一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用
阅读：936发布：2020-05-24
专利汇可以提供一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种调控 植物 避荫反应的可变剪切子及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述可变剪切子来自大豆GmERECTA基因编码的同源蛋白GmERa的可变剪切子GmERa.2，GmERa.2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述GmERa.2核苷酸序列对应的 氨 基酸序列如SEQ ID No.2所示。GmERa.2仅包含胞外结构域中的15个富含亮氨酸重复序列(Leucine‑rich repeat,LRR)，并通过在拟南芥中的遗传转化和生理生化实验，验证过量表达GmERa.2可以改变拟南芥er缺失突变体对荫蔽的敏感性，证明其确实参与了植物的避荫反应。本发明不仅找到了受体激酶新的剪切形式，并且有利于利用该基因序列对基因进行功能缺失突变或沉默，有利于利用受体激酶GmERECTA基因的特性运用 生物 技术手段进行作物品种改良，降低间套作中低位作物对高位作物荫蔽的敏感性。，下面是一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用专利的具体信息内容。
1.一种调控植物避荫反应的可变剪切子，其特征在于，所述可变剪切子来自大豆GmERECTA基因编码的同源蛋白GmERa的可变剪切子GmERa.2，所述GmERa.2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子，其特征在于，所述GmERa.2的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求1所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，所述可变剪切子在调控植物避荫反应中的应用。
4.如权利要求3所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，所述可变剪切子在调控拟南芥避荫反应中的应用。
5.如权利要求4所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，所述可变剪切子在调控拟南芥避荫反应中的应用，包括以下步骤：
1)从大豆中克隆出GmERa.2；
2)将大豆GmERa.2的核苷酸序列构建的表达载体pBASTA-35S-GWR-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中进行过量表达，检测基因转录水平和蛋白水平的表达情况。
6.如权利要求5所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，所述步骤1)的克隆采用Gateway克隆法，包括以下步骤：
A、GmERa.2基因片段通过两轮PCR扩增连上attB序列；
B、连上attB序列的基因经过胶回收进行BP反应，构建到入门载体pDONR/zeo；
C、BP反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂到含有50μg/ml zeocin抗性的LB培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/ml zeocin液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，用试剂盒提取质粒，质粒酶切鉴定后测序；
D、测序正确后，将构建好的入门载体进行LR反应，构建到pBASTA-35S-GWR-GFP表达载体；
E、LR反应产物转化DH5α，涂到含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，
37℃振荡培养，提取质粒，酶切鉴定正确后，得到含有目的基因的质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP；最后将质粒转化农杆菌GV3101，涂到50μg/ml卡那霉素+50μg/ml庆大霉素LB固体培养基上，28℃培养2d，菌落PCR鉴定为阳性克隆后于终浓度为15％的甘油中保存该菌种。
7.如权利要求6所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，步骤A中，所述第一轮PCR扩增时所用引物为：
5’-AAAAAGCAGGCTTCATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和
5’-AGAAAGCTGGGTCCAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’；所述第二轮PCR扩增时所用引物为：
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’和
