技术领域
[0001] 本
发明涉及烟用添加剂领域，具体涉及一种晒黄烟提取物的吸附 发酵制备方法和应用。
背景技术
[0002] 烟用添加剂为改善
烟草理化性能的助剂，包括香料香精、保润剂、 助燃剂、防霉剂和吸附剂。低焦油
卷烟的生产更需要加香加料以弥补 烟香的不足。烟制品加香加料的目的在于掩盖天然烟草的刺激性和杂 气等，并提高或改善其
香味。天然香料因其天然性、安全性和自然复 合的香气，更迎合消费者对健康的需求，但仍然具有提取效率较低、
溶剂残留多、杂质含量高、纯度较低、纯化步骤复杂成本高，有些因 特征香气显著，会导致有外加香气掩盖烟香、引入烟草以外化学物质 等
缺陷。
[0003]
生物产香技术是利用微
生物工程、酶工程、细胞培养、基因改造 等生物技术，通过
微生物代谢出特定香气成分，从而提升产品
质量的 一
门新技术。在生物产香技术制备天然香料的过程中，多采用悬浮微 生物发酵，这种方式同样存在天然浸膏和提取物类香料产品得率低下、 产品质量不稳定、纯化步骤复杂、成本高等缺陷，严重阻碍了生物产 香天然香料的应用推广。
[0004] 晒黄烟，在外形、化学成分、烟气和吃味均与烤烟相似。晒黄烟 色泽鲜明，品质好的晒黄烟油分充足、弹性好。晒黄烟中含有5～18％ 的糖分，包括
葡萄糖、果糖、半乳糖等，总氮含量在1.5～3.64％，烟
碱含量在1.29～5.45％，
蛋白质含量在7.83～16.84％之间。晒黄烟叶可 用作烟用香料的原料，其提取物可以增加卷烟香气
风味，是一种具有 烟草本香物质的天然香料。常规、普通的烟草提取物制备方法，通常 使提取香味物质的同时，带有对卷烟吸味不利的蛋白质、鞣质、
淀粉、 果胶、
纤维素、木质素及其他大分子物质，增香的同时也具有增加刺 激性、杂气和残留感的缺陷。
[0005] 目前有
专利“一种晒黄烟分子蒸馏物的制备方法”(
申请号 201810184517.9)，将晒黄烟
乙醇溶剂提取后，陶瓷
膜过滤浓缩后分 子蒸馏纯化，在卷烟中应用；专利“一种用于新型烟草的晒黄烟提取 物的制备方法”(专利号ZL201610988163.4)将晒黄烟
水提液与复合
氨基酸反应的美拉德反应液，进行精馏，应用于新型烟草；专利“一 种晾晒烟提取物及精油的制备方法”(申请号201110366722.5)利用 二
氧化
碳超临界流体萃取晾晒烟中的脂类与蜡质化合物等致香成分， 在卷烟中加香应用；但是通过晒黄烟烟杆和甜菜根等生物吸附材料来 固定活性菌株，温育
水解发酵晒黄烟叶，结合连续逆流超声提取技术， 得到晒黄烟吸附发酵提取物，并在传统和新型加热不燃烧卷烟中应用， 尚未见相关报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种晒黄烟提取物的吸附发酵制备方法和 应用，采用晒黄烟烟杆和甜菜根固定化吸附微生物菌株，对晒黄烟粗 粉进行温育水解发酵，再结合连续逆流超声提取，制备晒黄烟叶吸附 发酵提取物，该提取物具有天然烟草浓郁本香，带有水果酯香、奶香、
烘烤香气，香料品质提高，纯化分离步骤简单，工艺条件温和，提取 率和生产效率提高；在传统卷烟、新型加热不燃烧卷烟中加料加香应 用，具有天然烟草本香，卷烟香气浓郁醇厚、浓度增加、满足感提高， 带有奶香、水果酸香、烘烤香气和喉部回甜感，刺激性降低，口感改 善。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现：
[0008] 一种晒黄烟提取物的吸附发酵制备方法，包括如下步骤：
[0009] (1)原料前处理：晒黄烟烟叶经
粉碎机粉碎至40目～120目粉末；
[0010] (2)微生物菌株的活化：将扣囊复膜孢
酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)的活 性固体冻干菌粉，加入到5～10倍质量的灭菌处理的质量浓度为 5～30％葡萄糖溶液中，置于35～55℃水浴锅活化30～60min，得到 微生物菌株活化液，其中所述的食甲醇芽孢杆菌Bacilus methylotrophicus(VJ4-1)保藏号为CCTCC NO：2012004，分类命名 为食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)，于2012年1 月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；
