NKL维持在补充有
20％FBS和150IU/mL rhIL-2(Hoffman-LaRoche Inc.,Nutley,NJ,USA)的RPMI 1640培养基中。将293T(ATCC)和phoenix包装细胞系维持在具有10％FBS的DMEM培养基中。按照制造商的方案，使用EASYSEP人全血和骨髓CD138阳性选择试剂盒(StemCell Technologi+
es,Vancouver,BC,Canada)从MM患者的骨髓穿刺液中分离原代CD138MM细胞。所有人研究由俄亥俄州立大学伦理审查委员会批准。

[0175] 小鼠

[0176] 6至8周龄NOD.Cg-prkdcscid IL2rgtm1Wjl/szJ(NSG)小鼠获自Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)。所有动物研究由俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会批准。经常监测小鼠的MM疾病进展，当它们具有后肢瘫痪、昏睡以及明显的体重减的症状即将死亡时，将其杀死。

[0177] 抗-CS1 CAR慢病毒构建体的产生

[0178] 将从杂交瘤细胞系Luc90扩增的CS1-scFv片段与紧接在CS1-VL-编码序列之后的编码Myc标签的序列融合。融合的DNA序列包含有从逆转录病毒载体切取的
CD28-CD3ζ。将完整的CS1-scFv-myc标签-CD28-CD3ζ片段连接进称为PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(PCDH,System Biosciences,Mountain View,CA,USA)的慢病毒载体中以产生PCDH-CS1-scFv-myc标签-CD28-CD3ζ(PCDH-CS1-CAR)构建体。

[0179] NK细胞的慢病毒产生和转导

[0180] 为了产生VSVG 假型化慢病毒上清液，使用磷酸钙转染试剂(Promega,Madison,WI,USA)，利用PCDH-CS1-scFv-CD28-CD3ζ或PCDH对照载体(以产生用于利用空载体的模拟感染的病毒)与包装的构建体pCMV-VSVG和pCMV-dr9一起共转染DMEM培养基(Invitrogen)中培养的293T细胞。24小时后，用含有20％FBS的RPMI-1640培养基替换DMEM培养基。转染后48小时，收获含有慢病毒的条件培养基，并将其通过0.45μm 过滤器单元(Milliopore,Billerica,MA,USA)过滤以除去细胞碎片。在总体积2mL的含有
8μg/mL聚凝胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和450IU/mL rhIL-2的慢病毒上清液
6
中，使用2×10个NK-92或NKL细胞在6孔板中进行病毒感染。在32℃将细胞以1,800rpm离心45分钟，随后将板在37℃置于培养箱中持续2小时。随后在当天重复感染第二次，第二天再重复一次。在第三次转导后，在37℃下将细胞维持在补充有20％FBS和150IU/mL rhIL-2的RPMI 1640培养基中。使用FACS Aria II细胞分选仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)通过两轮细胞分选来富集转导的NK细胞。基于在PCDH载体中编码的绿色荧光蛋白(GFP)表面标志物的表达选择阳性细胞。

[0181] 稳定地表达CS1的U266细胞系的产生

[0182] 通过PCR从自IM9细胞分离的cDNA中扩增人CS1编码序列，随后将其亚克隆入PCDH慢病毒载体以产生PCDH-CS1构建体。使用上述方法进行慢病毒产生和U266细胞的感染。随后使用FACS Aria II细胞分选仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)来分选GFP阳性细胞。

[0183] 免疫印迹分析

[0184] 利用PBS洗涤细胞，并将其在laemmli缓冲液中直接裂解。将裂解物在4％至15％的梯度SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)上进行电泳分离，并转移至硝酸纤维素膜(EMD Millipore,Billerica,MA,USA)。用5％的于补充有0.1％Tween 20的Tris缓冲盐水(TBS)中的牛奶来封闭膜。用5％的于补充有0.1％Tween 20的TBS中的牛奶以1:1,000稀释小鼠抗-人CD3ζ链单克隆抗体(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)，并添加该抗体溶液以与膜反应过夜。随后在补充有Tween 20的TBS中洗涤膜3次。用5％的于补充有0.1％Tween 20的TBS中的牛奶以1:5,000稀释HRP缀合的第二抗体(GE Healthcare Biosciences,Pittsburgh,PA,USA)，并将所述抗体添加至膜中，放置1小时。将膜在补充有Tween 20的TBS中再洗涤4次，并添加增强化学发光试剂(ECL；
GE Healthcare Biosciences)，持续1分钟。随后将印迹暴露于胶片进行不同长度的时间以产生适当暴光的图像。