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’。
8.如权利要求6所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，所述菌落PCR鉴定所采用的引物为5’-ATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和5’-
CAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’。
9.如权利要求6所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，所述步骤E中，酶切鉴定体系为：NEB Buffer 1.1 1μl；BsrGI 0.1μl；重组质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP 8.9μl，于37℃水浴中反应4h。
10.如权利要求5所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，其特征在于，步骤
2)中，将构建好的表达载体pBASTA-35S-GmERa.2-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中采用浸花法，包括以下步骤：
A、农杆菌侵染液的制备：按LB液体的两倍体积配制5％蔗糖溶液，加入Silwet L-77至终浓度为0.3‰；将农杆菌于6500rpm离心5min，收集菌体，并重悬浮于5％蔗糖溶液，OD600为0.8即可；
B、花侵染：待拟南芥抽薹10cm时开始用农杆菌介导的浸花转化，将花蕾在上述含有终浓度为0.3‰Silwet L-77，5％蔗糖溶液的农杆菌液体中浸染20秒，将浸染过的植株置于弱光下12小时后继续正常光照生长，待一周后进行第二次浸染，直到花期结束，待种子成熟时，收获的种子中含有转基因种子，转基因种子种下一周后，叶片喷施1‰草甘膦筛选转基因苗，抗草甘膦的苗即为GmERa.2基因的过量表达植株。
一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用。
背景技术
[0002] 中国西南地区大面积推广的玉米-大豆带状间套作种植模式提高了土地产出率和农业可持续发展，但该模式下高位作物玉米对低位作物大豆会产生荫蔽胁迫。为适应自身生长，大豆等农作物会启动避荫反应以应对荫蔽的变化，虽然该反应对单个植株生长繁殖是有利的，但是对于高密度的作物群体而言，会导致作物群体产量下降。所以如何克服作物避荫反应，降低其对产量的影响，是实现高产的一个重要途径。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于针对上述间套作种植模式存在的问题，提供一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用，将本发明可变剪切子应用于植物避荫反应中，可以降低间套作中低位作物对荫蔽胁迫的敏感性，从而提高间套作低位作物的产量。本发明目的通过以下技术方案来实现：
[0004] 一种调控植物避荫反应的可变剪切子，所述可变剪切子来自大豆GmERECTA基因编码的同源蛋白GmERa的可变剪切子GmERa.2，所述GmERa.2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0005] 进一步，所述GmERa.2的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0006] 一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，所述可变剪切子在调控植物避荫反应中的应用。
[0007] 作为本发明所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，所述可变剪切子在调控拟南芥避荫反应中的应用。
[0008] 作为本发明所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，所述可变剪切子在调控拟南芥避荫反应中的应用，包括以下步骤：
[0009] 1)从大豆中克隆出GmERa.2；
[0010] 2)将大豆GmERa.2的核苷酸序列构建的表达载体pBASTA-35S-GWR-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中进行过量表达，检测基因转录水平和蛋白水平的表达情况。
[0011] 作为本发明所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，所述步骤1)的克隆采用Gateway克隆法，包括以下步骤：
[0012] A、GmERa.2基因片段通过两轮PCR扩增连上attB序列；
[0013] B、连上attB序列的基因经过胶回收进行BP反应，构建到入门载体pDONR/zeo；