[0011] (3)固定化载体制备：将晒黄烟的烟杆、甜菜根洗净烘干，处理 成碎
块，高压灭菌后烘干；
[0012] (4)微生物菌株的固定化处理：称取上述步骤(3)灭菌烘干后的 固定化载体碎块装入容器，按照碎块与活化液质量比为1:1～10加入 已培养活化好的微生物菌株活化液，放置于4+0.5℃冷藏柜固定12～36 h，过滤得到固定化微生物菌株的碎块；
[0013] (5)晒黄烟的吸附固定化发酵：将步骤(1)所得晒黄烟烟叶粉末 与5～15倍质量的水混合均匀，加入步骤(4)所述固定化微生物菌株 的载体碎块，载体碎块与晒黄烟烟叶粉末质量比为1:0.5～2，在
温度 为35～55℃，匀速搅拌，添加乳酸调节pH值为4.0～6.0，发酵1～6d， 筛网过滤去除载体碎块，微孔过滤晒黄烟粉残渣，保留晒黄烟发酵液 A；
[0014] (6)连续逆流超声提取：将步骤(5)所得晒黄烟粉残渣，按速率 0.1～1.0kg/10min投料至
浸出舱，开启主机和
超声波发生器，调节温 度65～100℃，料液比为质量比1:2～6，从浸出舱低端运行0.2～1h后 调节出液
阀门均匀放液，控制溶剂加入流量，保持浸出仓液位平衡， 连续逆流超声提取达30～60min时，投料加入一定比例的
醋酸铜、复 合氨基酸，当连续逆流超声提取共达90～150min时，停止生产工艺，
排渣，得到浸出液B；
[0015] (7)将步骤(5)的发酵液A和步骤(6)的浸出液B合并，得 到晒黄烟吸附发酵提取液。
[0016] 进一步的，还包括步骤(8)：将所述晒黄烟吸附发酵提取液经真 空
冷冻干燥得到晒黄烟吸附发酵提取物。
[0017] 进一步的，所述步骤(2)中的活性固体冻干菌粉为食品级，活性 为10～30u/mg。
[0018] 进一步的，所述步骤(3)中的碎块为用
剪刀剪成约1cm长的小 块，晒黄烟的烟杆和甜菜根的质量比为1:0.5～2。
[0019] 进一步的，所述步骤(5)中乳酸为食品级，匀速搅拌的转速为 20～80rpm。
[0020] 进一步的，所述步骤(6)中使用的醋酸铜为分析纯，占晒黄烟粉 质量0.1～1％，所述复合氨基酸为脯氨酸、缬氨酸、组氨酸的混合， 均为食品级，占晒黄烟粉质量的0.5～1.5％，三者之间的质量比为 1:0.5～2:0.5～2。
[0021] 本发明还提供一种上述方法制备的晒黄烟吸附发酵提取液在传 统卷烟配方烟丝加料中的应用，将与烟丝0.01～0.08％质量比的晒黄烟 吸附发酵提取液和糖分、水混匀，喷洒到制丝加料罐中，按正常卷烟 工艺加工成配方烟丝，具有协调卷烟香气，劲头和浓度增加，带有水 果酸香、奶香和烘烤香气，喉部有回甜感。
[0022] 本发明还提供一种上述方法制备的晒黄烟吸附发酵提取物在新 型加热不燃烧卷烟烟丝中加香的应用，将该晒黄烟提取物溶解到70％ 乙醇溶液中，稀释1000倍，按与烟丝0.01～0.1％的质量比加香，卷烟 香气浓郁醇厚、浓度增加，带有奶甜清香气、水果清香和烘烤香气， 提高满足感。
[0023] 本发明还提供一种上述方法制备的晒黄烟吸附发酵提取液在新 型加热不燃烧卷烟
再造烟叶中的应用，将该提取液按0.01～0.5％再造 烟叶原料的质量比，添加到加热不燃烧卷烟再造烟叶涂布液中应用， 增加新型卷烟的烟香和提高满足感，香气丰富，带有烟香、奶香、水 果酸香和烘烤香气，喉部回甜感，刺激性降低，口感改善。
[0024] 本发明提供的吸附发酵制备的晒黄烟提取物，采用晒黄烟的烟杆、 甜菜根碎块作为微生物菌株吸附固定化生物载体，前者是烟草本源物 质，后者富含
纤维素和糖类物质，牢牢吸附微生物菌株，易与发酵物 液过滤分离；晒黄烟叶粉末溶解在水中，与吸附在晒黄烟的烟杆、甜 菜根碎块上的微生物菌株的酶体系进行酸性条件下的温育水解发酵， 扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)具有产淀粉酶、β-葡 萄糖苷酶、酸性蛋白酶等特性，能够高效降解纤维素、淀粉、纤维二 糖、