[0185] 流式细胞术

[0186] 为了分析CS1-CAR的表面表达，将转导的NK细胞的单细胞悬浮液在4℃用抗-Myc标签小鼠mAb 9E10(Sigma-Aldrich)孵育1小时。用PBS洗涤细胞两次，随后在4℃用PE缀合的大鼠抗-小鼠IgG1第二抗体(BD Pharmingen)孵育30分钟。在用PE缀合的小鼠抗-CS1 mAb(eBiosciences,San Diego,CA,USA)和APC缀合的小鼠抗-CD138 mAb(BD Pharmingen)对细胞进行染色后，使用BD LSRII分析仪通过FACS分析来检查骨髓瘤细胞上的CS1和CD138的表面表达。使用FLOWJO软件(Tree Star Inc.,Ashland,OR,USA)进行数据分析。

[0187] 细胞毒性测定

[0188] 为了检测NK细胞介导的裂解，用100mCi铬-51(51Cr)标记MM靶细胞1.5小时，用常规RPMI培养基洗涤4次，并将其在96孔V型底微量滴定板的100μl体积中调整至5,000个细胞/孔的浓度。以不同的效/靶比(E:T)将FACS富集的模拟物-或
CS1-CAR-转导的NK细胞于100μl体积中添加至一式三份的孔中。在于37℃孵育4小时后，从每一个孔收获100μl的上清液，并将其转移至含有液体闪烁混合液(Fisher scientific,Pittsburgh,PA,USA)的闪烁瓶中，以便可在TOPCOUNT计数器(Canberra
51 51
Packard,Meriden,CT,USA)上测量 Cr的释放。为了测定最大 Cr释放，用100μl的SDS孵育靶细胞悬浮液。使用标准公式：100x(cpm实验性释放-cpm自发释放)/(cpm最大释放-cpm自发释放)来计算特异性裂解的百分比。

[0189] 干扰素-γ释放测定

[0190] 将骨髓瘤靶细胞与NK效应细胞在96孔V型底板中共培养24小时。总5 5
共地，将2.5×10个骨髓瘤细胞系细胞或1.0×10 个原代骨髓瘤细胞分别与
5 5
2.5×10个或5.0×10 个NK细胞一起孵育。按照制造商的说明书，使用来自R&D
Systems(Minneapolis,MN,USA)的试剂盒通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定无细胞上清液的干扰素-γ(IFN-γ)分泌。图中描述的数据代表来自具有相似结果的3个代表性实验之一的一式三份孔的平均值。

[0191] 原位MM小鼠模型和荷MM小鼠的体内处理和生物发光成像

[0192] 如先前所述(He S，等Blood 2013 121:4663–4671)，利用表达萤火虫荧光素酶的Pinco-pGL3-luc/GFP病毒对IM9细胞进行逆转录转导。使用FACS Aria II细胞分选仪(BD Biosciences)来分选GFP阳性细胞，并将其命名为‘IM9-Luc’细胞。随后，在第06
天经尾静脉用400μl磷酸缓冲盐水中的0.5×10个IM9-Luc MM细胞静脉内(i.v.)注射
6至8周龄雄性NSG小鼠，以建立异种移植原位MM模型。从第7天开始，每5天一次(总
6
共5次)用400μl磷酸缓冲盐水中的5×10个效应细胞(即CS1-CAR NK-92细胞或模拟
物-转导的对照细胞)i.v.注射小鼠。在IM9-Luc接种后4周，用D-荧光素(150mg/kg体重；Gold Biotechnology,St.Louis,MO,USA)腹膜内(i.p.)输注小鼠，用异氟烷麻醉小鼠，以及使用体内成像系统(IVIS-100,Perkin-Elmer,Waltham,MA,USA)，利用Living Image软件(Perkin-Elmer)进行成像。

[0193] 免疫组织化学分析

[0194] 将脊柱固定在10％缓冲的福尔马林磷酸盐中，并于饱和EDTA中进行脱钙，随后将其包埋在石蜡中。用苏木精和伊红(H&E)对5微米厚切片进行染色，以进行组织学检查。按照标准免疫组织化学染色程序，利用小鼠抗-人CD138 mAb(1:50稀释；Thermo-Scientific,Waltham,MA,USA)对切片进行免疫染色以鉴定人MM细胞。辣根过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG用作第二抗体，随后进行过氧化物酶酶促反应。

