用于检测肺癌的基因标志物、试剂盒及肺癌检测方法
阅读：672发布：2020-05-24
专利汇可以提供用于检测肺癌的基因标志物、试剂盒及肺癌检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于检测 肺 癌的基因标志物、 试剂 盒 及肺癌检测方法。基因标志物包括一个或两个以上以下基因：RUNX1转位伴侣基因1、F-Box和富含亮 氨 酸重复序列的 蛋白质 7、RNcA结合基序单链相互作用蛋白3、 钙 粘着蛋白11、红细胞膜蛋白谱带4.1样蛋白4A、 碱 核蛋白2、Tolloid样蛋白1、 硫酸 酯酶1、整合素亚基α8和R-脊椎蛋白3；通过高通量测序检测肺癌基因标志物中5-羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定肺癌是否存在。本发明检测肺癌具有安全无创、DNA来源广泛、准确性高、操作方便、用户体验好优点。本发明可与其他临床指标相结合，为肺癌筛查、诊断、 治疗 与 预后 提供更准确的判断。，下面是用于检测肺癌的基因标志物、试剂盒及肺癌检测方法专利的具体信息内容。
1.基因标志物用于检测肺癌的用途，通过高通量测序检测肺癌基因标志物中5-羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定肺癌是否存在，所述基因标志物包括一个或两个以上以下基因：
RUNX1转位伴侣基因1（RUNX1T1）、F-Box和富含亮氨酸重复序列的蛋白质7（FBXL7）、RNcA结合基序单链相互作用蛋白3（RBMS3）、钙粘着蛋白11（CDH11）、红细胞膜蛋白谱带4.1样蛋白
4A（EPB41L4A）、碱核蛋白2（BNC2）、Tolloid样蛋白1（TLL1）、硫酸酯酶1（SULF1）、整合素亚基α8（ITGA8）和R-脊椎蛋白3（RSPO3）。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述基因标志物包括RUNX1T1、FBXL7、RBMS3、CDH11、EPB41L4A、BNC2、TLL1、SULF1、ITGA8和RSPO3。
3.一种用于检测肺癌的方法，其特征在于包括以下步骤：
a）测定正常样品和受试者样品中权利要求1和2所述的基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶的含量；
b）用正常样品中所述基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量作为参照，将受试者样品中对应的基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量标准化，正常样品和受试者样品中同一基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量分别为X和Y，则受试者样品中该基因标志物的标准化5-羟甲基胞嘧啶含量为Y/X；
c）对步骤b）中经标准化的所述基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量进行数学关联，并获得评分P；
d）根据所述评分P的数值大小得到受试者样品是否患有肺癌的检测结果。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤a）包括如下步骤：将来自肺癌患者和正常人的样品的DNA片段化；将所述片段化的DNA末端修复并末端补齐；将末端补齐的DNA与测序接头连接，获得连接产物；通过标记反应对连接产物中的5-羟甲基胞嘧啶进行标记；富集含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段，获得富集产物；对富集产物进行PCR扩增，获得测序文库；对测序文库进行高通量测序，获得测序结果；根据测序结果确定5-羟甲基胞嘧啶在基因上的含量。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述标记反应包括：i）利用糖基转移酶将带有修饰基团的糖共价连接到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上，和ii) 将直接或间接连有生物素的点击化学底物与带有修饰基团的5-羟甲基胞嘧啶反应。