蔗糖等细胞壁大分子物质转化为葡萄糖并进一步转化为酯香为主 的香味物质、将非挥发性糖苷转
化成挥发性的香气物质，产香产酯除 杂味，破坏细胞壁更多地释放细胞中的活性化学物质，提高产率和增 加香气自然复杂性；食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1) 具有产β-半乳糖苷酶活性转化非挥发性糖苷为挥发性香气物质、转 化细胞壁和游离阿魏酸合成天然香兰素的能
力，能分解利用葡萄糖、 蔗糖、鼠李糖等糖类物质产醇、酯、酸等香气成分，使晒黄烟发酵提 取液中带有香兰素及其香味前体物质等奶香气成分，并破坏细胞壁释 放更多有效成分，提高提取率。
两种活性菌株发酵构成的复杂酶活力 体系，协调强效联合作用，更好地转化非挥发性糖苷为挥发性香气成 分，更有效地分解细胞壁中的纤维素、纤维
二糖、阿魏酸释放胞内活 性成分，降解多糖类物质为小分子成分，释放到发酵液中，经简单过 滤即可与带有微生物菌株的固定化载体碎块分离；再结合连续逆流超 声溶剂提取晒黄烟发酵物料残渣，工艺条件温和、缩短生产时间、提 高生产效率、降低成本，生产过程中添加醋酸
酮进一步吸附提取液中 残留的杂质如鞣质成分，添加复合氨基酸与晒黄烟发酵提取液中的还 原糖，在逆流加热条件下充分进行美拉德增色增香反应。总的来说， 使得杂质大分子成分包括蛋白质、多糖、淀粉等分解为香味物质，杂 质杂味减少，刺激性降低，香气种类自然复杂性增加，香气品质提高， 赋予晒黄烟吸附发酵提取液/物具有天然烟草浓郁本香的同时，还带 有自然复合香气包括水果酯香、奶香和烘烤香气，生产工艺条件温和、 步骤简单、易操作、成效高、成本低，杂质少，香料品质提升，粉末 状易运输、贮存，液状可直接加料应用减少稀释、混匀步骤；在传统 卷烟配方烟叶加料和新型加热不燃烧烟草中加香的应用，与烟气协调、 风格一致，增强烟草本香、提高满足感，带有奶香、水果香、烘烤香 气和喉部回甜感，工艺条件温和易实现，操作步骤简单。
具体实施方式
[0025] 以下具体
实施例对本发明进行详细地说明。
[0026] 实施例1
[0027] 一种晒黄烟提取物的吸附发酵制备方法，包括如下步骤：
[0028] (1)原料前处理：晒黄烟烟叶经粉碎机粉碎至40目粉末；
[0029] (2)微生物菌株的活化：将扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)的活性 固体冻干菌粉(食品级，活性为10u/mg)，加入到5倍质量的灭菌处 理的质量浓度为5％葡萄糖溶液中，置于35℃水浴锅活化30min，得 到微生物菌株活化液，其中所述的食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)保藏号为CCTCC NO：2012004，于2012年 1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；
[0030] (3)固定化载体制备：将晒黄烟的烟杆、甜菜根洗净烘干，用剪 刀剪成约1cm长的小块，两者质量比为1:0.5，高压灭菌后烘干；
[0031] (4)微生物菌株的固定化处理：称取上述步骤(3)灭菌烘干后的 固定化载体碎块装入容器，按照碎块与活化液质量比为1:1加入已培 养活化好的微生物菌株活化液，放置于4+0.5℃冷藏柜固定12h，过 滤得到固定化微生物菌株的碎块；
[0032] (5)晒黄烟的吸附固定化发酵：将步骤(1)所得晒黄烟烟叶粉末 与5倍质量的水混合均匀，加入步骤(4)所述固定化微生物菌株的 载体碎块，载体碎块与晒黄烟烟叶粉末质量比为1:0.5，在温度为35℃， 20rpm匀速搅拌，添加乳酸(食品级)调节pH值为4.0，发酵1d， 筛网过滤去除载体碎块，微孔过滤晒黄烟粉残渣，保留晒黄烟发酵液 A；
[0033] (6)连续逆流超声提取：将步骤(5)所得晒黄烟粉残渣，按速率 0.1kg/10min投料至浸出舱，开启主机和
