本发明涉及植物的病原抗性，更具体地说，涉及病原抗性基因的鉴 定和应用。本发明是建立在对拟南芥RPP5基因克隆的基础之上。

植物总是处于潜在病原微生物的攻击之中。而农作物植物又特别脆 弱，因为它们通常作为遗传均一的单种栽培体被培育生长；一旦受到疾 病侵袭，损失可能是严重的。但是，大多数植物对大多数植物病原是有 抗性的。为了保护自身，植物已逐渐形成了一系列预先存在的和可诱导 的防御系统。病原体，特别是那些通过与活植物细胞的紧密关联而得到 营养的活体营养性病原体。必须专门设法克服宿主的防御机制。如果病 原体能够引起疾病，那么该相互作用被称为是相容的，但是如果植物是 抗性的，那么该相互作用被称为是不相容的。品种特异性抗性与过敏性 反应(HR)有非常密切的关系，这是一种诱导性反应，(推测)借助 这种反应，植物通过在病原体企图侵入的位置使局部细胞死亡来遏制活 的宿主细胞中的病原体。

很久以前就已知道，HR-相关的疾病抗性常常是(虽然不是绝对 地)由显性基因(R基因)决定的。Flor曾表明，当病原体突变成能克 服这种R基因时，这些突变是隐性的。Flor得出结论，为了使R基因发 挥功能，必须在病原体内也存在被称为无毒性基因(Avr基因)的相应 基因。为了变成有毒性的，病原体必须因而停止制造激活R基因依赖性 防御机制的产物(Flor，1971)。一种通常被称为诱体/受体模型的，被 广泛接受的实用假设是，只要病原体携带有相应的Avr基因，R基因则 可编码使植物能够察觉该病原体存在的产物(Gabriel和Rolfe，1990)。 然后，这种识别被转化成对防御反应的激活作用。

某些相互作用显示出不同的遗传特性。表达毒素(Hc毒素)的炭 色长蠕孢(Helminthosporium carbonum)能感染缺乏Hm1抗性基因的 玉米品系。失去Hc毒素表达的突变是隐性的，并与毒性丧失有关，这 与基因对基因的相互作用相反，其中成为有毒性的突变是隐性的。1992 年报导了一个显著的成就，通过标记分离了Hm1基因(Johal和Briggs， 1992)。关于基因对基因的相互作用是如何从毒素依赖性毒性演化而来 的论据，仍然是似是而非的。例如，其产物是毒素的靶的植物基因，可 能突变成使植物对该毒素具有更高的敏感性，导致HR，并且使敏感性 基因转变成抗性基因。但是，这似乎不是Hm1的作用方式，它的基因产 物能使Hc毒素失活。

对于病原体无毒性基因的认识仍然很贫乏。几种细菌的Avr基因编 码与其它类型蛋白质没有同源性的亲水性蛋白质，而另一些基因带有重 复单位，其数目可以变更，从而改变它们在其中能表现无毒性的植物的 范围(Keen，1992，Long和Staskawicz，1993)。为了使细菌的Avr基因 诱导HR，需要其它细菌基因(hrp基因)，其病原性也需要其它细菌 基因(Keen，1992，Long和Staskawicz，1993)。还不清楚为什么病原体 要制造使植物能够察觉它们的产物。普遍相信，某些易弃去的Avr基因 虽然有助于其病原性，但不是必需的，而其它一些Avr基因很少是非必 需的(Keen，1992，Long等，1993)。对两种真菌无毒性基因的特征鉴定 也有报导，暗黄枝孢(Cladosporium fulvum)如Avr9基因使试图攻击 携带Cf-9基因的蕃茄变种的暗黄枝孢无毒性，该Avr9基因编码一种分 泌性富半胱氨酸的多肽，其最后加工后的大小为28个氨基酸，但对其在 相容性相互作用中的功能尚不清楚(De Wit，1992)。暗黄枝孢的Avr4 基因编码一种加工后最后大小为106个氨基酸的分泌性多肽(Joosten 等，1994)。

近年来，主要是基于遗传学准则的基因分离技术已取得了显著的进 展，目前许多研究工作者正试图克隆各种R基因。

基于蕃茄Pto基因克隆的图谱已被报导，该基因能使蕃茄具有对丁 香假单胞菌蕃茄致病变种的“基因对基因”抗性。(Martin等，1993)。 对YAC(酵母人工染色体)克隆的鉴定表明，它携带有非常紧密地连接 于该基因的限制性片段长度多态性(RFLP)标记。此YAC可用于分离 同源性cDNA克隆。将两个这种cDNA与一个强启动子融合，在用于转 化疾病敏感性蕃茄变种之后，其中的一个融合基因表现出能使此种蕃茄 对携带有相应无毒性基因AvrPto的Pst菌株具有抗性。这两个cDNAs 显示有相互同源性。的确，用Pto cDNA探针揭示了一个至少有6个成 员的小基因家族，其中的5个可以在从中分离出Pto的YAC上找到， 因此它确实含有这种根据对其它R基因座的遗传学分析推测的局部多基 因家族。