[0014] C、BP反应产物转化DH5α，涂到含有50μg/ml zeocin抗性的LB培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/ml zeocin液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，用试剂盒提取质粒，质粒酶切鉴定后测序；
[0015] D、测序正确后，将构建好的入门载体进行LR反应，构建到pBASTA-35S-GWR-GFP表达载体；
[0016] E、LR反应产物转化DH5α，涂到含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养，提取质粒，酶切鉴定正确后，得到含有目的基因的质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP；最后将质粒转化农杆菌GV3101，涂到50μg/ml卡那霉素+50μg/ml庆大霉素LB固体培养基上，28℃培养2d，菌落PCR鉴定为阳性克隆后于终浓度为15％的甘油中保存该菌种。
[0017] 作为本发明所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，步骤A中，所述第一轮PCR扩增时所用引物为：
[0018] 5’-AAAAAGCAGGCTTCATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和
[0019] 5’-AGAAAGCTGGGTCCAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’；所述第二轮PCR扩增时所用引物为：
[0020] 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’和
[0021] 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’。
[0022] 作为本发明所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，所述菌落PCR鉴定所采用的引物为5’-ATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和5’-CAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’。
[0023] 作为本发明所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，所述步骤E中，酶切鉴定体系为：NEB Buffer 1.1 1μl；BsrGI 0.1μl；重组质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP 8.9μl，于37℃水浴中反应4h。
[0024] 作为本发明所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用的一个具体实施例，步骤2)中，将构建好的表达载体pBASTA-35S-GmERa.2-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中采用浸花法，包括以下步骤：
[0025] A、农杆菌侵染液的制备：按LB液体的两倍体积配制5％蔗糖溶液，加入SilwetL-77至终浓度为0.3‰；将农杆菌于6500rpm离心5min，收集菌体，并重悬浮于5％蔗糖溶液，OD600为0.8即可；
[0026] B、花侵染：待拟南芥抽薹10cm时开始用农杆菌介导的浸花转化，将花蕾在上述含有终浓度为0.3‰Silwet L-77，5％蔗糖溶液的农杆菌液体中浸染20秒，将浸染过的植株置于弱光下12小时后继续正常光照生长，待一周后进行第二次浸染，直到花期结束，待种子成熟时，收获的种子中含有转基因种子，转基因种子种下一周后，叶片喷施1‰草甘膦筛选转基因苗，抗草甘膦的苗即为GmERa.2基因的过量表达植株。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0028] 本发明提供一种调控植物避荫反应的可变剪切子，来自大豆GmERECTA的同源蛋白GmERa的可变剪切子GmERa.2。GmERa.2仅包含胞外结构域中的15个富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat,LRR)，与常见受体激酶的可变剪切大不相同，并通过在拟南芥中的遗传转化和表型分析检测过量表达GmERa.2可以恢复拟南芥er-3缺失突变体对荫蔽的敏感性，证明其确实参与了植物的避荫反应。本发明不仅找到了受体激酶新的剪切形式，并且有利于利用受体激酶GmERECTA基因的特性运用生物技术手段进行作物品种改良，降低间套作中低位作物对高位作物荫蔽的敏感性。附图说明
[0029] 图1为GmERa的两种可变剪切子GmERa.1和GmERa.2的蛋白序列与拟南芥的同源蛋白AtER的蛋白序列比对图。
[0030] 图2为实施例1中采用RT-PCR对基因转录水平进行检测的结果。
[0031] 图3为实施例1中采用Western blot对蛋白的表达情况进行检测的结果。
