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杨树皮类脂超临界萃取方法和应用

阅读:1009发布:2020-07-20

专利汇可以提供杨树皮类脂超临界萃取方法和应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种杨树皮类脂超临界萃取方法和应用,属于杨树皮类脂超临界萃取技术领域,本发明将杨树皮净选,淘洗,阴干,切 块 ,烘干,粉粹,得到杨树皮粉末;接着将杨树皮粉末放置于超临界萃取装置的萃取釜中, 选定 萃取时间、CO2流量、萃取 温度 、萃取压 力 、分离I温度、分离I压力、分离II温度、分离II压力、利用超临界萃取法进行萃取;得到含有维生素E,磷脂,不饱和 脂肪酸 等活性成分的杨树皮类脂,具有免疫增强作用、 预防 和 治疗 肿瘤 、治疗 炎症 等广泛的 生物 活性。,下面是杨树皮类脂超临界萃取方法和应用专利的具体信息内容。

1.一种杨树皮类脂超临界萃取方法,其特征在于:包括以下步骤,
步骤1、将杨树皮依次净选、淘洗、阴干、切、烘干、粉粹,得到杨树皮粉末;
步骤2、将步骤1得到的杨树皮粉末放置于超临界萃取装置的萃取釜中,选定萃取时间、CO2流量、萃取温度、萃取压、两次压力分离、利用超临界萃取法进行萃取;
步骤3、将步骤2得到的产物,进行检测干物质含量≥90%,维生素E含量为≥1600mg/kg,磷脂含量≥1.2%,皂化值≥120mg/g,并且经GC-MS检测不饱和脂肪酸亚油酸的含量≥45%,亚麻酸含量≥5%时,即得到杨树皮类脂。
2.根据权利要求1所述的一种杨树皮类脂超临界萃取方法,其特征在于:所述步骤1中阴干至树皮表面没有分,切块切成50-60mm粒度,烘干温度为80℃、时间为5-6小时,烘干至水分为12-15%,粉碎至4-5mm的粉末。
3.根据权利要求1所述的一种杨树皮类脂超临界萃取方法,其特征在于:所述步骤2中的萃取时间优选为120min;CO2流量优选为20~25kg/h;萃取温度为40~50℃;萃取压力优选为25~30MPa。
4.根据权利要求1所述的一种杨树皮类脂超临界萃取方法,其特征在于:所述步骤2中的第一次分离温度为35~45℃,第一次分离压力为7~9MPa,第二次分离温度为30~35℃,第二次分离压力为5MPa。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的超临界萃取的杨树皮类脂应用于增强免疫力。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的超临界萃取的杨树皮类脂应用于预防治疗前列腺癌、结肠癌等肿瘤
7.根据权利要求1-4中任一项所述的超临界萃取的杨树皮类脂应用于治疗抑制炎性细胞因子。

说明书全文

杨树皮类脂超临界萃取方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种杨树皮类脂超临界萃取方法和应用,其属于杨树皮类脂超临界萃取技术领域。