对于简单的诱体/受体模型的支持者来说，Pto基因的cDNA序列是 令人费解的。它显示出与其在信号转导中的作用相符的，与丝氨酸/苏氨 酸激酶的明显同源性。令人感兴趣的是，在芥属植物(Brassicas)中， 存在着对与自身不相容性有关的激酶的强同源性，它们行使类似的功 能，其中需要它们阻止基因型确定的不相容花粉管的生长。但是，与芥 属植物SRK激酶不同(Stein等，1991)Pto基因似乎只编码激酶催化功 能区和可能促进与膜关联的潜在性N-末端十四酰化位点。如果这样一 种基因产物仅仅在察觉出入侵微生物内的AvrPto基因时，就能够单独起 作用来完成启动防御反应所需要的特异性识别作用，那将是令人惊奇 的。目前对于由携带有AvrPto的Pst菌株所制造的种特异性诱体分子仍 无了解，在查明Pto基因产物可能识别这种分子之前，需要对其特征进 行鉴定。

自从分离出Pto基因之后，又分离出了若干种其它的抗性基因。 Whitham等(1994)报导了从烟草中分离烟草花叶病抗性基因N的工 作。Lawrence等(1995)报导了从亚麻中分离亚麻锈病抗性基因L6 的工作。还有分离出了两个有丁香假单胞菌抗性的拟南芥基因的报导。 Bent等(1994)和Mindrinors等(1994)报导了对RPS2的分离，Grant 等(1995)报导了对RPM1的分离。这些基因可能编码携带有核苷酸结 合位点(NBS)和富亮氨酸重复单位(LRR)的细胞质蛋白质。对于 与之相互作用的配体尚未进行特性鉴定，并且还不了解为了完成防御反 应，它们将与何种植物蛋白质相互作用。我们自己的实验室已报导分离 出赋予对真菌暗黄枝孢抗性的蕃茄Cf-9基因。这已在WO95/18230中公 开，并且由Jones等(1994)报导了。我们还克隆了可赋予对暗黄枝孢 的抗性的蕃茄Cf-2基因，这在我们1996年4月1日提交的国际专利申 请中已经公开，该专利要求1995年3月31日提交的GB9506658.5的优 先权，并已被Dixon等(1996)报导。它的结构类似于Cf-9基因，据 其DNA序列，预测它主要是编码一种细胞外蛋白质，这种蛋白质具有 很多富亮氨酸的重复单位，并且推测携带有一个C端膜锚形体。最近还 克隆了水稻的Xa22基因(Song等，1995)。预测这种基因的蛋白质产 物将显示具有如下结构：一个推测是细胞外的，主要由类似于Cf-9和 Cf-2编码的富亮氨酸的重复单位组成的N-端结构域，一个预测的跨膜 结构域，以及一个推测是细胞质内的，与特别是由Pto编码的丝氨酸- 苏氨酸蛋白激酶非常相似的结构域。

本发明的主要内容是关于“病原抗性基因”或“疾病抗性基因”及 其应用。病原抗性基因(R)使植物能察觉表达相应无毒性基因(Avr) 的病原体的存在。当察觉出病原体时，则激活防御反应如过敏反应 (HR)。借助于这种方式，植物可能通过在病原体企图侵入的位置使 局部细胞死亡来遏制活细胞的病原体。其它的基因，(例如)包括 WO93/11241中的PGIP基因，是在由R基因察觉病原体而引起的植物防 御反应中被诱导产生的。

设想病原抗性基因可能编码一种受体来针对病原体产生的Avr依赖 性分子。按这种方式，它可能与植物的RADAR连接，用于发觉病原体。 一旦发觉病原体，植物将建立防御机制，与之有关的基因不是病原抗性 基因。在植物中，病原抗性基因的表达引起该植物中防御反应的激活。 虽然已有报导认为，可能是在诱体不存在下，抗性基因的过度表达导致 了激活作用，但是，这种激活可能是通过植物与病原体或相应的诱体分 子接触而引起的。防御反应可以在局部被激活，例如在植物与病原体或 诱体分子接触的位置，或者也可以在整个植物体中激活。在表达病原抗 性基因的植物中，防御反应的激活可能是由于植物与适当的相应诱体分 子接触而引起的。在病原体如寄生霜霉的抽提物中可能含有诱体，可完 全或部分地被纯化，并且可完全或部分地合成。一种诱体分子，如果它 是引起防御反应激活的R基因产物的合适配体，那么可以认为是“相 应”。

我们现在已分离出了赋予对霜霉病真菌(寄生霜霉)抗性的拟南芥 RPP5基因。确定了其DNA序列，并据此基因推导出最可能的氨基酸序 列。图1(SEQ ID NO.1)中显示了拟南芥RPP5基因组基因的DNA 序列，推导出的氨基酸序列显示在图2(SEQ ID NO.2)中。对氨基酸 序列的预测是根据使用为测定此基因组序列而设计的引物通过逆转录聚 合酶链式反应对内含子的鉴定。推测被剪接拼入外显子的并编码RPP5 多肽的部分DNA序列，以大写字母显示在图1中。图4(SEQ ID NO 5) 显示出编码图2氨基酸序列的邻接核苷酸序列，是通过把图1序列的外 显子连接在一起而形成的。