[0032] 图4为在白光和荫蔽生长条件下，Col-0，ER的缺失突变体er-3，ER基因的突变体er-3中过量表达GmERa.2的两个转基因株系(pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#2)的表型。
[0033] 图5为在白光和荫蔽生长条件下，Col-0，ER的缺失突变体er-3，ER基因的突变体er-3中过量表达GmERa.2的两个转基因株系(pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#2)的下胚轴长度统计结果。
具体实施方式
[0034] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0035] 一种调控植物避荫反应的可变剪切子，所述可变剪切子来自大豆GmERECTA基因编码的同源蛋白GmERa的可变剪切子GmERa.2，所述GmERa.2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述GmERa.2的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0036] 本发明所述的大豆为市场上所能购买得到的普通大豆，优选的大豆品种为南春豆29，南豆12，南夏豆25，南黑豆20，天隆一号，威廉82，其都含有本发明所需的可变剪切子GmERa.2。
[0037] 拟南芥中受体激酶ERECTA(AtER)可以调控避荫反应。目前仅发现了拟南芥中ERECTA全长完整基因的功能，在模式植物拟南芥及其它作物中未发现ERECTA及同源基因的可变剪切。可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，通过生物信息学的方法，我们找到大豆中AtER的同源蛋白并命名为GmERa，GmERb，GmERc，GmERd，发现GmERa有两个可变剪切GmERa.1和GmERa.2。
[0038] GmERa的两种可变剪切子GmERa.1和GmERa.2与拟南芥AtERECTA蛋白全长序列比对结果如图1所示。短横线表示某个氨基酸或某段氨基酸序列在其中一个蛋白中没有，而在另外两个蛋白中含有，在没有的蛋白中这些氨基酸用虚线表示。由图1中可以看出，GmERa.2与GmERa.1的其中一段序列能完全吻合，这段序列与AtER对应的序列相似性程度高达92.35％。同时，GmERa.1与拟南芥的AtER的序列和结构组成最为相似，由三部分组成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
[0039] 然而，对于GmERa的另一个剪切子GmERa.2仅包含GmERa.1的胞外结构域的一部分区域，由15个LRR(leucine-rich repeat，富含亮氨酸重复序列)组成。前人已发现很多全长受体激酶在植物的生长发育与环境适应方面发挥着重要的作用。到目前为止还未报道过有关受体激酶的类似剪切方式，更未报道类似的如此短的受体激酶胞外结构域能发挥功能，因此GmERa.2相对要比GmERa.1更有研究价值，并且根据我们的研究结果显示GmERa.2确实调控了拟南芥的避荫反应，其过量表达能弥补因拟南芥同源基因AtER的功能缺失而导致的对荫蔽敏感性的改变。
[0040] 通过在拟南芥中的遗传转化和表型分析实验，验证过量表达GmERa.2可以恢复拟南芥er缺失突变体对荫蔽的敏感性，证明其确实参与了植物的避荫反应。本发明不仅克隆了受体激酶GmERa基因新的剪切形式，并且有配套的引物，因此展开对GmERa.2的基因克隆转化势在必行，将GmERa.2的全长序列重组到含有高活性组成型启动子35S的表达载体上，通过农杆菌介导的方式，实现该基因在拟南芥中的过量表达。在此基础上可以直接运用GmERa.2序列，对拟南芥和大豆等作物中凡是含有GmERa.2同源序列的植物均可对GmERa.2的同源序列进行生物技术改造，由此可以改变植物对荫蔽的敏感性。
[0041] 本发明还提供所述一种调控植物避荫反应的可变剪切子的应用，所述可变剪切子在调控植物避荫反应中的应用。进一步，所述可变剪切子在调控大豆避荫反应中的有应用。将本发明可变剪切子应用于调控植物避荫反应，可以改变密植条件下或间套作中低位作物对高位作物所产生的荫蔽的敏感性。
[0042] 本发明是使用大豆GmERa的可变剪切子在拟南芥中进行跨物种应用，可以改变拟南芥对荫蔽胁迫的敏感性。根据我们的生物信息学分析表明，大豆GmER与拟南芥AtER具有很高的同源性，因此按照基因和蛋白的常规生物学功能特性推理，GmER与AtER具有相似的功能。然而，并未在拟南芥中发现与GmERa.2类似的可变剪切以及相应的调控避荫反应的功能。本发明中大豆GmERa.2既然能在双子叶植物拟南芥的避荫反应中发挥作用，那么由此推导GmERa.2在双子叶植物大豆等植物中也能起到调控避荫反应的作用，特别是大豆本身含有这个可变剪切子，由我们的跨物种实验结果推断，大豆中这个可变剪切子的存在在一定程度上维持了大豆对荫蔽的敏感性，对于单子叶植物是否有效还需要进一步实验验证。虽然在大豆中本身具有GmERa.2基因，然而，未进行人工大量激活或者使其人为失活，仅仅在某种特殊的条件下才能表达发挥作用，仅通过植物对外界环境的改变对该基因的表达进行自身调节。现有的研究结果表明，一个截短的拟南芥ER在番茄中的人为过量表达能增强番茄的抗旱性(Villagarcia et al.,2012)。拟南芥ER在拟南芥中以及其他作物水稻、番茄中进行跨物种过量表达均能增强该作物的耐热性(Shen et al.,2015)，而这些物种中本身含有ER同源基因却并没有表现出如此明显的抗旱性或耐热性。由此推导，可以通过人为激活表达的方式，比如将GmERa.2在大豆中通过35S持续激活型启动子的作用下进行过量表达，将能发挥更好的调控避荫反应的功能。