背景技术

[0002] 目前,林业剩余物包括森林采伐剩余物、木材加工剩余物及育林剪枝剩余物,统称林业“三剩物”。我国林业废弃物来源主要为:年采伐剩余物(含年采伐造材剩余物、年木材加工剩余物);中幼龄林抚育剩余物;薪炭林采薪;灌木林平茬复壮采薪;经济林抚育剩余物;园林绿化剩余物等,所产生的废弃物数量惊人,据不完全统计,仅加工木材所导致的树皮一项废弃物年高达近百万吨。这些树皮全部被就近烧掉,在资源大量浪费的同时,所造成的大气污染触目惊心。
[0003] 废弃物中的可利用部分目前主要用于造纸和新制木质,所占比例仅为30%左右,大量的废弃物则用于取暖和做饭被直接烧掉或者遗弃。用于造纸和新制木质,则存在二次污染如、废气、废渣;烧掉废弃物也面临资源利用率低和严重的环境大气污染问题。遗弃部分则极易引发山火,造成的损失更是无可估量,因此,如何彻底解决林木废弃物,使之变废为宝,成为制约发展绿色循环经济的主要障碍之一。
[0004] 杨树皮类脂(Poplar Bark Lipid,PBL)是从杨树皮中提取的一种纯天然物质,具有高度的生物学活性,富含大量的磷脂、不饱和甾醇、固醇、糖脂、维生素E、胡萝卜素以及大量的具有维生素PP功能的不饱和脂肪酸。前期研究表明,小剂量的类脂乳化液对巨噬细胞的吞噬功能具有显著的促进作用,在对腹腔吞噬细胞吞噬红细胞功能的影响实验中发现经类脂注射的小白鼠,其吞噬细胞功能有显著的增强作用。在对SPF鸡的免疫效果的研究中发现,注射一定量的PBL乳化液,可以使鸡的免疫器官法氏囊、脾脏、胸腺等具有显著的增重效果,组织切片表明,在应激条件下的类脂实验组与对照组相比,其免疫器官的发育更完善,更接近于正常健康动物免疫器官的形态。
[0005] 杨树皮类脂作为一种广谱的生物学活性天然物质,目前人们对其活性的报道多集中在免疫增强作用,对其他方面的研究报道较少。因此,对杨树皮类脂其他生物活性进行研究,可为其广泛用于医药、日化产品、保健品等领域提供技术支持。
[0006] 此外,超临界萃取技术(super critical fluid extraction,SFE)是现代分离天然物质中出现的最新技术,是国际上最先进的一种分离工艺。超临界 CO2 流体萃取技术采用无机溶剂提取,具有工艺简单,无溶剂残留,操作条件温和等优点。在油脂生产上,它能够克服溶剂提取法分离过程中存在溶剂残留,蒸馏加热导致油脂化酸败等缺点,也能够克服压榨法工艺复杂、产率低等缺点。因此研究超临界杨树皮类脂超临界 CO2 流体萃取技术,并对产品进行成分分析,将具有广阔的开发前景。

发明内容

[0007] 本发明针对上述现有技术中存在的不足,提供一种杨树皮类脂超临界萃取方法和应用。本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
一种杨树皮类脂超临界萃取方法,包括以下步骤,
步骤1、将杨树皮依次净选、淘洗、阴干、切、烘干、粉粹,得到杨树皮粉末;
步骤2、将步骤1得到的杨树皮粉末放置于超临界萃取装置的萃取釜中,选定萃取时间、CO2流量、萃取温度、萃取压、两次压力分离、利用超临界萃取法进行萃取;
步骤3、将步骤2得到的产物,进行检测干物质含量≥90%,维生素E含量为≥1600mg/kg,磷脂含量≥1.2%,皂化值≥120mg/g,并且经GC-MS检测不饱和脂肪酸亚油酸的含量≥45%,亚麻酸含量≥5%时,即得到杨树皮类脂。
[0008] 进一步,所述步骤1中阴干至树皮表面没有水分,切块切成50-60mm粒度,烘干温度为80℃、时间为5-6小时,烘干至水分为12-15%,粉碎至4-5mm的粉末。
[0009] 进一步,所述步骤2中的萃取时间优选为120min;CO2流量优选为20~25kg/h;萃取温度为40~50℃;萃取压力优选为25~30MPa。
[0010] 进一步,所述步骤2中的第一次分离温度为35~45℃,第一次分离压力为7~9MPa,第二次分离温度为30~35℃,第二次分离压力为5MPa。
[0011] 根据上述方法超临界萃取的杨树皮类脂应用于增强免疫力。
[0012] 根据上述方法超临界萃取的杨树皮类脂应用于预防治疗前列腺癌、结肠癌等肿瘤
[0013] 根据上述方法超临界萃取的杨树皮类脂应用于抑制炎性细胞因子。
[0014] 本发明的有益效果是:杨树皮类脂除了具有很好的免疫增强作用外,还具有较好的抗炎、抗肿瘤作用。本发明所述的杨树皮类脂的超临界萃取方法简单,无溶剂残留、成本较低,将杨树皮类脂用于医药、日化产品、保健品等领域,高效低毒,符合药物发展的要求。附图说明
[0015] 图1 实施例1制备的杨树皮类脂对小鼠脾脏指数的影响。PBS:对照组。PBL:杨树皮类脂五种剂量(0.12、0.25、0.50、1.00和2.00mg)的治疗组。APS:黄芪多糖治疗组(2.00mg)。*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001。
[0016] 图2 PBL对小鼠外周血细胞中CD4+T淋巴细胞增殖能力的影响。*,P<0.05。
[0017] 图3 PBL对小鼠外周血细胞中CD8+T淋巴细胞增殖能力的影响。*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001。
[0018] 图4 PBL对小鼠外周血细胞中CD4+/CD8+比值的影响。*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001。
[0019] 图5 PBL对小鼠外周血细胞中B细胞增殖能力的影响。*,P<0.05。
[0020] 图6实施例1制备的杨树皮类脂对LPS刺激RAW264.7细胞分泌炎症因子IL-6的影响。*,P<0.05;***,P<0.001。
[0021] 图7 实施例1制备的杨树皮类脂对LPS刺激RAW264.7细胞分泌炎症因子TNF-α的影响。**,P<0.01;***,P<0.001。
[0022] 图8实施例1制备的杨树皮类脂对LPS刺激RAW264.7细胞分泌抑炎因子IL-4的影响。*,P<0.05;**,P<0.01。
[0023] 图9实施例1制备的杨树皮类脂对人前列腺癌细胞(LNCaP)增殖的抑制作用活性图。**,P<0.01。
[0024] 图10实施例1制备的杨树皮类脂对人结肠癌细胞(HT-29)增殖的抑制作用活性图。**,P<0.01。