如在下面详述的，可通过基于基因图谱的克隆技术分离出拟南芥 RPP5基因。根据此技术，可以以相对于与抗性基因结合的限制性片段长 度多态性(RFLP)标志物更高的分辨率，测定赋予抗性的基因座的位 置。我们鉴定出一种似乎是完全与抗性基因结合的标志物，并应用与此 标志物相对应的探针，从以携带RPP5基因的拟南芥当地品种Landsberg erecta的DNA构成的文库中，分离出双重载体粘粒克隆。被定名为29L17 的双重载体粘粒克隆，当转化进入疾病敏感的拟南芥时，能赋予其疾病 抗性。通过对此克隆的DNA进行DNA序列分析，鉴别出编码富亮氨酸 重复单位的基因。在一种双重载体中，构建了被定名为pRPP5-1的亚克 隆29L17，它含有6304bp的DNA，包括距可能的起始密码子(图1) 1298bp的5′端(图1)，和距可能的终止密码子458bp的3′端。用此 亚克隆转化拟南芥Columbia生态型，则表现出赋予疾病抗性。通过分析 对已变成疾病敏感性的Landsberg的快中子诱导的突变，显示出此基因 的DNA结构发生了重排。综合这些资料，为如下结论提供了必要的证 据：图1和图2中显示的序列相当于RPP5基因。    

一方面，本发明提供了一种编码病原抗性基因的核酸分离物，该基 因的特征在于，它编码显示在SEQ ID NO 2中的氨基酸序列，或者其片 段，或者表现与其有明显同源性的氨基酸序列。N和L6可能被排除在 外。

举例来说，根据本发明的核酸，例如，编码一种多肽的核酸，此多 肽含有图2中所显示序列的突变体、衍生物、等位基因或变异体的氨基 酸序列(如在此所进一步论述的)，该核酸的实施方案可任选地通过具 有如下任何一个或多个特征，而区别于其它病原抗性基因如N，L6：

所编码的多肽具有与图3中所示烟草N蛋白的氨基酸序列小于30 ％的同源性，与图3中所示亚麻L6蛋白的氨基酸序列有小于25％的同 源性；

它的表达不激活通过植物与作为烟草N蛋白诱体的分子接触而引起 的防御反应；

它的表达不激活通过植物与作为亚麻L6蛋白诱体的分子接触而引 起的防御反应；

它的表达在烟草植物中不激活通过烟草植物与烟草花叶病毒接触而 引起的防御反应；

它的表达在亚麻植物中，不激活通过亚麻植物与亚麻栅锈菌接触而 引起防御反应；

它的表达不激活通过植物与作为拟南芥RPS2蛋白诱体的分子接触 而引起的防御反应；

它的表达不激活通过植物与作为拟南芥RPM1蛋白诱体的分子 接触而引起的防御反应；

它的表达在拟南芥中，不激活通过植物与丁香假单胞菌接触而引起 的防御反应；

所编码的多肽显示与蕃茄Cf-9蛋白氨基酸序列的同源性小于20 ％，并且与蕃茄Cf-2蛋白氨基酸序列的同源性也小于20％；

它的表达不激活通过植物与作为蕃茄Cf-9蛋白诱体的分子或者与 作为蕃茄Cf-2蛋白诱体的分子接触而引起的防御反应；

它的表达在蕃茄植物中不激活通过蕃茄植物与表达Avr2分子的暗 黄枝孢或者与表达Avr9分子的暗黄枝孢接触而引起的防御反应；

所编码的多肽含有推测的核苷酸结合位点；

所编码的多肽是一种细胞质蛋白；

所编码的多肽含有一个与果蝇Toll蛋白的细胞质结构域具有同源性 的区域。

区别本发明的核酸与其它病原抗性基因如N和L6的另一种方法， 可以根据它所编码的多肽，该多肽含有与在图2中所示RPP5 N末端结 构域氨基酸序列(图1的外显子1所编码的)具有大于60％同源性的N 末端结构域，和/或含有与在图2中所示的图1外显子2所编码的RPP5 结构域氨基酸序列具有大于40％同源性的核苷酸结合位点结构域，和/ 或含有与在图2中所显的图1外显子3编码的RPP5结构域氨基酸序列 具有大于30％同源性的结构域，和/或含有与图2中所示的图1外显子 4、5和6所编码的RPP5富亮氨酸重复单位(LRR)结构域氨基酸序 列具有大于30％同源性的结构域。

表2显示在推测的RPP5结构域与N之间，以及RPP5与L6之间， 由基因组序列的外显子所编码的相同氨基酸的百分数。

该核酸可能含有一段核苷酸序列，它编码表现与SEQ ID NO 2中所 显示的氨基酸序列至少有约60％同源性的一段氨基酸序列，优选地至少 有约70％的同源性，至少约80％的同源性，或者更优选地有至少约90 ％或更高的同源性。通常“氨基酸同源性的百分数”，可用于表示“相 同氨基酸的百分数”。高度同源性可以在合适的条件下，例如在足以排 除与不编码病原抗性基因序列杂交的严紧条件下，由互补核酸的杂交能 力来表示。因此，术语等位基因，衍生物或突变体，在此情况下可用于 任何有关的核苷酸序列，即能够与编码含有相关氨基酸序列多肽的任何 核苷酸序列杂交的序列。

最优选的是，该核酸能编码SEQ ID NO 2中显示的氨基酸序列，在 此情况下，该核酸可能包含带有SEQ ID NO 1中显示的编码序列DNA， 或者含有足够编码所需多肽的部分DNA(例如从mRNA的起始甲硫氨 酸密码子至框架下游的第一个终止密码子)。在一个实施方案中，DNA 含有SEQ ID NO 1中核苷酸1966至6511的核苷酸序列，或者是其例如 缺乏内含子的突变体、衍生物或等位基因。图4提供了一个编码图2氨 基酸序列的邻接序列。