[0195] 统计学

[0196] 如果是正态分布的话，将未配对学生t检验用于比较两个独立组的连续终点。当比较3个或更多个独立组时，使用单因素ANOVA。对于非正态分布终点，诸如体内生物发光强度，利用Kruskal–Wallis检验来比较NK-92-CS1-CAR与NK-92-EV和磷酸缓冲盐水组的中值。对于存活数据，绘制卡普兰-迈耶曲线，并使用时序检验进行比较。所有测试是双侧的。使用Bonferroni法调整用于多重比较的P值。<0.05的P值被认为是统计上显著的。

[0197] 结果

[0198] 表达CS1-CAR的NK-92和NKL NK细胞的产生

[0199] 利用依序含有信号肽(SP)、重链可变区(VH)、接头、轻链可变区(VL)、Myc标签、铰链、CD28和CD3ζ的PCDH慢病毒载体主链产生特定CS1-CAR构建体(图13A)。利用CAR构建体转导NK-92和NKL NK细胞系，随后分选GFP(由载体表达的标志物)的表达。分选的细胞的免疫印迹表明，CS1-CAR被成功地引入和表达，如通过含有CD3ζ的嵌合CS1-scFv受体在用CAR构建体而非用对照载体转导的NK-92和NKL细胞系中的表达所证明(图13B)。此外，抗-Myc Ab表面染色后的流式细胞术分析表明，CS1-CAR在用CS1-CAR构建体转导的NK-92和NKL细胞的表面上表达(图13C)。

[0200] 相较于模拟物-转导的NK细胞，经CS1-CAR修饰的NK细胞在体外更有效地消除+ –CS1MM细胞而非CS1 细胞

[0201] 在产生CS1-CAR NK细胞后，确定它们是否比CS1–MM细胞更佳地选择性杀伤CS1+。为了该目的，首先确认IM9和L363 MM细胞系组成型地在它们的表面上表达CS1蛋白，然而CS1的表达在U266 MM细胞中可被忽略(图14A)。随后，4小时的铬-51释放测定表明，相+
较于模拟物-转导的NK-92细胞，利用CS1-CAR转导的NK-92细胞在它们杀伤CS1IM9和L363细胞的能力上得以显著增强(图14B和14C，左图)。在使用利用CS1-CAR转导的NKL细胞重复的实验中观察到相似数据(图14B和14C，右图)。然而，CS1-CAR-和模拟物-转导的NK-92或NKL细胞在它们的低水平的抗CS1U266骨髓瘤细胞的细胞毒性上是相似的(图14D)。另外，CS1-CAR的强制表达不诱导NK-92或NKL细胞的明显细胞凋亡，如通过使用流式细胞术分析7AAD/膜联蛋白V-染色所测定(图20)，这表明CS1-CAR表达不引起针对NK-92或NKL细胞本身的细胞毒性。类似地，纯化的原代人NK细胞中的CS1-CAR表达增+
强它们抗CS1IM9骨髓瘤细胞的细胞毒性。