具体实施方式

[0025] 以下对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
[0026] 一种杨树皮类脂超临界萃取方法,包括以下步骤,步骤1、将杨树皮依次净选、淘洗、阴干、切块、烘干、粉粹,得到杨树皮粉末;
步骤2、将步骤1得到的杨树皮粉末放置于超临界萃取装置的萃取釜中,选定萃取时间、CO2流量、萃取温度、萃取压力、两次压力分离、利用超临界萃取法进行萃取;
步骤3、将步骤2得到的产物,进行检测干物质含量≥90%,维生素E含量为≥1600mg/kg,磷脂含量≥1.2%,皂化值≥120mg/g,并且经GC-MS检测不饱和脂肪酸亚油酸的含量≥45%,亚麻酸含量≥5%时,即得到杨树皮类脂。
[0027] 所述步骤1中阴干至树皮表面没有水分,切块切成50-60mm粒度,烘干温度为80℃、时间为5-6小时,烘干至水分为12-15%,粉碎至4-5mm的粉末。
[0028] 所述步骤2中的萃取时间优选为120min;CO2流量优选为20~25kg/h;萃取温度为40~50℃;萃取压力优选为25~30MPa。
[0029] 所述步骤2中的第一次分离温度为35~45℃,第一次分离压力为7~9MPa,第二次分离温度为30~35℃,第二次分离压力为5MPa。
[0030] 根据上述方法超临界萃取的杨树皮类脂应用于增强免疫力。
[0031] 根据上述方法超临界萃取的杨树皮类脂应用于预防和治疗前列腺癌、结肠癌等肿瘤。
[0032] 根据上述方法超临界萃取的杨树皮类脂应用于抑制炎性细胞因子。
[0033] 实施例1(1)杨树皮类脂的制备
A、原料的选择:选择的应是新鲜的杨树皮,不得混有其他树种的树皮和杂志,允许用小叶杨(Populus simonii Carr)、毛白杨(P.tomentosa Carr)树皮进行单独或混合,不允许用晒干或已霉烂的杨树皮。
[0034] B、预处理:将杨树皮置挑选台上除去杂质和灰屑,投入到洗药机中,反复清洗至药材无泥沙、土,出水管水质澄清,方可取出原料。将淘洗好的杨树皮置于阴凉洁净处阴干至树皮表面没有水分。利用切药机将杨树皮切成小块,粒度以50-60mm为宜。然后将切制好的杨树皮置于不锈托盘内,平铺,送入烘箱内烘干,设置烘箱温度为80℃,干燥时间为5-6小时,水分为12-15%。利用粉碎机将干燥后的杨树皮小块粉碎至4-5mm的粉末。
[0035] C、将经过预处理的杨树皮(200g)放置于超临界萃取的萃取釜内,萃取釜、分离罐 I 和分离罐 II 进行水浴加热,温度设定为45℃,打开 CO2储罐,流量为25kg/h,打开高压调频柱塞进行加压,压力达到萃取压力 30MPa 时,开启阀门对杨树皮中的类脂进行萃取,CO2分别经分离罐 I 和 II 减压将油脂解析后循环使用。其他工作参数设定为:分离罐 I 压力 9MPa,温度 40℃;分离罐 II 压力5MPa,温度 30℃;萃取时间为 120min。萃取完成后,用烧杯收集分离罐 I和分离罐 II 中的萃取物。
[0036] (2)对步骤(1)得到的杨树皮类脂进行分析A、杨树皮类脂的回收率计算:类脂回收率(%)=类脂质量/放入萃取釜内杨树皮质量×
100%。通过计算得杨树皮类脂的回收率为8.94%。
[0037] B、参照LY/T 1637-2005《中华人民共和国林业行业标准-杨树皮类脂》提供方法的方法进行检测,得到杨树皮类脂的干物质含量为97.42%,维生素E含量为1635mg/kg,磷脂含量1.4%,酸值为23.3mg/g,皂化值为123.7mg/g,得到的类脂为特极品。
[0038] 表1 GC-MS检测出PBL的前10种化合物化合物 含量(%)
亚油酸 65.8
亚麻酸 11.1
正十六酸 7.12
油酸 2.34
1-庚烷醇 1.87
鲨烯 1.26