另一方面，本发明提供了一个编码病原抗性基因的核酸分离物，或 者是它的一个片段，它可以通过以如下探针筛选核酸文库而得到：含有 SEQ ID NO 1核苷酸1966至6511的探针，或与此互补的核苷酸探针， 或者是含有它的一个片段，衍生物，突变体或等位基因的探针，并且还 可以通过分离能编码对植物赋予病原抗性的多肽的核酸而得到。在本专 业领域内，适合的技术是众所周知的。因此，本发明也提供了一种鉴定 和/或分离编码病原抗性基因核酸的方法，它包括用一种核酸探测待选物 (或“靶标”)核酸，这种核酸具有编码图2中所示氨基酸序列的核苷 酸序列，它对编码的序列是互补的，或者，它编码一个编码序列的片段， 或者是一个与编码序列互补的片段。待选物核酸(可能是例如cDNA或 基因组DNA)可能来自含有或推测含有编码病原抗性基因核酸的任何 细胞或生物体。一个优选的核苷酸序列显示在图1中。与此序列互补的 序列以及它们的片段都可以应用。

对于探测，优选的条件是那些对存在简单模式足够严紧的条件，此 模式具有少量鉴定为阳性，可进一步探查的杂交。本领域熟知的方式是 逐步增加杂交的严紧性，直到仅有少量阳性克隆剩下为止。

本发明的核酸可编码SEQ ID NO 2中显示的氨基酸序列，或者是此 序列的突变体，衍生物等位基因。优选的突变体，衍生物和等位基因， 是那些保留了由野生型基因编码的蛋白质功能特征的序列，特别是具有 赋予病原抗性的能力，可以通过在核酸中插入，删除或替代一个或多个 核苷酸，改变一个序列，产生突变体或衍生物，而导致一个或多个氨基 酸被插入，删除或被替代。当然，对核酸的改变也可能不造成其编码氨 基酸的任何改变。

核酸可以是DNA或RNA，并且可以人工合成，例如以最优密码子 用于在选择的宿主生物体内表达。本发明的核酸分子和载体，可以通过 从其天然环境中分离和/或纯化而得到，以基本纯化或均质的形式，或者 以所研究品种的游离或基本游离的核酸或基因的形式得到，或者是来源 于除编码具有所需功能多肽的其它序列。本发明的核酸可以包括cDNA， RNA，基因组DNA并且可能是完全或部分地合成形式。术语“分离物” 包括所有这些可能的形式。

另一方面，本发明提供的是这样一种核酸，它含有与某种核苷酸序 列互补的序列而这种核苷酸序列是能与在此所提供的任何编码序列杂交 的序列。与此相应的另一种途径是所寻找的核酸是能与本发明所提供的 任何编码序列互补的核苷酸序列杂交的核酸。当然，DNA通常是双链 的，印迹技术如Southern杂交通常在使双链分离之后进行，这种分离无 法区分哪条链是杂交的。优选的情况是，可杂交的核酸或它的互补体编 码一种能赋予宿主病原抗性的多肽，也就是包含病原抗性基因。优选的 杂交条件是专业人员所熟悉的。但是，通常是对所研究的序列与其它序 列以外的序列存在阳性杂交的足够严紧的条件，所述其它序列是不编码 能赋予宿主病原抗性的多肽的序列。

该核酸可以是以重组载体的形式存在的，例如噬菌体或粘粒载体。 为了在宿主细胞(如植物细胞)中表达，该核酸可处于适当的启动子和 调节因子的控制之下。在DNA的情况下，它可能含有其自身的启动子 和调节因子，而在cDNA的情况下，它可以在宿主细胞中的适合的启动 子和调节因子的控制之下进行表达。

本专业的技术人员都可构建载体，并设计重组基因表达方案。可以 选择或构建适合的载体，使之包含如下适当的调节序列：启动子序列、 终止子片段，聚腺苷酸化序列，增强子序列，标志物基因及其它适合的 序列。进一步的详情可参阅如分子克隆：实验指南，第2版，Sambrook 等，1989，冷泉港实验室出版社。核酸操作的许多已知技术和方案，在分 子生物学简明方案，第2版，Ausubel等编，John Wiley&Sons，1992 中都有详细叙述，例如核酸构建体的制备，诱变，测序，把DNA导入 细胞和基因表达，以及蛋白质分析等。Sambrook等和Ausubel等的公开 内容，在此也被引入作为参考。

在将一个所选择的基因构建体导入细胞时，某些对本专业技术人员 熟知的问题必须给予重视。被插入的核酸可装配在含有将驱动转录的有 效调节成分的构建体中。必须有一种将此构建体转运进入细胞的方法。 此构建体一旦进入了细胞膜，根据本发明不同的实施方案，进入细胞内 染色质的整合作用可能发生，或者不发生。最后，就植物而言，此靶细 胞必须是能够在整株植物中再生的细胞。