6.根据权利要求3、4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤（a）是测定所述基因标志物全长或其片段上的5-羟甲基胞嘧啶的含量。
7.根据权利要求3、4或5所述的方法，其特征在于步骤c）包括如下步骤：将各基因标志物的标准化5-羟甲基胞嘧啶含量乘以加权系数，获得该基因标志物的预测因子t；将各基因标志物的预测因子t相加，获得总预测因子T；将总预测因子T经过Logistic转换获得评分P；
若P>0.5，则该受试者样品患有肺癌；若P≤0.5，则该受试者样品为正常。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述样品是来自正常人或受试者体液中游离的DNA片段，或来源于细胞器、细胞以及组织中的完整基因组DNA。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述体液是血液、尿液、汗液、痰液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁或胰腺液。
10.一种用于检测肺癌的试剂盒，其特征在于包括：
a）用于测定权利要求1所述基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量的试剂；和b)说明书；
所述5-羟甲基胞嘧啶含量是指所述基因标志物全长或其片段上的5-羟甲基胞嘧啶的含量。
用于检测肺癌的基因标志物、试剂盒及肺癌检测方法
技术领域
背景技术
[0002] 原发性支气管肺癌(简称肺癌)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC/WHO)报道，2002年全球肺癌男性发病率为35.5/l0万，发病97万人，死亡率为31.2/l0万，死亡85万人；女性发病率为12.1/10万，发病39万人，死亡率为10.3/10万，死亡33万人。我国卫生部2008年4月公布的《第三次全国居民死亡原因调查》显示，在过去的30年中，我国肺癌发病率增量较大，已取代肝癌成为首位恶性肿瘤死亡原因。
[0003] 近年来，虽然医学技术不断发展，但肺癌患者的5年生存率并未得到明显改善，生存率仅提高到10%-15%。肺癌生存率低的一个重要原因是个体健康意识不足，对自身出现的异常现象不够重视，未及时就医，导致肺癌延迟诊断。因此，加强卫生知识宣传，大力推行个体对自身肺癌危险因素的筛查，对降低肺癌发病率、提高早期诊断率、改善患者预后有极为重要的意义。更为重要的是肺癌起病隐匿，早期常缺乏特异性表现，仅有一般的呼吸道症状，如咳嗽、痰中带血等，极易被忽略；甚至部分患者以非呼吸道症状起病，造成漏诊和误诊。因此，大部分患者就诊时已属于晚期，五年总体生存率低于15%。但肺癌患者的预后与诊断时的临床分期密切相关，0期病人术后5年生存率可达90%以上，一期为60%，二到五期病人则从40%下降至5%以下。因此，早期诊断和早期治疗对改善肺癌患者的预后及降低死亡率有重要意义。
[0004] 目前肺癌的检测主要通过影像学、组织活检及癌胚抗原（CEA）等。然而，影像学易受操作者经验影响，并且依赖于设备，费用昂贵，尤其是在医疗资源有限的情况下，其准确率难以保证，难以广泛和常规应用。组织活检是目前临床上确诊肺癌的金标准，但组织活检存在较大局限性，例如手术取样困难，或者某些癌症部位不便进行穿刺，并且穿刺本身也会带来一定的临床风险，反复穿刺筛查更会给患者带来巨大痛苦。目前应用最广的血清学检测是对癌胚抗原（CEA）的检测，但CEA对早期肺癌的灵敏度和特异性都不高。
[0005] 因此，寻找新的肺癌标志物，尤其是预警监测和早期诊断的标志物对提高早期肺癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肺癌病死率具有非常重要的意义。
发明内容
[0006] 本发明通过对正常样品和肺癌样品进行高通量测序，并对其中各基因上的5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）含量进行分析，出乎意料地发现了多个极具信息的可用于检测肺癌的基因标志物。