[0202] 经CS1-CAR修饰的NK细胞在暴露于CS1+MM细胞后比模拟物-转导的NK细胞分泌更多的IFN-γ

[0203] 包含在CAR构建体中的CD28共刺激分子的信号转导结构域可在CS1scFv与MM细胞表面上的CS1抗原识别后增强活化。因此，该信号转导结构域的包含可具有活化NK细胞以不仅具有更高的细胞毒性而且还产生更多IFN-γ的能力，其后者对于肿瘤监督以及+CD8T细胞和巨噬细胞的活化也是非常重要的(Martin-Fontecha A，等Nat Immunol 2004
5:1260–1265；Tu SP，等Cancer Res 2011 71:4247–4259；Ma J，等Cell Mol Life Sci +
2003 60:2334–2346)。为了测定这一点，单独地培养或与CS1骨髓瘤细胞(包括IM9和L363MM细胞系)共培养经CS1-CAR修饰的NK细胞或对照工程化的效应NK细胞。24小时后，通过ELISA测量IFN-γ产生。如图15中所示，当单独孵育时，经CS1-CAR修饰的和模–
拟物-转导的NK-92或NKL细胞自发地产生低水平或可忽略水平的IFN-γ。与CS1 MM肿瘤细胞(IM9或L363)的共培养在CS1-CAR和模拟物-转导的NK-92或NKL细胞系中都诱导IFN-γ；然而，由经CAR修饰的NK-92或NKL细胞产生比模拟物-转导的NK-92(图15A和–
15B，左图)或NKL细胞(图15A和15B，右图)显著更高水平的IFN-γ。当与CS1 MM细胞系U266共培养时，模拟物-转导的和CS1-CAR-转导的NK-92细胞(但非转导的NKL细胞)都产生比未与U266细胞共培养的对应细胞更高水平的IFN-γ(图15C)。这表明NK-92细胞上的NK细胞受体与它们在U266细胞上的配体之间的独特相互作用可诱导NK-92细胞的不依赖于CS1的IFN-γ产生。此外，当将CS1-CAR-转导的NK-92和NKL细胞与U266细胞共培养时，它们未产生比对应的模拟物-转导的NK-92和NKL细胞更多的IFN-γ(图15C)。
这些结果与上述细胞毒性数据一致，并且一起表明利用CS1-CAR的修饰可显著增强NK细胞+ –
在细胞毒性和IFN-γ产生方面响应于CS1但非CS1 骨髓瘤细胞的效应子功能。

[0204] U266细胞中的强制CS1表达增强NK-92-CS1-CAR细胞的细胞毒性和IFN-γ产生[0205] 随后探究CS1-CAR NK细胞的该增强的活性是否依赖于MM细胞上的CS1抗原表+ –达。上述观察—CS1-CAR的引入赋予NK-92细胞响应于CS1骨髓瘤细胞但非CS1 U266骨髓瘤细胞的增强的细胞毒性活性和增加的IFN-g产生—促进对U266细胞中的CS1过表达是否足以改变U266细胞对NK-92-CS1-CAR细胞的敏感性的研究。为此目的，通过慢病毒感染将CS1在U266细胞中异位表达。流式细胞术分析确认了，CS1蛋白在U266-CS1细胞表面上成功地表达(图16A)。铬-51释放测定表明，当与模拟物-转导的NK-92细胞相比较时，存在CS1-CAR-转导的NK-92细胞针对过表达CS1的U266细胞的细胞毒性活性的显著增强(图16B)。同样地，相较于含有模拟物转导的NK-92细胞的平行共培养物，与过表达CS1的U266细胞共培养的NK-92-CS1-CAR细胞分泌显著更高水平的IFN-g(图16C)。然而，与图14D和15C中的数据一致，当将它们与利用空载体对照转导的U266细胞一起孵育时，NK-92-CS1-CAR细胞与模拟物-转导的NK-92细胞之间的细胞毒性和IFN-γ分泌无差异(图16B和16C)。这些结果表明NK-92-CS1-CAR细胞对骨髓瘤细胞的增强的识别和杀伤以CS1依赖性方式发生。

[0206] NK-92-CS1-CAR细胞的表型表征

[0207] 随后研究CS1-特异性CAR的表达是否可改变NK细胞表型。将流式细胞术用于在IM9骨髓瘤细胞存在或不存在的情况下在培养后比较CS1-CAR-转导的与模拟物-转导的NK-92细胞表面上的抗原表达。如图17A所示，无论是在IM9细胞存在的情况下还是在其不存在的情况下培养，CS1-CAR-转导的与模拟物-转导的NK-92细胞之间在NK细胞受体(包括NKp30、NKp46、NKG2C和NKG2D)的表达上都不存在差异。还评估NK细胞的活化标志物CD6928和HLA-DR的表达(Phillips JH，等J Exp Med 1984 159:993–1008；Spits H，等Immunity 2007 26:11–16)。IM9细胞的识别不引发CD69在模拟物-转导的NK-92细胞上的表达，但仍然诱发CD69在CS1-CAR-转导的NK-92细胞表面上的表达的适度但显著的增加(图17A)。有趣地，与IM9细胞的共孵育在CS1-CAR-转导的和模拟物-转导的NK-92细胞中都引起HLA-DR的表达的显著增加。在IM9靶细胞不存的情况下，在CS1-CAR-转导的与模拟物-转导的NK-92细胞之间不存在HLA-DR表达的明显差异；然而，在用IM9细胞刺激后，HLA-DR的表达在NK-92-CS1-CAR细胞中相较于在模拟物-转导的NK-92细胞中变+得显著更高。因此，当将它们暴露于CS1MM细胞时，在NK-92-CS1-CAR细胞上表达的活化标志物，尤其是HLA-DR的增加的发生可与由这些细胞产生的增强的细胞毒性和IFN-γ产生相关。使用细胞内染色，当与模拟物-转导的NK细胞相比较时，NK-92-CS1-CAR细胞即使在MM肿瘤细胞不存在的情况下具有显著更高水平的穿孔素和颗粒酶B表达(图17B和17C)。
这与关于颗粒酶B在CAR T细胞中的升高的表达的先前报导一致(Koehler H，等Cancer Res 2007 67:2265–2273)，而且还与穿孔素和颗粒酶B表达通常与NK细胞的细胞毒性活性相关的事实一致(Krzewski K，等Front Immunol 2012 3:335)。