以含有预定序列的DNA片段转化的植物，可通过已知的植物基因 操作标准技术产生。用任何合适的技术可将DNA转化入植物细胞，例 如使用土壤杆菌携带的，无效的Ti-质粒载体，它表现天然的基因转移 能力(EP-A-270355，EP-A-0116718，NAR 12(22)8711-87215 1984)，颗 粒或微粒轰击(US 5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)，显微注射 (WO92/09696，WO94/00583，EP331083，EP175966  )，电穿孔法 (EP290395，WO8706614)或DNA直接摄入的其它形式(DE4005152， WO9012096，US4684611)。本专业的技术人员已将土壤杆菌转化技术 广泛地用于转化双子叶植物。虽然已有报导土壤杆菌能将外源性DNA 转化入某些单子叶植物(WO92/14828)，但当土壤杆菌表现得效率差 或没有作用时，用微粒轰击法，电穿孔法和DNA直接摄入法是优选的。 另一种方法是将不同的技术结合在一起，可用于提高转化过程的效率， 例如以包被微粒的土壤杆菌轰击(EP-A-486234)，或者用微粒轰击引 起创伤，然后与土壤杆菌进行共培养(EP-A-486233)。

对转化技术的具体选择，将取决于它转化某种植物的效率，以及以 具体的方法实施本发明技术人员的经验和偏好。显然，技术人员将核酸 导入植物细胞的具体的转化系统，对本发明不是必需的，也不对本发明 构成限制。

RPP5基因，其修饰形式以及相关的基因，都可以用于对植物赋予病 原抗性，例如对霜霉病的抗性，其中相关的基因是指编码与RPP5基因， 及其等位基因，突变体和衍生物的蛋白质产物有明显同源性的蛋白质的 基因。为此目的，上述核酸可用于产生转基因植物。这种植物可能具有 由RPP5基因赋予的病原抗性。

因此，本发明还进一步包括一种以所公开的载体转化的宿主细胞， 特别是一种植物细胞或微生物细胞。因此，本发明提供了一种含有本发 明核酸的宿主细胞，如一种植物细胞。在此细胞内，该核酸可被掺入到 染色体内。

含有本发明核酸的载体不必包含有启动子，特别是如果该载体是用 于将此核酸导入细胞，并重组进入其基因组时。

本发明还提供了一种植物细胞，本发明提供的核苷酸序列已被掺入 进它的基因组，此细胞已在控制表达所编码多肽的启动子的有效控制之 下。本发明的另一方面是提供了一种构建这种植物细胞的方法，包括把 含有此核苷酸序列的载体导入植物细胞。此种导入完成后，可进行载体 和植物细胞基因组之间的重组，以便将此核苷酸序列导入基因组内。然 后，被导入核酸所编码的多肽能够被表达。

本发明还提供了一种含有本发明的植物细胞的植物，并且提供了该 植株，种子，自交或杂交子代及后代，以及它们的任何部分的，如插条， 种子任何形式的克隆。本发明提供了任何一种植物繁殖体，它可以是用 于再生或繁殖的任何部分，有性或无性的，包括插条，种子等。

本发明进一步提供了一种方法，包括在将该核酸导入植物或其祖先 细胞的先行步骤之后，在植物细胞内，从编码SEQ ID NO 2氨基酸序列 或明显同源的氨基酸序列的核酸，或者其突变体，等位基因或衍生 物进行表达，从而产生所编码的多肽。这种方法可使植物具有病原抗性。

被稳定地掺入植物基因组的基因，代代相传至植物的后代，该植物 后代的细胞可表达所编码的多肽，并因此可具有更高的病原抗性。可以 通过测定对病原体如寄生霜霉或莴苣盘梗霉的相容性来测定病原抗性。

对RPP5基因测序表明，同Cf-9基因和Cf-2基因一样，它也包含有 编码富亮氨酸重复单位(LRR)区的DNA序列，并且，同源性检测已 显示与其它含有LRR的基因有很强的同源性。如在WO95/18230中所论 述，并在此发现中被进一步证实，存在LRR可能是许多病原抗性基因的 特征，因此，存在LRR可以在进一步鉴定病原抗性基因的方法中得到应 用。

而且，在RPP5与烟草花叶病毒抗性基因N和亚麻锈病抗性基因L6 之间，存在一些显著的同源性(图3)。(如可以从图3看出，RPP5 与N之间的总体同源性是33％氨基酸相同，而RPP5与L6的数值是27 ％)。这些同源性还可用于进一步鉴定抗性基因，例如可应用根据序列 保守性，优选地是根据氨基酸序列的保守性设计的寡核苷酸(例如一个 简并集合体)。具体地说，可以设计在如下区域之间扩增DNA的引物： 编码氨基酸序列FYDVDP(SEQ ID NO 6)的RPP5和N基因区域， 在L6中此区域编码FYMVDP(SEQ ID NO 7)，以及RPP5的IAC FF(SEQ ID NO 8)区域，此区域在L6中的序列是相同的，在N中是 IACFL(SEQ ID NO 9)。

另一方面，本发明提供了一种鉴定植物病原抗性基因的方法，包括 使用一种寡核苷酸来寻找新的抗性基因，此寡核苷酸含有在病原抗性基 因如RPP5，N和L6之间保守的一个或几个序列。因此，又提供了一种获 得含有病原抗性基因核酸(编码能赋予病原抗性的多肽)的方法，包括 使一个寡核苷酸(其详情在本文中论述)，或一个含有此寡核苷酸的核 酸分子，与靶标/待选核酸杂交。靶标或待选核酸可能含有例如从一个已 知编码病原抗性基因的生物体中得到的基因组文库或cDNA文库。可以 对成功的杂交进行鉴定，靶标/待选核酸可以被分离出来，用于进一步研 究和/或应用。