[0007] 因此，本发明的第一个方面涉及用于检测肺癌的基因标志物，包括一个或两个以上以下基因：RUNX1转位伴侣基因1（RUNX1T1）、F-Box和富含亮氨酸重复序列的蛋白质7（FBXL7）、RNcA结合基序单链相互作用蛋白3（RBMS3）、钙粘着蛋白11（CDH11）、红细胞膜蛋白谱带4.1样蛋白4A（EPB41L4A）、碱核蛋白2（BNC2）、Tolloid样蛋白1（TLL1）、硫酸酯酶1（SULF1）、整合素亚基α8（ITGA8）和R-脊椎蛋白3（RSPO3）。优选的，所述基因标志物包括RUNX1T1、FBXL7、RBMS3、CDH11、EPB41L4A、BNC2、TLL1、SULF1、ITGA8和RSPO3。
[0008] 本发明还涉及上述基因标志物在检测肺癌中的用途，通过高通量测序检测肺癌基因标志物中5-羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定肺癌是否存在。
[0009] 本发明的第二个方面涉及用于检测肺癌的方法，包括以下步骤：a）测定正常样品和受试者样品中本发明所述的基因标志物的5-hmC的含量；
b）用正常样品中所述基因标志物的5-hmC含量作为参照，将受试者样品中对应的基因标志物的5-hmC含量标准化；
c）对经标准化的所述基因标志物的5-hmC含量进行数学关联，并获得评分；和
d）根据所述评分获得检测结果。
b）用正常样品中所述基因标志物的5-hmC含量作为参照，将受试者样品中对应的基因标志物的5-hmC含量标准化；
c）对经标准化的所述基因标志物的5-hmC含量进行数学关联，并获得评分；和
d）根据所述评分获得检测结果。
[0010] 在一个实施方案中，所述样品是受试者或正常人体液中游离的DNA片段，或来源于细胞器、细胞以及组织中的完整基因组DNA。其中，体液是血液、尿液、汗液、痰液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁、胰腺液等。
[0011] 在一个实施方案中，本发明所述的基因标志物的5-hmC含量可通过本领域技术人员已知的任何方法进行测定，例如包括但不限于，葡糖基化法、限制性内切酶法、化学标记法、与高通量测序方法联用的沉淀法、单分子实时测序法（SMRT）、氧化重亚硫酸盐测序法（OxBS-Seq）等。葡糖基化法的原理是采用T4 噬菌体β-葡萄糖转移酶(β-GT), 在葡萄糖供体底物尿核苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glu)存在下, 将葡萄糖转移至羟基位置, 从而生成β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶(5-ghmC)。同时可采用同位素标记底物进行定量。在葡糖基化法基础上进一步发展出限制性内切酶法和化学标记法。限制性内切酶法的原理是：葡糖基化反应改变了一些限制性内切酶的酶切特性。甲基化依赖的限制性内切酶MspI和HpaII 可识别同样的序列(CCGG), 但它们对甲基化状态的敏感性是不同: MspI 识别并切割 5-甲基胞嘧啶（5-mC）和 5-hmC, 但不能切割5-ghmC; HpaII 只切割完全未修饰的位点, 胞嘧啶上的任何修饰(5-mC、5-hmC、5-ghmC)均阻碍切割。若CpG 位点含有5-hmC, 那么糖基化、酶解之后能检测到条带, 未糖基化对照反应中没有条带; 同时可采用qPCR 进行定量分析。另外, 其他限制性内切酶也同样存在阻碍5-ghmC 酶切的情况, 可应用于5-hmC 检测(如: GmrSD, MspJI, PvuRts1I, TaqI 等)。化学标记法的原理是：将酶反应底物上的葡萄糖进行化学修饰转变成UDP-6-N3-glucose, 将6-N3-glucose 转移到羟甲基位置, 生成N3-5ghmC。随后, 通过点击化学方法在每个5-hmC 上添加一分子生物素, 结合下一代高通量DNA 测序技术或单分子测序技术, 可分析5-hmC在基因组DNA中的分布情况。沉淀法是将5-hmC用特殊方式修饰后再将其特异性地从基因组DNA中捕获下来，并进行测序分析。氧化重亚硫酸盐测序法是首个以单碱基分辨率对5-hmC 进行定量测序的方法. 首先将5-hmC 进行KRuO4 氧化处理, 生成5-甲酰胞嘧啶（5fC）, 然后采用重亚硫酸盐测序。在此过程中,