超声波发生器，调节温度65℃， 料液比为质量比1:2，从浸出舱低端运行0.2h后调节出液阀门均匀放 液，控制溶剂加入流量，保持浸出仓液位平衡，连续逆流超声提取达 30min时，投料加入一定比例的醋酸铜、复合氨基酸，当连续逆流超 声提取共达90min时，停止生产工艺，排渣，得到浸出液B；
[0034] (7)将步骤(5)的发酵液A和步骤(6)的浸出液B合并，得 到晒黄烟吸附发酵提取液。
[0035] 进一步的，还包括步骤(8)：将所述晒黄烟吸附发酵提取液经真 空冷冻干燥得到晒黄烟吸附发酵提取物。
[0036] 进一步的，所述步骤(6)中使用的醋酸铜为分析纯，占晒黄烟粉 质量0.1％，所述复合氨基酸为脯氨酸、缬氨酸、组氨酸，食品级， 占晒黄烟粉质量的0.5％，三者之间的质量比为1:0.5:2。
[0037] 上述制备的晒黄烟吸附发酵提取液在传统卷烟配方烟丝中加料 应用：按0.01％烟丝质量比的晒黄烟吸附发酵提取液和糖分、水混匀， 喷洒到制丝加料罐中，按正常卷烟工艺加工成配方烟丝，具有协调卷 烟香气，劲头和浓度增加，带有水果酸香、奶香和烘烤香气，喉部有 回甜感。
[0038] 实施例2
[0039] 一种晒黄烟提取物的吸附发酵制备方法，包括如下步骤：
[0040] (1)原料前处理：晒黄烟烟叶经粉碎机粉碎至80目粉末；
[0041] (2)微生物菌株的活化：将扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)的活性 固体冻干菌粉(食品级，活性为25u/mg)，加入到8倍质量的灭菌处 理的质量浓度为15％葡萄糖溶液中，置于42℃水浴锅活化40min， 得到微生物菌株活化液，其中所述的食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)保藏号为CCTCC NO：2012004，于2012年 1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；
[0042] (3)固定化载体制备：将晒黄烟的烟杆、甜菜根洗净烘干，用剪 刀剪成约1cm长的小块，两者质量比为1:0.8，高压灭菌后烘干；
[0043] (4)微生物菌株的固定化处理：称取上述步骤(3)灭菌烘干后的 固定化载体碎块装入容器，按照碎块与活化液质量比为1:5加入已培 养活化好的微生物菌株活化液，放置于4+0.5℃冷藏柜固定24h，过 滤得到固定化微生物菌株的碎块；
[0044] (5)晒黄烟的吸附固定化发酵：将步骤(1)所得晒黄烟烟叶粉末 与8倍质量的水混合均匀，加入步骤(4)所述固定化微生物菌株的 载体碎块，载体碎块与晒黄烟烟叶粉末质量比为1:1.3，在温度为42℃， 50rpm匀速搅拌，添加乳酸(食品级)调节pH值为5.0，发酵3.5d， 筛网过滤去除载体碎块，微孔过滤晒黄烟粉残渣，保留晒黄烟发酵液 A；
[0045] (6)连续逆流超声提取：将步骤(5)所得晒黄烟粉残渣，按速率 0.5kg/10min投料至浸出舱，开启主机和超声波发生器，调节温度 85℃，料液比为质量比1:4.5，从浸出舱低端运行0.5h后调节出液阀 门均匀放液，控制溶剂加入流量，保持浸出仓液位平衡，连续逆流超 声提取达50min时，投料加入一定比例的醋酸铜、复合氨基酸，当 连续逆流超声提取共达120min时，停止生产工艺，排渣，得到浸出 液B；
[0046] (7)将步骤(5)的发酵液A和步骤(6)的浸出液B合并，得 到晒黄烟吸附发酵提取液。
[0047] (8)将所述晒黄烟吸附发酵提取液经
真空冷冻干燥得到晒黄烟吸 附发酵提取物。
[0048] 进一步的，所述步骤(6)中使用的醋酸铜为分析纯，占晒黄烟粉 质量0.5％，所述复合氨基酸为脯氨酸、缬氨酸、组氨酸，食品级， 占晒黄烟粉质量的0.9％，三者为等质量比。
[0049] 上述方法制备的晒黄烟吸附发酵提取物在新型加热不燃烧卷烟 烟丝中加香应用：将该晒黄烟提取物溶解到70％乙醇溶液中，稀释 1000倍，按与烟丝0.02％的质量比加香，卷烟香气浓郁醇厚、浓度增 加、满足感提高，带有奶甜清香气、水果清香和烘烤香气，模拟传统 卷烟感官效果好。
[0050] 实施例3