杂交可包括在适当的严紧条件下探测核酸和鉴定阳性杂交作用(根 据已知的技术)，以及/或者以寡核苷酸作引物，用于核酸扩增法如PCR 中。对于探测，优选的条件是那些对存在具有少量可进一步研究的，鉴 定为阳性杂交的简单模式是足够严紧的条件。本领域熟知的方式是逐步 增加杂交的严紧性，直到仅有少量阳性克隆剩下为止。

作为一种可选的探测法，虽然仍然是利用核酸杂交作用，但是被设 计用于扩增DNA序列的寡核苷酸，可用于PCR反应或涉及用常规方法 扩增核酸的其它方法。参见例如，“PCR方案，方法指南和应用”Innis 等编，1990，Academic Press，New York。

适合用于设计探针或PCR引物的优选氨基酸序列，是在至少两个能 赋予病原抗性的多肽之间保守(完全、基本或部分保守)的序列，例如 那些被RPP5和N，以及/或者L6编码的多肽。根据氨基酸序列的信息， 可设计寡核苷酸探针或引物，考虑到遗传密码的简并性，以及在适当的 情况下，从待选核酸可推导出生物体密码子的用途。优选的核苷酸序列 可包括那些含有或具有编码如下氨基酸的序列；(i)FYDVDP (SEQ ID NO 6)(ii)IACFF(SEQ ID NO 8)或者是与这些编码 序列互补的序列。可以应用这些序列的适当片段。例如，从氨基酸序列 FYDVDP可推导出寡核苷酸TTC/T TAC/T GAC/T GTX GAT/C CC (SEQ ID NO 10)。在与引物AAG/A AAG/A CA XGC T/G/A AT(SEQ ID NO 11)的组合物中，从编码IACFF的序列的底链推导出的这种寡 核苷酸引物可用于PCR。(所有序列以5′至3′的形式给出，见图3)。 X表示A，G，C或T。

本发明的寡核苷酸，例如用于核酸扩增的寡核苷酸，优选地具有大约 10个或较少的密码子(如6，7或8个)，即，大约30或较少些的核苷 酸长度(如18，21或24个核苷酸)。

可以按各种方式评估这种PCR产物是否与抗性基因相对应。来自这 种反应的PCR带可包含有复杂的产品混合物。可以对单个产物进行克 隆，并且，为了连接于已知的疾病抗性基因，对每一个产物都可单独地 进行筛选，此抗性基因是在对这种探针显示多态性的子代中分离的基 因。可选地，可以以一种能够使之在变性聚丙烯酰胺凝胶上表现出多态 性的方法处理这种PCR产物，并且，在克隆之前可预先挑选出连接于抗 性基因的特异性电泳带。一旦待选的PCR带被克隆，并且显示已连接于 一个已知的抗性基因，就可以把它用于分离cDNA克隆，这样可检查此 cDNA克隆是否有其它特征，以及是否与RPP5，N或L6有同源性。然后 可通过转化对它进行分析，测定它在被导入所研究的疾病敏感性植物变 种后的功能。另一种情况是，此PCR带或通过对它分析而推导出的序 列，可用于帮助植物育种者控制有用抗性基因的分离。

利用RPP5序列鉴定其它抗性基因的另一种方法是，用计算机寻找 表达的序列标志(EST)和其它DNA序列的基本数据，用于鉴定其它 品种中编码具有显著RPP5同源性的蛋白质的基因。例如，用一种BLAST 计算法(Altschul等，1990)得到至少为60的同源性分值将表明存在一 个待选的抗性基因。

已经用这些方法得到了核酸，为了例如对植物赋予病原抗性含有全 部或部分所得到的核酸序列的核酸分子可用于产生转基因植物。

对于本专业的技术人员，对上述各方面和实施方案的修改，以及本 发明进一步的方面和实施方案，将是显而易见的。所有被引述的文献在 此引入作为参考。

图1显示RPP5基因的基因组DNA序列(SEQ ID NO.1)。图中 用非大写字母显示内含子。特征：核酸序列-在核苷酸1966开始翻译；在 核苷酸6512停止翻译。

图2显示预测的RPP5蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。

图3显示由RPP5(SEQ ID NO 2)，N(SEQ ID NO 3)和L6 (SEQ ID NO 4)基因预测的氨基酸序列的比较。按照所预测的蛋白质 结构域，将蛋白质序列排列成直线。图3是用Wisconsin大学遗传学计 算机小组序列分析软件包7.2版的PRETTYBOX和PilelUp程序绘制的。

图4显示编码图2中显示的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的邻接核 苷酸序列(SEQ ID NO 5)，并且是通过将图1序列(SEQ ID NO 1) 的外显子序列连接在一起绘制的。 克隆拟南芥RPP5基因