棕榈酸 0.95
十七酸 0.88
花生酸 0.51
硬脂酸 0.42
其他 7.75
C、使用气相色谱-质谱(GC-MS)对纯化部分进行表征。取制得的类脂0.3ml,先加入无水乙醇(分析纯)定容到100ml声波震动10min后,取样品供气相-质谱联用仪检测。分析条件:毛细管色谱柱(0.25 mm×30 m×0.25 µm),载气为高纯度的氦气(99.999%),流速 2.0 mL/min,进口样温度 260℃,进样量 3μL,分流比为50:1。起始柱温80 ℃,保留 3 min,再以
5 ℃/min 升至120 ℃,保留10min; 再以 5℃/min 升至 150 ℃,保留 2 min;再以 10 ℃/min 升至220 ℃,保留 2 min;再以 10℃/min 升至 250℃,保留 23 min,总分析时间为64 min。采用 EI 电离方式,电子能量70 ev,离子源温度 210℃,质量扫描范围 m/z 40~
550,质谱检测时间1.6 64min,GC-MS 接口温度为 260℃。检测结果如表1所示,表1列出了~
结果含量前10的化合物。
[0039] 实施例2 得到的杨树皮类脂的免疫增强作用检测
(1)动物及给药:实验动物为5周龄的雌性BALB/C小鼠(18-22g),购自济南鹏悦实验动物繁育有限公司,每只小鼠均按照国家卫生研究院实验动物护理和使用指南进行处理。动物在标准实验室条件下繁殖和维持:温度(25±2°C)和光周期为12 h,自由饮食和饮水。将动物随机分为7组,每组由6只动物组成,分别为杨树皮类脂组、阳性对照组、空白对照组。杨树皮类脂(PBL)组分别按照0.12mg/天、0.25mg/天、0.50mg/天、1.00mg/天、2.00mg/天给予不同浓度的杨树皮类脂,阳性对照给予黄芪多糖(APS) 2.00mg/天,空白对照组给予等量的PBS。灌胃每天1次,连续28天。
[0040] (2)脾脏指数:最后一次给药24小时后,对动物称重后脱臼处死。收集脾脏和胸腺并立即称重,计算脾脏指数。结果如图1所示,各组脾脏指数均有提高(2.00mg组除外),其中0.50、1.00mg PBL组及APS组小鼠具有显著性差异。脾脏是重要的免疫器官,在非特异性免疫中起着重要作用,因此脾脏指数能很好地反映免疫功能,我们结果表明杨树皮类脂对脾脏有一定的影响。
[0041] (3)外周血淋巴细胞分析:取脾脏组织于400目筛网上研磨并用PBS冲洗完全,将冲洗液500G离心6min,去上清后将细胞破红处理。得到的细胞用大鼠血清上封闭30min后用FITC-CD3、PerCP/Cy5.5-CD8a、PE-CD4(10μg/ml)染色, 4℃下避光反应30分钟,然后用PBS洗涤细胞两次,再悬浮于1%多聚甲(PFA)中,用流式细胞仪测定CD3、CD4和CD8T淋巴细胞的计数以T淋巴细胞总数的百分比表示。实验结果如图2至图5所示,与对照组相比,各PBL组小鼠血液中CD3+CD4+的含量和CD4+/CD8+的比值均有不同程度的提高,1.00mg组最为显著。+ +
除了0.12和0.25mg组,其他各组 CD3CD8的含量降低,1.00mg PBL组效果最为显著。结果表明,PBL是可以通过促进淋巴细胞的增殖分化,增强细胞免疫来正向调节机体免疫反应。
[0042] 实施例3 用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测PBL对LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子和抑炎因子的影响。