[0043] 进一步，所述可变剪切子在调控拟南芥避荫反应中的应用。将本发明可变剪切子GmERa.2应用于拟南芥中，通过在拟南芥中的遗传转化和表型分析，验证过量表达GmERa.2可以弥补和改变拟南芥er缺失突变体对荫蔽的敏感性，证明其确实参与了拟南芥的避荫反应调控。根据现有的对ER的跨物种研究结果可以看出，这种作用将在大豆物种本生中起到很好的作用，甚至在其他双子叶植物如番茄中以及甚至在单子叶植物水稻中很可能也能起作用。
[0044] 进一步，所述可变剪切子在调控拟南芥避荫反应中的应用，包括以下步骤：
[0045] 1)从大豆中克隆出GmERa.2。
[0046] 本步骤采用巢氏PCR和Gateway克隆法，包括以下步骤：
[0047] A、GmERa.2基因片段通过两轮PCR扩增连上attB序列。
[0048] 具体地，巢氏PCR即是通过第一轮PCR，使用某基因(如GmERa.2)的特异引物外加一段悬挂序列，这段悬挂序列的设计可与后面的载体序列相匹配为目的(如GmERa.2的特异引物5’-AAAAAGCAGGCTTCATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和5’-AGAAAGCTGGGTCCAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’。
[0049] 其中，未标注下划线的序列为GmERa.2基因两端严格匹配的序列，加下划线的部分为attB序列的一部分，该部分与pDONR/zeo载体相匹配的序列)扩增出目的基因片段。接着以第一轮PCR为模板，在此基础上进行第二轮PCR，在第二轮PCR扩增时，我们继续采用第一轮PCR引物悬挂的方式进行扩增，既可以在第一轮PCR的基础上增加扩增的特异性，又可以在第一轮PCR产物的两端继续增加悬挂序列的长度。使用的引物会与第一轮扩增产物特异性结合，这样可以准确扩增出我们的目的基因，提高反应的特异性。在得到我们的目的基因片段后，通过Gateway方法在重组酶BP酶的作用下将目的基因片段与pDONR载体上特异片段置换，从而使得我们扩增出来的目的基因片段构建到pDONR载体上。本实验中，在GmERa.2扩增时，为了在GmERa.2两端加上attB序列，我们既可以采用一轮PCR的方法，在设计引物时将全长attB1和attB2序列直接加到GmERa.2基因特异引物序列的两端，只需要PCR扩增一次即可将attB1和attB2序列加到GmERa.2基因的两端。另外，也可以用本方法中所采用的巢式PCR的方法进行扩增。本实验选择了巢式PCR的方法进行扩增，是由于attB序列较长，如果用两轮PCR可以将悬挂序列分为两次加到GmERa.2基因的两端，通过两次扩增既可以增加PCR的成功几率，又可以增加扩增的特异性。
[0051] 5’-AAAAAGCAGGCTTCATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和
[0052] 5’-AGAAAGCTGGGTCCAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’。第一轮PCR扩增的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示。
[0053] 其中，未标注下划线的序列为GmERa.2基因两端严格匹配的序列，加下划线的部分为attB序列的一部分，该部分与pDONR/zeo载体相匹配的序列。在遵循引物设计原则的基础上，利用软件设计出扩增引物，所述第二轮PCR扩增时所用引物为：
[0054] 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’和
[0055] 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’。第二轮PCR扩增的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示。
[0056] 应当理解，本步骤中所述的PCR扩增的具体实现及操作过程对于本领域技术人员是公知的，在此不做具体说明，只要是采用本申请公开的引物序列将基因产物扩增连上attB序列的目的即可。
[0057] B、连上attB序列的基因经过胶回收进行BP反应，构建到入门载体pDONR/zeo。
[0058] 具体地，两端通过PCR方法悬挂上attB序列的GmERa.2基因片段用BP酶进行BP反应，构建到入门载体pDONR/zeo。