用基于基因图谱的克隆方案克隆RPP5基因，其原理类似于前面简 述的，用于分离蕃茄Pto基因的方法。

(i)RPP5基因图位置的排列

以前对在拟南芥RFLP基因图谱上RPP5基因图谱的定位已有报导 (Parker等，1993)此论文详述了两个被定名为Columbia和Landsberg erecta的当地拟南芥品种，是如何对定名为NoCo-2的寄生霜霉表现出不 同的反应，Landsberg erecta是抗性的，而Columbia是敏感的。已构建 了重组近交系(Lister和Dean，1993)，是从正在进行单一种子世代的 F2种子上产生的，此F2种子是从Landsberg和Columbia间的F1产生的， 并且对这些重组近交系进行对NoCo-2的抗性或敏感性的测定。这些分 析表明，RPP5基因位于染色体4上，在RFLP标志物m226和g4539之 间。用RAPD(随机扩增的多态性DNA)技术分析了Landsberg和 Columbia的DNA(Williams等，1990)，并对Landsberg和Columbia 间的多态性分析了其与RPP5的连锁。用操纵子引物OPC18产生的一种 多态性是绝对连锁于RPP5的，此引物在Columbia扩增产生了一条扩增 带，但在Landsberg中没有产生。克隆了这条540 bp的DNA带(在Parker 等，1993中被定名为OPC18540)，并将形成的探针称为C18探针。

(ii)在标志物m226和标志物g4539间的物理图谱的建立

拟南芥基因组项目的目的是建立染色体4的物理图谱，并且最终建 立整个拟南芥基因组的物理图谱。C18探针可用于鉴定杂交酵母的人工 染色体(YAC)克隆。这有利于建立在4539和226之间掺入其它连接 标志物如g13683的物理重叠群(contig)。已克隆出C18 RAPD带，并 用作对Columbia和Landsberg基因组DNA的探针。此探针的杂交作用 显示，在这两个基因型中，存在一个非常多态性的小多基因家族。对重 组近交系杂交表明，此多基因家族的所有成员是完全与抗性基因座连接 的(Lister和Dean，1993)。用CAPS程序(Konieczny和Ausubel，1993) 在从Columbia和Landsberg杂交的F1通过自花受精产生的F2群体中， 对其个体进行连接的标志物Ara-1和4539之间重组体的筛选。用于Ara-1 基因座的引物是：

Ara-15′TCG ACG ACT CTC AAG AAC CC 3′

Ara-25′CAC AAG CTA TAC GAT GCT CAC C 3′ 这样在Columbia和Landsberg中得到700bp的带，用Acc消化后，切割 Landsberg DNA，得到360bp和340bp的带。用于4539基因座的引物 是：

4539 F5′GGT CAT CCG TTC CCA GGT AAA G 3′

4539 R5′GGA CGTAGA ATC TGA GAG CTC 3′     在用Hind III消化后，Columbia的600bp带仍然未被切割，而Landsberg 带被切割成480bp和120bp的片段。按此方式，在此间隔内可产生另外 24个重组体。对这些重组体的分析表明，C18多基因家族的所有成员， 再次恰好是以RPP5共分隔的。因为所连接的多基因家族具有疾病抗性 基因的特性(Martin等，1993，Jones等，1994，Whitham等，1994)，我们 对C18带可能与RPP5基因杂交的假设进行了验证。对载体pCLD04541 中来自Landsberg双重载体粘粒文库的粘粒进行了鉴定(C.Dean，pers. com.Bem等，1994)，并对与C18探针杂交的粘粒克隆进行了鉴定。表 1列举出了这些杂交的克隆。其中的每一种都被用于以对NoC0-2敏感并 易于转化的拟南芥当地品种No-O进行的转化试验。对以粘粒29L17转 化而产生的转化体进行了鉴定，并对此转化体的自交子代进行了抗寄生 霜霉NoC0-2抗性的分离。这证明，携带有与C18 RAPD探针杂交带的 克隆29L17带有功能性寄生霜霉抗性基因。

(iii)对29L17植物DNA插入片段的DNA序列分析

从29L17制备粘粒DNA，超声处理，并克隆进入pUC18载体，以 及进行随机测序。对随机克隆上的240个DNA进行测序反应，此随机 克隆被鉴定为与29L17插入DNA片段杂交的克隆，即携带有植物DNA 插入片段的克隆。根据此DNA序列资料的计算机分析，可将DNA序列 的重叠群编制成含有14.3Kb的DNA。并检查了此DNA序列是否存在 编码富亮氨酸重复单位的序列。在SEQ ID NO.1中，发现一个这样的区 域，是从核苷酸3000至核苷酸6138。

(iv)对与RPP5突变有关的DNA重排的分析

用于确定植物DNA的一个被表征的区域是否与所研究的基因相对 应的标准之一是，检查在相对应的基因中是否有由电离辐射引起的，与 所研究区域内DNA重排有关的突变。可用寄生霜霉筛选快中子诱变的 Landsberg种子突变体对疾病的敏感性。发现三种突变，并通过Southern 印迹试验分析了与此基因相应的，携带富亮氨酸重复单位的DNA中的 干扰或重排。一个突变品系FNB387显示出不同的Southern印迹杂交模 式。更进一步的分析表明，此干扰是由270bp的DNA片段在携带富亮 氨酸重复单位的阅读框架C端插入而构成。对此区域的序列分析表明， 270bp的插入片段已在粘粒29L17上携带的基因中由几个LRR复制而产 生。这充分有力地证明RPP5基因相当于携带富亮氨酸重复单位的阅读 框架。