[0043] 试验分为对照组(Con)、LPS组(LPS)、实验组(不同剂量的PBL:0.25、0.5、2和1 mg/ml),每组进行3个重复。将密度为 2 × 105个/ml 的RAW264.7 细胞悬液加入24孔板内,每孔0.5 ml,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。接种24小时后,实验组加入PBL使其终浓度为0.25、0.5、1和2 mg/ml,Con组和LPS组加入等体积DMEM培养基,在37℃、5% CO2培养箱中培养。作用24h后加入LPS组及实验组加入LPS(终浓度为1mg/ml),处理6小时后收集细胞上清。
用ELISA法对细胞上清中IL-4、TNF-α和IL-6的含量进行检测。
[0044] 结果如图3所示,随着PBL浓度的升高,上清中IL-6(图6)和TNF-α(图7)的含量明显降低,且PBL浓度为2mg/kg时效果最为显著(***P<0.001),IL-4(图8)的含量随着PBL浓度的升高而升高,且均具有显著性差异(*P < 0.05)。当机体内部促炎和抗炎系统之间的平衡被打破会出现炎症反应,在正常情况下,TNF-α和 IL-6 等促炎因子与 IL-4 等抗炎因子之间保持着动态的平衡,而当机体受到病理性刺激时该平衡被打破,导致促炎症因子持续高表达,造成细胞和组织不可逆损伤和坏死。因此,及时有效地恢复促炎因子和抗炎因子间的平衡成为了抗炎治疗的一种重要手段。实验结果 PBL能剂量依赖性地抑制RAW264.7 细胞分泌 TNF-α和 IL-6,促进 IL-4 的分泌。因此,PBL具有较好的抗炎作用,主要与其抑制炎性细胞因子的表达密切相关。
[0045] 实施例4采用MTT法检测杨树皮类脂对人前列腺癌细胞(LNCaP)和人结肠癌细胞(HT-29)增殖的抑制作用。
[0046] (1)分别将LNCaP细胞和HT-29细胞培养用DMEM培养液(含10%胎血清)培养至对数生长期,密度为80% 90%。(2)胰蛋白酶消化离心后重悬细胞,调整细胞密度为5×104 个/~ml,每孔100 μl接种于96孔板上,37°C、5%CO2培养24h。(3)细胞孵育24h后实验组加入待测样品,使其终浓度分别为5、10、20、40和80 μg/ml,对照组加入相同体积比的DMSO溶液作为对照,37°C、5%CO2继续培养48h。(4)培养48h后,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),37°C孵育4h。(5)离心弃上清液,每孔加入100μl DMSO溶液,振荡15 min,酶标仪测定OD570并计算细胞增殖抑制率,同时作图并计算半数抑制浓度(IC50)。细胞增殖抑制率=[1-(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组]×100%
结果如图9至图10所示,随着杨树皮类脂浓度的升高,癌细胞LNCaP和HT-29的存活率均呈现明显下降的趋势。在不同浓度(5、10、20、40和80 μg/ml)的含羟基酸提取物作用下,LNCaP细胞的增殖抑制率分别为:8.57%、12.77%、39.56%、57.23%、79.05%、88.8%,计算得该提取物对LNCaP的IC50为18.01 μg/ml;与对照相比,在浓度≥10 μg/ml时,处理组与对照组有显著性差异(**P<0.01)。HT-29细胞的增殖抑制率分别为:12.9%、39.22%、58.01%、
74.98%、92.93%,计算得该提取物对HT-29的IC50为16.37 μg/ml。与对照相比,在浓度≥10 μg/ml时,处理组与对照组有显著性差异(**P<0.01)。
[0047] 以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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