[0208] CS1-CAR-转导的NK-92细胞离体更有效地识别和杀伤抗NK的原代MM细胞

[0209] 为了使发现更加与临床相关，研究当离体识别原代MM细胞时，经CS1-CAR-修饰的NK-92细胞是否也具有增强的细胞溶解活性和IFN-γ产生。使用流式细胞术来评估CS1在+来自MM患者的原代CD138磁珠选择的MM细胞上的表面表达(图18A)。与显示CS1蛋白在CD138磁珠纯化的MM患者细胞上高度表达的先前报导(Hsi ED，等Clin Cancer Res 2008
14:2775–2784；Tai YT，等Blood 2008 112:1329–1337)一致，CS1蛋白确实均一地在原代MM细胞的表面上表达(图18A)。通过铬-51释放测定，已显示从MM患者新鲜分离的原代骨髓瘤细胞甚至在高至40:1和20:1的E:T比下对NK-92细胞介导的裂解具有高度抗性；
然而，该抗性可被CS1-CAR的NK-92细胞表达部分克服，这导致原代骨髓瘤细胞的消除显著增加(图18B)。与细胞毒性结果一致，在与原代骨髓瘤细胞共培养24小时后，CS1-CAR-转导的NK-92细胞相较于模拟物-转导的NK-92细胞也分泌显著更高水平的IFN-γ(图18C)。

[0210] CS1-CAR-转导的NK-92细胞在原位异种移植MM模型中抑制荷瘤小鼠的MM肿瘤生长并且延长其存活期

[0211] 为了进一步阐明NK-92-CS1-CAR细胞的潜在治疗性应用，在IM9异种移植NSG小鼠中检查它们的抗肿瘤活性。利用表达萤火虫荧光素酶的病毒，通过逆转录病毒转导IM9细胞来产生表达萤火虫荧光素酶的IM9细胞系(IM9-Luc)，随后进行基于GFP的细胞分选。通过RT-PCR确认全长萤火虫荧光素酶mRNA的表达。与典型的骨髓瘤细胞一样，IM9-Luc细胞在它们的表面上表达CD138蛋白。与先前的报导(Francisco JA，等Cancer Res 2000
60:3225–3231)一致，荷IM9-Luc的NSG小鼠表现散播性疾病，表现为后肢瘫痪和运动性共济失调。表现后肢瘫痪的小鼠的脊柱的组织学检查显示许多肿瘤细胞和溶骨性病变存在于骨组织中(图19A，左)。利用人特异性抗-CD138抗体的免疫组织化学染色进一步确认肿瘤细胞的存在(图19A，右)。将生物发光成像用于监测IM9-Luc肿瘤生长。如图19B和19C中所示，以及与体外细胞毒性数据一致，与后来接受利用模拟物-转导的对照细胞注射的小鼠相比较，IM9-Luc肿瘤在后来代替施用NK-92-CS1-CAR细胞的小鼠中被显著抑制。此外，利用NK-92-CS1-CAR细胞的处理相较于利用模拟物-转导的NK-92对照细胞的处理显著延长荷IM9-Luc肿瘤小鼠的存活期(图19D)。值得注意的是，当类似地施用NK-92-CS1-CAR细胞或模拟物-转导的NK-92细胞，但无IM9-Luc细胞的i.v.注射时，小鼠不发展散播性疾病或死亡。

[0212] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开的发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本文引用的出版物和针对其引用的材料通过引用明确地并入。

[0213] 本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验来确定，本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效物。此类等效物意欲被以下权利要求涵盖。

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