5-hmC先氧化为5fC, 而后脱氨形成U。通常，同时采用多种检测方法对5-hmC进行定量检测。
5-hmC先氧化为5fC, 而后脱氨形成U。通常，同时采用多种检测方法对5-hmC进行定量检测。
[0012] 在本发明的一个实施方案中，利用化学标记法结合高通量测序来测定本发明的基因标志物的5-hmC含量。在该具体的实施方案中，测定本发明的基因标志物的5-hmC含量的方法包括以下步骤：将来自肺癌患者和正常人的样品的DNA片段化；将所述片段化的DNA末端修复并末端补齐；将末端补齐的DNA与测序接头连接，获得连接产物；通过标记反应对连接产物中的5-羟甲基胞嘧啶进行标记；富集含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段，获得富集产物；对富集产物进行PCR扩增，获得测序文库；对测序文库进行高通量测序，获得测序结果；根据测序结果确定5-羟甲基胞嘧啶在基因上的含量。其中，标记反应包括：i）利用糖基转移酶将带有修饰基团的糖共价连接到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上，和ii) 将直接或间接连有生物素的点击化学底物与带有修饰基团的5-羟甲基胞嘧啶反应。其中，步骤i）和步骤ii）可以按顺序进行，也可以在一个反应中同时进行。这种标记方法减少了测序所需的样本量，且5-羟甲基胞嘧啶上的生物素标签使其在测序中显示出更高的动力学信号，提高了核苷酸识别的准确性。在该实施方案中，所述糖基转移酶包括但不限于： T4噬菌体β-葡糖基转移酶（β-GT)、 T4噬菌体α-葡糖基转移酶（α-GT）及其具有相同或相似活性的衍生物、类似物、或重组酶；所述带有修饰基团的糖包括但不限于：带有叠氮修饰的糖类（例如6-N3-葡萄糖）或带有其他化学修饰（例如羰基、巯基、羟基、羧基、碳-碳双键、碳-碳三键、二硫键、胺基、酰胺基、双烯等）的糖类，其中优选带有叠氮修饰的糖类；所述用于间接连接生物素和点击化学底物的化学基团包括但不限于：羰基、巯基、羟基、羧基、碳-碳双键、碳-碳三键、二硫键、胺基、酰胺基、双烯。在该实施方案中，优选通过固相材料来富集含有5-hmC标记的DNA片段。具体地，可以通过固相亲和反应或其他特异性结合反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料上，然后通过多次洗涤去除未结合的DNA片段。固相材料包括但不限于带有表面修饰的硅片或其他芯片，例如人工高分子小球(优选直径为1nm-100um)、磁性小球(优选直径为1nm-100um)、琼脂糖小球等(优选直径为1nm-100um)。固相富集中所用的洗涤液是本领域技术人员熟知的缓冲液，包括但不限于：含有Tris-HCl、MOPS、HEPES（pH=6.0-10.0， 浓度在1mM到1M之间）、NaCl（0-2M）或表面活性剂如Tween20（0.01%-5%）的缓冲液。在该实施方案中，优选直接在固相上进行PCR扩增从而制备测序文库。如有需要，在固相上进行PCR扩增后，可以回收扩增产物后进行第二轮PCR扩增来制备测序文库。所述第二轮PCR扩增可用本领域技术人员已知的常规方法进行。任选地，在制备测序文库的过程中可进一步包括一个或多个纯化步骤。本领域技术人员知晓的或可商购的任何纯化试剂盒均可用于本发明。纯化方法包括但不限于：凝胶电泳切胶回收、硅胶膜离心柱法、磁珠法、乙醇或异丙醇沉淀法或其组合。任选地，在高通量测序之前，对测序文库进行质量检查。例如，对文库进行片段大小分析并使用qPCR方法对文库的浓度进行绝对定量。通过质量检查的测序文库可用于高通量测序。然后将一定数量（1-96个）含有不同barcode的文库按相同浓度混匀并根据二代测序仪的标准上机方法上机测序，获得测序结果。本领域已知的各种二代测序平台及其相关的试剂可用于本发明。