[0051] 一种晒黄烟提取物的吸附发酵制备方法，包括如下步骤：
[0052] (1)原料前处理：晒黄烟烟叶经粉碎机粉碎至120目粉末；
[0053] (2)微生物菌株的活化：将扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)的活性 固体冻干菌粉(食品级，活性为30u/mg)，加入到10倍质量的灭菌 处理的质量浓度为30％葡萄糖溶液中，置于55℃水浴锅活化60min， 得到微生物菌株活化液，其中所述的食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)保藏号为CCTCC NO：2012004，于2012年 1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；
[0054] (3)固定化载体制备：将晒黄烟的烟杆、甜菜根洗净烘干，用剪 刀剪成约1cm长的小块，两者质量比为1:2，高压灭菌后烘干；
[0055] (4)微生物菌株的固定化处理：称取上述步骤(3)灭菌烘干后的 固定化载体碎块装入容器，按照碎块与活化液质量比为1:10加入已 培养活化好的微生物菌株活化液，放置于4+0.5℃冷藏柜固定36h， 过滤得到固定化微生物菌株的碎块；
[0056] (5)晒黄烟的吸附固定化发酵：将步骤(1)所得晒黄烟烟叶粉末 与15倍质量的水混合均匀，加入步骤(4)所述固定化微生物菌株的 载体碎块，载体碎块与晒黄烟烟叶粉末质量比为1:2，在温度为55℃， 80rpm匀速搅拌，添加乳酸(食品级)调节pH值为6.0，发酵6d， 筛网过滤去除载体碎块，微孔过滤晒黄烟粉残渣，保留晒黄烟发酵液 A；
[0057] (6)连续逆流超声提取：将步骤(5)所得晒黄烟粉残渣，按速率 1.0kg/10min投料至浸出舱，开启主机和超声波发生器，调节温度 100℃，料液比为质量比1:6，从浸出舱低端运行1h后调节出液阀门 均匀放液，控制溶剂加入流量，保持浸出仓液位平衡，连续逆流超声 提取达60min时，投料加入一定比例的醋酸铜、复合氨基酸，当连 续逆流超声提取共达150min时，停止生产工艺，排渣，得到浸出液 B；
[0058] (7)将步骤(5)的发酵液A和步骤(6)的浸出液B合并，得 到晒黄烟吸附发酵提取液。
[0059] 进一步的，还包括步骤(8)：将所述晒黄烟吸附发酵提取液经真 空冷冻干燥得到晒黄烟吸附发酵提取物。
[0060] 进一步的，所述步骤(6)中使用的醋酸铜为分析纯，占晒黄烟粉 质量0.1～1％，所述复合氨基酸为脯氨酸、缬氨酸、组氨酸，食品级， 占晒黄烟粉质量的1.5％，三者之间的质量比为1:2:0.8。
[0061] 上述方法制备的晒黄烟吸附发酵提取液在新型加热不燃烧卷烟 再造烟叶中的应用，将该提取液按0.015％再造烟叶原料的质量比， 添加到加热不燃烧卷烟再造烟叶涂布液中应用，能增加新型卷烟的烟 香和提高满足感，香气丰富，带有烟香、奶香、水果酸香和烘烤香气， 喉部回甜感，刺激性降低，口感改善。
[0062] 试验例1：应用的感官效果对比评价
[0063] 将实施例1-3吸附发酵制备的晒黄烟提取物与空白对照，在传统 烟丝和新型加热不燃烧卷烟中分别进行感官评价对比实验。
[0064] 结果表明(如表1所示)：本发明吸附发酵制备的晒黄烟提取物 在传统卷烟和新型加热不燃烧卷烟中的应用，与烟气协调、保持卷烟 风格一致，增强烟草本香、提高满足感，烟香舒适，带有奶香、水果 酸香、烘烤香气和回甜感，刺激性降低，口感改善。
[0065] 表1.
马里兰烟叶发酵提取物在卷烟中的感官评价
[0066]
[0067]
[0068] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围 并不局限于此，任何属于
本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术 范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之 内。因此，本发明的保护范围应该以
权利要求的保护范围为准。