[0059] 进一步，连上attB1(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC)和attB2(GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC)序列的基因经过胶回收进行BP反应，构建到入门载体pDONR/zeo。BP反应按照Invitrogen公司的BP II enzyme mix(货号11789-020)说明书进行。
[0060] C、BP反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂到含有50μg/ml zeocin抗性的LB培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/mlzeocin液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，用试剂盒提取质粒，质粒酶切鉴定后测序。
[0061] D、测序正确后，将构建好的入门载体进行LR反应，构建到pBASTA-35S-GWR-GFP表达载体。
[0062] E、LR反应产物转化DH5α，涂到含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养，提取质粒，酶切鉴定正确后，得到含有目的基因的质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP；最后将质粒转化农杆菌GV3101，涂到50μg/ml卡那霉素+50μg/ml庆大霉素LB固体培养基上，28℃培养2d，菌落PCR鉴定为阳性克隆后于终浓度为15％的甘油中保存该菌种。
[0063] 进一步，所述菌落PCR鉴定所采用的引物为5’-ATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和5’-CAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’。菌落PCR鉴定上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。
[0064] 进一步，所述酶切鉴定体系为：NEB Buffer 1.1 1μl；BsrGI 0.1μl；重组质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP 8.9μl，于37℃水浴中反应4h。
[0065] 2)将大豆GmERa.2的核苷酸序列构建的表达载体pBASTA-35S-GWR-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中进行过量表达，检测基因转录水平和蛋白水平表达情况。
[0066] 具体地，将构建好的表达载体pBASTA-35S-GmERa.2-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中采用浸花法，包括以下步骤：
[0067] A、农杆菌侵染液的制备：按LB液体的两倍体积配制5％蔗糖溶液，加入SilwetL-77至终浓度为0.3‰；将农杆菌于6500rpm离心5min，收集菌体，并重悬浮于5％蔗糖溶液，OD600为0.8即可。详细操作过程如下：
[0068] 1)将-80℃保存的农杆菌菌种在冰上解冻，取10μl加入到50ml YEP液体培养基(50μl/ml卡那霉素+50μl/ml庆大霉素)，28℃，200rpm震荡培养48h。
[0069] 2)吸取100μl菌液转移到新的含有抗生素的200ml YEP液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养16h，当菌液OD600达到1.5时，将菌液5000rpm离心5min收集菌体；
[0070] 3)菌体沉淀在5％蔗糖溶液中悬浮，加入表面活性剂Silwet L-77至终浓度为0.3‰，混匀，其最终OD600达到0.8即可。
[0071] B、花侵染：待拟南芥抽薹10cm时开始用农杆菌介导的浸花转化，将花蕾在上述含有终浓度为0.3‰Silwet L-77，5％蔗糖溶液的农杆菌液体中浸染20秒，将浸染过的植株置于弱光下半天后继续正常光照生长，待一周后浸染过的花蕾长出果荚、新的花蕾再次长出时进行第二次浸染，直到花期结束，待种子成熟时，收获的种子中含有转基因种子，转基因种子种下一周后，叶片喷施1‰草甘膦筛选转基因苗，抗草甘膦的苗即为GmERa.2基因的过量表达植株。
[0072] 进一步，用RT-PCR、Western blot方法分别检测基因转录水平和蛋白水平的表达情况，以判断转化完成情况及在拟南芥中的表达情况。
[0073] 下面结合具体示例对本发明一种调控植物避荫反应的可变剪切子及其应用进行进一步说明。
[0074] 示例1
[0075] 本示例对可变剪切子GmERa.2在调控拟南芥避荫反应中的应用进行具体说明。具体操作如下：
[0076] 1)从大豆中克隆出GmERa.2。
[0077] 用巢氏PCR和Gateway克隆法，包括以下步骤：
[0078] A、通过两轮PCR扩增目的基因，并通过BR反应将该基因重组上attB序列。