[0013] 在本发明的一个实施方案中，优选将测序结果与标准人类基因组参考序列进行比对，挑选出其中比对到本发明基因标志物上的序列，即选择比对位点与基因特征（如组蛋白修饰位点、转录因子结合位点、基因外显子内含子区域以及基因启动子等）重合区域的读段数量，以代表5-hmC在该基因上的修饰水平，从而测定5-hmC在该基因标志物上的含量。优选在进行比对前，首先将测序结果清除低质量测序位点，其中衡量测序位点质量的因素包括但不限于：碱基质量、reads质量、GC含量、重复序列和Overrepresented 序列数量等。该步骤中涉及的各种比对软件和分析方法是本领域已知的。
[0014] 在本发明的一个实施方案中，测定基因标志物的5-hmC含量是指测定该基因标志物全长上的5-hmC含量或测定该基因标志物上某一片段的5-hmC含量或其组合。
[0015] 根据本发明，在测定各基因标志物上5-hmC含量之后，用正常样品中所述基因标志物的5-hmC含量作为参照，将受试者样品中对应的基因标志物的5-hmC含量标准化。举例而言，正常样品和受试者样品中同一基因标志物的5-hmC含量分别为X和Y，则受试者样品中该基因标志物的标准化5-hmC含量为Y/X。
[0016] 根据本发明，在数据标准化后，对各基因标志物的标准化5-hmC含量进行数学关联以获得评分，从而根据所述评分获得检测结果。如本文所用，“数学关联”是指将来自生物样品的基因标志物的5-hmC含量与肺癌诊断结果相关联的任何计算方法或机器学习方法。本领域普通技术人员理解，可选择不同的计算方法或工具用于提供本发明的数学关联，例如弹性网络正则化、决策树、广义线性模型、逻辑回归、最高分值对、神经网络、线性和二次判别式分析(LQA 和QDA)、朴素贝叶斯、随机森林和支持向量机。
[0017] 在本发明的一个实施方案中，对各基因标志物的标准化5-hmC含量进行数学关联并获得评分的具体步骤如下：将各基因标志物的标准化5-hmC含量乘以加权系数，获得该基因标志物的预测因子t；将各基因标志物的预测因子t相加，获得总预测因子T；将总预测因子T经过Logistic转换获得评分P；若P>0.5，则该受试者样品患有肺癌；若P≤0.5，则该受试者样品为正常。本文所述的加权系数是指在考虑可能影响5-hmC含量的因素（例如受试者地域、年龄、性别、低于、吸烟史、饮酒史、家族史等）的情况下，通过本领域技术人员已知的各种高级统计分析方法获得的系数。
[0018] 本发明第三个方面还涉及利用上述基因标志物进行肺癌检测的试剂盒，其包括用于测定上述基因标志物的5-hmC含量的试剂和说明书。用于测定基因标志物的5-hmC含量的试剂是本领域技术人员已知的，例如T4 噬菌体β-葡萄糖转移酶和同位素标记（对于葡糖基化法）、限制性内切酶（对于限制性内切酶法）、糖基转移酶和生物素（对于化学标记法）、PCR和测序所用试剂等。
[0019] 与现有技术相比，本发明检测肺癌的方法是基于基因标志物上的5-hmC含量，因此可以使用更为广泛的DNA样品来源。因此，本发明具有以下几个优点：（1）安全无创，即使无症状人群也对该检测接受度高；（2）DNA来源广泛，不存在影像学中的检测盲区；（3）准确性高，对早期肺癌有较高的灵敏度和特异性，适合用于肺癌的早期筛查；（4）操作方便，用户体验好，容易进行肺癌复发和转移的动态监测。本发明的基因标志物可与其他临床指标相结合，为肺癌筛查、诊断、治疗与预后提供更准确的判断。附图说明
[0020] 图1是本发明区分肺癌样品与健康样品对照的曲线图。
具体实施方式
[0021] 下面结合实施例及附图对本发明进行详细说明，以使本领域技术人员更好的理解本发明，并能予以实施。
[0022] 实施例1. 肺癌基因标志物的筛选1）抽提血浆DNA：
从来自20位肺癌患者和20位正常人的样品中分别抽提10 ng血浆DNA，可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于抽提血浆DNA的方法和试剂进行此步骤。
从来自20位肺癌患者和20位正常人的样品中分别抽提10 ng血浆DNA，可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于抽提血浆DNA的方法和试剂进行此步骤。