(v)证明29L17的亚克隆含有RPP5

为了证实通过诱变鉴定的基因对赋予疾病抗性不但是必要的。而且 是充分的，在双重载体SLJ7292中构建29L17的亚克隆。此亚克隆被定 名为pRPP5-1，它含有由BglII限制酶5′位点对该基因(SEQ ID NO.1 中的核苷酸668和由PstI限制酶3′位点对该基因(SEQ ID NO.1中的核苷 酸6971)规定的6304bp的DNA片段。pRPP5-1被用于转化拟南芥的 Columbia生态型，并显示赋予疾病抗性的能力。

(vi)对RPP5转录物的RT-PCR分析

从苗叶的信使RNA可制备cDNA的第一条链，再从此cDNA，用 内含子侧翼引物进行PCR扩增。这些引物是：对于内含子1，5′-GAGT TCGCTCTATCATCTCC和5′-TTATTGCATTCGAAACATCATTG；对于 内含子2和3，5′-AAATTGATCGTGCAAAGTCC和5′-AAGATTCGCA TTCTTCAAGATT；对于内含子4，5′-GAAGATGGATTTGTATAATTC C和5′-TCAAATTCGGGCATCCAGTG。对于内含子5采用了嵌套PCR 方案，将一小份第一次扩增的产物用作第二次扩增的模板。采用的引物 是：对于第一次扩增，5′-TGGTGACACTTCCTTCCTCG和5′-CCAAACT TTTGCAGTTGTTG；对于第二次扩增，5′-TCTCAATGTGAGCGGCTGC AAGC和5′-AACTTGAGCAACCACTGAGATCG。用载体特异性和引物 特异性插入片段的组合，对克隆的PCR产物进行测序。内含子序列被显 示在SEQ ID NO.1(图1)中的下面一套序列中，位于显示在上面一套 序列中的外显子序列之间。

(vii)RPP5基因序列与其它抗性基因序列的比较

将RPP5序列与基因N和L6相比较，整个N-末端区显示出非常强 的同源性。这些区域在图3中被突出。它们包括与核苷酸结合有关的， 被称为激酶-1a，激酶-2，激酶-3a的区域，激酶-1a常常被称为 P-环。N-末端到核苷酸结合结构域的区域，也表明有显著的同源 性。引物被设计成特别针对携带氨基酸序列FYDVDP的保守区 (RPP5的氨基酸104至109)，以及氨基酸IACFF区(RPP5的437 -441)。当基于氨基酸序列的简并寡核苷酸引物被用于PCR反应时， 不论在拟南芥基因组DNA上，还是在由其它品种的RNA制备的cDNA 上，都观察到大小与可能的编码抗性基因一致的产物。

这些引物可单独地，或者与编码已鉴定的抗性基因保守区和非保守 区的其它引物共同用于分离其它的同源基因序列，所述同源基因序列可 能包含以前未被表征的抗性基因。

表1：

与C18杂交的双重载体粘粒克隆

双重载体：04541

转化入No-o的：

      3D23

      27E2

      29L17

      38G10

      42P15 

随后被鉴定的：

      45F8

      18A10

      56G2

表2：

RPP5和N间以及RPP5和L6间相同氨基酸的百分数

            N外显子1  N外显子2  N外显子3  N外显子4+5 RPP5 外显子1            55 外显子2                      36 外显子3                                26 外显子4，5+6                                     26

            L6外显子1 L6外显子2 L6外显子3 L6外显子4 RPP5 外显子1            37 外显子2                      30 外显子3                                17 外显子4，5+6                                      26 参考文献 1.Bent AF，et al.，(1994)拟南芥的RPS2：Science   265：1856. 2.De Wit PJGM(1992).Ann.Rev.Phytopathol.   30：391-418. 3.Dixon，MD，et al.(1996)Cell 84：451-459. 4.Flor HH(1971).Ann.Rev.Phytopathol.9：275-296. 5.Gabriel DW，et al.，(1990).Ann.Rev.Phytopathol.   28：365-391. 6.Grant，MR，et al.Science 269：843-846(1995) 7.Johal GS，et al.，(1992).Science(Wash.).   258：985-987. 8.Jones DA，et al.，(1994).Science 266：789-793. 9.Joosten MHAJ，et al.，(1994).Nature 367：384. 10.Keen NT，(1992).Ann.Rev.Gen.24：447-463. 11.Konieczny A，et al.，(1993).Plant Journal    4：403-407. 12.Lawrence，GJ et al.Plant Cell 7：1195-1206    (1995) 13.Lister C，et al.，(1993).Plant Journal(in    press). 14.Long SR，et al.，(1993).Cell 73：921-935. 15.Martin GB，et al.，(1993).Science    262：1432-1436. 16.Mindrinos M，et al.，(1994).Cell 78：1089-1099. 17.Parker JE，et al.，(1993).Plant Journal    4：821-831. 18.Song W-Y，et al.(1995).Science 270：1804-1806. 19.Stein JC，et al.，(1991).proc.Natl.Acad.Sci.USA.    88：8816-8820. 20.Whitham S，etal.，(1994).Cell 78：1011-1115. 21.Williams JGK，et al.，(1991).Nucl.Acids Res.    18：6531-6535. 22.Altschul，S.F.，et al.，(1990).J.Mol.Biol.    215：403-410.