[0079] 具体地，所述第一轮PCR扩增时所用引物为：
[0080] 5’-AAAAAGCAGGCTTCATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和5’-AGAAAGCTGGGTCCAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’。第一轮PCR扩增的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示。
[0081] 所述第二轮PCR扩增时所用引物为：
[0082] 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’和5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’。第二轮PCR扩增的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示。
[0083] B、连上attB序列的基因经过胶回收进行BP反应，构建到入门载体pDONR/zeo。
[0084] 具体地，连上attB1(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC)和attB2(GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC)序列的GmERa.2基因片段经过胶回收进行BP反应，构建到入门载体pDONR/zeo。BP反应按照Invitrogen公司的BP II enzyme mix(货号11789-020)说明书进行。
[0085] C、BP反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂到含有50μg/ml zeocin抗性的LB培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/mlzeocin液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，用试剂盒提取质粒，质粒酶切鉴定后测序。
[0086] D、测序正确后，将构建好的入门载体进行LR反应，构建到pBASTA-35S-GWR-GFP表达载体。
[0087] E、LR反应产物转化DH5α，涂到含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养，提取质粒，酶切鉴定正确后，得到含有目的基因的质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP；最后将质粒转化农杆菌GV3101，涂到50μg/ml卡那霉素+50μg/ml庆大霉素LB固体培养基上，28℃培养2d，菌落PCR鉴定为阳性克隆后于终浓度为15％的甘油中保存该菌种。
[0088] 其中，菌落PCR鉴定所采用的引物为5’-ATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和5’-CAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’。菌落PCR鉴定上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。
[0089] 步骤C和步骤E中的酶切鉴定体系为：NEB Buffer 1.1 1μl；BsrGI 0.1μl；重组质粒pBASTA-35S-GmERa.2-GFP 8.9μl，于37℃水浴中反应4h。
[0090] 2)将大豆GmERa.2的核苷酸序列构建的表达载体pBASTA-35S-GWR-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中进行过量表达，检测基因转录水平和蛋白水平的表达情况。
[0091] 具体地，将构建好的表达载体pBASTA-35S-GmERa.2-GFP转到拟南芥ERECTA突变体er-3中采用浸花法，包括以下步骤：
[0092] A、农杆菌侵染液的制备：按LB液体的两倍体积配制5％蔗糖溶液，加入SilwetL-77至终浓度为0.3‰；将农杆菌于6500rpm离心5min，收集菌体，并重悬浮于5％蔗糖溶液，OD600为0.8即可；
[0093] B、花侵染：待拟南芥抽薹10cm时开始用农杆菌介导的浸花转化，将花蕾在上述含有终浓度为0.3‰Silwet L-77，5％蔗糖溶液的农杆菌液体中浸染20秒，将浸染过的植株置于弱光下半天后继续正常光照生长，待一周后浸染过的花蕾长出果荚、新的花蕾再次长出时进行第二次浸染，直到花期结束，待种子成熟时，收获的种子中含有转基因种子，转基因种子种下一周后，叶片喷施1‰草甘膦筛选转基因苗，抗草甘膦的苗即为GmERa.2基因的过量表达植株。
[0094] 用RT-PCR、Western blot方法分别检测基因转录水平和蛋白水平的表达情况，结果如图2和图3所示，表明可变剪切子GmERa.2转化完成并在拟南芥中表达成功。