[0023] 2）将血浆DNA进行末端补齐、悬A并与测序接头连接：根据Kapa Hyper Perp Kit说明书制备含有50uL血浆DNA、7uL End Repair & A-Tailing Buffer和3uL End Repair & A-Tailing Enzyme mix的反应混合液（总体积为60 uL），在20℃温浴30分钟，然后在65℃温浴30分钟。在1.5mL低吸附EP管中配置以下连接反应混合物：5uL Nuclease free water，30uL Ligation Buffer以及10 uL DNA Ligase。向
45uL连接反应混合物中加入5uL 的测序接头，混合，于20℃加热20分钟，然后保持于4℃。使用AmpureXP beads对反应产物进行纯化，用20uL含Tris-HCl（10mM， pH=8.0）及EDTA（0.1mM）的缓冲液进行洗脱获得最终的DNA连接样品。
45uL连接反应混合物中加入5uL 的测序接头，混合，于20℃加热20分钟，然后保持于4℃。使用AmpureXP beads对反应产物进行纯化，用20uL含Tris-HCl（10mM， pH=8.0）及EDTA（0.1mM）的缓冲液进行洗脱获得最终的DNA连接样品。
[0024] 3）标记5-羟甲基胞嘧啶：制备总体积为26 uL的标记反应混合液：叠氮修饰的二磷酸尿苷葡萄糖（即UDP-N3-Glu，终浓度为50uM）、β-GT（终浓度为1uM）、Mg2+（终浓度为25mM）、HEPES（pH=8.0，终浓度为
50mM）和来自上述步骤的20uL DNA。将混合液在37℃温浴1小时。取出混合液，用AmpureXP beads纯化，获得纯化的20uL DNA。
50mM）和来自上述步骤的20uL DNA。将混合液在37℃温浴1小时。取出混合液，用AmpureXP beads纯化，获得纯化的20uL DNA。
[0025] 然后在上述纯化的20uL DNA中加入1uL连接有生物素的二苯基环辛炔（DBCO-Biotin），于37℃反应2小时，接着用AmpureXP beads纯化，获得纯化的标记产物。
[0026] 4）固相富集含有标记的5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段：首先，按以下步骤准备磁珠：取出0.5uL C1 streptadvin beads（life technology）并加入100uL缓冲液（5mM Tris，pH=7.5，1M NaCl，0.02% Tween20），涡旋混合30秒，然后用
100uL洗涤液（5mM Tris，pH=7.5，1M NaCl，0.02% Tween20）洗涤磁珠3次，最后加入25 uL结合缓冲液（10mM Tris，pH=7.5，2M NaCl，0.04% Tween20或其他表面活性剂），并混合均匀。
然后，在磁珠混合液中加入上述步骤获得的纯化的标记产物，并在旋转混合器中混合15min使其充分结合。最后，用100uL洗涤液（5mM Tris，pH=7.5，1M NaCl，0.02% Tween20）洗涤磁珠3次，离心去掉上清液，加入23.75uL不含核酸酶的水。
100uL洗涤液（5mM Tris，pH=7.5，1M NaCl，0.02% Tween20）洗涤磁珠3次，最后加入25 uL结合缓冲液（10mM Tris，pH=7.5，2M NaCl，0.04% Tween20或其他表面活性剂），并混合均匀。
然后，在磁珠混合液中加入上述步骤获得的纯化的标记产物，并在旋转混合器中混合15min使其充分结合。最后，用100uL洗涤液（5mM Tris，pH=7.5，1M NaCl，0.02% Tween20）洗涤磁珠3次，离心去掉上清液，加入23.75uL不含核酸酶的水。
[0027] 5）PCR扩增：向上述步骤的最终体系中加入25uL的2 X PCR master mix和1.25uL PCR引物（总体积为50uL），按照下述PCR反应循环的温度和条件进行扩增：
将扩增产物用AmpureXP beads纯化，得到最终测序文库。
将扩增产物用AmpureXP beads纯化，得到最终测序文库。
[0028] 6）对测序文库进行质检后进行高通量测序：将获得的测序文库通过qPCR进行浓度测定，并用Agilent2100对文库中DNA片段大小含量进行确定。将通过质检的测序文库以相同浓度混合，用Illumina Hiseq 4000进行测序。