[0095] 图2为采用RT-PCR对基因转录水平进行检测的结果。该图表示分别以野生型Col-0,ER基因的突变体er-3为负对照材料，检测了在er-3突变体中过量表达GmERa.2的两个转基因株系(pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#2)中GmERa.2基因的表达情况。结果表明GmERa.2基因在Col-0和er-3中没有表达，而在人为转基因的植株pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#2中有表达。在这4个材料中，以看家基因ACTIN2为对照，检测了ACTIN2在这4个材料中的表达情况，结果显示ACTIN2在这4个材料中的表达量一致，说明在前期对每个材料的总RNA浓度定量及反转录时的操作无误。检测GmERa.2表达所用引物为5’-ATGAAACAGCTGGAAAATCTG-3’和5’-CAAGGATATAATGTTCTGAAGC-3’，检测看家基因ACTIN2所用引物为5’-AGCGCTGAGGCTGATGATATTCAAC-3’和5’-TCTAGAAACATTTTCTGTGAACGATTC-3’。
[0096] 图3为采用Western blot对蛋白的表达情况进行检测的结果。图3中分别以野生型Col-0,ER基因的突变体er-3为负对照材料，检测了在er-3突变体中过量表达GmERa.2的两个转基因株系(pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#2)中GFP蛋白的表达情况，结果表明GFP在未转基因的Col-0和er-3中没有表达，而在人为转基因的植株pBASTA-35S-GmERa.2-GFPin er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#2中表达正常。图中，CBB所示为4个材料的相同上样量的总蛋白电泳后用考马斯亮蓝染色结果，4个材料的考马斯亮蓝染色亮度及条带厚度相似，则说明对总蛋白的定量是准确的，由此表明GFP在Col-0和er-3中没有表达，而在pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#2中表达正常，非人为误差引起，而是准确的实验结果。
[0097] 图4表示在白光(以W表示)和荫蔽(以S表示)生长条件下，Col-0，ER的缺失突变体er-3，ER基因的突变体er-3中过量表达GmERa.2的两个转基因株系(pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#2)的表型。野生型Col-0在白光下，下胚轴伸长受到抑制，而在荫蔽条件下下胚轴伸长明显；在ER缺失突变体er-3中，荫蔽对下胚轴伸长的诱导与Col-0相比受到明显的抑制，表现出对荫蔽相对不敏感的表型；ER基因的突变体er-3中过量表达GmERa.2的两个转基因株系(pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP iner-3#2)又明显地恢复了荫蔽下下胚轴的长度，改变了原来er-3对避荫不敏感这一性状。说明来自大豆的GmERa.2能跨物种在拟南芥中起作用，改变拟南芥对荫蔽的敏感性，调控拟南芥的避荫反应特性。
[0098] 图5表示白光(以White light表示)和荫蔽(以Shade表示)生长条件下，Col-0，ER的缺失突变体er-3，ER基因的突变体er-3中过量表达GmERa.2的两个转基因株系(pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#2)的下胚轴长度统计结果。下胚轴长度统计结果显示GmERa.2的过量表达改变了ER缺失突变体er-3的对荫蔽的敏感性(与图4的表型对应)。野生型Col-0在荫蔽条件下与白光相比其下胚轴伸长明显得到促进；在ER缺失突变体er-3中，荫蔽对下胚轴伸长的诱导与荫蔽下Col-0的下胚轴长度相比受到明显的抑制，表现出对荫蔽相对不敏感的表型；ER基因的突变体er-3中过量表达GmERa.2的两个转基因株系(pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#1和pBASTA-35S-GmERa.2-GFP in er-3#2)又明显地恢复了荫蔽下下胚轴的长度，改变了原来er-3对避荫不敏感这一性状。说明来自大豆的GmERa.2能跨物种在拟南芥中起作用，改变拟南芥对荫蔽的敏感性，调控拟南芥的避荫反应特性。图中使用T检验法分析了4个材料之间荫蔽条件下下胚轴长度之间的显著性，***，P<0.0001。
[0099] 从图4和图5形态学指标及统计结果显示过量表达GmERa.2能很好地恢复er-3缺失突变体对荫蔽的敏感性。与Col-0相比，er缺失突变体(er-3)在荫蔽条件下下胚轴长度较低，对荫蔽不敏感，而GmERa.2在er-3中的过量表达使er-3对避荫的敏感性发生了改变，恢复到了类似Col-0的表型，说明GmERa.2参与到了拟南芥的避荫反应中。
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