[0029] 7）确定各基因标志物的5-hmC含量和加权系数：将获得的测序结果进行初步质控评估，清除低质量测序位点后，将达到测序质量标准的读段利用Bowtie2工具与人类标准基因组参考序列进行比较。然后利用featureCounts和HtSeq-Count工具来统计读段数量以确定各基因标志物的5-hmC含量。同时利用高通量测序结果，将可能影响5-hmC含量的因素作为共变量，通过逻辑回归和弹性网络正则化获得各基因标志物的加权系数。结果如表1所示。
[0030] 表1：本发明的肺癌基因标志物的平均标准化5-hmC含量和加权系数正式符号 平均标准化5-hmC含量 p值(FDR) 加权系数 基因ID 基因名称
RUNX1T1 1.61 7.07E-19 0.04 862 RUNX1转位伴侣基因1
FBXL7 1.70 1.38E-18 0.03 23194 F-Box和富含亮氨酸重复序列的蛋白质7
RBMS3 1.56 1.43E-18 0.04 27303 RNA结合基序单链相互作用蛋白3
CDH11 1.56 1.43E-18 0.06 1009 钙粘着蛋白11
EPB41L4A 1.42 4.83E-18 0.14 64097 红细胞膜蛋白谱带4.1样蛋白4A
BNC2 1.39 3.63E-16 0.11 54796 碱核蛋白2
TLL1 1.53 1.70E-14 0.02 7092 Tolloid样蛋白1
SULF1 1.43 8.08E-13 0.06 23213 硫酸酯酶1
ITGA8 1.38 1.73E-12 0.01 8516 整合素亚基α8
RSPO3 1.40 4.04E-12 0.04 84870 R-脊椎蛋白3
如上所述，平均标准化5-hmC含量是指肺癌样品中该基因标志物的平均5-hmC含量与正常样品中同一基因标志物的平均5-hmC含量之比。从表1可以看出，本发明的肺癌基因标志物的5-hmC含量在正常样品中和肺癌样品中存在显著差异。
RUNX1T1 1.61 7.07E-19 0.04 862 RUNX1转位伴侣基因1
FBXL7 1.70 1.38E-18 0.03 23194 F-Box和富含亮氨酸重复序列的蛋白质7
RBMS3 1.56 1.43E-18 0.04 27303 RNA结合基序单链相互作用蛋白3
CDH11 1.56 1.43E-18 0.06 1009 钙粘着蛋白11
EPB41L4A 1.42 4.83E-18 0.14 64097 红细胞膜蛋白谱带4.1样蛋白4A
BNC2 1.39 3.63E-16 0.11 54796 碱核蛋白2
TLL1 1.53 1.70E-14 0.02 7092 Tolloid样蛋白1
SULF1 1.43 8.08E-13 0.06 23213 硫酸酯酶1
ITGA8 1.38 1.73E-12 0.01 8516 整合素亚基α8
RSPO3 1.40 4.04E-12 0.04 84870 R-脊椎蛋白3
如上所述，平均标准化5-hmC含量是指肺癌样品中该基因标志物的平均5-hmC含量与正常样品中同一基因标志物的平均5-hmC含量之比。从表1可以看出，本发明的肺癌基因标志物的5-hmC含量在正常样品中和肺癌样品中存在显著差异。
[0031] 实施例2. 肺癌基因标志物的有效性本实施例验证本发明的肺癌基因标志物用于检测肺癌的有效性。
[0032] 根据实施例1的方法测定第一批80个样品（40例肺癌和40例健康对照）中本发明所述的10个肺癌基因标志物的5-hmC含量。
[0033] 将各基因标志物的标准化5-hmC含量乘以该标志物在实施例1中对应的加权系数，获得该基因标志物的预测因子t，之后将各基因标志物的预测因子t相加，获得总预测因子T，然后将总预测因子T根据以下公式经过Logistic转换获得评分P：若P>0.5，则该受试者样品患有肺癌；若P≤0.5，则该受试者样品为正常。
[0034] 图1示出了根据本发明的方法区分该批样品的结果。如图1所示，本发明的方法能够达到89%的灵敏度和94%的特异性。
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